Sự thay đổi số lượng vi khuẩn lactic trong quá trình lên men tự nhiên hạt ca cao và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic thích hợp cho quá trình lên men ca cao

Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản

Số 2/2013

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC

SỰ THAY ĐỔI SỐ LƯỢNG VI KHUẨN LACTIC TRONG QUÁ TRÌNH
LÊN MEN TỰ NHIÊN HẠT CA CAO VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG
VI KHUẨN LACTIC THÍCH HỢP CHO Q TRÌNH LÊN MEN CA CAO
CHANGES IN THE NUMBER OF LACTIC BACTERIA IN NATURAL FERMENTATION
OF COCOA AND SELECTION OF LACTIC BACTERIAL STRAIN SUITABLE
FOR COCOA FERMENTATION
Võ Thị Mỹ Lộc1, Mai Thị Tuyết Nga2, Nguyễn Minh Trí
Ngày nhận bài: 13/11/2012; Ngày phản biện thông qua: 11/3/2013; Ngày duyệt đăng: 15/5/2013

TÓM TẮT
Nghiên cứu theo dõi sự thay đổi số lượng vi khuẩn lactic trong quá trình lên men tự nhiên các hạt ca cao và chất
lượng ca cao thành phẩm của 12 mẫu ca cao lên men. Kết quả cho thấy mẫu có chất lượng tốt nhất sau lên men (xác định
bằng phương pháp cắt hạt) cũng là mẫu có số lượng vi khuẩn lactic cao nhất. Điều này cho thấy vai trò của vi khuẩn lactic
trong lên men tác động đến chất lượng sản phẩm ca cao sau lên men. Ở mẫu đạt chất lượng cao nhất, vi khuẩn lactic có
mặt sau 48 h lên men và tồn tại trong suốt q trình này, nhóm vi khuẩn lactic chiếm chủ yếu thuộc lồi Lactobacillus
fermentum.
Từ khóa: vi khuẩn lactic, ca cao, lên men tự nhiên

ABSTRACT
Changes in the number of lactic bacteria during natural box fermentation of cocoa were studied. The results showed
that among the 12 observed samples, the one with the best quality, determined by cut test, had the highest number of
lactic bacteria. This indicated the role of lactic bacteria during cocoa fermentation to the fermented product quality. In
the best sample, lactic acid bacteria presented after 48 h of fermentation and the predominating strain was Lactobacillus
fermentum.
Key words: lactic bacteria, cocoa, natural fermentation

I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Lên men ca cao là công đoạn đầu tiên trong chế
biến chocolate. Ở giai đoạn này, màu sắc, hương vị
và những hợp chất tiền sinh hương phát triển [8].
Quá trình lên men hạt ca cao tự nhiên chịu tác động
rất lớn của vi sinh vật nói chung trong đó có vi khuẩn
lactic. Vi khuẩn lactic chuyển hóa glucose, fructose
và citrate thành acid lactic, thúc đẩy những biến đổi
sinh hóa góp phần tăng hương vị chocolate [8]. Số
lượng vi khuẩn lactic cao, cùng với sự có mặt của
các nhóm vi sinh khác sẽ góp phần nâng cao chất
lượng ca cao sau lên men.

1
2

Do đó việc nghiên cứu sự thay đổi số lượng
vi khuẩn lactic trong quá trình lên men hạt ca cao
tự nhiên và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic cho
quá trình lên men hạt ca cao là việc làm cần thiết.
Kết quả của nghiên cứu này sẽ làm tiền đề cho
các nghiên cứu sau về vai trò của vi khuẩn lactic
đến chất lượng hạt ca cao sau lên men, đồng thời
nó cũng là bước khởi đầu phục vụ cho quá trình
nghiên cứu chuyên sâu về lĩnh vực này từ đó góp
phần ổn định và nâng cao chất lượng ca cao sau
lên men.

Võ Thị Mỹ Lộc: Lớp Cao học Công nghệ Sau thu hoạch 2010 - Trường Đại học Nha Trang

TS. Mai Thị Tuyết Nga, 3 TS. Nguyễn Minh Trí: Khoa Cơng nghệ thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang

118 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG


Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản

Số 2/2013

II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Vật liệu nghiên cứu
Quả ca cao được lên men là giống TD2 - quả có màu vàng sậm hoặc đỏ được thu mua ở tỉnh Đăk-Lăk.
Quả được lên men sau khi thu hoạch không quá 7 ngày.
2. Phương pháp nghiên cứu
2.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát:
Hạt ca cao
Lấy mẫu định kỳ
mỗi 24 giờ

