Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hệ xúc tác sinh học để thủy phân polysaccharid thành oligo và saccharide

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Nguyễn Thị Hồng Nhung

NGHIÊN CỨU HỆ XÚC TÁC SINH HỌC ĐỂ THỦY PHÂN
POLYSACCHARIDE THÀNH OLIGO- VÀ SACCHARIDE

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2011


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Nguyễn Thị Hồng Nhung

NGHIÊN CỨU HỆ XÚC TÁC SINH HỌC ĐỂ THỦY PHÂN
POLYSACCHARIDE THÀNH OLIGO- VÀ SACCHARIDE
Chuyên ngành: Hóa lí thuyết và hóa lí
Mã số: 604431

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS. TS Vũ Ngọc Ban – Trƣờng ĐH KHTN, ĐHQGHN

GS. TSKH Trần Đình Toại – Viện Hóa học, Viện KH&CN VN

Hà Nội – Năm 2011


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Hồng Nhung

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

2

DANH MỤC CÁC BẢNG

3

DANH MỤC CÁC HÌNH

5

MỞ ĐẦU

11

CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN

13

1.1 Vi sinh vật phân hủy cellulose

13

1.1.1 Hệ Enzyme cellulase

14

1.1.2 Ức chế hệ enzyme cellulase

15

1.1.3 Cơ chế thủy phân cellulose bằng hệ enzyme cellulase

15

1.1.4 Các yếu tố quan trọng ảnh hƣởng tới quá trình sinh trƣởng

16

của vi sinh vật
1.1.4.1 Ảnh hƣởng của pH tới quá trình phát triển của vi vinh vật

16

1.1.4.2 Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới quá trình sinh trƣởng của vi sinh vật

19

1. 2. Cấu trúc và tính chất của một số thành phần có trong rơm rạ

21

1.2.1 Cellulose

21

1.2.2 Hemicellulose

24

1.2.3 Lignin

25

1.3 Vài nét về nhiên liệu sinh học

26

1.3.1 Các thế hệ nhiên liệu sinh học

26

1.3.1.1 Nhiên liệu sinh học thế hệ I

26

1.3.1.2 Nhiên liệu sinh học thế hệ II

26

1.3.2 Tình hình sản xuất và sử dụng nhiên liệu sinh học

28

1.3.2.1 Trên thế giới

28

1.3.2.2 Tại Việt Nam

29

1.4 Phƣơng pháp thủy phân cellulose và lên men etanol

29

1.4.1 Thủy phân cellulose

29

1.4.2 Lên men etanol

30

1


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Hồng Nhung

1.4.3 “Lên men đồng thời” và “Lên men nối tiếp”

32

1.4.4 Tiền xử lý nguyên liệu

33

CHƢƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

34

2.1 Nguyên vật liệu

34

2.1.1 Các chủng vi sinh vật để nghiên cứu

34

2.1.2 Các chế phẩm enzyme cellulase

34

2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu

35

2.2.1 Phƣơng pháp xử lý nguyên liệu

35

2.2.1.1 Tách cellulose từ rơm rạ

35

2.2.1.2 Phƣơng pháp tiền xử lý

36

2.2.2 Phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh

36

2.2.2.1 Môi trƣờng để nuối cấy các chủng vi sinh vật

36

2.2.2.2 Nuôi cấy các chủng vi sinh vật

37

2.2.2.3 Thu dịch enzyme từ các chủng vi sinh

38

2.2.3 Phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc

38

2.2.4 Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme cellulase

39

2.2.4.1 Đơn vị enzyme

39

2.2.4.2 Phƣơng pháp đục lỗ thạch

39

2.2.4.3 Xác định hoạt lực enzyme cellulase đƣợc tách chiết từ vi

40

sinh vật
2.2.5 Phƣơng pháp xác định mật độ tế bào

40

2.2.5.1 Dùng máy so màu

40

2.2.5.2 Phƣơng pháp xác định ATP

40

2.2.6 Phƣơng pháp cố định enzyme cellulase từ tế bào vi sinh

41

2.2.7 Thủy phân cellulose bằng enzyme

41

2.2.7.1 Thủy phân cellulose bằng enzyme cellulase tự do chƣa cố định

41

2.2.7.2 Thủy phân cellulose bằng enzyme cellulase cố định trên PVA

41

2.2.8 Lên men đồng thời (SSF)

42

2


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Hồng Nhung

2.2.9 Phƣơng pháp xác định đƣờng glucose bằng axit dinitro salicylic

42

(DNS)
2.2.10 Phƣơng pháp xác định etanol bằng chuẩn độ với K2Cr2O7

44

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

45

3.1 Nghiên cứu nguồn nguyên liệu để sản xuất etanol

45

3.2 Nghiên cứu tiền xử lý nguyên liệu

46

3.2.1 Hiệu quả thủy phân cellulose

46

3.2.1.1 Tách cellulose từ rơm, rạ

46

3.2.1.2 Định tính enzyme cellulase

47

3.2.1.3 So sánh hiệu quả của việc dùng cellulose và rơm cắt khúc để

47

thủy phân
3.2.2 Hiệu quả của quá trình thủy phân rơm đƣợc xử lý cơ học và tiền

49

xử lý
3.2.2.1 Xử lý cơ học và tiền xử lý nguyên liệu

49

3.2.2.2 So sánh hiệu quả của quá trình thủy phân rơm đƣợc xử lý cơ

49

học và tiền xử lý
3.2.3 So sánh hiệu quả thủy phân cellulose và rơm tiền xử lý

51

3.3 Nghiên cứu lựa chọn chủng vi sinh để thuỷ phân polisaccharide

51

3.3.1 Khảo sát 5 chủng vi sinh

51

3.3.1.1 Khảo sát ảnh hƣởng của pH và nhiệt độ ảnh hƣởng tới các

52

chủng vi sinh trong quá trình thủy phân nguyên liệu
3.3.1.2 Khảo sát khả năng thủy phâ của 5 chủng vi sinh
3.3.2 So sánh hiệu quả thủy phân của chủng A. Terreus với enzyme

