Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống invitro và trồng thử nghiệm cây lan gấm ludisia discolor (ker gawler) blume tại đà nẵng

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MƠI TRƯỜNG

NGUYỄN THỊ MỸ PHƯỢNG

NGHIÊN CỨU HỒN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG
INVITRO VÀ TRỒNG THỬ NGHIỆM CÂY LAN GẤM
LUDISIA DISCOLOR (KER GAWLER) BLUME TẠI ĐÀ
NẴNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đà Nẵng, 2015


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MƠI TRƯỜNG

NGUYỄN THỊ MỸ PHƯỢNG

NGHIÊN CỨU HỒN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG
INVITRO VÀ TRỒNG THỬ NGHIỆM CÂY LAN GẤM
LUDISIA DISCOLOR (KER GAWLER) BLUME TẠI ĐÀ
NẴNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Hướng dẫn khoa học: TS. Võ Châu Tuấn
Người thực hiện

: Nguyễn Thị Mỹ Phượng

Đà Nẵng, tháng 05 năm 2015


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tơi. Các số liệu, kết
quả trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng được ai
cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.
Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Mỹ Phượng


LỜI CẢM ƠN
Đến với Bộ môn Công nghệ sinh học, khoa Sinh – Môi trường, trường
Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng, chính việc được trực tiếp tiến hành thí
nghiệm trong mơi trường đầy đủ thiết bị hiện đại, tôi đã học hỏi thêm được
nhiều kiến thức bổ sung cho phần kiến thức lý thuyết cũng như trang bị thêm
kỹ năng làm thực nghiệm cho bản thân. Qua đó, tơi thêm u thích thế giới
sinh học, có tư duy khoa học tốt hơn và cũng đã trưởng thành hơn rất nhiều.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Võ Châu Tuấn – thầy giáo đã tận tình
hướng dẫn và giúp đỡ tơi trong suốt q trình tơi thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ths. Bùi Thị Thơ đã giúp đỡ tôi rất nhiều
trong việc trau dồi kiến thức và kĩ năng thực hành thí nghiệm trong suốt q
trình tơi thực hiện đề tài khố luận của mình.
Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành và sâu sắc đến gia
đình, bạn bè thương yêu đã ln động viên, khích lệ tơi cả về vật chất lẫn tinh
thần để tơi có thể đạt được kết quả tốt nhất.

Xin chân thành cảm ơn!
Đà Nẵng, tháng 5 năm 2015
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Mỹ Phượng


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
2,4-D : diclorophenoxyacetic acid
AC

: active carbon (than hoạt tính)

BA

: 6-benzyl adenine

CW

: coconut water (nước dừa)

IBA

: indole 3-butyric acid

KC

: Knudson C (1965)

KIN

: kinetin

ĐHST : điều hòa sinh trưởng
MS

: Murashige và Skoog (1962)

NAA : α-naphthalen acetic acid
RE

: Robert Ernst (1979)

SH

: Schenk và Hildebrandt (1972)

VW

: Vacin và Went (1949)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng
3.1.

3.2.

Tên bảng
Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây lan

gấm
Ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro
cây lan gấm

Trang
20

23

3.3.

Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng ra rễ in vitro cây lan gấm

25

3.4.

Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ in vitro cây lan gấm

26

3.5.

Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ in vitro cây lan gấm

28

3.6.

Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây con in vitro

30

3.7.

Ảnh hưởng của các chế độ phân bón đến sự sinh trưởng của lan gấm

31


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình

Tên hình

Trang

3.1.

Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây lan
gấm.
(a) Bổ sung 1 mg/L BA;

(b) Bổ sung 2 mg/L BA;

(c) Bổ sung 3 mg/L BA;

(d) Bổ sung 4 mg/L BA;

22

(e) Bổ sung 5 mg/L BA
3.2.

Ảnh hưởng của 3 mg/L BA + (0,1 – 0,5) mg/L NAA đến khả năng
nhân nhanh chồi in vitro cây lan gấm.
(a) Bổ sung 3 mg/L BA + 0,1 mg/L NAA;
(b) Bổ sung 3 mg/L BA + 0,2 mg/L NAA;

25

(c) Bổ sung 3 mg/L BA + 0,3 mg/L NAA;
(d) Bổ sung 3 mg/L BA + 0,4 mg/L NAA;
(e) Bổ sung 3 mg/L BA + 0,5 mg/L NAA
3.3.

Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng đến khả năng tạo rễ in vitro cây
lan gấm.
(a) Mơi trường MS;

3.4.

3.5.

(b) Mơi trường ½ MS

Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ in vitro cây lan gấm.
(a) 0,5 mg/L IBA;

(b) 1 mg/L IBA;

(c) 1,5 mg/L IBA;

(d) 2 mg/L IBA

Ảnh hưởng của các chế độ phân bón đến sự sinh trưởng của lan
gấm. (a) 30:10:10;

3.6.

26

(b) 30:20:10;

(c) 20:20:20

Sự ra hoa của lan gấm sau 6 tháng trồng thử nghiệm

28

32
32


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................... 2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ............................................................................ 2

3.1. Ý nghĩa khoa học .......................................................................................... 2
3.2. Ý nghĩa thực tiễn .......................................................................................... 2
3.3.Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2
Chương 1 .................................................................................................................... 4
TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................................... 4
1.1. Sự phân bố của các loài lan và vai tròdược liệu .............................................. 4
1.1.1.Sự phân bố .................................................................................................. 4
1.1.2. Vai trò dược liệu của cây lan ..................................................................... 5
1.2. Các nhân tố ảnh hưởng đến nuôi cấy nhân giống in vitro ............................... 7
1.2.1. Môi trường nuôi cấy .................................................................................. 7
1.2.2. Điều kiện ni cấy..................................................................................... 8
1.2.3. Các chất điều hịa sinh trưởng thực vật ..................................................... 9
1.2.4. Môi trường tự nhiên ................................................................................ 10
1.3. Các nghiên cứu nhân giống bảo tồn và phát triển các loài lan quý hiếm bằng
kỹ thuật invitro ...................................................................................................... 11
1.3.1 Các nghiên cứu trên thế giới .................................................................... 11
1.3.2. Các nghiên cứu trong nước ..................................................................... 12
1.4. Giới thiệu về lan gấm..................................................................................... 15
1.4.1. Đặc điểm sinh học, sinh thái và phân bố ................................................. 15
1.4.2. Công dụng của cây lan gấm: ................................................................... 16
1.4.3. Các nghiên cứu nhân giống invitro cây lan gấm: .................................... 16
Chương 2 .................................................................................................................. 18
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................. 18
2.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................... 18


2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 18
2.2.1.Phương pháp nhân nhanh chồi in vitro cây lan gấm ................................ 18
2.2.2 Phương pháp tạo rễ in vitro cây lan gấm.................................................. 19
2.2.3. Phương pháp đưa cây ra đất .................................................................... 19