Lên men

Đếm và phân lập
vi khuẩn lactic

Làm khô tự nhiên

Giữ chủng

Đánh giá chất lượng
Hình 1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

Ca cao lên men được lấy mẫu phân tích vi sinh sau mỗi ngày lên men (24 h) cho đến khi kết thúc quá trình
lên men. Tiến hành giữ chủng vi khuẩn lactic từ các mẻ lên men ca cao có chất lượng tốt.
2.2. Lên men ca cao
Đập quả, tách hạt, lên men tự nhiên trong thùng xốp, mỗi mẻ 3,5kg hạt tươi, thời gian lên men 6 ngày, đảo
trộn được thực hiện 2 lần trong quá trình lên men sau 48 h và 96 h lên men.
2.3. Đánh giá chất lượng hạt ca cao
Kiểm tra chất lượng hạt sau lên men theo phương pháp cắt hạt. Việc kiểm tra chất lượng hạt liên quan
đến q trình lên men có thể được thực hiện bằng cách kiểm tra phân loại như sau: màu nâu hoàn toàn (lên
men hoàn toàn), màu nâu một phần, màu tím một phần (lên men một phần), tím (dưới mức lên men), chai xám
(khơng lên men), bị hư hỏng, bị mốc, hoặc nảy mầm [5].
2.4. Tiến hành đếm và phân lập vi khuẩn lactic từ ca cao lên men
Chọn ngẫu nhiên 25 g hạt ca cao đang ủ lên men, pha loãng trong 225 ml dung dịch muối sinh lý vô trùng,
cấy bề mặt trên đĩa thạch MRS [3], nuôi cấy ở nhiệt độ thường từ 3 - 5 ngày. Chọn ngẫu nhiên 10 khuẩn lạc
trên môi trường MRS, định danh sơ bộ xác định tỷ lệ vi khuẩn lactic B%. Mật độ M của vi khuẩn lactic (CFU / g)
được tính theo cơng thức sau [1].
M (CFU / g) = (Ai x Di / V) x B
Trong đó:
Ai : là số khuẩn lạc trung bình / đĩa ở độ pha loãng Di
Di : là độ pha lỗng cấy kiểm tra
V : là thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa (ml).
2.5. Định danh sơ bộ vi khuẩn lactic:
Vi khuẩn phát triển trên môi trường MRS đặc trưng hình thành khuẩn lạc, Gram dương, catalase âm tính.
2.6. Định danh chủng vi khuẩn bằng phương pháp giải trình tự gen
Sử dụng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH.
2.7 Xử lý số liệu và vẽ đồ thị
Xử lý số liệu và vẽ đồ thị bằng phần mềm Microsoft Excel 2007. Kết quả giữa các mẫu được so sánh bằng
phân tích ANOVA, phép kiểm định Ducan. Các giá trị trung bình mang chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý
nghĩa thống kê (p < 0,05).
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

1. Chất lượng hạt ca cao sau lên men
Kết quả kiểm tra chất lượng của 12 mẫu lên men đánh giá bằng phương pháp cắt hạt. Chất lượng ca cao
liên quan đến tỷ lệ các hạt lên men hoàn toàn, tỷ lệ các hạt lên men một phần, tỷ lệ các hạt dưới lên men.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 119


Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản
1.1. Tỷ lệ hạt lên men hoàn toàn:
Kết quả về tỷ lệ các hạt ca cao lên men hồn
tồn được trình bày trong hình 2.

Số 2/2013
tỷ lệ các hạt lên men hồn toàn chiếm 93,33%, trong
khi ở mẫu 4 chỉ đạt 55%.
1.2. Tỷ lệ hạt lên men một phần, dưới mức lên men:
Bên cạnh tỷ lệ % hạt lên men hoàn toàn / tổng
số hạt kiểm tra (100 g), cịn có một số chỉ tiêu khác
như: tỷ lệ hạt ca cao lên men một phần, tỷ lệ hạt ca
cao dưới mức lên men và tỷ lệ các hạt không lên
men. Kết quả các tỷ lệ này được trình bày ở hình 3,
hình 4 (theo thứ tự).

Hình 2. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ hạt lên men hoàn toàn
của 12 mẫu ca cao lên men

Sau lên men chất lượng hạt ca cao cao hay
thấp phụ thuộc vào tỷ lệ hạt lên men hoàn toàn /
tổng số hạt kiểm tra (100 g), tỷ lệ này càng cao đồng
nghĩa với chất lượng hạt ca cao sau lên men càng

cao, do vậy có thể nói tỷ lệ này quyết định đến việc
xếp loại chất lượng hạt ca cao sau lên men. Tỷ lệ
hạt lên men hoàn tồn giữa các mẫu lên men khác
nhau có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Ở các mẫu
nghiên cứu từ mẫu 1 đến mẫu 7, chất lượng hạt ca
cao còn thấp, Từ mẫu 8 đến mẫu 12, chất lượng ca
cao sau lên men cao hơn, cao nhất là ở mẫu 12, có

Hình 3. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ hạt lên men một phần
của 12 mẫu lên men

Tỷ lệ hạt lên men một phần giữa 12 mẫu lên
men khác nhau đáng kể (p<0,05). Qua biểu đồ cho
thấy trong 12 mẫu lên men, mẫu 7 có tỷ lệ % hạt ca
cao lên men một phần cao nhất với 14,43%, sau đó
đến mẫu 4 là 13,73%, mẫu có tỷ lệ thấp nhất là mẫu
1 với 4,46%.