54
58

Cellic HTech2
3.4 Nghiên cứu hiệu quả quá trình cố định enzyme cellulase

59

3.4.1 Cố định enzyme cellulase

59

3.4.2 Hiệu quả quá trình cố định enzyme cellulase

60

3.5 Khảo sát khả năng chuyển hóa các sản phẩm trung gian thành nhiên liệu

3

61


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Hồng Nhung

sinh học của các chủng nấm men
3.5.1 Khảo sát các chủng nấm men của Việt Nam

61

3.5.2 Khảo sát các chủng nấm men của Nga

66

3.6 Nghiên cứu “Lên men đồng thời” chuyển hóa rơm rạ thành etanol
3.6.1 Kết quả lựa chọn các chủng nấm men cho phƣơng pháp lên men
đồng thời

69
69
70

3.6.2 “Lên men đồng thời” chuyển hóa rơm rạ thành etanol thế hệ II

70

3.6.2.1 Cố định nấm Saccharomyces cerevisiae T2 trên PVA

70

3.6.2.2 Tiến hành lên men

71

KẾT LUẬN

73

4


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Hồng Nhung

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

ATP

Adenosine triphosphate

BSA

Bovine serum albumine (Albumin huyết thanh bò)

CMC

Carboxyl methyl cellulose

DNS

Axit dinitrosalicylic

PVA

Polyvinyl alcohol

TCA

Triclo axetic axit

SSF

Simultaneous saccharification and fermentation (Đồng
thời đƣờng hóa và lên men)

OD

Optical density (mật độ quang)

YATP

Hiệu suất tế bào theo ATP

Y(p/s)

Hiệu suất tế bào theo sản phẩm

Y(x/s)

Hiệu suất tế bào theo cơ chất

g/l

gam/lít

C

Nồng độ

V

Thể tích

MT

Mơi trƣờng

5


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Hồng Nhung

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1

Vi sinh vật phân huỷ cellulose (nuôi cấy đƣợc)

13

Bảng 1.2

Giá trị pH đối với sự phát triển của một số vi sinh vật

17

Bảng 1.3

Nhiệt độ (°C ) phát triển của một số vi sinh vật

19

Bảng 1.4

Giá trị trung bình các thành phần hóa học của rơm rạ (%)

21

Bảng 1.5

Cellulose tinh khiết trong nguyên liệu

22

Bảng 2.1

Các chủng vi sinh vật để thủy phân cellulose

34

Bảng 2.2

Các chủng nấm men cho lên men etanol

34

Bảng 2.3

Mật độ quang của dãy dung dịch chuẩn glucose

43

Bảng 3.1

Thành phần hóa học của rơm, rạ một số giống lúa gieo trồng

45

tại các tỉnh phía Bắc, Bắc Trung Bộ
Bảng 3.2

Thành phần hóa học của rơm. Rạ một số giống lúa gieo trồng

46

tại các tỉnh phía Bắc Trung bộ

Bảng 3.3

Kích thƣớc vòng phân giải cellulose trên đĩa thạch

47

Bảng 3.4

Sự biến đổi nồng độ glucose (mg/ml) trong quá trình thủy phân

48

của cellulose và rơm cắt khúc
Bảng 3.5

Sự biến đổi hàm lƣợng Gc ,Go, Gh

50

Bảng 3.6

Ảnh hƣởng của pH tới quá trình thuỷ phân nguyên liệu

52

Bảng 3.7

Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới quá trình thuỷ phân nguyên liệu

53

Bảng 3.8

Sự biến đổi nồng độ cellulose và glucose

54

theo thời gian của 5 chủng vi sinh
Bảng 3.9

Tổng hợp sự tạo thành glucose

57

trong quá trình thủy phân cellulose bởi các chủng vi sinh
Bảng 3.10

Sự biến đổi nồng độ glucose trong quá trình thủy phân cellulose

60

bằng tế bào chƣa cố định và cố định enzyme Cellic HTech2
Bảng 3.11

Các chủng nấm men đƣợc lựa chọn để nghiên cứu

62

Bảng 3.12

Các thơng số động học của q trình lên men etanol bởi các

62

chủng của Việt Nam

6


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Hồng Nhung

Bảng 3.13

Một số thông số động học trong quá trình lên men

65

Bảng 3.14

Các chủng nấm men của Nga đƣợc lựa chọn để nghiên cứu

66

Bảng 3.15

Các thơng số động học của q trình lên men etanol bởi các

66

chủng của Nga
Bảng 3.16

Một số thông số động học trong quá trình lên men (bởi chủng

69

của Nga)
Bảng 3.17

Kết quả chuyển hóa dịch thủy phân rơm thành etanol khi sử

70

dụng các tế bào nấm men cố định ở 37ºС và 45ºС
Bảng 3.18

Nồng độ etanol trong quá trình lên men etanol bằng nấm
Saccharomyces cerevisiae T2, Candida sp