2.2.4. Xử lý thống kê ......................................................................................... 19
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ................................................................................... 20
3.1.Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi in
vitro cây lan gấm .................................................................................................. 20
3.2.Ảnh hưởng của nhóm chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh
chồi in vitro cây lan gấm ...................................................................................... 20
3.3. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo rễ in vitro cây lan
gấm........................................................................................................................ 22
3.3.1. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ in vitro cây lan gấm ............... 26
3.3.2. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng nhân tạo rễ in vitro cây lan gấm .... 28
3.4.Đưa cây lan ra đất – trồng trong nhà lưới ....................................................... 28
3.4.1. Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống sót của cây con invitro ................ 30
3.4.2. Ảnh hưởng của chế độ phân bón đến sự sinh trưởng của cây lan ........... 30
3.4.3. Sự ra hoa của lan gấm…………………………………………………..32
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………………..33
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................ 33


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Từ xưa đến nay, lan được biết đến như một loài hoa quý phái, hoa của bậc vua
chúa vương giả [15]. Họ lan (Orchidaceae) là họ lớn thứ hai trong giới thực vật có
hoa và cho đến nay, người ta đã phát hiện được 20.000 lồi trong đó có đến 70% số
lồi lan sinh sống ở vùng nhiệt đới [42]. Việt Nam nằm trong vùng khí hậu gió mùa
nên các lồi lan phân bố rất đa dạng và phong phú, có khoảng 140 chi và trên 800
lồi lan [2] và có nhiều lồi là đặc hữu có giá trị cao ở khu vực Đông Nam Á [4].
Trong đời sống, lan thường được sử dụng để làm cảnh chẳng hạn như Dendrobium,
Paphipedium….[15]. Bên cạnh giá trị làm cảnh, các loại lan còn được sử dụng làm
nguồn dược liệu chẳng hạn như lan gấm. Lan gấm phân bố ở một số nước châu Á
như: Indonesia (Anambas và quần đảo Natoena), Malaysia, Thái Lan, Miến Điện,

Việt Nam, Trung Quốc, Philippines [62]. Ở Việt Nam, lan gấm phân bố chủ yếu tại
một số địa phương như Lào Cai (Sa Pa), Vĩnh Phúc (Tam Đảo 3), Hà Tây (Ba Vì),
Thừa Thiên – Huế (Bạch Mã), Đà Nẵng, Quảng Nam (Cù Lao Chàm), Khánh Hòa
(Phú Hữu), Đăk Lắc, Lâm Đồng (Baika, Đà Lạt), Ninh Thuận (Cà Ná), Đồng Nai,
Bà Rịa – Vũng Tàu (Côn Đảo) [5].
Cây lan gấm (Ludisia discolor (Ker Gawler) Blume) là một trong số các loài
cây dược liệu được biết đến nhiều ở châu Á bởi những giá trị dược liệu của chúng,
chẳng hạn điều trị các bệnh về phổi, hỗ trợ hệ thần kinh và chữa các vết thương bị
cắn bởi côn trùng [1]. Các lồi thuộc họ lan ln nhạy cảm và có nguy cơ bị tuyệt
chủng lớn nhất trong các loài thực vật. Số lượng nhiều lồi lan trong tự nhiên đang
có xu hướng giảm đi bởi sự ảnh hưởng bất lợi của điều kiện môi trường và nạn khai
thác quá mức [16] [63] [45]. Hiện nay, ở Việt Nam nhu cầu sử dụng dược liệu từ
thực vật ngày càng cao, cây lan gấm đang bị khai thác nhiều dùng để làm thuốc, số
lượng cây ngồi tự nhiên đang giảm xuống nhanh chóng. Chính vì vậy, cây lan gấm
đang được xếp vào loại cây thuốc quý hiếm, có nguy cơ tuyệt chủng, cần được bảo
vệ [14].
Trong tự nhiên, cây lan nhân giống chủ yếu bằng hình thức sinh sản vơ tính
với hệ số nhân rất thấp. Mặt khác, hạt lan trong tự nhiên rất khó nảy mầm do chúng
khơng chứa nội nhũ [16] [6]. Hiện nay công nghệ nhân giống invitro được xem là
1


phương pháp hữu hiệu nhất trong việc nhân nhanh và bảo tồn nhiều loài lan quý
hiếm [16] [54] bởi hệ số nhân giống rất cao, cây con sạch bệnh và đồng nhất về mặt
di truyền. Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống cây lan gấm nhằm nhân nhanh nguồn
cây giống góp phần bảo tồn và phát triển bền vững loài dược liệu quý hiếm là vô
cùng cần thiết.
Cho đến nay, chỉ có duy nhất một cơng trình nghiên cứu về cây lan gấm tại
Việt Nam của Nguyễn Vũ Huyền Trinh (2013) tuy nhiên, kết quả chỉ là bước đầu,
chưa có dữ liệu hồn chỉnh.

Xuất phát từ những có cơ sở trên chúng tơi nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu
hồn thiện quy trình nhân giống invitro và trồng thử nghiệm cây lan gấm
Ludisia discolor (Ker Gawler) Blume tại Đà Nẵng”
2. Mục tiêu nghiên cứu
Xây dựng được quy trình nhân nhanh giống invitro cây lan gấm với hệ số
nhân giống cao, chất lượng cây giống tốt đồng thời đánh giá được khả năng sinh
trưởng của cây lan gấm invitro trồng trong nhà lưới tại Đà Nẵng.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu đề tài cung cấp dẫn liệu khoa học có tính hệ thống và
hồn chỉnh về quy trình nhân giống invitro cây lan gấm đồng thời cung cấp cơ sở
khoa học về khả năng sinh trưởng của cây lan gấm invitro trồng trong điều kiện nhà
lưới.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của đề tài là cơ sở để phát triển hệ thống sản xuất nhân nhanh cây lan
gấm phục vụ cho bảo tồn, phát triển bền vững nguồn tài nguyên cây thuốc quý góp
phần chăm sóc và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.
3.3.Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát ảnh hưởng về thành phần và nồng độ của các chất điều hòa sinh
trường (BA, NAA) đến khả năng nhân nhanh chồi invitro cây lan gấm.
- Khảo sát ảnh hưởng về mơi trường khống (MS, ½ MS) và thành phần, nồng
độ chất điều hòa sinh trường (NAA, IBA) đến khả năng tạo rễ invitro cây lan gấm.

2


- Khảo sát ảnh hưởng của giá thể (phân, xơ dừa, than gỗ, trấu hun) đến tỷ lệ
sống của cây lan con invitro cũng như ảnh hưởng của chế độ phân bón đến khả
năng sinh trưởng của cây lan trồng trong nhà lưới tại Đà Nẵng.

