Luận án tiến sĩ nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời anthocyanin và anthocyanidin trong rau, củ, quả

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----------------------------------------

Vũ Thị Trang

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỒNG
THỜI ANTHOCYANIN VÀ ANTHOCYANIDIN
TRONG RAU, CỦ, QUẢ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

HÀ NỘI - 2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----------------------------------------

Vũ Thị Trang

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỒNG
THỜI ANTHOCYANIN VÀ ANTHOCYANIDIN
TRONG RAU, CỦ, QUẢ

Chun ngành: Hóa phân tích
Mã số: 9440112.03

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1. PGS.TS LÊ THỊ HỒNG HẢO
2. PGS.TS NGUYỄN XUÂN TRUNG

HÀ NỘI - 2019


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được cơng bố trong bất kỳ cơng
trình nào khác.
Tác giả

Vũ Thị Trang


LỜI CẢM ƠN
Với tình cảm chân thành, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Lê
Thị Hồng Hảo và PGS.TS. Nguyễn Xuân Trung là những người thầy đã tận tâm
hướng dẫn, động viên và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tơi trong suốt q trình thực
hiện đề tài và viết luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn tới các q Thầy, Cơ trong Bộ mơn Hóa Phân
tích, khoa Hóa Học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội
đã tâm huyết truyền dạy và cho tôi những kiến thức quý giá trong q trình học tập
và thực hiện đề tài này.
Tơi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm
An toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia và toàn thể cán bộ trong Khoa Chất lượng, phụ
gia và chất hỗ trợ chế biến thực phẩm đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được học
tập và thực hiện nghiên cứu này.
Lời sau cùng, xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới những người thân
trong gia đình, tới những người bạn, đồng nghiệp, các học viên, sinh viên đã ln

động viên, chia sẻ mọi khó khăn với tôi.
Hà nội, ngày

tháng

năm 20

Tác giả

Vũ Thị Trang


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .......................................................................................... 5
1.1.

Giới thiệu về chất chống oxy hóa ...................................................................... 5

1.2.

Tổng quan về anthocyanin và anthocyanidin ..................................................... 7

1.2.1. Cấu trúc hóa học ....................................................................................................7
1.2.2. Tính chất sinh lý thực vật của anthocyanin ......................................................10

1.2.3. Tính chất hóa học của anthocyanin và anthocyanidin.....................................11
1.2.4. Tác dụng của anthocyanin ..................................................................................13
1.2.5. Sự phân bố của anthocyanin trong thực vật .........................................................15
1.3. Các phương pháp xác định anthocyanin và anthocyanidin.................................... 18
1.3.1. Phương pháp phổ hấp thụ phân tử UV - Vis .......................................................19
1.3.2. Phương pháp điện di mao quản .............................................................................20
1.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng ........................................................................................21
1.4.

Các phương pháp xử lý mẫu phân tích anthocyanin và anthocyanidin ........... 30

1.5.

Phương pháp mặt mục tiêu tìm điều kiện tối ưu trong phân tích ..................... 33

1.5.1. Nguyên tắc ............................................................................................................33
1.5.2. Phương pháp mặt mục tiêu tìm điều kiện tối ưu cho quá trình tách sắc ký
lỏng

................................................................................................................................35

1.5.3. Phương pháp mặt mục tiêu tìm điều kiện tối ưu cho quá trình xử lý mẫu
xác định anthocyanidin .....................................................................................................37
1.6.

Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa .............................................. 38

1.6.1. Phương pháp ứng dụng phản ứng khử gốc tự do DPPH .................................38
1.6.2. Phương pháp ứng dụng phản ứng ức chế gốc tự do NO .................................39

1.6.3. Phương pháp ứng dụng phản ứng khử màu cation gốc tự do ABTS ............39
1.6.4. Phương pháp ứng dụng phản ứng khử phức sắt ...............................................40
1.6.5. Phương pháp ứng dụng khả năng tạo phức FTC .............................................40
1.6.6. Phương pháp ứng dụng việc xác định tổng năng lực khử ..............................40
1.7.

Kết luận chung phần tổng quan ....................................................................... 42

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM .................................................................................... 45
2.1. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất, chất chuẩn .............................................................. 45
2.1.1. Thiết bị và dụng cụ .................................................................................................45
2.1.2. Hóa chất, chất chuẩn ...............................................................................................46
2.3. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu ................................................................. 48
2.3.1. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................................48
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu........................................................................................49
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 66
3.1. Nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện phân tích của hệ HPLC-DAD xác định
đồng thời anthocyanin và anthocyanidin kết hợp sử dụng UPLC-MS/MS để nhận
biết................................................................................................................................. 66
3.1.1. Khảo sát sơ bộ một số điều kiện phân tích HPLC-DAD để xác định đồng
thời anthocyanin và anthocyanidin ..................................................................................66
3.1.2. Tối ưu hóa điều kiện HPLC-DAD xác định đồng thời anthocyanin và
anthocyanidin theo phương pháp mặt mục tiêu (RSM) ................................................70
3.1.3. Tối ưu hóa điều kiện UPLC-MS/MS để nhận biết đồng thời 6 anthocyanin
và 6 anthocyanidin .............................................................................................................81
3.2. Tối ưu hóa điều kiện chiết các anthocyanin và anthocyanidin từ nền mẫu rau, củ,
quả ................................................................................................................................. 87
3.2.1 Khảo sát điều kiện chiết các anthocyanin .............................................................87
3.2.2. Khảo sát điều kiện tối ưu để thủy phân anthocyanin thành anthocyanidin .....90

