Nghiên cứu điều kiện phân tích các sulfamit bằng phương pháp sắc ký

Luận văn Thạc sĩ
Thái

Bùi Minh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---- ----

Bùi Minh Thái

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH CÁC SULFAMIT BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

1


Luận văn Thạc sĩ
Thái

Bùi Minh

THÔNG TIN VỀ LUẬN VĂN THẠC SĨ
1. Họ và tên học viên: Bùi Minh Thái
2. Giới tính: Nữ
3. Ngày sinh:
02/12/1987
4. Nơi sinh:Quảng Ninh
5. Quyết định cơng nhận học viên: ngày 20 tháng 10 năm 2009

6. Các thay đổi trong q trình đào tạo: Khơng
7. Tên đề tài luận văn:
Nghiên cứu điều kiện phân tích các sulfamit bằng phương pháp sắc ký.
8. Chuyên ngành : Hóa phân tích
9. Mã số: 60 44 29
10. Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Văn Ri – khoa Hóa học – trường Khoa
học Tự nhiên.
11. Tóm tắt các kết quả của luận văn:
Dư lượng kháng sinh trong thực phẩm hiện là vấn đề quan ngại của hầu hết các cơ
quan kiểm soát thực phẩm trên thế giới. Họ Sulfamit (SAs), metronidazole (MTD) là
những chất có hoạt phổ rộng, được sử dụng nhiều trong trong nuôi trồng, chế biến nông
thủy sản v.v...Việc sử dụng chất này một cách tuỳ tiện có thể dẫn đến tồn dư một lượng lớn
quá giới hạn cho phép trong cơ thể động vật. Khi người tiêu dùng sử dụng thực phẩm có
dư lượng lớn sulfamit hay các chất kháng sinh trong thời gian dài gây ra một loạt các phản
ứng như rối loạn đường tiết niệu, rối loạn tạo máu. Cho nên việc xác định chính xác lượng
các sulfamit, các chất kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi và lượng tồn dư trong sản phẩm từ
động vật là rất quan trọng. Dựa trên thực tế đó, trong luận văn này, chúng tôi tiến hành
nghiên cứu các điều kiện tách và xác định đồng thời chất kháng sinh metronidazole(MTD)
và các sulfamit như
sulfaguanidine(SGU),sulfamethoxazone(SMX),sulfamethoxypiridazine(SMP),
sulfadoxin(SDO) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) hấp phụ pha ngược
ghép nối detector UV – Vis.
Chúng tôi đã chọn được điều kiện phù hợp cho việc xác định đồng thời các SAs và
MTD như sau: sử dụng cột tách RP- C18, sử dụng detector UV- Vis: 2 kênh(λ= 270nm, λ =
320nm). Pha động: ACN – đệm axetat (20/80,v/v), nồng độ đệm 10mM, pH = 4,5. Tốc độ
pha động 1ml/phút.
Sau khi chọn được điều kiện phân tích, chúng tơi tiến hành đánh giá phương pháp
được các kết quả như sau: Khoảng tuyến tính của các sulfamit và metronidazole: 0,05
-1,00ppm, giới hạn phát hiện LOD: 0,012 – 0,029ppm, giới hạn định lượng LOQ: 0,040 –
0,096ppm. Hệ số biến thiên: 0,2% - 5,0% trong khoảng nồng độ 0,08 – 0,8ppm.

Ứng dụng quy trình trên, chúng tôi xác định dư lượng SAs, MTD trong một số mẫu
tôm. Tôm sau được trộn với ACN, Na2SO4 khan , quay ly tâm( quá trình lặp lại 3 lần), gạn
lấy dung dịch. Dung dịch được chiết qua cột chiết ODS qua 4 bước: bão hòa cột(MeOH +
H2O), nạp mẫu, rửa (H2O), rửa giải( bằng MeOH). Sau khi chiết được dung dịch chất phân
tích chứa trong MeOH, cơ cạn bằng dịng khí N2, sau đó định mức bằng dung dịch pha
động để bơm vào hệ thống HPLC. Với quy trình sử lý mẫu như trên, chúng tôi đạt hiệu
suất thu hồi 71-90%.
Kết quả phân tích các mẫu tơm cho thấy: cả 4 mẫu tôm( tôm sú, tôm rảo, tôm chân
trắng, tôm lớt) đều có chứa dư lượng SGU cao hơn lượng cho phép là 0,1ppm. Riêng mẫu
tơm sú cịn xuất hiện chất SMP, tuy nhiên với hàm lượng không đáng kể(90ppm). Không

2


Luận văn Thạc sĩ
Thái

Bùi Minh

phát hiện thấy MTD, SDO,SMX trong các mẫu. Xác định được dư lượng SGU trong mẫu
tôm chân trắng: 0,16 ± 0,01ppm, tôm lớt: 0,21±0,03ppm, tôm rảo:0,12±0,02ppm, tôm
sú :0,26±0,02ppm, dư lượng SMP trong tôm sú 0,09 ± 0,01ppm .
12. Khả năng ứng dụng trong thực tiễn: Ứng dụng trong lĩnh vực an toàn thực phẩm như
xác định dư lượng các sulfamit, metronidazole trong: tôm, gan gà, gan lợn, sữa, trứng…
13. Những hướng nghiên cứu tiếp theo:
- Nghiên cứu để tăng độ nhạy, tăng giới hạn phát hiện và định lượng.
- Nghiên cứu phương pháp tách các chất sử dụng phương pháp dẫn xuất hóa
- Nghiên cứu phương pháp đo sắc ký lỏng ghép nối với các thiết bị hiện đại hơn như
MS…
- Nghiên cưú phương pháp xác định đồng thời nhiều chất trong họ sulfamit và các chất

kháng sinh khác.
- Đối với mẫu tôm: tiến hành phân tích nhiều mẫu theo thời gian kể từ khi tơm sử dụng
thức ăn, thuốc chữa bệnh có chứa chất kháng sinh, kháng khuẩn…để đưa ra thời gian thu
hoạch tôm mà trong đó dư lượng các chất kháng sinh, kháng khuẩn không ảnh hưởng tới
sức khỏe của người tiêu dùng.
14. Các cơng trình đã cơng bố có liên quan đến luận văn: Không.
Ngày 01 tháng 09 năm 2011
Học viên
Bùi Minh Thái

3


Luận văn Thạc sĩ
Thái

Bùi Minh

INFORMATION ON MASTER’THESIS
1. Full name: BUI MINH THAI
2. Sex: Female
3. Date of birth:
02/12/1987
4. Place of birth: Quang Ninh
5. Admission decision dated: 20th Octorber,2009
6. Changes in academic process: No
7.Official thesis title:
Research on Sulfamit condition analysis byChromatography
8. Major:
Analytical chemistry

9. Code: 60 44 29
10. Supervisors: A. Prof. NGUYEN VAN RI - Hanoi University of Science
11. Summary of the finding of the thesis:
Antibiotic residues in food now is an issue that concerns of most of the food
control agencies in the world. Sulfonamides (SAs) and metronidazole (MTD) are wide
spectrum and active substances, they are used in farming, agricultural and aquatic
products, etc...The use of the arbitrary nature of this in a way that could lead to a
large amount of excess inventory limit allowed in the body of animals. When
consumers use major food residues or antibiotic sulfonamides substances for long
periods, it can cause a series of reactions such as urologist and hematopoietic
disorders, ect... So the components determination of the sulfonamides, the antibiotic
in animal feed and residue in animal products is very important. Based on that, in
this paper, we studied the conditions for separation and determination of antibioticMetronidazole (MTD) and sulfonamides related such as: sulfaguanidine (SGU),
sulfamethoxazone (SMX, sulfamethoxypiridazine (SMP), sulfadoxin (SDO) buy the
best method-high-performance liquid chromatography (HPLC) with reverse
adsorption mobile phase pairing detector-UV-Vis.
We have chosen the suitable condition for determining simultaneously the SAs
and MTD as follows: the separated column-RP C18 , detector UV-Vis at the both
wavelengths (λ = 270nm, λ = 320nm) , the mobile phase: ACN- buffer acetate (10mM,
pH=4,5 ) (20/80, v/v), the follow rate: 1ml/min.
After selecting the best analysis condition, we continue to conduct method and
gets the result as follows: the range of concentration (approximately linear) of
metronidazole and sulfamit: 0.05-1.00 ppm, limit of detection (LOD): 0.012 – 0,
029ppm, limit of quantity( LOQ): 0.040-0, 096ppm. Coefficient variation(CV): 0.2%5.0% in the range of concentrations of 0.08-0, 8ppm.

4


Luận văn Thạc sĩ
Thái

Bùi Minh

The application process, we determine the residue SAs, MTD in samples of
shrimp .Shrimp after being mixed with ACN and Na2SO4 anhydrous continued
centrifugal, then retrieved to take solution of sample . The solution is extracted
through ODS column through 4 steps: saturation of columns (MeOH + H2O), load
the template, wash (H2O), elution (MeOH). After extraction, the aqueous fluid
analysis is injected in HPLC systems.With the process for handing such sample, we
achieved 71-90 yeild.. Results analysis of samples of shrimp shows: all 4 shrimp
samples(Metapenaeus ensis: 0,12±0,02ppm, Penaeus vannamei: 0,16 ± 0,01ppm,
Penaeus monodon: 0,26±0,02ppm, Penaeus merguiensis0,21±0,03ppm), they contain
higher amounts of residue SGU allow is 0, 1ppm. MTD, SGU, SMX, SDO not
detected in samples
12. Practical applicability: applications in the field of food safety such as determination
of residual metronidazole and sulfamit related , in: shrimp, chicken liver, pork liver,
milk, eggs, etc...
13. Further research directions:
- Research to increase sensitivity, detection and quantification limit.
- Research methods of separating substances using chemical derivatives
- Study method for measuring liquid pairing with the colors up modern equipment
such as MS
- Research method to define many substances of sulfamit and other antibiotic
substances at the same time
- To the sample of shrimp : conduct analysis multiple samples over time since the
shrimp used for food, medicines containing antibiotic, antibacterial, etc... to define
time to harvest shrimp in which residues of antibiotics, antimicrobial without
affecting the health of consumers.
14. Thesis-related publications: NO
Date:1st September,2011

Full name: BUI MINH THAI

5


Luận văn Thạc sĩ
Thái

Bùi Minh

MỤC LỤC
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG BIỂU
DANH MỤC HÌNH VẼ
MỞ ĐẦU …………………………………………………………………..
Chương 1 - TỔNG QUAN ……………………………………………….
1.1. Giới thiệu chung về sulfamit (SAs), metronidazole (MTD)………
1.1.1. Cấu trúc phân tử …………………………………………………..
1.1.2. Tính chất vật lý và hố học của các Sulfamit, Metronidazole ………….
1.1.3. Tính chất dược lý và phổ tác dụng của Sulfamit, Metronidazole ...........
1.1.4. Cơ chế tác dụng kháng khuẩn của Sulfamit, Metronidazole ..........
1.1.5. Một số chế phẩm của Sulfamit tiêu biểu ………..………………...
1.2. Phương pháp xác định……………………………………………….
1.2.1. Một số cơng trình nghiên cứu xác định Sas bằng phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ……………………………………………..
1.2.2. Một số cơng trình nghiên cứu xác định Metronidazole bằng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) …………………………………….
1.2.3. Một số cơng trình nghiên cứu xác định đồng thời các sulfamit và
metronidazole bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ……….
Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……..

2.1. Đối tượng, mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu…………………

2.1.1.

Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu

…………………………………

2.1.2. Nhiệm vụ nghiên cứu ……………………………………………..
2.2.

Phương pháp nghiên cứu…………………………………………

2.2.1. Nguyên tắc chung và trang bị của phương pháp HPLC …….
2.2.2.
Phân tích định lượng bằng HPLC …………………………
2.3.
2.4.

Giới thiệu chung về phương pháp chiết pha rắn ….………….
Hóa chất và dụng cụ……………………………………………..

2.4.1.
2.4.2.

Hố chất …………………………………………………

Dụng cụ ………………………………………………………
Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ……………………………….

6


Luận văn Thạc sĩ
Thái

Bùi Minh

3.1. Khảo sát các điều kiện sắc ký ……………………………………….
3.1.1. Chọn bước sóng của detector ……………………………………..
3.1.2. Thăm dò khả năng tách của các Sulfamit trên cột RP-C18 ……….
3.2. Chọn pha tĩnh ……………………………………………………......
3.3. Tối ưu hóa pha động …………………………………………………
3.3.1. Nồng độ đệm axetat của pha động ………………………………...
3.3.2. Độ pH cho dung dịch đệm axetat ………………………………….
3.3.3. Tỉ lệ thành phần pha động ………………………………………...
3.3.4. Tốc độ pha động ..............................................................................
3.4. Đánh giá phương pháp phân tích …………………………………..
3.4.1. Khảo sát lập đường chuẩn trong khoảng nồng độ 0,05 – 1,000ppm
3.4.2. Giới hạn phát hiện (LOD); Giới hạn định lượng (LOQ) ................
3.4.3. Độ đúng, độ lặp lại của phép đo ………………………………….
3.5. Mẫu thực, quy trình xử lý và kết quả phân tích …………………...
3.5.1. Quy trình xử lý mẫu, xác định hiệu suất thu hồi …………………..
3.5.2. Phân tích mẫu thực ………………………………………………………

KẾT LUẬN ……………………………………………………………….
TÀI LIỆU THAM KHẢO

7

Luận văn Thạc sĩ
Thái

Bùi Minh

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9

Viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

ACN

Acetonitrin

Axetonitrin

Bộ Nông nghiệp phát
triển nông thôn

BNNPTNT
CV

Coeficient Variation

Hệ số biến thiên

HPLC

High Performance Liquid
Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng
cao

RP

Reversed phase

Hấp phụ pha đảo

LOD

Limit of Detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of Quantity

Giới hạn định lượng

TT
UV - Vis

Thông tư
Untraviolet - Visibet

8

Tử ngoại – Khả kiến


Luận văn Thạc sĩ
Thái

Bùi Minh

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 3.1:

Diện tích của pic phụ thuộc vào bước sóng detector…………………

25

Bảng 3.2:

Thời gian lưu và thứ tự ra pic của các chất phân tích………………..

27

Bảng 3.3:

Sự phụ thuộc k’ vào nồng độ đệm axetat của pha động……………..

29

Bảng 3.4:

Hệ số dung tích ở các giá trị pH khác nhau………………………….

31

Bảng 3.5:

Hệ số dung tích phụ thuộc vào %ACN trong pha động……………..

33-34

Bảng 3.6:

Diện tích pic của các chất phân tích phụ thuộc vào tốc độ pha động....

36

Bảng 3.7:

Diện tích pic sắc ký phụ thuộc vào nồng độ các chất phân tích………

38-39

Bảng 3.8:

Bảng giá trị các Ftính của các chất phân tích............................................

42

Bảng 3.9:

LOD, LOQ tính theo phương trình hồi quy ..........................................

43

Bảng 3.10: Khảo sát độ đúng, độ lặp lại của phương pháp phân tích (nồng độ 0,08ppm)

45

Bảng 3.11:

46

Khảo sát độ đúng, độ lặp lại của phương pháp phân tích (nồng độ 0,4ppm)

Bảng 3.12: Khảo sát độ đúng, độ lặp lại của phương pháp phân tích (nồng độ 0,8ppm)

47-48

Bảng 3.13: Chiều cao píc sắc ký mẫu tơm ở các nồng độ thêm chuẩn khác nhau

50

Bảng 3.14: Kết quả xác định hiệu suất thu hồi các chất phân tích………………..

51

Bảng 3.15: Kết quả phân tích các chất đối với mẫu tơm rảo…………………….

52

Bảng 3.16: Hàm lượng các chất phân tích trong mẫu tơm rảo…………………..

53

Bảng 3.17: Kết quả phân tích các chất đối với mẫu tôm chân trắng…………….

54

Bảng 3.18: Hàm lượng chất phân tích trong mẫu tơm chân trắng……………….

54

Bảng 3.19: Kết quả phân tích các chất đối với mẫu tơm sú……………………...

55

Bảng 3.20: Hàm lượng các chất phân tích trong mẫu tơm sú……………………

55

Bảng 3.21: Kết quả phân tích các chất đối với mẫu tơm lớt…………………….

56

Bảng 3.22: Hàm lượng chất phân tích trong mẫu tơm lớt……………………….

57

9


Luận văn Thạc sĩ
Thái

Bùi Minh

DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 1.1: Sơ đồ chuyển hố axít folic thành nucle protein…………………...

5

Hình 2.1: Sơ đồ khối hệ thống HPLC đầy đủ………………………………..

19

Hình 3.1: Phổ hấp thụ trong vùng tử ngoại khả kiến của các Sas……………

23-24

Hình 3.2: Diện tích của pic phụ thuộc vào bước sóng detector………………

25

Hình 3.3: Thời gian lưu của các sulfamit……………………………………

26-27

Hình 3.4: Sự phụ thuộc của k’ vào nồng độ đệm axetat trong pha động……

10

29


Luận văn Thạc sĩ
Thái

Bùi Minh

Hình 3.5: Píc sắc ký ở các giá trị nồng độ đệm khác nhau...................................

29-30

Hình 3.6: Sự phụ thuộc của K’ vào pH của pha động..........................................

31

Hình 3.7: Sắc đồ sắc ký ở pH khác nhau...............................................................

32

Hình 3.8: Sự phụ thuộc k’ vào tỉ lệ % ACN trong pha động...............................

34

Hình 3.9: Sắc đồ píc sắc ký tại các tỉ lệ thành phần pha động khác nhau...........

34-35

Hình 3.10: Sự phụ thuộc diện tích píc sắc ký vào tốc độ pha động.......................

36

Hình 3.11: Sắc đồ tốc độ khác nhau của pha động.................................................

37

Hình 3.12: Đường chuẩn của chất phân tích trong khoảng nồng độ 0,05-1,00ppm….

39-40

Hình 3.13: Sắc đồ của các chất phân tích nồng độ khác nhau tại bước sóng 270nm…

40

Hình 3.14: Sắc đồ của các chất phân tích nồng độ khác nhau tại bước sóng 320nm…

41

Hình 3.15: Sắc đồ của 5 chất phân tích với nồng độ 0,01ppm…………………

43

Hình 3.16: Sắc đồ các chất phân tích sau 8 lần bơm mẫu nồng độ 0,08ppm ….

45

Hình 3.17: Sắc đồ các chất phân tích sau 8 lần bơm mẫu nồng độ 0,4ppm ……

47

Hình 3.18: Sắc đồ các chất phân tích sau 8 lần bơm mẫu nồng độ 0,8ppm ……

48

Hình 3.19: Sơ đồ xử lý mẫu Tơm.............................................................................

49

Hình 3.20: Sắc đồ hiệu suất thu hồi theo quy trình xử lý mẫu tơm........................

50

Hình 3.21: Đường chuẩn SGU trong mẫu tơm rảo khi phân tích thêm chuẩn….