3


Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sự phân bố của các lồi lan và vai trịdược liệu
1.1.1.Sự phân bố
Họ lan là một họ lớn nhất trong giới thực vật có hoa, ước tính khoảng từ
20.000 đến 35.000 lồi [63] [45] [34] [24] [23]. Chúng phân bố khắp nơi trên toàn
thế giới trừ Nam Cực [59]. Sự phân bố của các loài lan khơng đồng đều, phần lớn
chúng được tìm thấy ở vùng có khí hậu nhiệt đới [63]. Hầu hết các lồi lan có
nguồn gốc từ các khu rừng nhiệt đới ẩm ở Trung và Nam Mỹ, Ấn Độ, Sri Lanka,
Miến Điện, Nam Trung Quốc, Thái Lan…[39].
Theo Helmut Bechtel (1982), hiện nay lan rừng phân bố trên thế giới gồm 5
khu vực [17]:
Ở châu Á nhiệt đới,lan phân bốchủ yếu gồm các chi: Bulbophyllum, Calanthe,
Ceologyne, Cymbidium, Dendrobium, Paphiopedilum, Phaius, Phalaenopsis,
Vanda, Anoectochillus.
Ở châu Mỹ nhiệt đới,gồm các chi: Brassavola, Catasetum, Cattleya,
Cynoches, Pleurothaillis, Stanhopea, Zygopetalum, Spathoglottis.
Ở châu Phi gồm các chi: Lissochilus, Polystachiya, Ansellia, Disa.
Ở châu Úc gồm các chi: Bulbophyllum, Calanthe, Cymbidium, Dendrobium,
Eria, Phaius, Pholidota, Sarchochilus.
Vùng ôn đới của Châu Âu, Bắc Mỹ và Đơng Bắc Á Châu lan phân bố ít hơn,
chỉ gồm các chi: Cypripedium, Orchis, Spiranthes.
Ngay cả trong các vùng nhiệt đới, sự phân bố này cũng rất khác nhau giữa các
lục địa và trong khu vực.Theo Barthlott và cs (1996), Myers và cs (2000) vùng
phân bố phong phú của những loài lan đặc biệt gắn liền với sự đa dạng của các thực
vật bậc cao. Dãy Andes phía bắc của Nam Mỹ, những dãy núi hẹp của Trung Mỹ,
Madagascar, Ấn Độ và Tây Nam Trung Quốc, Sumatra, Borneo, New Guinea và

vùng ơn hịa Tây Nam Úc là các vùng đặc biệt phong phú về các loại Lan. Dãy
Andes của Colombia và Ecuador là nơi có sự đa dạng và phong phú về lan nhất trên
thế giới, khoảng một phần tư các lồi được tìm thấy ở đây. Hơn 720 loài lan được
4


ghi nhận là phát triển trên Núi Kinabalu ở Sabah, NE Borneo. Trên khắp Đông Phi,
người ta đã phát hiện được rất nhiều loài lan, số lượng của chúng gấp ba lần ở Bắc
Mỹ và năm lần số lan được tìm thấy ở Anh. Hơn 1.200 lồi phong lan đã được tìm
thấy từ đảo Sumatra và gần 1.000 từ Madagascar . Ước tính 500 lồi phong lan có
thể được tìm thấy trong các vương quốc Himalaya nhỏ của Bhutan. Thoạt nhìn,
những khu vực này có ít điểm chung nhưng sự đa dạng của mơi trường sống, địa
chất, khí hậu và mức độ cô lập là những yếu tố không đổi rõ ràng nhất [63].
Ở Việt Nam, lan cũng vô cùng đa dạng phong phú, có khoảng hơn 1.000 lồi
hoa các loại, chúng sinh sống tại các vùng rừng, núi như Cao Bằng, Lào Cai, Huế,
Quy Nhơn, Đà Lạt, Pleiku… Lan Việt Nam đẹp, thanh cao, lại chứa đựng nhiều ý
nghĩa, có rất nhiều cây quý hiếm và có những cây trước kia chỉ thấy mọc ở Việt
Nam (như lan nữ hài Paphiopedilum delenati) [15]. Ở nước ta cũng có một số loài
đặc hữu thuộc các chi như Anoectochillus, Bulbophyllum, Calanthe, Cheirostylis,
Cleisostoma, Coelogyne, Cymbidium, Dendrobium, Eria, Liparis, Oberonia,
Paphiopedilum, Pholidota, Taeniophyllum [60]. Tuy nhiên, hiện nay do tác động từ
hoạt động sống của con ngườicũng như khai thác quá mức các loài lan ngồi tự
nhiên dẫn đến một số lồi lan có nguy cơ tuyệt chủng và đã có 67 lồi lan có tên
trong sách đỏ Việt Nam (phần thực vật - 2007) với nhiều loài đặc hữu như: Cầu
diệp ngọc linh (Bulbophylum ngoclinhensis Aver.), Giả thùy sa pa (Anoectochilus
chapaensis Gagnep.), Hài việt nam Paphiopedilum vietnamense Gruss & Perner…
Một số loài đang

ở mức cực kì nguy hiểm (CR) như: Hài đỏ

(Paphiopedilumdelenatii Guillaum.), Hài điển ngọc (Paphiopedilum

emersonii

Koop. & P.J. Cribb.), Hài tam đảo (Paphiopedilum gratrixianum Mast. Ex Rolfe),
Hài hê - len (Paphiopedilum helenae Aver) [2].
1.1.2. Vai trò dược liệu của cây lan
Từ hàng ngàn năm nay thực vật đóng một vai trị vơ cùng quan trọng trong
việc chăm sóc và chữa bệnh cho con người. Hiện nay, đã có đến 35.000 lồi được
sử dụng làm thuốc. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO,1993), ước tính có khoảng
70-80 % dân số trên thế giới, đặc biệt là các nước đang phát triển, sử dụng chủ yếu
các loài thảo dược truyền thống để bảo vệ sức khỏe [22].

5


Hoa lan là một trong những nhóm lớn nhất của Angiosperms thuộc họ
Orchidaceae.