3.2.3. Tối ưu hóa quy trình chiết anthocyanidin bằng phương pháp mặt mục tiêu
(RSM) ................................................................................................................................93


3.3. Thẩm định phương pháp xác định các anthocyanin và anthocyanidin bằng
HPLC-DAD ................................................................................................................ 103
3.3.1 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn ...................................................................103
3.3.2 Giới hạn phát hiện (MDL) và giới hạn định lượng (MQL) của phương pháp104
3.3.3 Đánh giá độ lặp lại .................................................................................................106
3.3.4 Đánh giá độ đúng ...................................................................................................107
3.4. Phân tích hàm lượng anthocyanin, anthocyanidin trong một số mẫu rau, củ, quả
và bước đầu thử hoạt tính chống oxy hóa của chúng .................................................. 112
3.4.1. Phân tích hàm lượng anthocyanin, anthocyanidin trong một số mẫu rau, củ,
quả

..............................................................................................................................112

3.4.2. Thử hoạt tính chống oxy hóa của anthocyanin, anthocyanidin và một số
mẫu rau, củ, quả ...............................................................................................................118
KẾT LUẬN ................................................................................................................. 124
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 127
PHỤ LỤC ................................................................................................................... 140


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Các anthocyanin xuất hiện trong tự nhiên và vị trí thế trong cấu trúc .......8
Bảng 1.2: Thành phần và hàm lượng anthocyanidin trong một số thực vật .............17
Bảng 1.3: Hàm lượng anthocyanin tổng số có trong một số thực vật tại Việt Nam .18
Bảng 1.4: Điều kiện LC-DAD-MS/MS phân tích các anthocyanin và anthocyanidin
...................................................................................................................................22

Bảng 1.5: Điều kiện HPLC-DAD phân tích các anthocyanin và anthocyanidin ......26
Bảng 1.6: Một số điều kiện chiết anthocyanin ..........................................................31
Bảng 1.7: Một số điều kiện chiết và thủy phân anthocyanin thành anthocyanidin ..33
Bảng 1.8: Hoạt tính chống oxy hóa của anthocyanin ...............................................41
Bảng 2.1: Mức cơ sở và các yếu tố ảnh hưởng của quá trình tách sắc ký ................51
Bảng 2.2: Mức cơ sở các yếu tố ảnh hưởng của quá trình xử lý mẫu.......................56
Bảng 3.1: Chương trình gradient rửa giải các anthocyanin và anthocyanidin ..........69
Bảng 3.2: Mức cơ sở và khoảng biến thiên các yếu tố theo mơ hình bậc hai tâm
xoay tối ưu điều kiện tách HPLC ..............................................................................71
Bảng 3.3: Kết quả thực nghiệm theo mơ hình bậc hai tâm xoay ..............................72
Bảng 3.4: Kết quả phân tích ANOVA của hàm Y1..................................................73
Bảng 3.5: Kết quả phân tích ANOVA hàm Y1 sau khi loại bỏ yếu tố khơng có nghĩa
...................................................................................................................................74
Bảng 3.6: Phương trình hồi quy và độ chính xác của mơ hình .................................75
Bảng 3.7: Các thơng số cài đặt để tìm điều kiện tối ưu ............................................77
Bảng 3.8: So sánh kết quả thực nghiệm và mô hình .................................................78
Bảng 3.9: Giá trị hàm CRF theo ma trận thực nghiệm .............................................79
Bảng 3.10: Kết quả phân tích ANOVA của hàm CRF .............................................80
Bảng 3.11: Chương trình gradient tách đồng thời anthocyanin và anthocyanidin ...81
Bảng 3.12: Các thông số tối ưu hóa điều kiện phân mảnh .......................................82
Bảng 3.13: Chương trình rửa giải gradient tách anthocyanin và anthocyandin bằng
UPLC-MS/MS ..........................................................................................................84


Bảng 3.14: Chương trình gradient rửa giải các anthocyanin và anthocyanidin bằng
UPLC-MS/MS ..........................................................................................................87
Bảng 3.15: Ảnh hưởng của dung môi chiết đến hàm lượng anthocyanin thu được .87
Bảng 3.16: Mức cơ sở và khoảng biến thiên các yếu tố theo mô hình bậc hai tâm
xoay tối ưu hóa q trình chiết anthocyanidin ..........................................................95
Bảng 3.17: Tổng hàm lượng anthocyanidin theo mơ hình bậc hai tâm xoay ...........96