Hình 4. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ hạt dưới mức lên men (A) và tỷ lệ hạt không lên men (B) của 12 mẫu ca cao lên men

Tỷ lệ các hạt dưới mức lên men cũng khác nhau rõ trong 12 mẫu nghiên cứu (p < 0,05). Kết quả cho thấy,
mẫu 3 có tỷ lệ hạt dưới mức lên men cao nhất, chiếm 12,4%. Ở mẫu 12, khơng có hạt dưới mức lên men, và
đây cũng là mẫu có chất lượng cao nhất trong 12 mẫu lên men. Tỷ lệ này càng cao cho thấy chất lượng hạt ca
cao cuối cùng càng thấp.
Tỷ lệ số hạt không lên men cao nhất ở mẫu 1, tỷ lệ 22,32%; sau đó đến mẫu 4 với 21,57%. Thấp nhất ở
mẫu 12 (0%).
Mẫu có tỷ lệ các hạt lên men cao nhất là mẫu 12. Hình ảnh các hạt ca cao lên men mẫu 12 được trình bày ở hình 5.

Hạt ca cao sau lên men

Kết quả cắt hạt ca cao sau lên men

Hình 5. Hạt ca cao sau lên men và kết quả cắt hạt sau lên men của mẫu 12

120 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG


Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản
2. Sự thay đổi số lượng vi khuẩn lactic trong quá
trình lên men ca cao tự nhiên
Kết quả nghiên cứu trình bày ở trên cho thấy
chất lượng của các mẫu ca cao cao khi tỷ hạt lên
men tăng. Trong suốt quá trình lên men, tỷ lệ hạt
lên men hồn tồn cao ln được mong đợi. Do đó,
việc nghiên cứu để nâng cao tỷ lệ này là một việc vơ
cùng cần thiết, nó giúp nâng cao được chất lượng
hạt ca cao thành phẩm.
Trong q trình lên men, vi khuẩn lactic có vai
trị quan trọng trong việc tạo chất lượng tốt cho hạt
ca cao lên men [6], Kết quả nghiên cứu về sự thay
đổi số lượng vi khuẩn lactic trong quá trình lên men
ca cao tự nhiên được trình bày trong hình 6.

Hình 6. Sự biến đổi của vi khuẩn lactic của 12 mẫu trong
suốt quá trình lên men

Số 2/2013
vọng vi khuẩn lactic ở mẫu này có tác động tốt đến
chất lượng hạt ca cao sau lên men.
Trong nghiên cứu của Carr và cộng sự (1979),

vi khuẩn lactic xuất hiện với số lượng nhiều trong
suốt quá trình lên men. Trong các nghiên cứu về
hệ vi sinh vật lên men ca cao ở Indonesia và Brazil
cho thấy vi khuẩn lactic là các vi sinh vật chiếm ưu
thế sau khi lên men từ 36-48 h (Schwan và cộng sự,
1995; Ardhana & Fleet, 2003) [4]. Kết quả nghiên
cứu của mẫu 12, vi khuẩn lactic xuất hiện sau 24 h
lên men với số lượng 2,78 lg (CFU / g).
Đối với lên men ở Brazil, trong suốt 48 giờ
đầu của quá trình lên men, số lượng vi khuẩn
lactic phổ biến [8], nhưng trong nghiên cứu này
chúng xuất hiện sau 48 h lên men chỉ với số lượng
4,68 lg (CFU / g). Có sự khác biệt trên có thể là
do: Nguồn nguyên liệu lên men khác nhau, Phương
pháp lên men khác nhau (nghiên cứu này tiến hành
lên men trong thùng xốp trong khi nghiên cứu của
Nielsen và cộng sự mẫu được lấy từ lên men trong
thùng gỗ); và lượng mẫu dùng trong quá trình lên
men khác nhau (khối lượng lên men của nghiên cứu
này chỉ 3,5 kg) trong khi khối lượng lên men của các
nghiên cứu khác rất lớn.