Hoa lan dùng làm thuốc chủ

Gastrodia,Eulophia,

Orchis,

Vanda,

Calanthe,

yếu thuộc về các chi:

Coelogyne,

Cymbidium,

Cypipedium, Dendrobium, Ephemerantha, Eria, Galeola, Gastrodia, Gymnadenia,
Habenaria, Ludisia, Luisia, Nevilia và Thunia [24] [23] [45]. Nhiều hoạt chất sinh
học quý của lan đã được nghiên cứu và sử dụng trong đời sống [23].
Alkaloid là hợp chất thứ cấp, có tác dụng dược lý đối với con người và động
vật. Đối với hoa lan, 214 lồi trong 64 chi có chứa 0,1% alkaloid hoặc nhiều
hơn. Bên cạnh đó, nhiều hợp chất có giá trị khác cũng đã được ơng cơng bố như
phenanthrenes, terpenoid, các dẫn xuất, các bibenzylflavonoid và phenanthrenes….
Các hợp chất được sử dụng trong kháng khuẩn, kháng viêm, kháng virus và ức chế
khối u [23].
Chiết xuất từ lá và thể giả hành lồi Bulbophyllumneilgherrense có hoạt tính
kháng lại một số loài vi khuẩn như Escherichia coli,Staphylococcus aureus,
Bacillus pumilus, Pseudomonas aeruginosa và Pseudomonas putida [72]. Quả của
loài vani (Vanilla planifolia Andrews) là một loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng
cao, thúc đẩy sức khỏe của con người, ức chế cảm nhiễm và tăng sức đề kháng cho
cơ thể, ngăn ngừa bệnh do vi khuẩn gây nên [33]. Bột rễ cây Orchis mascula L.
giúp điều trị tiêu chảy mãn tính và bệnh lỵ, nó cũng được sử dụng để chữa chứng
rối loạn thần kinh, thần kinh suy nhược và là một trong những phương thuốc giúp
kích thích tình dục, giúp kiểm soát bệnh tiểu đường [25]. Dactylorhiza hatagirea
(D.Don) Soo là một loại thảo mộc được sử dụng truyền thống tại Ấn Độ. Chiết xuất
từ dịch củ của D. hatagirea (D.Don) Soo giúp điều trị chứng rối loạn chức năng
cương dương và cải thiện sự hình thành của testosterone ở nam giới [72]. Chiết
xuất từ đoạn thân loài Dendrobium pulchellum cô lập được 4 loại bibenzyl:
chrysotobibenzyl; chrysotoxine; crepidatin và moscatilin có tác dụng ức chế sự tăng
trưởng của các tế bào ung thư phổi, ức chế di căn của các tế bào ung thư, mở ra một
cách tiếp cận quan trọng cho sản xuất thuốc chống lại ung thư [30]. Năm 2005, Xia
và cs đã công bố dịch chiết được phân lập từ củ của loài Cremastra appendiculata

(D. Don) Makino có tác dụng chữa trị các dịng ung thư ác tính ở người như ung
thư đại tràng (HTC-8), ung thư gan (Bel7402), ung thư dạ dày (BGC-823), ung thư
6


phổi (A549), ung thư vú (MCF-7) và ung thư buồng trứng (A2780) [77].Theo
nghiên cứu khác, denbinobin phân lập từ Ephemerantha lonchophylla cũng có tác
dụng chống lại ung thư phổi (A549) ở người [23]. Năm 2012, Liu và cs đã cô lập
từ thân củ loài Arundinagraminifoliađược sáu hợp chất là dẫn xuất của bibenzyl có
cơng

thức

là

2,7-dihydroxy-1-(p-hydroxylbenzyl)-4-methoxy-9,10-

dihydrophenanthrene; 4,7 - dihydroxy – 1 - (p - hydroxylbenzyl) -2- methoxy - 9,10
-dihydrophenanthrene; 3,3'-dihydroxy-5-methoxybibenzyl; (2E)-2-propenoic acid3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl) - tetracosyl ester; (2E) - 2-propenoic acid-3-(4hydroxy-3-methoxyphenyl)-pentacosyl ester và pentadecyl acid có tác dụng chống
lại các tế bào ung thư ác tính [51]. Ung thư vú là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong ở
phụ nữ và tỷ lệ tử vong cao chủ yếu là do di căn. Denbinobin (5-hydroxy-3,7dimethoxy- 1,4-phenanthraquinone) là một hoạt chất sinh học được phân lập từ loài
Ephemerantha lonchophylla giúp chống lại đáng kể sự di căn của các tế bào ung
thư vú, cho thấy khả năng chữa trị căn bệnh này [31].
Nhiều chất hóa chất thực vật khác đã được tìm thấy từ các lồi phong lan. 2,
6-dimetoxy-1, 4 benzoquinone được báo cáo là có phản ứng dị ứng được phân lập
từ Cymbidium sp [43]. Habenariol đã được phân lập từ Habenaria repens, ức chế
sự peroxy lipid của con người khi nồng độ lipoprotein thấp [48]. Gastrol có tác
dụng giãn cơ trơn trong các sản phẩm từ hồi tràng chuột đã được phân lập từ thân
rễ của Gastrodia elata [44]. Nidemin và 9,19-Cyclolanosta-24,24- dimethyl-25-en3β-YL-trans-p-hydroxycinnamate đã được phân lập từ Scaphyglottis livida và
Nidema boothi [38]. Ferulates alkyl với tính antiooxidatve đã được phân lập từ

methanol chiết xuất từ Dendrobium monoliforme [50].
1.2. Các nhân tố ảnh hưởng đến nuôi cấy nhân giống in vitro
1.2.1. Môi trường nuôi cấy
Thành phần hóa học của mơi trường ni cấy thay đổi tùy theo mỗi lồi cây,
bộ phận ni cấy, thậm chí mỗi kiểu gen và mục đích ni cấy (ni cấy mô sẹo,
huyền phù tế bào, tế bào trần, bao phấn, hạt phấn). Các mơi trường khống cơ bản
thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là MS (1962), B5 (1968), SH
(1972) hoặc White (1963) [8].

7


Môi trường được sử dụng nhiều để nuôi cấy hoa lan là VW (1949) và KC
(1946). Theo Morel (1960), môi trường KC (1946) rất tốt để nuôi cấy hầu hết các
lồi lan [12]. Tuy nhiên hiện nay mơi trường cơ bản MS (1962) được xem là mơi
trường có hàm lượng và thành phần các muối khoáng phong phú hơn cả. Vì thế hầu
hết các thí nghiệm ni cấy mơ đều được thực hiện trên môi trường này.
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, đường được xem là nguồn cung cấp
carbon quan trọng giúp các tế bào phân chia, tăng sinh khối. Hai dạng thường được
sử dụng nhất là saccharose và glucose, nhưng saccharose phổ biến hơn.Saccharose
là cacbonhydrate phổ biến nhất trong vỏ cây và nhựa cây tham gia trong việc kiểm
sốt q trình phát triển [29] [41].
1.2.2. Điều kiện nuôi cấy
Để tăng hiệu quả của kỹ thuật nuôi cấy in vitro, ngồi thành phần mơi trường
thì điều kiện ni cấy như ánh sáng, nhiệt độ, pH cũng phải được tối ưu hóa.
- Ánh sáng:
Chất lượng ánh sáng (chất lượng quang phổ), số lượng (photon thông lượng)
và thời gian chiếu sáng có ảnh hưởng sâu sắc đến sự phát triển và phát sinh hình
thái của các mơ ni cấy [37] [70]. Nhìn chung, đèn huỳnh quang là nguồn ánh
sáng chính cho việc duy trì ni cấy mơ [37]. Ánh sáng phải được sử dụng liên tục