7

71


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Hồng Nhung

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1

Giả thiết cơ chế thủy phân cellulose

16

Hình 1.2

Ảnh hƣởng của pH đối với chủng vi sinh có pH tối ƣu cho sự

18

phát triển là 6,2
Hình 1.3

Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới tốc độ sinh trƣởng tƣơng đối (%)

20

của chủng vi sinh có nhiệt độ phát triển tối ƣu là 45-47 0C
Hình 1.4

Cấu trúc khơng đồng nhất của phân tử cellulose

23

Hình 1.5

Cấu trúc phân tử hemicellulose

25

Hình 1.6

Giả thiết cấu trúc của lignin

26

Hình 1.7

Xu hƣớng sản xuất nhiên liệu sinh học trên thế giới

28

Hình 1.8

Sự biến đổi các thành phần trong quá trình lên men etanol

32

Hình 2.1

Phƣơng pháp đếm số lƣợng khuẩn lạc

38

Hình 2.2

Lên men đồng thời trong điều kiện yếm khí

42

Hình 2.3

Đồ thị đƣờng chuẩn glucose theo phƣơng pháp DNS

43

Hình 2.4

Sự thay đổi màu trong quá trình chuẩn độ xác định etanol

44

Hình 3.1

Cellulose tách từ rơm rạ

46

Hình 3.2

Hiệu quả của thủy phân cellulose

48

Hình 3.3

Mẫu rơm đƣợc xử lý cơ học

49

Hình 3.4

Mẫu rơm đƣợc tiền xử lý ở 80оС, рН = 12, trong 3 giờ

49

Hình 3.5

Sự biến đổi hàm lƣợng Gc ,Go, Gh

50

Hình 3.6

So sánh hiệu quả thủy phân cellulose và rơm tiền xử lý

51

Hình 3.7

Ảnh hƣởng của pH tới quá trình thuỷ phân nguyên liệu

53

Hình 3.8

Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới quá trình thuỷ phân nguyên liệu

54

Hình 3.9

Sự biến đổi nồng độ cellulose và glucose theo thời gian của 5

57

chủng vi sinh
Hình 3.10

Sự biến đổi nồng độ glucose trong quá trình thủy phân
cellulose bằng các chủng vi sinh

8

58


Luận văn thạc sĩ

Hình 3.11

Nguyễn Thị Hồng Nhung

Sự biến đổi nồng độ glucose khi thủy phân bằng enzyme Cellic

59

HTech2 và nấm A. Terreus
Hình 3.12

Hạt cố định enzyme Cellic HTech2

59

Hình 3.13

So sánh biến đổi nồng độ glucose trong quá trình thủy phân

61

cellulose bằng tế bào chƣa cố định và cố định của các chủng vi
sinh
Hình 3.14

Sự biến đổi các thơng số động học trong quá trình lên men

64

etanol bằng chủng của Việt Nam
Hình 3.15

Sự biến đổi các thơng số động học trong quá trình lên men

68

etanol bằng chủng của Nga
Hình 3.16

Hạt cố định nấm Saccharomyces cerevisiae T2

71

Hình 3.17

Sự biến đổi nồng độ etanol bằng phƣơng pháp lên men đồng

72

thời của 2 chủng Candida sp(1); Saccharomyces cerevisiae
T2(2)

9


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Hồng Nhung

MỞ ĐẦU
Theo dự báo, các nguồn năng lƣợng tiềm ẩn trên trái đất (dầu mỏ, khí, than
đá, uran) chỉ trong khoảng 100 năm tới sẽ cạn kiệt, con ngƣời có thể lâm vào tình
trạng khủng hoảng năng lƣợng. Vì vậy, việc tìm kiếm các nguồn năng lƣợng thay thế
trở thành một trong những nhiệm vụ cấp bách nhất hiện nay của nhân loại, trong đó có
Việt Nam. Nguồn năng lƣợng thay thế đang trở thành hiện thực chính là nhiên liệu sinh
học (diesel, xăng, gas sinh học). Trong xăng sinh học, etanol (thu đƣợc từ các quá trình
lên men các sản phẩm hữu cơ nhƣ tinh bột, cellulose) đƣợc sử dụng để pha trộn thay
cho phụ gia chì.