Bảng 3.18: Kết quả phân tích ANOVA của hàm Y ..................................................97
Bảng 3.19: Kết quả phân tích ANOVA của hàm Y sau khi loại bỏ yếu tố khơng có
nghĩa..........................................................................................................................98
Bảng 3.20: Các thơng số cài đặt để tìm điều kiện tối ưu ........................................100
Bảng 3.21: Hàm lượng anthocyanidin trong đỗ đen tại điều kiện tối ưu ................102
Bảng 3.22: Phương trình hồi quy của các anthocyanin và anthocyanidin ..............104
Bảng 3.23: MDL, MQL của các anthocyanin và anthocyanidin ............................105
Bảng 3.24: Độ lặp lại của các anthocyanin .............................................................106
Bảng 3.25: Hiệu suất thủy phân anthocyanin .........................................................108
Bảng 3.26: Hiệu suất chiết anthocyanidin…………………………………......... 108
Bảng 3.27: Hàm lượng anthocyanidin trong một số mẫu rau, củ, quả ...................113
Bảng 3.28: Hoạt tính chống oxy hóa của một số anthocyanin và anthocyanidin ...120
Bảng 3.29: Hàm lượng anthocyanidin và hoạt tính chống oxy hóa trong một số mẫu
thực phẩm................................................................................................................122


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Sơ đồ cấu trúc của các phenol trong tự nhiên ................................................. 6
Hình 1.2: Cấu trúc chung của một anthocyanin diglucosid được acyl hóa .................... 7
Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của 6 anthocyanidin phổ biến ........................................... 10
Hình 1.4: Sự thay đổi cấu trúc hóa học của cyanidin theo pH...................................... 12
Hình 3.1: Phổ hấp thụ phân tử của 6 anthocyanidin và 6 anthocyanin ......................... 66
Hình 3.2: Sắc ký đồ rửa giải các anthocyanin trong 15 phút tại FA 0,1% ................... 68
Hình 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ FA đến tổng diện tích pic và thời gian lưu của
Del-3G........................................................................................................................... 69
Hình 3.4: Sắc ký đồ phân tích các anthocyanin và anthocyanidin tại FA 10% ............ 70
Hình 3.5: Đồ thị mặt mục tiêu (độ phân giải) theo các yếu tố ảnh hưởng .................... 76
Hình 3.6: Sắc ký đồ 12 chất phân tích tại điều kiện tối ưu ........................................... 78
Hình 3.7: Sắc ký đồ UPLC-MS/MS của 6 anthocyanin và 6 anthocyanidin. ............... 84
Hình 3.8: Ảnh hưởng của tốc độ dịng tới diện tích pic của các anthocyanidin ........... 85

Hình 3.9: Ảnh hưởng của nồng độ acid formic tới diện tích pic các anthocyanidin .... 86
Hình 3.10: Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng anthocyanin thu được ....... 88
Hình 3.11: Ảnh hưởng của khối lượng mẫu đến hàm lượng anthocyanin thu được .... 89
Hình 3.12: Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng anthocyanin ....................... 89
Hình 3.13: Sắc ký đồ phân tích anthocyanin trong mẫu vỏ đỗ đen .............................. 90
Hình 3.14: Ảnh hưởng của nồng độ HCl đến hàm lượng anthocyanidin thu được ...... 91
Hình 3.15: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng anthocyanidin thu được .............. 91
Hình 3.16: Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hàm lượng anthocyanidin ........... 92
Hình 3.17: Sắc ký đồ anthocyanidin trong vỏ đỗ đen ................................................... 93
Hình 3.18: Ảnh hưởng khối lượng cân đến hàm lượng anthocyanidin ........................ 94
Hình 3.19: Sắc ký đồ mẫu đỗ đen tại điều kiện (nhiệt độ 100oC, HCl 1M và thời
gian thủy phân 60 phút) ................................................................................................ 95
Hình 3.20: Đồ thị mặt mục tiêu hàm lượng anthocyanidin theo nhiệt độ và nồng độ
acid ................................................................................................................................ 99
Hình 3.21: Tương quan giữa thực nghiệm và mơ hình của hàm lượng anthocyanidin100


Hình 3.22: Sắc đồ thủy phân mẫu chuẩn tại điều kiện tối ưu trên UPLC-MS/MS ..... 111
Hình 3.23: Sắc ký đồ các anthocyanin và anthocyanidin tại MDL, MQL.................. 105
Hình 3.24: Sắc ký đồ phân tích anthocyanidin trong mẫu vỏ nho .............................. 117
Hình 3.25: Sắc ký đồ phân tích anthocyanin trong mẫu vỏ nho ................................ 117
Hình 3.26: Sắc ký đồ phân tích anthocyanidin mẫu cà tím ........................................ 118
Hình 3.27: Cơ chế phản ứng khử gốc tự do ................................................................ 121