với quang chu kỳ là 16 giờ, 18 giờ hoặc 24 giờ tùy loài [9].
Nhiều nghiên cứu cho thấy ánh sáng đóng vai trị quan trọng trong việc tạo
hình thái cây ni cấy mơ. Trong giai đoạn tạo chồi ban đầu và nhân chồi tiếp theo,
cường độ ánh sáng chỉ cần 1000 lux. Nhưng trong giai đoạn tạo rễ, cây cần nhiều
ánh sáng, cường độ ánh sáng cao từ 3000 – 10.000 lux để kích thích cây chuyển từ
giai đoạn dị dưỡng sang tự dưỡng [3].
- Nhiệt độ:
Là nhân tố có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào và các quá trình trao
đổi chất của mơ ni cấy, đồng thời nó có ảnh hưởng tới sự hoạt động của auxin,
do đó làm ảnh hưởng đến khả năng ra rễ của cây con được ni cấy. Nhiệt độ thích
hợp để ni cấy các lồi hoa lan khác nhau thường khơng giống nhau. Ở các lồi
lan đa thân, nhiệt độ thích hợp là 22± 10C hoặc 26± 30C đối với lan đơn thân [11].
- Độ pH:
8


pH của môi trường là yếu tố rất quan trọng, ảnh hưởng đến sự phát sinh hình
thái của mẫu ni cấy tại các giai đoạn khác nhau. Sự ổn định pH của mơi trường là
yếu tố duy trì trao đổi chất trong tế bào. Giá trị của pH trong môi trường thích hợp
cho sinh trưởng và phát triển của nhiều loài thực vật biến đổi từ 5,5 – 6,0 [9] [28].
1.2.3. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Chất ĐHST thực vật là các yếu tố hóa học cần thiết cho sự sinh trưởng và phát
triển của thực vật, có thể là những chất tự nhiên được sản sinh với một hàm lượng
rất nhỏ trong một bộ phận nào đó của cá thể thực vật hoặc những chất được tổng
hợp nhân tạo.
Việc bổ sung một hoặc nhiều chất ĐHST như auxin, cytokinin, … là rất cần
thiết để kích thích sự sinh trưởng phát triển và phân hóa cơ quan, cung cấp sức
sống tốt cho mô và các tổ chức. Tuy vậy, yêu cầu của những chất này thay đổi theo
từng lồi thực vật, loại mơ, hàm lượng chất ĐHST nội sinh của chúng [20].
- Nhóm auxin

Các chất nhóm auxin có tác động thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở của tế
bào, tăng cường các quá trình tổng hợp và trao đổi chất, kích thích hình thành rễ và
tham gia vào cảm ứng phát sinh phơi vơ tính. Chất auxin tự nhiên được tìm thấy
nhiều ở thực vật là IAA. IAA có tác dụng ĐHST kéo dài tế bào, điều khiển sự hình
thành rễ. NAA và 2,4-D cũng đóng vai trị quan trọng trong sự phân chia mơ và
trong q trình tạo rễ. IAA kích thích sự ra rễ và kìm hãm sự phát triển callus.
Ngược lại, 2,4-D kích thích sự hình thành callus và kìm hãm sự hình thành rễ trong
môi trường nuôi cấy tại nồng độ cao. Mặc dù cùng nhóm chất auxin nhưng hai chất
này lại có tính chất đối kháng.NAA được Went và Thimann (1937) tìm ra. Chất này
có tác dụng làm tăng hơ hấp của tế bào và mơ ni cấy, tăng hoạt tính enzim và ảnh
hưởng mạnh đến trao đổi chất của nito, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường
trong môi trường ni cấy [19].
- Nhóm cytokinin
Cytokinin là chất ĐHST có tác dụng làm tăng sự phân chia tế bào, sự hình
thành và sinh trưởng của chồi in vitro, cảm ứng sự sinh trưởng của chồi bên và loại
bỏ ưu thế đỉnh. Các cytokinin thường gặp là BA, KIN. KIN được Shoog phát hiện
ngẫu nhiên trong khi chiết xuất axit nucleic. KIN là dẫn xuất của base nito adenin.
9


BA là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn KIN. BA và KIN
có tác dụng kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân
sinh và làm hạn chế sự già hóa của tế bào [59].
1.2.4. Mơi trường tự nhiên
- Nhiệt độ: Nhiệt độ là yếu tố quyết định đến sinh trưởng, phát triển của cây
hoa. Nhiệt độ tác động chủ yếu đến cây qua con đường quang hợp, quang hợp của
cây tăng theo chiều tăng của nhiệt độ. Nhiệt độ có thể ảnh hưởng chung hoặc ảnh
hưởng riêng đến sự sinh trưởng, phát triển của cây hoa. Thông thường tăng trưởng
của cây tăng hoặc giảm dần dần theo sự thay đổi nhiệt độ.
- Độ ẩm: Độ ẩm của không khí và độ ẩm đất ảnh hưởng nhiều đến sự sinh

trưởng và phát triển của cây hoa. Độ ẩm thích hợp thì cây hoa sinh trưởng, phát
triển tốt, ít sâu bệnh, ra hoa đẹp, chất lượng cao. Nước đóng vai trò rất quan trọng
trong cơ thể thực vật, trong phân chia tế bào, trong duy trì và phát triển của tế bào.
Khi có đầy đủ nước và mơi trường thích hợp, tế bào phân chia và phát triển thuận
lợi, cây sinh trưởng nhanh. Khi thiếu nước, các quá trình sinh lý, sinh hoá trong cây
hoa giảm, các hợp chất hữu cơ được tạo thành ít, cây cịi cọc, chậm phát triển. Nếu
quá trình thiếu nước kéo dài cây hoa sẽ bị héo, khô và chết.
- Ánh sáng: Cường độ quang hợp phụ thuộc vào điều kiện chiếu sáng, ánh
sáng là yếu tố rất cần thiết cho quá trình quang hợp. Đối với các loài hoa, nếu thiếu
ánh sáng cây sẽ chậm lớn, lá xanh nhạt, mềm yếu, nếu trong điều kiện thừa sáng lá
cây chuyển màu xanh vàng, cây kém phát triển.
- Giá thể: Giá thể trồng hoa tạo ra sự cân bằng động giữa các yếu tố nước,
dinh dưỡng và khơng khí để cây sinh trưởng và phát triển tốt. Giá thể lý tưởng để
trồng hoa là tơi xốp, thốt nước, thẩm thấu khí tốt, có khả năng giữ nước tốt, có
nhiều chất hữu cơ, độ pH từ 6,5 - 6,7.
- Dinh dưỡng khoáng: là yếu tố quan trọng để nâng cao năng suất, chất lượng
và sức chống chịu của cây trồng. Các nguyên tố thiết yếu cho cây được chia làm ba
nhóm:
+ Các nguyên tố đa lượng, có trong cơ thể thực vật với lượng từ vài phần trăm
đến vài phần nghìn: N, P, K, Ca, Mg, Si, S...