Năm 2010, trên thế giới, tổng sản lƣợng etanol đạt hơn 19 tỷ US gallon
tƣơng đƣơng 76 tỷ lít. Dự kiến, năm 2011 tổng sản lƣợng etanol đạt 23 tỷ US gallon
tƣơng đƣơng 87 tỷ lít. Hiện nay ở Việt Nam, đã sản xuất Ethanol chừng 0,3 tỉ lít.
Mục tiêu tới năm 2015 là 1,9 tỉ lít [12].
Nhƣng cần chú ý rằng, các cơng ty nƣớc ngồi chỉ đầu tƣ xây dựng các nhà
máy sản xuất etanol sinh học thế hệ I - etanol từ lƣơng thực sắn, mía đƣờng. Nhƣ
vậy, chúng ta chỉ tiếp thu cơng nghệ đã lạc hậu trên thế giới. Điều này không chỉ
làm Việt Nam lạc hậu về mặt khoa học công nghệ mà còn tác động xấu tới chiến
lƣợc an ninh lƣơng thực Quốc gia.
Nƣớc ta có diện tích đất cây trồng lúa hơn 8 triệu ha. Trong những năm gần
đây, hàng năm, sản lƣợng nơng nghiệp quy ra thóc đạt gần 40 triệu tấn. Với sản
lƣợng lớn nhƣ vậy, phế thải nông nghiệp ƣớc chừng hơn 80 - 100 triệu tấn. Hiện
nay, phế thải nông nghiệp không chỉ làm ô nhiễm mơi trƣờng sinh thái mà cịn làm
mất đi cảnh quan văn hố đơ thị và nơng nghiệp nơng thơn. Song, phế thải nông
nghiệp thực sự là một nguồn tài ngun có giá trị kinh tế vơ cùng lớn.
Sản xuất nhiên liệu sinh học từ phế thải nông nghiệp (rơm, rạ), trƣớc hết góp
phần giải quyết vấn đề năng lƣợng, cũng là thúc đẩy phát triển sản xuất lƣơng thực
(lúa). Đồng thời, sản xuất nhiên liệu sinh học từ phế thải cịn có các ý nghĩa sau:
Tái sử dụng tài nguyên (là phế thải )

10


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Hồng Nhung

Xử lý ô nhiễm mơi trƣờng tại các vùng nơng thơn.
Để góp phần thực hiện “Đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015,
tầm nhìn đến năm 2025” theo quyết định số 177/2007/Qđ-TTg do Thủ tƣớng chính

phủ ký ngày 20 tháng 11 năm 2007, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu hệ xúc
tác sinh học để thủy phân polisacchride thành oligo- và saccharide”. Đây là một
trong những cơ sở để nghiên cứu sản xuất nhiên liệu sinh học (etanol thế hệ II) từ
phế thải nông nghiệp (rơm, rạ) chứa cellulose, hemicellulose.
Trong khuôn khổ của đề tài, chúng tôi nghiên cứu các nội dung sau:
1. Lựa chọn các loại phế thải nguồn gốc nông nghiệp của Việt Nam (rơm, rạ)
để làm nguồn nguyên liệu sản xuất nhiên liệu sinh học.
2. Nghiên cứu quá trình tách cellulose từ rơm, rạ.
3. Lựa chọn nguồn vi sinh vật để lên men etanol.
4. Nghiên cứu hệ xúc tác sinh học dị thể dựa trên cơ sở các enzyme cellulase
vi sinh cố định
5. Nghiên cứu quá trình thuỷ phân cellulose để tạo thành các sản phẩm
trung gian.
6. Nghiên cứu q trình chuyển hố (lên men) các sản phẩm trung gian
(hydrolizat) thành nhiên liệu sinh học bằng con đƣờng sinh học dùng các vi sinh
vật, enzyme tự do và cố định.

11


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Hồng Nhung

CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN
Trong khuôn khổ đề tài, chúng tôi nghiên cứu hệ xúc tác sinh học là các vi
sinh vật và polisaccharide là cellulose có trong rơm, rạ. Để có cái nhìn khái quát,
chúng tôi xin giới thiệu tổng quan về vi sinh vật phân hủy cellulose; cấu trúc, tính
chất của một số thành phần có trong rơm rạ.
1.1 Vi sinh vật phân hủy cellulose [11]

Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân huỷ bởi vi sinh vật cả trong điều
kiện hiếu khí và kị khí. Các lồi vi sinh vật có thể có tác động hiệp lực hoặc thay
phiên nhau phân huỷ cellulose đến sản phẩm cuối cùng là glucose. Số lƣợng các
loài vi sinh vật tham gia phân huỷ cellulose rất phong phú. Chúng thuộc nấm sợi, xạ
khuẩn, vi khuẩn, thậm chí cả nấm men. Hiện nay, ngƣời ta đã biết đƣợc một số vi
sinh vật có khả năng phân huỷ cellulose (Bảng 1.1).
Bảng 1.1. Vi sinh vật phân huỷ cellulose (nuôi cấy đƣợc)
Xạ khuẩn
Actinomyces