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt

Tên tiếng Anh

Tên tiếng Việt

ABTS

2,2’-azinobis (3
ethylbenzothiazoline-6-sulfonate

2,2’-azinobis (3 etyl benzo
thiazolin-6-sulfonat

ACN

Acetonitrile

Acetonitril

ANOVA

Analysis of variance

Phân tích phương sai

AOAC

Association of Official Analytical
Communites

Hiệp hội các cộng đồng phân
tích chính thức

APCI

Atmospheric pressure chemical
ionization

Ion hóa hóa học áp suất khí
quyển

CE

Cappillary electrophoresis

Phương pháp điện di mao
quản

APCI

Atmospheric pressure chemical
ionization

Ion hóa hóa học áp suất khí
quyển

CRF

Chromatographic response
function

Hàm sắc ký chung

CV

Coefficient of variation

Hệ số biến thiên

Cya

Cyanidin

Cyanidin

Cya-3G

Cyanidin-3-O-glucoside

Cyanidin-3-O-glucosid

CZE

Cappillary zone electrophoresis

Điện di mao quản vùng

DAD

Diode array detector

Detector chuỗi diod

Del

Delphinidin

Delphinidin

Del-3G

Delphinidin-3-O-glucoside

Delphinidin-3-O-glucosid

DPPH

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

ESI

Electrospray Ionization

Ion hóa phun điện tích

EtOH

Ethanol

Etanol


FA

Formic acid

Acid formic

FRAP

Ferric reducing ability of plasma

Khả năng khử sắt của huyết
tương

FTC

Ferric thiocyanate

Sắt thiocyanat

HPLC

High performance liquid
chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IC50

Ihibitory concentration

Nồng độ ức chế

LC-MS/MS

Liquid chromatography tandem
mass spectrometry

Sắc ký lỏng ghép nối hai lần
khối phổ.

Mal

Malvidin

Malvidin

Mal-3G

Malvidin-3-O-glucoside

Malvidin-3-O-glucosid

MDL

Method Detection Limit

Giới hạn phát hiện của
phương pháp

MQL

Method Quantification Limit

Giới hạn định lượng của
phương pháp

MeOH

Methanol

Metanol

MSD

Mass selective detector

Detector chọn lọc khối

PDA

Photo diode array

Chuỗi quang diod

Pelar

Pelargorindin

Pelargorindin

Pelar-3G

Pelargorindin-3-O-glucoside

Pelargorindin-3-O-glucosid

Peo

Peonidin

Peonidin

Peo-3G

Peonidin-3-O-glucoside

Peonidin-3-O-glucosid

Petu

Petunidin

Petunidin

Petu-3G

Petunidin-3-O-glucoside

Petunidin-3-O-glucosid

ppm

Parts per million

Phần triệu

RSD

Relative standard deviation

Độ lệch chuẩn tương đối


RSM

Response Surface Methodology

Phương pháp mặt mục tiêu

SD

Standard Deviation

Độ lệch chuẩn

TCVN

Tiêu chuẩn Việt nam

TEA

Triethylamine

Tri etyl amin

TFA

Trifluoroaxetic acid

Acid Trifloacetic

TLTK

Tài liệu tham khảo

TPTZ

2,4,6tripyridyl-s-triazine

[2,4,6tripyridyl-s-triazin

tR

Retention time

Thời gian lưu

uHPLC

Ultra High Performance Liquid
Chromatography

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng
cao

UPLC

Ultra Performance Liquid
Chromatography

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

USDA

United States Department of
Agriculture

Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ

UV – Vis

Ultraviolet visible

Tử ngoại khả kiến

Ghi chú: tên hóa chất viết theo nguyên gốc tiếng Anh


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết, mục tiêu và nội dung của luận án
“Stress oxy hóa” là hiện tượng xuất hiện trong cơ thể sinh vật khi có sự mất

cân bằng giữa việc sản xuất các gốc tự do và hoạt động của các chất chống oxy hóa
[20]. Hiện tượng này là nguyên nhân của rất nhiều bệnh nguy hiểm, trong đó có ung
thư, các bệnh tim mạch, các bệnh suy giảm hệ thần kinh (Alzheimer, Parkinson) và
lão hóa sớm [52]. Các nhà khoa học và toàn xã hội đều đang quan tâm đến tác hại
của gốc tự do, xu hướng tìm kiếm của các chất chống oxy hố góp phần trong q
trình giảm stress oxy hóa đang được tập trung nghiên cứu [3].
Các hợp chất polyphenol có mặt khắp nơi trong tự nhiên và thường được tìm
thấy trong các cấu trúc phức tạp [35]. Anthocyanin là một trong số rất nhiều các
hợp chất thuộc nhóm polyphenol flavonoid và nổi bật với vai trò tạo ra màu sắc đỏ
tươi, xanh lam và tím của thực vật [14]. Một vai trị quan trọng được phát hiện gần
đây của các hợp chất anthocyanin là khả năng chống oxy hóa của chúng [85]. Các
thử nghiệm invivo, invitro cho thấy tác dụng tích cực của anthocyanin trong việc
phòng chống ung thư, các bệnh tim mạch và béo phì [22]. Mức tiêu thụ hàng ngày
của anthocyanin tại Mỹ trung bình là 12,5mg/người/ngày [74], trong khi ở Châu Âu
là 20 mg/người/ngày [14, 80] và cao hơn tại một số nước như Phần Lan là 82
mg/người/ngày [74, 112]. Hàm lượng anthocyanin được sử dụng như một chỉ số
đánh giá chất lượng của một số sản phẩm [110]. Các lý do trên đã thúc đẩy sự phát
triển của các kỹ thuật phân tích để nhận biết và định lượng anthocyanin trong các
sản phẩm tự nhiên, cũng như nghiên cứu tác dụng của chúng đối với cơ thể.
Anthocyanin được tìm thấy trong tự nhiên ở dạng aglycon (anthocyanidin)
liên kết với gốc đường (glycosid) [58]. Các nhà khoa học dự đoán có khoảng hơn
1000 loại anthocyanin nhưng hiện nay mới có khoảng 600 anthocyanin được phát
hiện và nhận danh cấu trúc [28]. Mặc dù số lượng anthocyanin lớn nhưng chúng
được tạo thành bởi 23 loại anthocyanidin tự nhiên, trong đó sáu loại anthocyanidin
phổ biến nhất bao gồm: cyanidin, delphinidin, pelargonidin, peonidin, petunidin và
malvidin [28]. Các aglycon và các glycosid có hoạt tính sinh học khác nhau, do đó,