10


+ Các nguyên tố vi lượng, có trong cơ thể thực vật với lượng rất nhỏ khoảng
vài phần nghìn: Cu, Zn, Mo, Mn, Co...
+ Các nguyên tố siêu vi lượng có trong cơ thể thực vật với lượng cực nhỏ
khoảng vài phần triệu: Rb, Cs, Se, Cd…
Bón phân N, P, K đầy đủ với tỷ lệ thích hợp có tác dụng thúc đẩy sự sinh
trưởng và phát triển của cây. Tuỳ từng giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cây mà

sử dụng loại phân NPK với tỷ lệ thích hợp:
+ Giai đoạn cây sinh trưởng thân lá cần nitơ nhiều nên bón loại phân có tỷ lệ
đạm cao NPK = 20:10:10 hoặc 30:10: 10.
+ Để kích thích cây phân hố mầm hoa, giai đoạn này cần bón phân có hàm
lượng lân và kali cao NPK = 10:30:20 hoặc 10:52:10.
+ Khi cây đã ra hoa để cây chống chịu tốt, hoa đẹp, bền cần bón loại phân có
hàm lượng kali cao NPK = 15:10:30 hoặc 15:15:30.
1.3. Các nghiên cứu nhân giống bảo tồn và phát triển các loài lan quý hiếm
bằng kỹ thuật invitro
Hoa lan có một vai trị vơ cùng quan trọng đối với cuộc sống như vậy và hiện
nay, nó đang đứng trước nguy cơ bị tiêu diệt một cách nhanh chóng [63] [45].
Đứng trước một thách thức lớn như vậy, hiện nay con người đã áp dụng biện pháp
nhân giống in vi tro để bảo vệ cũng như khai thác được hết những khía cạnh, những
giá trị của loài lan này.
1.3.1 Các nghiên cứu trên thế giới
Năm 2010, Ded và Sungkumlong đã cho tái sinh in vitro mô lá của hai lồi lan
q của Đơng bắc Ấn Độ là Coelogyne suaveolens và Taenia Latifolia. Đối với
Coelogyne suaveolens đã cảm ứng tốt trên mơi trường MS có chứa 3% sucrose,
0,1% than hoạt tính (AC), và 6 μM NAA + 9 μMBA (khoảng 73%). Khoảng 75%
phân khúc lá nuôi của T. latifolia cảm ứng và hình thành 5 chồi trong vịng 5 tuần
trên mơi trường MS có chứa 3% sucrose, 0,1% AC, và 3 μM IAA + 6 μMBA. Các
chồi măng phát triển từ các phân đoạn của lá C. suaveolens biệt hóa thành cây con
trên mơi trường ½ MS có chứa 3% sucrose, 0.1% AC, 6 μM NAA + 9 μMBA. Còn
T. latifolia một phản ứng tương tự trên mơi trường MS có chứa 2% sucrose, 0,1%
và AC 3 μM NAA + 9 μM BA [36].
11


Bhadra and Hossain (2000) đã nuôi cấy hạt giống Geodorum densiflorum
(Lam.) Schltr.trên môi trường MS 8% agar và PM. Sau 45 – 60 ngày, trên môi

trường PM xuất hiện cấu trúc thân rễ bất thường cịn trên mơi trường MS hạt nảy
mầm và phát triển trực tiếp thành cây con. Khả năng nhân nhanh chồi cao nhất ở
môi trường MS có bổ sung 3% sucrose + 2,0 mg/ L NAA và 2,0 mg/ L BAP. Môi
trường MS + 3% sucrose + 1,0 mg/L IAA + 01 % AC là môi trường tạo rễ tốt nhất
cho G. densiflorum (Lam.) Schltr [29].
Mohanty và cs (2012) đã nuôi cấy in vitro thành công cây Cymbidium
mastersii. Các hạt giống nảy mầm đạt tỷ lệ 93,58±0,56% trên môi trường MS sau
8-9 tuần nuôi cấy. Protocorm phát triển tốt nhất khi được nuôi cấy trên môi trường
MS có bổ sung 5,0 mM BA và 2,5 mM NAA. Môi trường tạo rễ là MS bổ sung 10
mM IBA. Cây con được chuyển sang trồng với giá thể gạch vụn, than (1:1) và rơm,
phân bò (1:1), tỷ lệ sống lên đến 88% [69].
Năm 2013 Priya Kumari và cs tiến hành nuôi cấy trên cây lanDendrobium
Sonia(Fa. Orchidaceae) ‘Earsakul.’, môi trường ½ MS bổ sung 4 mg L-1 BA thích
hợp cho việc nảy mầm của cây. Sự kết hợp của 2,0 mg L-1 kinetin và 0,1 mg L-1
NAA đã được tìm thấy để tạo điều kiện cho sự nhân nhanh chồi. Mơi trường MS có
bổ sung 0,5 mg L-1 NAA cho rễ sớm nhất. Than và gạch miếng trong với tỷ lệ 1: 1
thì cho tỷ lệ sống là 66,67% khi cho ra trồng thí nghiệm tại vườn ươm [68].
Manner và cs (2010) nghiên cứu nhân giống in vitro loài Vanda coerulea Griff
ex Lindl.các đỉnh rễ được cấy trên môi trường MS có bổ sung 30 µM/l BA và 15
µM/l IAA để tạo protocorm. Các chồi được hình thành từ protocorm và tạo rễ, cây
con được trồng với giá thể gạch vụn, than, lá cây mục (1:1:1) và một ít dớn phủ lên
trên. 95% cây con sống sót sau khi đem trồng ngoài nhà lưới [52]. Naing và cs
(2011) đã tiến hành nhân giống lồi Coelogyne cristata. Mơi trường ½ MS cho thấy
khả năng tạo protocorm tốt nhất. Tỷ lệ nhân nhanh chồi đạt mức tối đa 8,1
chồi/mẫu khi được bổ sung 1,0 mg/l NAA; 0,5 mg/l BA và bột dừa. Tạo rễ đạt tỷ lệ
15 rễ/mẫu với môi trường ½ MS có bổ sung 2,0 mg/l IBA và bột chuối [56].
1.3.2. Các nghiên cứu trong nước
Năm 2010, Nguyễn Thanh Tùng và cs đã nuôi cấy lát mỏng tế bào cây lan
Hoàng thảo thân gãy (Dendrobium aduncum) - một loài lan rừng có giá trị của Việt
12