Nấm
Aspergillus

Vi khuẩn
Bacillus

Actinomyces diastaticus

A. oryzae

B. amylogenas

Actinomyces roseus

A. terreus

B. flavefacicus

Actinomyces thermofucus

A. syndovii

B. megaterium

Actinomyces diastaticus

A. flarus

B. menssenteroides

A. niger

B. ruminicola

Streptomyces

Trichoderman

Clotridium

Str. rectus

T. reseii

Clos. Butyricum

Str. thermofuscus

T. viridae

Clos. Lochehesdii

Str. thermonitrificans

T. lignorum

Acetobacter xylinum

Str. thermoviolaceus

T. hazianum

Pseudomonas fluorescens

Str. thermovulgaris

Pen. Notatum

Ruminococcus albus

Str. violaceus

Cephalosporium

Bacteroides amylophilus

12


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Hồng Nhung

Thermomonospora curvata

Neurospora

amylophillus sp

Thermomonospora vulgaris

AaBasii diomycetes

Cellulosemonas

Fusarium culmorum
1.1.1 Hệ enzyme cellulase trong thủy phân cellulose [3, 16]
Các vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose là do chúng có thể tiết ra các
enzyme tạo thành một hệ enzyme gọi là hệ cellulase. Tuy nhiên, trong thiên nhiên
khơng có một vi sinh vật nào có khả năng cùng một lúc sinh tổng hợp tất cả các loại
enzyme có trong hệ cellulase.
Các vi sinh vật này có khả năng sinh tổng hợp mạnh loại enzyme này, loài
khác lại tổng hợp mạnh loại enzyme khác. Chính vì thế, sự phân hủy cellulose trong
điều kiện tự nhiên thƣờng rất chậm và không triệt để. Các enzyme hệ cellulase này
xúc tác quá trình thủy phân cắt ngắn mạch cellulose.
Nhiều tác giả cho rằng hệ cellulase gồm các enzyme chính:
Endo-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4), còn gọi là cellulase (Cx). Enzyme này tác
động thuỷ phân lên các liên kết phía trong mạch cellulose một cách tuỳ tiện làm
trƣơng phồng cellulose, dẫn đến làm giảm nhanh chiều dài mạch và tăng chậm các
nhóm khử. Enzyme này hoạt động mạnh ở vùng vơ định hình nhƣng lại hoạt động

yếu ở vùng tinh thể của cellulose.
Exo - 1,4- gluconase (EC 3.2.1.91), còn gọi là cellobiohydrolase (C1).
Enzyme này giải phóng cellobiose hoặc glucose từ đầu khơng khử của cellulose.
Enzyme này tác động yếu lên vùng vơ định hình ở phía bên trong của mạch, nhƣng
tác động mạnh lên mạch bên ngoài của cellulose tinh thể hoặc cellulose đã bị phân
giải một phần. Hai enzyme exo và endo- glucanase có tác dụng hiệp đồng cho hiệu
quả rõ rệt.
 - 1,6 - glucosidase (EC 3.2.1.21), còn gọi là cellobiase. Enzyme này thuỷ
phân cellobiose và các cellodextrin hồ tan, chúng có hoạt tính thấp và giảm khi
chiều dài của mạch cellulose tăng lên. Tuỳ theo vị trí mà  - glucosidase đƣợc coi là

13


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Hồng Nhung

nội bào, ngoại bào hoặc liên kết với thành tế bào. Chức năng của  - glucosidase có
lẽ là điều chỉnh sự tích luỹ các chất cảm ứng của cellulase.
1.1.2 Ức chế hệ enzyme cellulase
Các enzyme trong hệ cellulase hoạt động hiệp lực rất mạnh nên có thể thủy
phân cellulose tinh thể cho tới glucose. Tuy vậy, có nhiều yếu tố ảnh hƣởng tới hoạt
tính của enzyme, nhƣ nhiệt độ và pH mơi trƣờng. Các yếu tố này sẽ đƣợc phân tích
kỹ hơn trong các phần sau. Ngồi các yếu tố đó, hoạt tính của enzyme còn bị nhiều
tác nhân khác ảnh hƣởng tới. Các tác nhân này có thể làm tăng hoạt tính của
enzyme gọi là các chất hoạt hóa. Cũng có các tác nhân có tác động ngƣợc lại, làm
giảm hoạt tính của enzyme gọi là các chất ức chế.
Các chất ức chế hệ enzyme cellulase trong thủy phân cellulose có thể có bản
chất vơ cơ hoặc hữu cơ. Có chất ức chế chính là hợp phần của ngun liệu, cũng có

những chất từ bên ngồi mơi trƣờng tác động tới. Xét về mặt tác động thuỷ phân
sinh khối (chứa cellulose, hemicellulose), chất ức chế là các thành phần tồn tại ngay
trong nguồn nguyên liệu cần đƣợc xem xét kỹ.
Trong các thành phần hóa học của phế phẩm nơng nghiệp (rơm, rạ),
hemicellulose chiếm tới ~25 %, lignin chiếm tới ~12 %, silic chiếm khoảng ~13 %,
cũng tƣơng tự nhƣ vậy, có thể thấy các chất này xuất hiện trong vỏ trấu. Nhiều cơng
trình nghiên cứu cho thấy rằng đây là các chất ức chế rất mạnh hoạt tính của các
enzyme hệ cellulase, đặc biệt ức chế làm giảm mạnh hoạt tính của các enzyme
exoglucanase và -glucosidase (những enzyme thủy phân cellulobiose thành
glucose).
1.1.3 Cơ chế thủy phân cellulose bằng hệ enzyme cellulase
Việc nghiên cứu cơ chế thủy phân cellulose đƣợc tác giả Klyosov [8,9] chú ý
từ sớm. Sau này nhiều tác giả khác cũng chú ý tới vấn đề này. Cơ chế thủy phân
cellulose đƣợc giả thiết có ít nhất hai bƣớc:
Bƣớc 1: Endoglucanase (ký hiệu C1) sẽ làm trƣơng hoặc hydrat hóa các liên
kết trong mạch cellulose.

14


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Hồng Nhung

Bƣớc 2: Exoglucanase (ký hiệu Cx) và β - glucosidase (cellubiase) thủy phân
các liên kết mạch phía ngồi giải phóng glucose.
Cellulose tinh thể
Endoglucanase (C1)

Cellulose vơ định hình

Oligomer
Các oligomer ngắn

Exoglucanase (Cx)

Cellobiose

-1,4-glucosidase
Glucose

Mơ hình thủy phân cellulose

Cellulose

(3)
Endo - glucanase
(2)

(1)

Gn

Cellobiohydrolase

G1

Cellobiase

Glucose

Endo – glucanase + Cellobiohydrolase
Exo - glucanase
Mơ hình thủy phân cellulose của Klyosov.
Hình 1.1. Giả thiết cơ chế thủy phân cellulose

1.1.4 Các yếu tố quan trọng ảnh hưởng quá trình sinh trưởng của vi sinh vật
1.1.4.1 Ảnh hưởng của pH tới quá trình sinh trưởng của VSV [18, 30, 31]
Phần lớn các vi sinh vật phát triển thuận lợi trong mơi trƣờng có pH trong
khoảng 5,5 - 7,5. Rất ít các vi sinh vật phát triển trong môi trƣờng có pH nhỏ hơn
4,0 hoặc cao hơn 9,0. Tuy vậy, vẫn tồn tại các vi sinh vật phát triển trong môi
trƣờng nhỏ hơn 2,0 hoặc cao hơn 10,0 (Bảng 1.2).

15


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Hồng Nhung

Bảng 1.2. Giá trị pH đối với sự phát triển của một số vi sinh vật
Vi sinh vật

Cực tiểu

Clostridium perfringens

5.5 5.8

Vibrio vulnificus

5.0

Bacillus cereus

4.9

Campylobacter spp.

4.9

Shigella spp.

Tối ƣu
7.2
7.8
6.0 7.0
6.5 7.5

4.9

Vibrio parahaemolyticus

4.8

Cực đại
8.0 9.0
10.2
8.8

9.0
9.3

7.8 8.6

11.0

Clostridium botulinum toxin

4.6

8.5

Clostridium botulinum growth

4.6

8.5

Staphylococcus aureus growth

4.0

Staphylococcus aureus toxin

4.5

Enterohemorrhagic Escherichia coli

4.4

Listeria monocytogenes

4.39

Salmonella spp.

4.2

16

6.0 7.0
7.0 8.0
6.0 7.0
7.0
7.0 7.5

10.0

9.6

9.0
9.4
9.5


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Hồng Nhung

Yersinia enterocolitica

4.2

7.2

9.6

Các chủng vi sinh vật phát triển trong mơi trƣờng có pH thấp (tính axit cao)
gọi là “Ƣa axit” (acidophile). Đối với các chủng quá ƣa axit (extreme acidophile),
pH có thể thấp tới 4,2.
Thí dụ: Chủng Trichoderma reesei có thể sinh ra hệ enzyme cellulase có hoạt
tính cao để thủy phân cellulose trong mơi trƣờng axit có pH = 4,8. Có chủng đặc
biệt nhƣ chủng ƣa axit cổ đại (thermoacidophilic archaeon) Sulfolobus solfataricus
A chịu đƣợc axit rất cao pH = 1, 8 rất bền nhiệt, đồng thời sinh ra endo-β-glucanase
bền nhiệt và có hoạt tính cao. Ở pH = 1,8 và 80 0C enzyme này chỉ mất 50 % hoạt
tính sau 8 giờ bảo quản.
Các chủng vi sinh vật phát triển trong môi trƣờng có pH trung tính (quanh
vùng 7) gọi là “Vừa phải”(obligate acidophile). Đối với chúng, cần mơi trƣờng có
nồng độ ion H+ để bảo đảm độ bền cho màng nguyên sinh chất.
Các chủng vi sinh vật phát triển trong môi trƣờng có pH cao (tính kiềm cao)
gọi là “Ƣa kiềm” (alkaliphile). Đối với các chủng quá ƣa kiềm (extreme
alkaliphile), có thể phát triển trong mơi trƣờng có pH cao tới 9,5 nhƣ các loài
Geoalkalibacter ferrihydriticus, Alkalibacterium iburiense, Bacillus okhensis.
Đồ thị hoạt tính thủy phân cellulose của các chủng vi sinh phụ thuộc vào pH
thƣờng có dạng quả chng với cực đại ở pH tối ƣu. Vị trí cực đại đồ thị phụ thuộc
vào pH tối ƣu của các chủng vi sinh
Đối với chủng vi sinh có pH tối ƣu cho sự phát triển là 6,2 thì tốc độ sinh
trƣởng tƣơng đối (%) có thể thay đổi nhƣ đồ thị trên hình 1.2:
A, %

100-

80-

60-

17

2

4

6

8

10

pH


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Hồng Nhung

Hình 1.2. Ảnh hƣởng của pH
đối với chủng vi sinh có pH tối ƣu cho sự phát triển là 6,2
1.1.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình sinh trưởng của VSV [7, 10, 15, 31]
Dựa vào khả năng thích ứng với nhiệt độ, vi sinh vật có thể chia thành 3

nhóm với các nhiệt độ thích hợp:
1- Chịu lạnh (psychrophilic) ( 0
2- Ƣa ấm

 25oC)

(25oC  40oC)

(mesophilic)

3- Ƣa nóng (thermophilic)

(35oC  60oC)

Kết quả theo dõi nhiệt độ đối với sự phát triển của một số vi sinh vật đƣợc
ghi trong bảng 1.3:
Bảng 1.3. Nhiệt độ (°C ) phát triển của một số vi sinh vật
Vi sinh vật

Cực tiểu

Tối ƣu

Cực đại

Bacillus cereus

5

28-40

55

Campylobacter spp.