1

biết được thành phần anthocyanin của thực vật sẽ cung cấp thơng tin về độ bền, hoạt
tính sinh học và lợi ích của chúng đối với sức khỏe con người [88]. Mỗi lồi thực
vật vẫn đang ẩn chứa các thơng tin về những cấu trúc độc đáo của các anthocyanin
và chúng vẫn tiếp tục được nghiên cứu, khám phá. Sự đa dạng và phức tạp trong
cấu trúc của các anthocyanin là thách thức lớn trong việc nhận biết và định lượng
chúng. Để có được thơng tin chính xác, cần thiết phải có sự kết hợp của các kỹ thuật
phân tích khác nhau. Sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector mảng diod (DAD)
đang là công cụ được sử dụng phổ biến để xác định các anthocyanin và
anthocyanidin. Bên cạnh đó, sự nhận biết các anthocyanin mới hoặc để khẳng định
loại anthocyanin, kỹ thuật cao hơn như: detector khối phổ (MS) được sử dụng với
chế độ ion hóa phun điện tử (ESI), chế độ bẫy ion (IT) hay sử dụng khả năng phân
giải cao của khối phổ thời gian bay (TOF). Tại Việt nam hiện nay, các quy trình
phân tích đã công bố và áp dụng chủ yếu sử dụng phương pháp pH vi phân kết hợp
với quang phổ UV-Vis chỉ xác định được lượng tổng anthocyanin quy theo
cyanidin-3-glucosid [2, 5, 8].
Do sự hạn chế về nguồn chất chuẩn và để đơn giản hóa q trình định lượng,
các anthocyanin thường được thủy phân, cắt mạch để chuyển về 6 dạng
anthocyanidin chính. Tuy nhiên, các điều kiện thủy phân đã được công bố rất khác
nhau và đã có một số tác giả chỉ ra sự thủy phân khơng hồn tồn dẫn đến sự tồn tại
cả dạng anthocyanin và anthocyanidin trong dung dịch mẫu [70, 87]. Điều đó gây
sai số lớn cho việc định lượng chất phân tích. Để có cơ sở dữ liệu đầy đủ về thành
phần và hàm lượng các anthocyanin hay anthocyanidin trong thực vật, cần thiết phải
nghiên cứu xây dựng phương pháp chiết, tách và xác định chất chống oxy hóa nhóm
anthocyanin, làm cơ sở để lựa chọn nguồn ngun liệu có hàm lượng và hoạt tính
sinh học cao.
Xuất phát từ những vấn đề nêu trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời anthocyanin và anthocyanidin
trong rau, củ, quả” với ba mục tiêu:

2

1. Nghiên cứu phát triển phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với
detector DAD (HPLC-DAD) để xác định đồng thời các anthocyanin và
anthocyanidin.
2. Nghiên cứu xây dựng quy trình xử lý mẫu để tách, chiết các anthocyanin
và anthocyanidin trong rau, củ, quả.
3. Áp dụng phương pháp để nhận biết, định lượng và bước đầu thử hoạt tính
chống oxy hóa của anthocyanin và anthocyanidin trong một số loại rau,
củ, quả.
Với các mục tiêu trên, nội dung của luận án bao gồm:
-

Nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện phân tích HPLC-DAD xác định đồng thời
anthocyanin và anthocyanidin kết hợp sử dụng UPLC-MS/MS để nhận biết
chúng.

-

Nghiên cứu sử dụng phương pháp quy hoạch hóa thực nghiệm bậc 2 để tìm điều
kiện tối ưu cho quá trình tách sắc ký và xử lý mẫu.

-

Thẩm định phương pháp xác định đồng thời sáu anthocyanin và sáu
anthocyanidin bằng HPLC-DAD.

-

Áp dụng phương pháp nhận biết, định lượng và bước đầu thử hoạt tính chống

oxy hóa của anthocyanin và anthocyanidin trong một số mẫu rau, củ, quả.
2. Những đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn của luận án
• Về mặt khoa học

-

Đề tài đã sử dụng phương pháp quy hoạch hóa thực nghiệm bậc hai để tìm điều
kiện tối ưu cho quá trình tách sắc ký lỏng xác định đồng thời sáu anthocyanin và
sáu anthocyanidin. Kết quả tách các anthocyanin và anthocyanidin tối ưu hơn so
với các cơng trình đã cơng bố sử dụng phương pháp đơn biến. Việc xác định
đồng thời cả anthocyanin và anthocyanidin cho phép nhận biết và định lượng cả
hai dạng trong cùng một lần phân tích, giúp đánh giá hiệu suất quá trình thủy
phân, đảm bảo kết quả định lượng chính xác chất phân tích.

-

Q trình tách, chiết các anthocyanidin trong nền mẫu rau, củ, quả được tối ưu
hóa sử dụng phương pháp quy hoạch hóa thực nghiệm bậc hai. Kết quả nghiên

3


cứu cho biết điều kiện tối ưu của quá trình xử lý mẫu khi đánh giá được ảnh
hưởng đồng thời và tương hỗ của các yếu tố.
• Về mặt thực tiễn
-

Các thông số tối ưu của HPLC-DAD tách và xác định đồng thời anthocyanin và
anthocyanidin được ứng dụng trong các phịng thí nghiệm để đánh giá hiệu suất
q trình chiết và thủy phân cho mỗi nền mẫu cụ thể, đặc biệt khi nguồn chất

chuẩn anthocyanin khơng sẵn có.

-

Kết quả phân tích 31 nền mẫu rau, củ, quả đã nhận biết và định lượng được
thành phần anthocyanidin, đồng thời sơ bộ thử nghiệm hoạt tính của một số mẫu
thực phẩm là cơ sở để lựa chọn nguồn nguyên liệu có hàm lượng và hoạt tính
sinh học cao.

-

Thơng tin về phổ khối hai lần của các anthocyanin và anthocyanidin góp phần
cung cấp thêm dữ liệu cho thư viện phổ để áp dụng cho những nghiên cứu tiếp
theo.

4


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.

Giới thiệu về chất chống oxy hóa
Chất chống oxy hóa là các hợp chất có khả năng làm chậm lại, ngăn cản hoặc

đảo ngược quá trình oxy hóa các hợp chất có trong tế bào của cơ thể [54].
Dựa trên nguyên tắc hoạt động, các chất chống oxy hóa được phân thành hai
loại: chất chống oxy hóa bậc 1 và chất chống oxy hóa bậc 2. Các chất chống oxy
hóa bậc 1 khử hoặc kết hợp với các gốc tự do, do đó kìm hãm pha khởi phát hoặc bẻ
gãy dây chuyền phản ứng của quá trình oxy hóa. Các chất chống oxy hóa bậc 2 kìm
hãm sự tạo thành các gốc tự do (hấp thụ các tia cực tím; tạo phức với các kim loại

kích hoạt sự tạo gốc tự do như Cu, Fe, vô hoạt oxy đơn) [94].
Cơ chế hoạt động của các chất chống oxy hóa tự nhiên [3]:
• Khử và vơ hoạt hóa các gốc tự do nhờ thế oxy hóa khử thấp
• Tạo phức với các ion kim loại
• Kìm hãm hoạt động của các enzym có khả năng tạo các gốc tự do như
Xanthine oxydase
Cơ thể con người có thể tự sản xuất các chất chống oxy hóa. Tuy nhiên khi
tuổi tác càng cao, stress nhiều hoặc trong điều kiện môi trường ô nhiễm, thức ăn
chứa nhiều độc tố, chế độ ăn khơng đủ chất dinh dưỡng, khống chất, vitamin ...
làm các gốc tự do xuất hiện quá nhiều và cơ thể khơng sản xuất đủ các chất chống
oxy hóa để đáp ứng. Để hạn chế vấn đề này, con người cần bổ sung các chất chống
oxy hóa từ bên ngồi thông qua thực phẩm hoặc thực phẩm chức năng.
Các chất trong tự nhiên có khả năng chống oxy hóa được biết đến nhiều nhất
là vitamin C, vitamin E, các chất nhóm carotenoids như: b-caroten, lycopene,
lutein…có mặt trong nhiều loại trái cây và rau xanh. Các chất chống oxy hoá khác
như: Selen - một khoáng chất cực kỳ cần thiết trong sinh tổng hợp men glutathion
peroxidase, coenzym Q10 và a-lipoic acid cũng là những chất chống oxy hóa nguồn
gốc thực phẩm. Một nhóm dưỡng chất chống oxy hóa được biết đến rộng rãi là các
flavonoid, cũng có thể được tìm thấy trong các loại rau và hoa quả [60, 77].

5


Flavonoid là một nhóm của các hợp chất phenol lớn nhất trong tự nhiên, là
sắc tố sinh học, sắc tố thực vật quan trọng tạo ra màu sắc của hoa, cụ thể giúp sản
xuất sắc tố vàng, đỏ, xanh cho cánh hoa để thu hút nhiều động vật đến thụ phấn. Có
khoảng 2% carbon được sản xuất từ thực vật chuyển hóa thành flavonoid [72]. Hơn
9000 flavonoid tự nhiên được đặc trưng bởi nhiều loại thực vật khác nhau, được
phân loại theo cấu trúc hóa học và thường được chia thành các phân nhóm phụ
thuộc vào mức độ oxy hóa của vòng pyran như: flavanones, flavones, flavonols,

anthocyanins [109].
Phenol
Phenol đơn giản
Acid
phenolic

Polyphenol

Coumarin

Flavonoid

Tanin
Tanin thủy phân

Flavanon

Anthocyanin

Flavon

Proanthocyanidin

Flavonol

Hình 1.1: Sơ đồ cấu trúc của các phenol trong tự nhiên
Sự đề cấu trúc của các phenol trong các sản phẩm tự nhiên dẫn đến các dạng
phenol đơn giản (bao gồm acid phenolic, coumarin) và các polyphenol (tập hợp của
hai nhóm lớn flavonoid và tannin) (hình 1.1). Anthocyanin là chất chuyển hóa thứ
cấp của polyphenol được tổng hợp trong hầu hết các thực vật bậc cao và đóng góp

một phần để tạo nên màu tím, xanh, đỏ trong lá, hoa và quả. Nhóm anthocyanin
được đặc biệt quan tâm trong những năm gần đây do chúng là các hợp chất tự nhiên
có nhiều hoạt tính sinh học q, đang được tập trung nghiên cứu và khai thác vào
nhiều mục đích khác nhau.

6


1.2.

Tổng quan về anthocyanin và anthocyanidin

1.2.1. Cấu trúc hóa học
Anthocyanin là những glycosid do gốc đường glucose, galactose, rutinose...
kết hợp với gốc aglycon có màu. Các anthocyanin khi tách hết nhóm đường được
gọi là anthocyanidin hay aglycon.

B
A

C

Hình 1.2: Cấu trúc chung của một anthocyanin
Cấu trúc lõi của anthocyanin là khung C6-C3-C6 bao gồm một vòng
benzopyran liên kết với một vòng thơm tại vị trí 2 của vịng pyran và được gọi là
cation flavylium. Thơng thường, các vịng được dán nhãn A, B, C với vòng A là
vòng benzoyl, vòng B là vịng thơm (phenol) đính kèm và vịng C là vịng pyran ở
vị trí trung tâm. Anthocyanin khác với các họ cịn lại trong nhóm flavonoid bởi điện
tích dương của oxy trong vịng pyran (hình 1.2). Vịng A-C có thể bị glycosyl hóa
tự nhiên bởi các loại đường tại các vị trí 3, 5, 7 trong đó chủ yếu là vị trí 3 hoặc 5, vị

trí 7 rất ít. Trong một số trường hợp hiếm, sự glycosyl hóa có thể xảy ra tại vị trí 3’,
4’ và 5’ trên vịng B. Các loại đường được gắn tự nhiên có thể bao gồm: glucose,
rhamnose, xylose, galactose, arabinose và fructose dưới dạng mono -, di - hoặc tri glycosid [56]. Dạng liên kết với gốc đường phổ biến nhất là 3 - monoside, 3 bioside, 3,5 - diglucosid và 3,7 - diglucosid. Dẫn xuất 3 - glucosid thường lớn hơn
2,5 lần dạng diglucosid, trong đó phổ biến nhất là cyanin - 3 - glucosid [28]. Nhiều
anthocyanin được acyl hóa bởi các acid thơm hoặc các acid aliphatic, các nhóm acyl
thường thấy nhất là: coumaric, cafeic, ferulic, p-hydroxy benzoic, synapic, malonic,

7


acetic, succinic, oxalic va malic [108]. Sự đa dạng về cấu trúc này đã tạo ra một số
lượng lớn các anthocyanin mà đến nay mới ghi nhận được khoảng 600 loại [112].
Các cation flavylium aglycone được gọi là anthocyanidin. Đến nay, có 23
anthocyanidin đã được tìm thấy (bảng 1.1), trong đó có 6 anthocyanidin phổ biến
nhất là: cyanidin, delphinidin, pelargonidin, peonidin, malvidin và petunidin [28].
Sự khác nhau của 6 loại cấu trúc phổ biến này là do sự thay đổi của nhóm hydroxyl
và methoxyl tại vị trí 3’ và 5’ trong vòng B.
Bảng 1.1: Các anthocyanin xuất hiện trong tự nhiên và vị trí thế trong cấu trúc
Anthocyanidin
Loại phổ biến

Vị trí thế
3

5

6

7

3’

4’

5’

Pelargonidin

OH

OH

H

OH

H

OH

H

Cyanidin

OH

OH

H

OH

OH

OH

H

Peonidin

OH

OH

H

OH

OMe

OH

H

Delphinidin

OH

OH

H

OH

OH

OH

OH

Malvidin

OH

OH

H

OH

OMe

OH

OMe

Petunidin

OH

OH

H

OH

OMe

OH

OH

Apigeninidin

H

OH

H

OH

H

OH

H

Luteolinidin

H

OH

H

OH

OH

OH

H

Tricetinidin

H

OH

H

OH

OH

OH

OH

Riccionidin A

H

H

OH

OH

H

OH

H

Auratinidin

OH

OH

OH

OH

H

OH

H

6-hydroxycyanidin

OH

OH

OH

OH

OH

OH

H

3-deoxyanthocyanidin

Các loại khác

8


Anthocyanidin

Vị trí thế

6-hydroxydelphinidin

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

Hirsutidin

OH

OH

H

OMe

OMe

OH

OMe

Rosinidin

OH

OH

H

OMe

OMe

OH

H

Europinidin

OH

OMe

H

OH

OMe

OH

OH

Capensinidin

OH

OMe

H

OH

OMe

OH

OMe

5-methylcyanidin

OH

OMe

H

OH

OH

H

Pulchellidin

OH

OMe

H

OH

OH

OH

Arrabidin

H

H

OH

OH

H

OH

OMe

Carajurin

H

H

OH

OH

H

OMe

OMe

3’-hydroxyarrabidin

H

H

OH

OH

OH

OH

OMe

6-hydroxypelargonidin

OH

OH

OH

OH

H

OH

H

Các anthocyanidin tồn tại dưới dạng cation flavylium với cấu trúc của 6 loại
phổ biến được mô tả như trong hình 1.3.

9


Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của sáu anthocyanidin phổ biến
1.2.2. Tính chất sinh lý thực vật của anthocyanin
Anthocyanin có mặt trong hầu hết các thực vật bậc cao. Chúng rất hiếm

trong nấm, tảo nhưng dạng 3-deoxyanthocyanidin đã được ghi nhận trong các nhóm
rêu [96]. Anthocyanin được tìm thấy trong các tế bào biểu bì và dưới da trong rễ,
thân, cánh hoa, quả và lá [51, 93]. Anthocyanin có nhiều chức năng trong sinh lý

10


thực vật. Các chức năng này được phân làm hai loại: tương tác thực vật-động
vật/côn trùng và tương tác đáp ứng.
Sự khác biệt hóa học giữa các aglycon cùng với các yếu tố biến đổi màu sắc
khác làm cơ sở cho sự thay đổi màu sắc trong hoa và quả. Màu sắc tươi sáng thu hút
côn trùng thụ phấn hoặc phân tán hạt [35]. Một số quan điểm cho rằng lá thay đổi
màu sắc trong mùa thu vì sự giảm hàm lượng diệp lục làm lộ ra các sắc tố
anthocyanin. Thay vào đó, điều này có liên quan đến sự sản xuất anthocyanin và nó
có thể là dấu hiệu cảnh báo cho các loại côn trùng và động vật ăn cỏ về sự độc hại
hoặc ít dinh dưỡng [62].
Anthocyanin đóng vai trị chính trong sự đáp ứng tương tác của thực vật đối
với các vấn đề có hại, như: bức xạ UV, sự tấn công của côn trùng, vi khuẩn và nâm.
Cấu trúc polyphenol của anthocyanin hấp thụ tia UV, đặc biệt là các dạng acyl hóa
làm giảm q trình quang hóa và sự phá hủy ADN [57]. Hơn nữa, anthocyanin ở vị
trí cuối trong dãy chuyển hóa sinh tổng hợp flavonoid nên hợp chất này có hoạt tính
sinh học mạnh [62]. Trong một số nghiên cứu, sự tấn công của côn trùng vào lá làm
tăng sự sản xuất anthocyanin [32, 50]. Người ta cũng ghi nhận sự ức chế nấm của 3deoxyanthocyanidin [76].
1.2.3. Tính chất hóa học của anthocyanin và anthocyanidin
Anthocyanin tan tốt trong dung môi phân cực. Anthocyanin hịa tan tốt trong
H2O, C2H5OH, CH3OH, …, trong đó khả năng tan trong CH3OH - HCl và C2H5OH
- HCl là tương đương nhau và cao nhất [8].
Màu sắc của các anthocyanidin thay đổi phụ thuộc vào cấu trúc, nhiệt độ, pH,
môi trường và một số yếu tố khác. Những sắc tố này kém bền và dễ bị ảnh hưởng
bởi một số yếu tố như: loại nhóm thế trong cấu trúc hóa học anthocyanin, pH, nhiệt

độ bảo quản, ánh sáng, sự có mặt của oxy… [27]
Về ảnh hưởng của cấu trúc, khi tăng số lượng nhóm OH trong vịng benzen
thì màu càng xanh đậm [2]. Mức độ methyl hóa các nhóm OH ở vịng benzen càng
cao thì màu càng đỏ. Nếu nhóm OH ở vị trí thứ ba kết hợp với các gốc đường thì

11