Nam. Nguyên liệu ban đầu là lát cắt mỏng đoạn thân theo chiều ngang của chồi in
vitro. Kết quả nghiên cứu cho thấy môi trường tối ưu cảm ứng protocorm - (PLB)
là mơi trường ½ MS bổ sung 0,5 mg/L BAP cho 29,85 PLB/lát mỏng sau 8 tuần
nuôi cấy. Môi trường MS bổ sung KIN 3,0 mg/L kết hợp với NAA 0,3 mg/L cho tỷ
lệ tái sinh chồi cao nhất đạt 5,67 chồi/mẫu. Sau đó chồi in vitro được cấy lên mơi
trường MS bổ sung 2,0 mg/L NAA là thích hợp nhất cho việc tạo rễ in vitro với kết
quả 9,18 rễ/chồi. Cây con in vitro tái sinh được đem ra thích nghi và trồng lên giá
thể, sau 6 tuần tỷ lệ sống đạt 90% [18].
Trần Thị Liên và cs (2010) nghiên cứu nhân nhanh chồi cây hoàng thảo
(Dendrobium nobile Lindl.) trên mơi trường VW có bổ sung 1,0 - 2,0 mg/l BA
hoặc 3,0 mg/l KIN và 20 g/l saccharose. Tỷ lệ cây con sống sót ngồi nhà lưới đạt
trên 90% [7].
Hoàng Thị Giang và cs (2011) nghiên cứu trên cây lan hài hằng
(Paphiopedilum hangianum) cho thấy môi trường RE thích hợp cho hạt nảy mầm
(58 - 67%). Mơi trường nhân nhanh protocorm là mơi trường RE có bổ sung 15%
CW và 100 g/l chuối cho hệ số nhân cao nhất (4,3 lần). Mơi trường này cũng rất có
hiệu quả để tạo chồi. Bổ sung 0,4 - 0,6 mg/l NAA vào môi trường cho khả năng ra
rễ tốt nhất. Các kết quả thí nghiệm ngồi nhà kính cho thấy: cây đạt tiêu chuẩn ra
vườn ươm cao 3 - 4 cm, có từ 3 - 4 lá, 4 - 5 rễ; trồng trên giá thể dớn; chế độ dinh
dưỡng NPK (30:10:10) với lượng bón là 1,0 g/l và chế độ phun 2 lần/tuần [4].
Nguyễn Văn Song và cs (2011) đã nghiên cứu nhân nhanh in vitro lan kim
điệp (Dendrobium chrysotoxum). Nguyên liệu sử dụng là hạt của quả lan 3 tháng
tuổi. Mơi trường thích hợp cho nảy mầm và phát sinh protocorm của hạt là MS bổ
sung 20 g/l saccharose; 8 g/l agar; 15% CW và 2,0 mg/l BA. Môi trường nhân
nhanh protocorm tốt nhất là MS bổ sung 20 g/l saccharose; 8 g/l agar, 15% CW và
2,0 mg/l BA. Môi trường MS bổ sung 30 g/l saccharose; 8 g/l agar; 1,0 g/l AC;
15% CW; 2,0 mg/l BA và 1,0 mg/l NAA thích hợp nhất cho tái sinh chồi từ
protocorm và sinh trưởng của chồi in vitro [12].

Năm 2012, Nguyễn Quang Thạch và cs đã nghiên cứu thiết lập quy trình nhân
giống in vitro hoàn chỉnh loài lan kim tuyến (Anoetochilus setaceus). Cơ quan vào
mẫu phù hợp nhất là thể chồi và mắt đốt ngang thân được khử trùng và đưa vào các
13


môi trường nền khác nhau (MS, Knud, Knudson). Môi trường thích hợp nhất để
nhân nhanh thể chồi và mắt đốt ngang thân là Knud* có bổ sung 0,5 mg/l BA; 0,3
mg/l KIN; 0,3 mg/l NAA; 20g/l saccharose; 0,5 g/l AC; 7 g/l agar cho hệ số nhân
chồi là 6,55 chồi/mẫu. Các chồi có chiều cao từ 3-4 cm được sử dụng để ra rễ in
vitro. Tỷ lệ ra rễ là 100% và số rễ/chồi (4,21 rễ/chồi) đạt cao nhất trên mơi trường
có bổ sung 1mg/l NAA [15].
Phùng Văn Phê và cs (2010) nghiên cứu nhân nhanh chồi invitro loài Lan
kim tuyến – Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl.. Môi trường phù hợp nhất
để nhân nhanh chồi Lan kim tuyến in vitro là Knud*. Thể chồi 8 tuần tuổi từ phơi
hạt chín và chồi từ thể chồi cao từ 2-3 cm là phù hợp nhất để nhân nhanh trong mơi
trường thích hợp Knud* bổ sung 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 0,3 mg/l NAA
+ 100 ml/l ND + 100 g/l dịch chiết khoai tây + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar + 0,5 g/l
AC [10].
Vũ Ngọc Lan và Nguyễn Thị Lý Anh (2013) nghiên cứu trên cây
lanDendrobiumnobile Lindl. (Thạch hộc), nguyên liệu sử dụng thích hợp là quả lan
5 tháng tuổi, môi trường gieo hạt là MS + (100ml ND + 10g saccharose + 6,0g
agar)/ lít mơi trường. Trong nhân in vitro kinh điển, môi trường nhân nhanh
protocorm tối ưu là KC + (100ml ND + 10g saccharose + 6,0g agar)/ lít; nhân
nhanh cụm chồi tốt nhất là MS + (100ml ND + 10g saccharose + 6,0g agar)/lít.
Trong nhân in vitro cải tiến: nuôi cấy lỏng lắc nút bông và lỏng lắc màng thống
khí đã tăng hệ số nhân protocorm đạt 1,9 và 2,3 lần so với nhân in vitro kinh điển.
Ni cấy đặc thống khí giúp giảm 25% lượng saccharose bổ sung vào môi trường
và tăng hệ số nhân protocorm lên gấp 1,4 lần so với nuôi cấy kinh điển. Nhân
nhanh cụm chồi bằng kỹ thuật bioreactor giảm ½ thời gian nhân giống. Mơi trường

tối ưu tạo cây hồn chỉnh là RE+ (10g saccharozase + 0,5g THT)/lít, cường độ ánh
sáng 2300lux [6].
Nguyễn Văn Song và cs (2011) đã nghiên cứu nhân giống loài lan Kim Điệp
Dendrobium chrysotoxum – một lồi lan rừng có nguy cơ bị tuyệt chủng vào năm
2011. Hạt nảy mầm và phát triển protocorm tốt nhất trên mơi trường MS cơ bản có
20g/l sucrose, 8 g/l agar, 15% nước dừa và 2,0 mg/L BAP. Môi trường nhân nhanh
protocorm tốt nhất là MS cơ bản có 20 g/L sucrose, 8 g/L agar, 15% nước dừa và
14