32

42-45

45

Clostridium botulinum A, B*

10-12

30-40

50

Clostridium botulinum E**

3-3.3

25- 37

45

Clostridium perfringens

12

43-47

50

Escherichia coli

7

35- 40

46

18


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Hồng Nhung

Listeria monocytogenes

0

30- 37

45

Salmonella spp.

5

35- 37

45

Staphylococcus aureus

7

35-40

48

Staphylococcus aureus toxin

10

40-45

46

Shigella spp.

7

37

45

Vibrio cholerae

10

37

43

Vibrio parahaemolyticus

5

37

43

Vibrio vulnificus

8

37

43

Yersinia enterocolitica

-1

28- 30

42

, %
100-

80-

60-

35

40

45

50

55 t0C

Hình 1.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới tốc độ sinh trƣởng tƣơng đối (%)
40-

của chủng vi sinh có nhiệt độ phát triển tối ƣu là 45-47 0C
Thí dụ: Đối với chủng vi sinh có nhiệt độ phát triển tối ƣu là 45-47 0C, tốc độ
20-

sinh trƣởng tƣơng đối (%) có thể thay đổi nhƣ đồ thị trên hình 1.3.
Nhiều chủng nấm men là những chủng ƣa nhiệt, nhƣ các chủng lên men
etanol, thí dụ 0chủng Thermoanaerobacter. Ngồi ra, cịn có chủng vi sinh vật

19


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Hồng Nhung

thích nghi với nhiệt độ ngoài vùng nhiệt độ của các chủng vi sinh vật thuộc 3
nhóm nêu trên.
Các chủng thích nghi với nhiệt độ rất thấp dƣới vùng nhiệt độ cho các chủng
vi sinh vật thuộc nhóm “Chịu lạnh” đƣợc gọi là “Quá ƣa lạnh” (Extreme
psychophile hoặc psychotrophs hoặc Cryophile). Các chủng vi sinh vật này có thể
phát triển ở nhiệt độ rất thấp - 10 đến -15oC. Chúng đƣợc tìm thấy ở những biển
băng giá thuộc 2 cực của trái đất nhƣ Arthrobacter sp., Psychrobacter sp., và các
thành viên của giống Halomonas, Pseudomonas, Hyphomonas, Sphingomonas.
Các chủng thích nghi phát triển ở nhiệt độ rất cao, cao hơn cả nhiệt độ phát
triển cho các chủng thuộc nhóm “Ƣa nóng”, có thể tới 70°C hoặc cao hơn nữa, gọi
là “Quá ƣa nóng” (Extreme thermophiles). Một số chủng cịn thích hợp với nhiệt độ
80°C - 105°C, đƣợc gọi là Hyperthermophiles. Những chủng này đƣợc tìm thấy ở
các vùng cận núi lửa, suối nƣớc nóng nhƣ ở công viên Yellowstone National Park
châu Phi hoặc vùng Kamchatka của Nga.
1. 2 Cấu trúc và tính chất của một số thành phần có trong rơm rạ
Thành phần của rơm rạ chứa chủ yếu là cellulose, hemicellulose và số ít các
hợp phần khác (Bảng 1.4) [4].
Bảng 1.4. Giá trị trung bình các thành phần hóa học của rơm rạ (%)
Thành phần hóa học

Rơm, rạ

Trấu

Cellulose

43

35

Hemicellulose

25

25

Lignin

12

20

Protein thơ (N x 6.25)

3-4

3

16-1(silic 83%)

17 (silic 94%)

Hàm lƣợng tro

1.2.1 Cellulose [3, 5, 6, 17, 32]

Cellulose là thành phần cơ bản của vách tế bào thực vật và có lẽ là hợp chất
sinh học phong phú nhất trên trái đất, hàng năm đƣợc tạo thành với khối lƣợng lớn
đến mức vƣợt tất cả các sản phẩm tự nhiên khác. Theo một số tác giả, sinh khối

20


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Hồng Nhung

thực vật của trái đất là 2-3.1012 tấn trong đó cellulose chiếm 40%. Do vậy, tổng
lƣợng cellulose của toàn thế giới là 7-8.1011 tấn, còn lƣợng cellulose tạo thành hàng
năm là 4.1010 tấn.
Trong vách tế bào thực vật cellulose tồn tại trong mối liên kết chặt chẽ với
các polysaccarit khác tạo thành những phức hợp bền vững. Hàm lƣợng cellulose
trong xác thực vật thƣờng thay đổi trong khoảng 50 - 80%, trong giấy là 61%,
trong trấu là 31%, bã mía là 46%, trong sợi bông hàm lƣợng này vƣợt trên 90%
(Bảng 1.5).
Bảng 1.5. Cellulose tinh khiết trong nguyên liệu [5]
Nguyên liệu