53

Hình 3.22: Sắc đồ pic sắc ký khi thêm chuẩn SGU trong mẫu tơm rảo………

53

Hình 3.23: Đường chuẩn SGU trong mẫu tơm chân trắng khi phân tích thêm chuẩn..

54

Hình 3.24: Sắc đồ pic sắc ký khi thêm chuẩn SGU trong mẫu tôm chân trắng...

54

Hình 3.25: Đường chuẩn của SGU, SMP trong mẫu tơm sú khi phân tích thêm chuẩn

55

Hình 3.26: Sắc đồ pic sắc ký khi thêm chuẩn SGU, SMP trong tôm sú……….

56

Hình 3.27: Đường chuẩn SGU trong mẫu tơm lớt khi phân tích thêm chuẩn…..

57

Hình 3.28: Sắc đồ pic sắc ký khi thêm chuẩn SGU trong tôm lớt…………….

57

11

Luận văn Thạc sĩ
Thái

Bùi Minh

MỞ ĐẦU
Dư lượng kháng sinh trong thực phẩm hiện là vấn đề quan ngại của hầu hết
các cơ quan kiểm soát thực phẩm trên thế giới. Một số loại kháng sinh thông thường
(chloramphenicol, malachite green, metronidazole…) bản thân nó có thể gây ra tác
động có hại cho sức khoẻ người tiêu dùng, một số loại khác như các kháng sinh
nhóm nitrofurans qua q trình trao đổi chất trong cơ thể động vật có thể sinh ra
những hợp chất có độc tính cao đối với cơ thể sống. Họ thuốc kháng khuẩn Sulfamit
(SAs) là nhóm kháng khuẩn có hoạt phổ rộng, được sử dụng nhiều trong trong nuôi
trồng, chế biến nông thủy sản, v.v..
Việc sử dụng chất này một cách tùy tiện có thể dẫn đến tồn dư một lượng lớn
quá giới hạn cho phép trong cơ thể động vật. Khi người tiêu dùng sử dụng thực
phẩm có dư lượng lớn sulfamit hay các chất kháng sinh trong thời gian dài gây ra
một loạt các phản ứng như rối loạn đường tiết niệu, rối loạn tạo máu, rối loạn
chuyển hóa porphyrin. Cho nên việc xác định chính xác lượng các sulfamit, các chất
kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi và lượng tồn dư trong sản phẩm từ động vật là rất
quan trọng.

12


Luận văn Thạc sĩ
Bùi Minh
Thái
Dựa trên thực tế đó, trong luận văn này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các

điều kiện tách và xác định đồng thời chất kháng sinh metronidazole và các sulfamit
như sulfaguanidine, sulfamethoxazone, sulfamethoxypiridazine, sulfadoxin bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ghép nối detector UV – Vis,
phương pháp này có độ chọn lọc, độ nhạy tốt và được trang bị ở nhiều cơ sở kiểm
nghiệm của nước ta, có tính khả thi và ứng dụng vào thực tế cao.

Chương 1 - TỔNG QUAN
1.2. Giới thiệu chung về sulfamit (SAs), metronidazole(MTD)
1.1.1. Cấu trúc phân tử [3,6]
Họ SAs có cấu trúc phân tử tổng quát:
R2 N

SO2 NH R1

Khi thay thế các nhóm R1, R2 bằng các gốc khác nhau, chúng ta có các SAs
khác nhau.Vì thế có cả một họ SAs.
Khi R2 = H thì sulfamit mới có hoạt tính kháng khuẩn. Khi R 2 # H, thì chất đó
là tiền thuốc. R1 có thể là mạch thẳng, dị vòng. Tuy nhiên nếu R 1 là dị vịng thì hiệu
lực kháng khuẩn mạnh hơn, thơng thường các dị vòng 2-3 dị tố.
Cấu trúc Metronidazole(MTD):

13


Luận văn Thạc sĩ
Thái

Bùi Minh

Là một thuốc kháng sinh thuộc họ nitroimidazole sử dụng đặc biệt đối với vi

khuẩn kỵ khí và động vật nguyên sinh. MTD là một trong những thành phần có mặt
trong thức ăn chăn ni, thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản (với tên thương
mại là Enro DC).
1.1.3. Tính chất vật lý và hố học của các Sulfamit, Metronidazole [3]
1.1.2.1. Tính chất vật lý
SAs ở dạng tinh thể màu trắng hoặc vàng nhạt, không mùi, thường ít tan trong
nước, tan trong dung dịch axít, tan trong dung dịch kiềm (trừ sulfagu-anidin).
MTD là tinh thể hoặc bột kết tinh, hơi vàng, khơng mùi, bền ngồi khơng khí,
sẫm màu dần khi tiếp xúc với ánh sáng. Nóng chảy ở khoảng 159 oC – 163oC.
Metronidazol khó tan trong nước, aceton.
1.1.2.2. Tính chất hố học
- SAs có tính chất lưỡng tính:
• Có tính kiềm do có nhóm amin thơm tự do, nên tan trong dung dịch axít.
Ví dụ: cho kết tủa muối picrat trong dung dịch HCl lỗng.
• Có tính axít do có ngun tử H ở N-amit linh động, nên dễ tan trong dung

dịch kiềm tạo muối natri tan để pha thuốc tiêm (trừ Sulfaguanidin):

14


Luận văn Thạc sĩ
Thái

Bùi Minh
R

H2N

SO2

R

N

H2N

H

SO2

N
H

H2N

SO2

N

R

Na

- SAs tạo muối phức kết tủa với ion Ag +, và tạo phức màu kết tủa với ion Cu 2+,
Co2+, …
- Ở nhóm amin bậc một của SAs có đơi điện tử tự do, giúp SAs thực hiện phản
ứng tạo phức chuyển điện tích với phenosafranine (PSF) cho phức màu tím có bước
sóng hấp thụ cực đại ở 270-273 nm.
- Nhóm amin thơm tự do cho phản ứng diazo hoá, rồi ngưng tụ với

naphtol cho sản phẩm azoic màu đỏ cam hấp thụ ở bước sóng 460nm.
Ar-NH2 + NaNO2 + 2HCl = [Ar-N+ ≡N]Cl- + NaCl + 2H2O
Muối diazoni
Ở đây, Ar – là thành phần -C6H5-SO2NH-R1 của phân tử SAs.
Nhờ thế mà việc định lượng SAs theo hai phương pháp này diễn ra dễ dàng.