2,0 mg/L BAP. Môi trường tái sinh chồi từ protocorm và sinh trưởng của chồi in
vitro thích hợp nhất là MS cơ bản có 30 g/L sucrose, 8 g/L agar, 1g/L than hoạt
tính, 15% nước dừa, 2,0 mg/L BAP và 1,0 mg/L NAA. Mơi trường MS cơ bản có
20 g/L sucrose, 8 g/L agar, 15% nước dừa và 1,0 mg/L NAA là thích hợp cho tạo rễ
của chồi in vitro [12].
Năm 2012, Nguyễn Thị Sơn và cs đã tiến hành nghiên cứu Lan Dendrobium
fimbriatum Hook. (Hoàng thảo long nhãn) - loài lan đẹp được sử dụng làm cảnh và
làm thuốc, đang đe dọa tuyệt chủng nhằm bảo tồn và phát triển nguồn gen loài lan
quý. Kết quả nghiên cứu đã chỉ rõ: Nguyên liệu sử dụng là quả lan 3 tháng tuổi;
Mơi trường thích hợp cho nảy mầm và phát sinh protocorm của hạt là môi trường
MS + 100ml ND + 10g saccharoza + 6,0g agar/lít mơi trường; mơi trường nhân
nhanh protocorm tốt nhất là môi trường KC + 100ml ND + 10g sacaroza + 60g
khoai tây + 6,0g agar/lít môi trường; Môi trường MS + 100ml ND + 20g sacaroza +
60g chuối chín + 6,0g agar/lít mơi trường là thích hợp nhất cho nhân nhanh chồi in
vitro; mơi trường tạo cây hoàn chỉnh là RE + 10g sacaroza + 1g THT + 6,0g agar/lít
mơi trường [13].
Nghiên cứu của Nguyễn Thị Thủy và cs năm 2012 đã được tiến hành trên
Hoàng long (Coelogyne lawrenceana Rolfe) - một loài lan rừng đa thân có giá trị
với hoa lớn (3 -5 cm), đẹp và có hương thơm. Kết quả nghiên cứu cho thấy, hạt nảy
mầm tốt nhất trên môi trường cơ bản MS (Murashige– Skoog,1962) bổ sung 15%

(v/v) CW (nước dừa) + 2,0 mg/L BA (N6-benzyladenin) sau thời gian 38 ngày nuôi
cấy. Khả năng nhân nhanh chồi từ protocorm tốt nhất (15,20 chồi/protocorm, chiều
cao chồi 0,91 cm) trên môi trường MS bổ sung 15% (v/v) CW + 0,3 mg/L NAA (1Naphthylacetic acid) + 2,0 mg/L BA sau 8 tuần. Trên môi trường cơ bản ½ MS bổ
sung 15% (v/v) CW + 0,3 mg/L IBA (Indole – 3 butyric acid), các chồi in vitro tạo
rễ tốt nhất (3,0 rễ/chồi) sau 8 tuần [16].
1.4. Giới thiệu về lan gấm
1.4.1. Đặc điểm sinh học, sinh thái và phân bố
Cây lan gấm thuộc: bộ lan (Orchidales) và họ lan (Orchidaceae), lớp thực vật
một lá mầm. Tên đồng nghĩa :Haemaria discolor (Ker Gawl.) Blume [62][40].

15


Cây cao 10-25 cm. Gốc thẳng, thân dài, hơi mọng nước, phần gốc bò tạo
thành thân rễ, phần đỉnh đứng, ít lá, lá hầu như tập trung ở phần đỉnh thân, xếp
xoắn, có bẹ ở gốc, cuộn [67] [32]. Lá có màu đỏ nhạt ở phân rìa mép, càng về phía
mép thì màu đỏ càng nhạt đi [32]. Lá thường có màu xanh rất đậm hoặc nâu với các
gân màu bạc, vàng hoặc hồng, thn dài, hình elip. Cụm hoa ở đỉnh, chùm có ít đến
nhiều hoa. Hoa khá nhỏ, lộn ngược, nhuốm màu trắng với đỏ, cam, bao phấn màu
vàng sáng, lá đài rời [32]. Cánh mơi khơng có cựa, không linh động, vặn một cách
không đối xứng. Khối phấn chia làm hai, mềm, có chi, có gót dính. Đầu nhụy
không chia thùy rõ rệt [40] [67].
Cây lan gấm thường sinh sống ở khu vực ẩm ướt dọc theo các thung lũng
trong rừng lá rộng thường xanh, trên vùng đất có nhiều mùn lá rụng, lớp đất đá có
phủ rêu [32]. Thông thường, lan gấm sinh sống ở độ cao 200-1500 m [40] [39].
1.4.2. Công dụng của cây lan gấm:
Sản phẩm quan trọng của cây là lá, một loại dược liệu q có nhiều cơng dụng
như chữa lao phổi khạc ra máu, hỗ trợ hệ thần kinh, chữa các vết thương bị cắn bởi
côn trùng… [42] [52]. Chiết xuất từ lá thu được các hợp chất như asparagine,
glutamine, histidine, serine và threonine [47]. Cây cũng được làm cảnh vì lá và hoa

đẹp.
1.4.3. Các nghiên cứu nhân giống invitro cây lan gấm:
Cây lan gấm khơng những có giá trị về mặt y học, ngồi ra cịn có giá trị cao
về mặt kinh tế và đời sống. Chính vì lí do như vậy, hiện nay lan gấm ngoài tự nhiên
đang bị khai thác ngày càng cạn kiệt. Đứng trước thực trạng như vậy, cây lan gấm
đã được một số nhà khoa học nghiên cứu nhân nhanh giống in vitro nhằm bảo tồn
nguồn gen quý và có giá trị này.
Vào năm 2001, Chou và cs đã nghiên cứu về sự nảy mầm của hạt và sử dụng
các loài nấm rễ cộng sinh trên lan gấm. Trên môi trường MS bổ sung 20 và 30 g/l
saccharose tỷ lệ nảy mầm chỉ đạt 34%. Tuy nhiên, trên môi trường Hyponex #1 và
Hyponex #3 tỷ lệ nảy mầm là 60-63% sau 60 ngày nuôi cấy. Sinh trưởng của lan
gấm trong nhà kính là tốt nhất tại nhiệt độ 30/25o C. Sử dụng kính hiển vi thông
thường và điện tử quan sát thấy vỏ rễ lan gấm bị nhiễm các loại nấm rễ cộng sinh
trên phong lan (OMF) và mang cấu trúc rễ lan điển hình của tolypophagy với hệ sợi
16