% Cellulose tinh khiết

Sợi bông

90 - 99

Cây lanh

70 - 75

Cây gai dầu

75 - 80

Đay

60 - 65

Bông gạo

70 - 75

Gai (cây)

70 - 75

Thân cây ngô, lúa

40 - 50

Rơm lúa mì

48

Rơm lúa nƣớc

43

Cây dứa sợi

40 - 45

Bã mía

42

Tre

40 - 50

Gỗ

40 - 50

Mùn cƣa

38

Vỏ hạt bơng

42

Cỏ

33

21


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Hồng Nhung

Cellulose có cơng thức (C6H10O5)n là polymer mạch thẳng của -D-glucose
với liên kết -(1

4) (gọi là polysaccharide), bao gồm 10.000 - 20.000 gốc

glucose, nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucosid. Kiểu liên kết này đối lập với liên
kết α-1,4-glucosid có trong tinh bột, glycogen và các carbohydrate khác. Cellobiose
là đơn vị cấu trúc lặp lại của cellulose gồm có 2 gốc glucose:

Cellulose
Phân tử cellulose chứa 3 dạng anhydroglucose. Dạng thứ nhất có đầu khử
với nhóm bán acetal tự do (hoặc aldehyde) ở C-1. Dạng thứ hai có đầu khơng khử
với nhóm hydroxyl tự do ở C-4 và dạng thứ 3 có vịng nối giữa C-1 và C-4. Không
giống nhƣ các alcohol đơn giản, phản ứng thủy phân cellulose bị kiểm soát nhiều
hơn bởi yếu tố không gian so với khả năng phản ứng theo tính chất vốn có của các
nhóm hydroxyl trong vịng anhydroglucose.
Các nhóm hydroxyl của gốc glucose ở mạch này tạo liên kết hydro với
nguyên tử oxy của mạch khác giữ cho các mạch ở bên cạnh nhau một cách vững
chắc, hình thành nên các vi sợi (microfibril) với độ bền cao.
Đặc điểm quan trọng và đặc trƣng của cellulose tự nhiên đó là cấu trúc
khơng đồng nhất, gồm hai vùng (Hình 1.4):
- Vùng cellulose có cấu trúc tinh thể có trật tự cao, rất bền vững với các tác
động bên ngoài.

- Vùng vơ định hình có cấu trúc khơng chặt chẽ do đó kém bền vững hơn.
vùng tinh thể

vùng vơ định hình

22

vùng tinh thể


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Hồng Nhung

Hình 1.4. Cấu trúc khơng đồng nhất của phân tử cellulose
Cellulose có cấu trúc tinh thể là cellulose chỉ tạo nên từ monomer glucose.
Cellulose có cấu trúc tinh thể (cellulose microcrystalline) cịn gọi là α cellulose
hoặc “cellulose thực”. Khi cho tác động với dung dịch NaOH 17.5% ở 20°C,
cellulose tinh thể (α cellulose) có đặc trƣng là không tan, phần tan trong dung dịch
này là β cellulose và γ cellulose. β cellulose kết tủa khi cho thêm axit, phần cịn lại
khơng kết tủa với axit là γ cellulose. β cellulose gọi là hemicellulose A (xylan), γ
cellulose gọi là hemicellulose B (arabinoxylan).
Tuy cellulose của bông có trật tự cao nhất nhƣng trong cấu trúc, lƣợng đƣờng
glusose chỉ đạt 90%, còn lại là các đƣờng xylose, arabinose và rất ít rhamnose.
Vùng vơ định hình có thể hấp thụ nƣớc và trƣơng lên, còn vùng tinh thể mạng
lƣới liên kết hydrogen ngăn cản sự trƣơng này.
Trong tự nhiên, các chuỗi glucan của cellulose có cấu trúc dạng sợi. Mỗi đơn
vị sợi nhỏ nhất có đƣờng kính khoảng 3 nm. Các sợi sơ cấp hợp lại thành vi sợi có
đƣờng kính 10 – 40 nm, dài 100-40000 nm và bao gồm đến 40 chuỗi cellulose.
Những vi sợi này hợp thành bó sợi to có thể quan sát dƣới kính hiển vi quang học.

Tồn bộ bó sợi có một lớp vỏ Hemicellulose và lignin rắn chắc bao bọc bên ngoài
làm cho sự xâm nhập của enzyme vào cấu trúc bên trong hết sức khó khăn. Điều
này làm tăng thêm độ bền vững của cellulose nói chung .
Cellulose tinh thể là hợp chất bền vững. Nếu nhƣ đun ở 60-70 0C, tinh bột đã
từ trạng thái tinh thể chuyển sang vơ định hình thì đối với cellulose ở 320 0C mới
xảy ra chuyển trạng thái nhƣ vậy.
Cellulose không tan trong nƣớc, trong nhiều dung môi hữu cơ và các dung
dịch kiềm lỗng. Cellulose có thể bị phân hủy thành glucose khi đun nóng với axit
hoặc kiềm. Liên kết glucosit khơng bền với axít. Dƣới tác dụng của axít, cellulose
tạo thành các sản phẩm thủy phân có độ bền cơ học kém hơn. Cellulose khi bị thủy
phân hoàn toàn sẽ thu đƣợc sản phẩm cuối cùng là đƣờng hòa tan D-glucose.
1.2.2 Hemicellulose [17, 32]

23