1.1.6. Tính chất dược lý và phổ tác dụng của Sulfamit, Metronidazole [3,6,9]
Với liều điều trị, SAs không diệt vi khuẩn, chỉ làm vi khuẩn yếu đi, không phát
triển và sinh sản được, dễ bị bạch cầu tiêu diệt.
SAs có phổ tác dụng và hoạt phổ rộng: tác dụng lên nhiều vi khuẩn than, vi
khuẩn tả, Shigella, E.coli, trực khuẩn Hansen... Ít hoặc không tác dụng trên một số
vi khuẩn: liên cầu khuẩn yếm khí, trực khuẩn lao, Ricketchia... Khơng có tác dụng
đối với virut (trừ virut gây đau mắt nhạy cảm với sulfacylum). Nhưng lại có tác
dụng lên một số ký sinh trùng, đặc biệt ký sinh trùng sốt rét.

15


Luận văn Thạc sĩ
Bùi Minh
Thái
Tính hấp thu và đào thải: trừ nhóm SAs điều trị đường ruột, các SAs nói chung
đều được hấp thu nhanh ở ruột non, đào thải chủ yếu qua đường thận với tốc độ
khác nhau nên thời gian có tác dụng khác nhau.
Metronidazole cũng có hoạt phổ rộng bao gồm động vật nguyên sinh và các vi
khuẩn yếm khí bao gồm: nhóm Bacteroides(gồm cả B. fragilis), Fusobacterium
Veillonella, nhóm Clostridium (bao gồm cả C. difficile và C. perfringens),
Eubacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus. Nó là hiệu quả đối với B. fragilis
phân lập kháng với clindamycin..
Metronidazole cũng có những hoạt động ức chế miễn dịch và kháng viêm, và

nó đã được sử dụng trong các bệnh nhân bị bệnh rosacea. Các hoạt động kháng
khuẩn của metronidazole làm thay đổi trao đổi chất của vi khuẩn acid mật trong
đường ruột, giảm ngứa ở những bệnh nhân bị ứ mật thứ cấp đến xơ gan mật tiền phát.
1.1.7. Cơ chế tác dụng kháng khuẩn của Sulfamit, Metronidazole [3]
1.1.4.1. Cơ chế kháng khuẩn của SAs
- Ức chế enzym chuyển hóa acid folic
Các sulfamit có hiệu lực điều trị tốt đều có gốc R mang dị vòng, dị vòng 2 dị
tố tốt hơn dị vòng 1 dị tố. Ví dụ: sulfamethoxazol: ức chế enzym dihydrofolat
synthetase nên ngăn chặn giai đoạn chuyển acid folic thành axit hydrofolic.
- Ngăn cản tổng hợp axít folic của vi khuẩn
Vi khuẩn tổng hợp và chuyển hố axít folic thành nucleo protein (cần thiết cho
mọi tế bào sống) theo sơ đồ sau:

16


Luận văn Thạc sĩ
Thái

Bùi Minh

OH
N

CH2

N

NH

CO

NH

CH CH2 CH2 COOH
COOH

H2N

N

acid glutamic

A.PAB

N

+

(vitamin H )

pterin
pteoryl

Acid folic (acid pteoryl glutamic)

Acid Dihydrofolic

Dihydrofolat syntetase
(enzym)

Dihydrofolat sreductase
(enzym)

Acid Tetrahydrofolic
Nucleoprptein

Acid folinic

Hình 1.1. Sơ đồ chuyển hố axít folic thành nucle protein
Theo sơ đồ trên sự đối kháng giữa A.PAB và SAs là sự cạnh tranh vào vị trí
của A.PAB trong thành phần phân tử axít folic trong q trình vi khuẩn tổng hợp
axít này. Khi nồng độ đủ cao thì SAs sẽ chen vào vị trí của A.PAB làm cho việc
tổng hợp axít folic bị gián đoạn, ngưng trệ. Sự tranh chấp giữa A.PAB và SAs rõ
ràng tuân theo quy luật khối lượng, nên cần duy trì nồng độ có tác dụng ở máu trong
suốt thời gian dùng SAs.
SAs thay được A.PAB vì chúng giống nhau về hình dạng, kích thước và nhóm
chức hố học:
o

6 .7 A

6 .9 Ao
O

O
H2N

o

C

2 .3 A
OH

H2N

2 .4 Ao

S
O
NH - R

Ở ngoài mặt phẳng
A.PAB

Sulfamit

Như vậy những vi khuẩn khơng cần đến axít folic hoặc lấy được axít foclic có
sẵn trong mơi trường thì khơng bị SAs tác dụng. Tế bào của người và động vật lấy

17


Luận văn Thạc sĩ
Bùi Minh
Thái
axít folic từ bên ngồi vào như một vitamin (axít folic là vitamin B 9), nên không bị
ảnh hưởng bởi SAs. Khi dùng SAs để chữa bệnh thì nó chỉ có tác dụng chọn lọc
trên vi khuẩn.
H H

N

(-)
S N R
O

H H
N

H

H
N

(-)
S N R

(-)
O S O
O

O

anion sulfamit

H H
N

(-)
O S O

O

anion PAB

1.1.4.2. Cơ chế kháng khuẩn của Metronidazole
Metronidazole tác dụng lên vi khuẩn kỵ khí như Helicobacter pylori và
Gardnerella vaginalis, nhưng cơ chế của hành động này là chưa được hiểu rõ. Tuy
nhiên, hoạt động của nó chống lại vi khuẩn kỵ khí bắt buộc xảy ra thơng qua một
quy trình bốn bước:
- Tấn cơng vào vi sinh vật: Metronidazole là một hợp chất có khối lượng phân
tử thấp nên dễ dàng khuếch tán qua màng tế bào của vi sinh vật kỵ khí và hiếu khí.
- Làm suy giảm hoạt hóa bởi sự vận chuyển protein trong tế bào:
Metronidazole làm giảm bởi pyruvat : ferredoxin(protein chứa sắt chuyển các điện
tử) oxidoreductaza (enzyme xúc tác phản ứng oxy hóa- khử) trong ty thể của vi
khuẩn kỵ khí, làm thay đổi cấu trúc hóa học của nó.
Pyruvate: ferredoxin oxidoreductase thường tạo ra ATP qua decarboxylation
oxy hóa của pyruvate. Với metronidazole trong tế bào, nhóm nitro của nó hoạt động
như một chỗ cất giữ điện tử, thu giữ điện tử thường được chuyển giao cho các ion
hydro trong chu kỳ này. Tác dụng làm suy giảm của metronidazole thúc đẩy hình
thành các hợp chất trung gian và các gốc tự do độc hại đối với tế bào.
- Giảm tương tác tiểu phân trung gian với tế bào - các tiểu phân trung gian độc
tương tác với DNA chủ, dẫn đến vỡ sợi DNA và phá hủy chuỗi AND.

18


Luận văn Thạc sĩ
Bùi Minh
Thái

- Sự phá vỡ của các sản phẩm trung gian gây độc tế bào - các tiểu phân trung
gian độc hại phân hủy thành sản phẩm cuối cùng không hoạt động.
1.1.8. Một số chế phẩm của Sulfamit tiêu biểu [3;6; 9]
Như ta đã biết, các SAs có cả một họ gồm hàng nghìn chất, với những tính
chất và cơng dụng khác nhau. Vì vậy, chúng tơi chỉ đi sâu vào bốn SAs sẽ được
nghiên cứu trong luận văn này.
1.1.8.1. Sulfaguanidin (SGU)
Cơng thức:
O

O
S
NH

H2N

NH2

HN

Tính chất: Dạng bột tinh thể màu trắng, tan rất ít trong nước, axeton, etanol
96o; không tan trong metylen clorit (CHCl3); không tan trong dung dịch có tính
kiềm; tan tốt trong dung dịch các axít vơ cơ lỗng... Nhiệt độ nóng chảy 189 –
193oC.
SGU cũng như nhiều SAs khác có cấu trúc rất giống A.PAB - một chất không
thể thiếu cho sự phát triển của vi khuẩn. Nên dễ dàng thay thế A.PAB để kìm hãm
quá trình trao đổi chất của vi khuẩn. Vì vậy SGU là một tác nhân kháng khuẩn
mạnh, được dùng như một loại thuốc chống các bệnh dịch tả, đái tháo đường, chứng
phù, tăng huyết áp...
1.1.5.2.Sulfamethoxypyridazin (SMP)

Cơng thức:
N
O

O

N

OCH3

S
NH
H2N

Tính chất: SMP ở dạng bột kết tinh màu trắng hoặc trắng ngà, dưới tác dụng
của ánh sáng sẽ bị sẫm màu, nâu dần; có vị đắng; rất ít tan trong nước, tan trong

19


Luận văn Thạc sĩ
Bùi Minh
Thái
kiềm và axít vơ cơ lỗng. Nhiệt độ nóng chảy của dẫn chất axetyl hố là 228 –
229oC.
SMP tác dụng lên vi khuẩn tương tự như sulfadiazin nhưng hấp thụ ở ruột
nhanh hơn, nhiều hơn và đào thải rất chậm nên đạt được nồng độ cao trong máu,
đồng thời duy trì được nồng độ có tác dụng lâu, nên có tác dụng kéo dài. Vì vậy
dùng liều thấp hơn, ít nguy cơ kết tinh ở đường tiết niệu song cần đề phịng nguy cơ
tích luỹ gây ngộ độc vì sự đào thải chậm. SMP dùng để điều trị các bệnh nhiễm

khuẩn đường hô hấp, sinh mủ, viêm (hoặc giãn) phế quản, viêm đường niệu đạo (bể
thận, ruột thận), viêm họng, màng não tuỷ, v.v...
1.1.5.3.Sulfadoxin (SDO)
Công thức:
O

N

O

N

S
OCH3

NH
OCH 3

H2N

Tính chất: SDO dạng bột kết tinh màu trắng, rất ít tan trong nước, ít tan trong
etanol 96o, không tan trong ete, tan trong các dung dịch axít vơ cơ lỗng và
hydroxyt kiềm. Nhiệt độ nóng chảy 198oC.
SDO chỉ định các nhiễm khuẩn do tụ cầu, lậu cầu, màng não cầu, E.coli, phế
cầu. Dung dịch muối natri tiêm tĩnh mạch cho các trường hợp nhiễm khuẩn nặng, trị
sốt rét. Muối Ag của SDO có tác dụng tốt lên trực khuẩn mủ xanh, chữa bỏng. SDO
cũng có tác dụng kéo dài.
1.1.5.4. Sulfamethoxazol (SMX)
Công thức:
O

O

O
S
NH

H2N

20

N
CH3


Luận văn Thạc sĩ
Bùi Minh
Thái
Tính chất: SMX dạng bột tinh thể trắng hoặc trắng ngà. Thực tế không tan
trong nước, khó tan trong ete, hơi tan trong ethanol 96 o, dễ tan trong axeton, tan
trong các dung dịch hydroxyt kim loại kiềm lỗng. Nhiệt độ nóng chảy là 169 172oC.
SMX có tính kháng khuẩn mạnh, đã được làm thuốc điều trị sốt rét phối hợp
với pyrimethamin, do ức chế men dihydropholat nên ngăn cản sự chuyển hóa axít
dihydrofolic. SMX cịn được dùng rộng rãi cho các bệnh nhiễm khuẩn đường hô
hấp, tai - mũi - họng, đường tiết niệu, thận, máu, bộ phận sinh dục, đường tiêu hoá,
v.v...
1.2. Phương pháp xác định
1.2.1. Một số cơng trình nghiên cứu xác định Sas bằng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trị vơ cùng
quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất

là các lĩnh vực của hoá dược, sinh hoá, hoá thực phẩm, nơng hố, hố dầu, hố học
hợp chất thiên nhiên, các loại chất có tác dụng độc hại, phân tích mơi trường... đặc
biệt là tách và phân tích lượng vết các chất.
Phương pháp HPLC được sử dụng rộng rãi để xác định các kháng khuẩn SAs
trong các loại mẫu khác nhau, khá ưu thế so với các phương pháp khác khi xác định
dư lượng các kháng khuẩn trong mẫu thực phẩm vì có độ chính xác, độ nhạy và độ
lặp lại cao...
Detector ghép nối trong máy HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất sau
khi rửa giải. Ngày nay có rất nhiều loại detector được sử dụng cho mục đích này đã
mở rộng khả năng phát hiện được rất nhiều loại chất bằng phương pháp HPLC. Đối
với phân tích dư lượng thì người ta hay sử dụng detector khối phổ (MSD) nhất là
tách và phân tích chất trong các đối tượng phức tạp. Cịn thơng dụng người ta dùng
detector UV-Vis hay detector huỳnh quang. Dùng detector UV-Vis thì xác định được
nhiều loại chất hơn, nhưng detector huỳnh quang thường nhạy hơn, chọn lọc hơn và
ít hơn các tương tác do các hợp chất có trong nền mẫu.

21


Luận văn Thạc sĩ
Bùi Minh
Thái
Theo tiêu chuẩn ngành TCN 196: 2004 [8], qui định phương pháp xác định
hàm lượng nhóm chất SAs (gồm: sulfadiazin, sulfathiazol, sulfamerazin, sulfamethazin,sulfamethoxypiridazine,sulfacloropyridazin,sulfadoxin, sulfamethoxazone
sulfadimethoxin và sulfa-chinoxalin) trong sản phẩm thủy sản bằng HPLC- detector
huỳnh quang. Điều kiện chạy sắc ký như sau: Cột sắc ký: cột Nucleosil 250×3mm
100-5 C18 AB. Chương trình pha động (gồm: dung dịch H 3PO4 0,02M và hỗn hợp
metanol- axcetonitril tỷ lệ 1:1), bắt đầu với 60 % H 3PO4 và đến 45 phút 45 %
H3PO4, tốc độ dòng 0,6 ml/phút. Thể tích mẫu tiêm 10l. Bước sóng kích thích
405nm, bước sóng phát xạ 495nm. Phương pháp xử lý mẫu này cho hiệu suất thu

hồi nằm trong khoảng 60-70 %, với giới hạn phát hiện nhỏ hơn 5 g/kg.
Năm 2010 Cheong và cộng sự[12] đã xác định dư lượng 4 SAs (Sulfadiazine
(SDZ),Sulfamethazine(SMZ),Sulfamethoxazole(SMX) và Sulfaquinoxaline(SQX))
trong gan gà sử dụng phương pháp HPLC pha đảo, detector UV tại bước sóng
266nm. Điều kiện chạy sắc ký như sau: cột C18 (5 μm, 4.6 mm x 25.0 cm). Kênh A:
amoni axetat nồng độ 0,01M(pH =4,6). Kênh B: ACN. Sử dụng gariend pha động
như sau: ban đầu 95% A- 5%B, sau 18phút: 67%A -37%B, sau 23 phút95% A5%B. Tốc độ pha động 1ml/phút. Nồng độ của SAs được phát hiện trong mẫu từ 11
tiểu bang trên bán đảo Malaysia là 0,006-0,062 μg/g trong nhu mô và 0,08-0.193
μg/g trong gan .
Rodrigo H.M.M. Granja, Alfredo M. Montes Niño, Fernanda Rabone and
Alessandro Gonzalez Salerno[25] đã sử dụng phương pháp HPLC –detector UV để
xác định sunfamit trong mật ong. Sulfonamid được trích xuất từ mật ong với
dichloromethane sau khi giải thể với clorua natri 30%, và làm sạch với chiết pha rắn
trên các cột Florisil. Dung dịch chiết được phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
với phát hiện tia cực tím. Các giới hạn phát hiện được xác định tại 3 μg/kg, 4 mg/kg
và 5 mg/kg cho sulfamethazine, sulfathiazole và sulfadimethoxine, tương ứng với
hiệu suất thu hồi 61,0% cho sulfathiazole; 94,5% cho sulfamethazine và 86,0% cho
sulfadimethoxine ở mức 100μg/kg.

22


Luận văn Thạc sĩ
Bùi Minh
Thái
Ngoài detector UV, huỳnh quang, là những detector thường dùng, nhiều cơng
trình nghiên cứu cịn sử dụng detector khác như detector diode array (DAD),
detector điện hóa cho độ nhạy và độ chọn lọc cao.
Tác giả Ivan Pecorelli và các đồng sự [18], sử dụng phương pháp HPLC DAD để phân tích đồng thời dư lượng 10 SAs trong mẫu bắp thịt (sulfadiazin,
sulfathiazol, sulfapyridin, sulfamerazin, sulfamethazin, sulfamono-methoxin, sulfachlorpyridazin, sulfamethoxazone, sulfaquinoxalin, và sulfadimethoxin). Điều kiện

chạy sắc ký: Cột C8 (250mm × 3mm, 5m). Pha động là axetonitril (A) và dung
dịch đệm axetat pH = 4,5(B), chạy gradient: bắt đầu với 15% B, đến 22 phút 41%
B, tốc độ pha động 0,4 ml/phút. Detector DAD đặt 270nm. Chuẩn bị mẫu: Cân 10g
mẫu bắp thịt đã được nghiền đồng thể vào ống ly tâm 50ml. Thêm vào đó 10g
Na2SO4 khan và 20ml etyl axetat lắc đều trong 15 phút. Đem ly tâm với tốc độ 3000
vòng/phút trong 10 phút. Pha hữu cơ được chuyển sang bình nón 250ml. Q trình
chiết như vậy được lặp lại lần hai. Kết hợp hai phần chiết lại đem cô cạn bằng hút
chân không. Sau đó đem pha trong 40ml etyl axetat. Chiết pha rắn: Cột Speedisk
được hoạt hố bằng 2×3ml n-hexan và 2×4ml etyl axetat. Sau khi bơm mẫu vào cột
được rửa bằng 5ml nước và 5ml metanol, rửa giải bằng 20ml hỗn hợp
metanol/amoniac (tỷ lệ 97,5/2,5 về thể tích). Dung dịch thu được làm khơ trong
điều kiện chân khơng, rồi hồ tan trong 1ml dung dịch đệm axetat pH = 4,5 với
0,1% metanol. Lọc qua catridge 0,45 và 0,2l trước khi bơm vào máy HPLC.
Phương pháp này có hiệu suất thu hồi các SAs khá cao 55-92%, với giới hạn phát
hiện 0,05 g/kg.
W.Hela và các cộng sự [29] cũng sử dụng phương pháp HPLC - DAD để xác
định đồng thời mười hai SAs (sulfadiazin, sulfathiazol, sulfapyridin, sulfamerazin,
sulfamethizol,sulfadimidin,sulfisoxazol,sulfamethoxazone,sulfatroxazol,sulfachlorp
yrazin, sulfaphenazol và dapsone) trong mẫu bắp thịt, gan và thận của lợn, gà...
Điều kiện chạy sắc ký: pha tĩnh được dùng là cột Phenonmenex Luna C 8 (250 ×
2mm, kích thước hạt nhồi 5m). Pha động là đệm amoniaxetat pH=4,6 (A) và
axetonitril (B), chạy gradient bắt đầu với 5% B đến 60 phút 40% B, tốc độ pha động

23


Luận văn Thạc sĩ
Bùi Minh
Thái
0,35 ml/phút. Detetor DAD đặt 260nm (đối với các SAs), và đặt 294nm (đối với

chất nội chuẩn). Phương pháp này có giới hạn phát hiện các SAs là 1ppb.
Sắc ký lỏng (HPLC) là một phương pháp được lựa chọn cho việc xác định
các chất vô cơ và hữu cơ trong hỗn hợp khác nhau. Tuy nhiên, nhiều chất có thể
khơng được phát hiện trong HPLC vì khơng chứa các màu, huỳnh quang hoặc
nhóm khử oxy hóa. Điều này vấn đề có thể khắc phục bằng các phản ứng dẫn xuất
hóa. Một phản ứng dẫn xuất hóa là cần thiết để tăng độ nhạy cảm hay chọn lọc và
có thể đạt được bởi một phát hiện cụ thể, chẳng hạn như huỳnh quang hoặc hấp thụ
trong ánh sáng nhìn thấy, tại một bước sóng cao. Ngày nay, có rất nhiều cơng trình
nghiên cứu ứng dụng lý thuyết này để phát hiện và tách các sulfamit trong các mẫu
sinh học phức tạp.
PVinas, C.Lopez Erroz, N.Campillo, M.Hernandez [22] xác định dư lượng
sulfamit( sulfadiazine, sulfathiazole, sulfapyridine, sulfamerazine, sulfamethazine,
sulfamethizole,sulfamethoxypyridazine,sulfachloropyridazine,sulfamonomethoxine,
, sulfamethoxazole, sulfadimethoxine) trong thực phẩm bằng phương pháp HPLC
với dẫn xuất hóa huỳnh quang sau cột. Chất dẫn xuất hóa được sử dụng ở đây là
OPA (o-phthldialdehyde) kết hợp với β-mercaptoethanol (ME). Phát hiện huỳnh
quang: Eex =302nm; Eem = 412nm. Xây dựng đường chuẩn: Pha động ban đầu:
acetonitrile-nước (3:97) trong 5 phút sau đó gradient tuyến tính từ(3:97) đến (40:60)
trong 15 phút. Cuối cùng, lặp lại điều kiện ban đầu trong 1phút, giữ trong 15phút,
tốc độ 0,5ml/phút. Chất dẫn xuất hóa (0,01M OPA + 0,02M ME, hòa tan trong
ethanol 2% 0,7M H3PO4) được thêm bởi bơm nhu động tại tốc độ 0,25ml/phút.
Chúng được trộn lẫn và phản ứng trong cuộn PTFE (2,5

0,8 I.D) ở 40oC. Đường

chuẩn của sulphamethoxazole từ 0,01 -2 µg/ml, các sulfamit cịn lại 0,02 -2 µg/ml.
Craig D.C. Salisbury, Jason C.Sweet, Roger Munro[13]sử dụng phương pháp
HPLC với dẫn xuất huỳnh quang trước cột để xác định dư lượng sulfamit
(sulfachloropyridazine,sulfadiazine,sulfadimethoxine,sulfadoxine, sulfaquinoxaline,
sulfaethoxypyridazine, sulfamethazine, sulfathiazole) trong mơ lợn, gan bị, cừu

,ngựa , thịt gà, gan cá, thức ăn chăn ni. Mẫu trích được bảo quản trong đệm pH

24


Luận văn Thạc sĩ
Bùi Minh
Thái
3,0-ACN (60:40), mẫu được dẫn xuất hóa trước cột với fluorescamine. Các chất dẫn
xuất sulfonamide được tách bằng sắc ký lỏng sử dụng cột C18 với pha động: acid
phosphoric 0,02M-ACN(60,5: 39,5) và phát hiện bằng huỳnh quang (E ex = 405 nm;
Eem = 495nm). Giới hạn phát hiện (LOD) cho tất cả các sulfamit được 0,01 μg/g,
ngoại lệ sulfaquinoxaline LOD là 0,015 μg/g.
Qiong-Hui Zou, Xiang-Feng Wang,Yuan Liu, Jin Wang, Jia Song, Hui Gao,
Jie Han[23] cũng xác định dư lượng đồng thời là 12 sulfamit (sulphadiazine,
sulphamethazine,sulphathiazole,sulphadimethoxine,sulphamerazine,sulphapyridine,
sulphamethoxazole,suphamethizole,sulphaquinoxaline,sulphameter,sulphamonomet
hoxine, và sulphachloropyridazine) trong các mô động vật (gan lợn, thịt gà, bắp thịt
bò) bởi HPLC với detecto UV. Chất dẫn xuất hóa trước cột của các hợp chất
sulfamit với 9-fluorenylmethyl chloroformate (FMOC-Cl) đã được đề xuất và các
điều kiện phản ứng đã được tối ưu hóa. Các giới hạn phát hiện cho các hợp chất
sulfamit đã được cải thiện rất nhiều sau khi bước dẫn xuất hố. Dư lượng sulfamit
trong mơ động vật được chiết bằng acetonitrile và tinh chế bằng cách chiết pha rắn
với C18. Phương pháp này có độ nhạy cao và lặp lại tốt và hiệu suất thu hồi trung
bình trên 70%. Các giới hạn phát hiện cho hầu hết các sulfamit có thể đạt 3-5 μg/kg.
1.2.2. Một số cơng trình nghiên cứu xác định Metronidazole bằng phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
HPLC là phương pháp mới được ứng dụng để xác định Metronidazole trong
những năm gần đây.
Năm 2005, Ticiano Gomes Nascimento và cộng sự [26] sử dụng HPLC – UV

xác định đồng thời ranitidine và metronidazole trong huyết tương. 250ml huyết
tương sau khi được kết tủa với percloric 60%, ly tâm, sau đó tiêm trực tiếp vào
HPLC. Điều kiện tách: cột C18 Shimpak, pha động KH2PO4 10mM(pH=3,5) –
ACN(90:10,v/v), phát hiện UV tại bước sóng 315nm. Phương pháp này cho độ
chính xác cao (RSD <15%). Hiệu suất thu hồi: ranitidine (96,22 ± 3,52);
metronidazole (95,00 ± 4,50%). Định lượng ranitidine trong huyết tương là
20ng/ml, metronidazole là 40ng/ml.

25