Trong 12 mẫu nghiên cứu, số lượng vi khuẩn
3. Định danh chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn
lactic ở mẫu 12 có số lượng lớn nhất. Chúng xuất
từ quá trình lên men ca cao tự nhiên.
hiện sau 24 h lên men với số lượng 2,78 lg (CFU / g),
Các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ các mẻ
tăng dần sau 48 h, 72 h và 96 h lên men, đạt cao nhất
ca cao lên men tự nhiên được giữ lại. Qua kết quả

sau 120 h lên men với số lượng 7,67 lg (CFU / g),
trình bày ở trên, mẫu 12 là mẫu có chất lượng lên
khi kết thúc quá trình lên men số lượng giảm còn
men tốt nhất, hy vọng chủng vi khuẩn lactic ở mẫu
7,37 lg (CFU / g).
này có tác động tốt đến chất lượng hạt ca cao sau
Trong 12 mẫu nghiên cứu, mẫu 12 có chất
lên men.
lượng hạt sau lên men cao nhất với số lượng vi
Chủng vi khuẩn lactic có số lượng chủ yếu
khuẩn lactic lớn nhất. Do đó tuyển lựa chủng vi
phân lập được từ mẫu 12, ký hiệu LL12.1. Đặc điểm
khuẩn lactic chủ yếu trong mẫu lên men này với hy
chủng LL12.1 được trình bày trong bảng 1, hình 7.
Bảng 1. Đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa của chủng vi khuẩn lactic LL12.1
Đặc điểm

Mơ tả

Hình dạng khuẩn lạc
Hình thái tế bào

Hình hoa, có nhân hình trịn ở giữa, bề mặt bên ngồi nhám
que, dài

Nhuộm Gram

+

Phản ứng catalase

-

Hình dạng khuẩn lạc

Hình thái tế bào

Hình 7. Hình thái tế bào của LL12.1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 121


Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản

Số 2/2013

Sau khi định danh sơ bộ, tiến hành định danh LL12.1 bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA

Hình 8. Kết quả giải trình tự gen 16S của chủng LL12.1

IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

ủ 97,3% số hạt lên men hoàn toàn, chỉ 2,7% lên
men một phần. Kết quả định danh chủng vi khuẩn
lactic LL12.1 từ mẻ ca cao lên men này là vi khuẩn
Lactobacillus fermentum.

1. Kết luận
Qua quá trình nghiên cứu kết quả thu được
mẫu 12 có chất lượng cao nhất trong 3 mẫu ca cao

lên men tự nhiên. Mật độ vi khuẩn lactic tăng dần
đều, đạt cao nhất sau 120 giờ lên men (lg CFU/g là
7,67), sau đó giảm lại ở cuối giai đoạn ủ. Sau 6 ngày

2. Kiến nghị
Để khẳng định lại vai trò của chủng Lactobacillus
fermentum LL12.1 đến chất lượng hạt ca cao sau
lên men, cần nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ
sung chủng vi khuẩn này đến chất lượng hạt ca cao
sau quá trình lên men.

Kết quả giải trình tự gen cho thấy chủng LL12.1
là Lactobacillus fermentum.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1.

Trần Linh Thước, tái bản lần thứ 6. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, NXB Giáo dục,
trang 65-66, 81-82.

2.

TCVN 5165-1990, Sản phẩm thực phẩm, Phương pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí.
Tiếng Anh

3.

D.S. Nielsen, O.D. Teniola, L. Ban-Koffi, M. Owusu, T.S. Vàersson, W.H. Holzapfel, 2007. The microbiology of Ghanaian
cocoa fermentations analysed using culture-dependent and culture-independent method, international journal of food

microbiology. International Journal of Food Microbiology. 168–186

4.

Dennis Sandris Nielsen, 2007, The microbiology of Ghanaian cocoa fermentations, Department of Food Science, Food
Microbiology, The Royal Veterinary and Agricultural University Denmark, ISBN 87-991713-1-7.

5.

Nicholas Camu, Tom De Winter, Solomon K Addo, Jemmy S Takrama, Herwig Bernaert and Luc De Vuyst, 2008. Fermentation
of cocoa beans: influence of microbial activities and polyphenol concentrations on the flavour of chocolate, Journal of the
Science of Food and Agriculture J Sci Food Agric 88:2288–2297

6.

Luc De Vuyst et al, 2010 , The Functional Role of Lactic Acid Bacteria in Cocoa Bean Fermentation, Biotechnology of Lactic
Acid Bacteria Novel Applications. Biotechnology of Lactic Acid Bacteria Novel Applications, ISBN: 978-0-813-81583-1

7.

Michael P. Doyle, Larry R.Beuchat, Thomas J. Montville, Food microbiology fundamentals and frontiers – cocoa and coffee.

8.

T.F. Santos et al, 2011, Lactic acid bacteria dynamics during spontaneous fermentation of cocoa beans verified by
culture-independent denaturing gradient gel electrophoresis, Genet. Mol. Res. 10 (4): 2702-2709 (2011).

122 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG