Nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp GP5 m của virus PRRS gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn

LỜI CẢM ƠN
Trong q trình thực tập, hồn thiện khóa luận tốt nghiệp, tại Phịng Cơng
nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam em đã nhận đƣợc rất nhiều sự quan tâm và giúp đỡ tận tình
của các giáo viên hƣớng dẫn,cùng các thầy cô và cán bộ nghiên cứu tại phịng
thí nghiệm của Viện, với sự nỗ lực cố gắng của bản thân, em đã hồn thành khóa
luận tốt nghiệp của mình.
Em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Chu Hồng Hà, Viện
trƣởng Viện Cơng nghệ sinh đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt q trình
thực hiện khóa luận.
Em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới NCS.ThS. Nguyễn Thị Minh Hằng,
PGS.TS Phạm Bích Ngọc đã giúp đỡ, giảng dạy, đem đến cho em những kiến
thức quý báu về Công nghệ sinh học, ngƣời đã tạo cho em những cơ hội quý báu
để thực hiện niềm say mê nghiên cứu khoa học và cũng là giáo viên hƣớng dẫn
em trong quá trình thực tập tốt nghiệp. Nội dung của đề tài khóa luận này cũng
nằm trong đề tài nghiên cứu sinh của NCS.ThS Nguyễn Thị Minh Hằng.
Em xin chân thành cảm ơn ThS. Hồ Thị Thƣơng, ThS. Nguyễn Thu Giang
cùng toàn thể cán bộ, học viên, sinh viên Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện
Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện làm việc, giúp đỡ và truyền đạt để lại cho
em những kiến thức, kinh nghiệm làm việc quý báu và cần thiết cho bản thân
sau này.
Trong quá trình học,thực tập, hồn thiện, hồn thành chƣơng trình học và
khóa luận tốt nghiệp chuyên ngành Công nghệ sinh học tại Trƣờng Đại học Lâm
nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học
Lâm Nghiệp, Ban Giám hiệu Trƣờng Đại học Lâm nghiệp đã tạo điều kiện thuận
lợi cho em học tập, nghiên cứu và giảng dạy em những kiến thức nền tảng làm
phong phú thêm nguồn kiến thức của bản thân em cũng nhƣ là tiền đề trong
công việc ở tƣơng lai sau khi em bƣớc ra khỏi cánh cổng đại học.
v

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình và bạn bè, những
ngƣời đã ln bên cạnh động viên, góp ý cho em trong suốt quá trình học tập và
hồn thành khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 05 tháng 4 năm 2018
Sinh viên

Trần Thị Ngọc

vi


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... v
MỤC LỤC ........................................................................................................... vii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ..................................................................... ix
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................. x
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................. xi
MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 12
Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 3
1.1.Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn .................................................. 3
1.1.1. Giới thiệu chung .......................................................................................... 3
1.1.2. Nguyên nhân gây bệnh lợn tai xanh............................................................ 4
1.1.3. Tình hình dịch bệnh lợn tai xanh ................................................................ 7
1.1.4. Sản xuất vacxin phòng dịch bệnh lợn tai xanh ......................................... 11
1.2. Hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật ......................................... 13
1.3. Sản xuất protein tái tổ hợp tạm thời bằng phƣơng pháp agroinfiltration..... 15
Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 17
2.1. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu................................................................. 17
2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu.................................................................................. 17

2.1.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 17
2.2. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 17
2.2.1. Chủng vi khuẩn ......................................................................................... 17
2.2.2. Các vector và vật liệu thực vật .................................................................. 17
2.2.3. Các cặp mồi sử dụng ................................................................................. 18
2.3. Hóa chất, thiết bị .......................................................................................... 18
2.3.1. Hố chất..................................................................................................... 18
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 19
2.4.1. Phƣơng pháp khuếch đại gen bằng phản ứng PCR ................................... 19
2.4.2. Phản ứng nối ghép gen (ligation) .............................................................. 20
2.4.3. Biến nạp plasmid vào tế bào E. coli và A. tumefaciens........................... 21
vii


2.4.4. Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) .......................... 22
2.4.5. Tách chiết và tinh sạch plasmid ................................................................ 22
2.4.6. Cắt plasmid kiểm tra bằng enzyme cắt giới hạn ....................................... 24
2.4.7. Phƣơng pháp trong biểu hiện tạm thời ...................................................... 24
2.4.8. Tách chiết protein tổng số ......................................................................... 25
2.4.9. Phƣơng pháp điện di SDS-Page và lai miễn dịch Western blot ............... 25
Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 27
3.1. Thiết kế vector tách dịng pRTRA tái tổ hợp gen mã hóa kháng nguyên
GP5-M gắn kết Elastin like-polypeptide. ............................................................ 27
3.1.1. Kết quả khuếch đại đoạn gen gp5-m bằng kỹ thuật PCR ......................... 27
3.1.2. Tạo vector tách dòng pRTRA tái tổ hợp gen mã hóa kháng nguyên GP5M gắn kết Elastin like-polypeptide ..................................................................... 27
3.1.3. Thiết kế vector chuyển gen pCB301 tái tổ hợp gen mã hóa kháng nguyên
GP5-M gắn kết Elastin like-polypeptide ............................................................. 30
3.1.4. Tạo chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector pCB301-gp5-m100xELP tái tổ hợp.............................................................................................. 32
3.2. Kết quả biểu hiện gen gp5-m ở cây thuốc lá N. benthamiana ..................... 33
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. 36

Kết luận ................................................................................................................ 36
Kiến nghị ............................................................................................................. 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO

viii


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
bp

Base pair

CMV

Cauliflower mosaic virus

cDNA

Complementary DNA

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxyribonucleotide triphosphate

E. coli

Escherichia coli

EDTA

Ethylene Diamine Tetra-Acetate
acid

EtBr

Ethidium Bromide

HA

Hemagglutinin

Kb

Kilobase

KDa

Kilodalton

LB

Luria and Bertani

PBS

Phosphate-buffered saline

PCR

Polymerase Chain Reaction

PCS

Polycloning site

RNA

Ribonucleic acid

RNase

Ribonuclease

SAP

Shrimp alkaline phosphatase

SDS

Sodium dodecyl sulfate

TAE

Tris Acetate EDTA

Taq DNA polymerase

Thermus
polymerase

v/p

vòng/phút

ix

aquaticus

DNA


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu .............................................. 18
Bảng 2.2. Thành phần tham gia phản ứng PCR .................................................. 19
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng nối ghép gen.................................................... 20
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng enzyme cắt giới hạn ............ 24

x


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Đặc điểm hình thái cơ bản của virus PRRS .......................................... 6
Hình 1.2. Mơ hình cấu trúc và các khung đọc mở trên hệ gen virus PRRS ......... 7
Hình 1.3. Cây N. benthamiana ............................................................................ 13
Hình 2.1. Xâm nhiễm cây bằng phƣơng pháp hút chân khơng. .......................... 34

Hình 3.1. Sản phẩm khuếch đại đoạn gen gp5-m bằng phản ứng PCR .............. 27
Hình 3.2. Colony-PCR chọn dịng tế bào E.coli mang plasmid pRTRA-gp5-mELP ...................................................................................................................... 28
Hình 3.3 Kiểm tra sản phẩm cắt vector pRTRA-gp5-m-ELP tái tổ hợp bằng
enzyme giới hạn HindIII ..................................................................................... 29
Hình 3.4. Bản đồ cấu trúc vector tách dịng pTRA35S-gp5-m –ELP. ................ 30
Hình 3.5. Kiểm tra sản phẩm cắt plasmid pCB301-gp5-m-ELP tái tổ hợp bằng
enzyme cắt giới hạn HindIII................................................................................ 31
Hình 3.6. Bản đồ cấu trúc vector chuyển gen pCB301-gp5-m-100xELP........... 32
Hình 3.7. Colony-PCR ........................................................................................ 33
Hình 3.8. Xác định sự biểu hiện của kháng nguyên GP5-M bằng Western blot 35

xi


MỞ ĐẦU
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and
Respiratory Syndrome, PRRS) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do virus gây ra,
có khả năng lây lan nhanh gây thiệt hại nặng nề cho ngành kinh tế. Ở Việt Nam,
bệnh còn đƣợc gọi là bệnh “lợn tai xanh” do lợn mắc bệnh thƣờng bị xung huyết
ở tai, lúc đầu đỏ sẫm sau đó tím xanh. Đặc trƣng của bệnh là hiện tƣợng sẩy thai
ở lợn nái đang chửa hoặc các triệu chứng bệnh về đƣờng hô hấp, đặc biệt là ở
lợn con cai sữa.
Bệnh đƣợc phát hiện lần đầu tiên ở Hoa Kỳ năm 1987. Sau đó xuất hiện ở
nhiều nƣớc chăn ni lợn theo phƣơng thức công nghiệp: Canada (1987); Nhật
Bản (1989); Đức (1990); Hà Lan, Tây Ban Nha, Anh, Pháp (1991); Đan Mạch
(1992)…. Từ năm 1992, bệnh đã gây ra các ổ dịch lớn ở nhiều nƣớc khác thuộc
Bắc Mỹ, châu Âu và châu Á, gây tổn thất lớn cho nghề chăn nuôi lợn trên thế
giới.
Ở Việt Nam, lần đầu tiên phát hiện đƣợc huyết thanh dƣơng tính với
PRRS trên đàn lợn nhập khẩu từ Hoa Kỳ năm 1997 (Tô Long Thành, 2007). Sau

nhiều năm khơng có dịch, đến đầu tháng 3 năm 2007, lần đầu tiên dịch bệnh đã
bùng phát dữ dội tại tỉnh Hải Dƣơng, sau đó lan nhanh sang các tỉnh lân cận nhƣ
Hải Phịng, Thái Bình, Hƣng n, Bắc Ninh, Bắc Giang và Quảng Ninh. Cho
đến nay, dịch bệnh đã bùng phát rộng khắp trên cả ba miền của cả nƣớc, gây
thiệt hại nặng nề về kinh tế cũng nhƣ các vấn đề an sinh xã hội cho các địa
phƣơng này.
PRRS là một bệnh virus mới gần nhƣ đồng thời đƣợc tìm thấy ở Mỹ và
châu Âu vào cuối những năm 1980 và đầu những năm 1990, tƣơng ứng. Cho
đến nay, PRRS đã lan rộng ra toàn thế giới với các đặc điểm của dịch bệnh đặc
hữu ở những nƣớc nuôi lợn, gây thiệt hại kinh tế rất lớn mỗi năm. Nghiên cứu
phát triển vaccine PRRS hiệu quả đã đi đầu trong nghiên cứu lâm sàng trong
những năm gần đây. Mặc dù vắc-xin sống biến đổi (MLV) và vaccine bất hoạt
hiện nay có sẵn trên thị trƣờng và đƣợc sử dụng rộng rãi. Đã khơng có một báo
xii


cáo nào cho thấy virus sống có thể có khả năng trở lại độc lực và gây ra các triệu
chứng giống nhƣ PRRS trong suốt thời gian tồn tại ở đàn lợn sau khi chủng
ngừa . Vaccine giết chết không thể luôn cung cấp khả năng miễn dịch bảo vệ
vững chắc ở cấp độ đàn. Có một yêu cầu cấp bách để phát triển văcxin hiệu quả
hơn và thay đổi các chiến lƣợc chống lại căn bệnh này. Thiết kế virus tái tổ hợp
là một trong những phƣơng pháp phổ biến và hữu ích.
Vacine thực vật hay cịn goị là vaccine ăn đƣợc (edible vacine) là một
trong những sản phẩm của công nghệ sinh học hiện đại. Thực chất vacine thực
vật là vacine tiểu đơn vị đƣợc sản xuất dựa trên hệ thống thực vật để thu protein
kháng nguyên mong muốn. So với các hệ thống sản xuất vacine truyền thống,
vacine thực vật có nhiều ƣu điểm nhƣ: dễ dàng tăng quy mô sản xuất và thu sinh
khối; các kháng nguyên biểu hiện trong thực vật ổn định ở nhiệt độ phịng nên
dễ bảo quản và sử dụng; có thể dùng qua đƣờng miệng nhƣ ăn tƣơi hoặc nấu
chín an tồn; đặc biệt vacine ăn đƣợc kích thích sản xuất kháng thể của hệ thống

niêm mạc ruột hiệu quả hơn vacine tiêm.
Từ những cơ sở trên tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu biểu hiện protein
tái tổ hợp GP5-M của virus PRRS gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở
lợn”.

2


Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp ở lợn
1.1.1. Giới thiệu chung
Bệnh có thể xâm nhiễm vào lợn ở mọi lứa tuổi, tỷ lệ Hội chứng rối loạn hô
hấp và sinh sản ở lợn (PRRS viết tắt của: Porcine reproductive and respiratory
syndrome) hay còn gọi là bệnh lợn tai xanh là một bệnh truyền nhiễm nguy
hiểm, lây lan nhanh và làm chết nhiều lợn, bệnh gây thiệt hại lớn cho
ngành chăn nuôi lợn trong nƣớc nói riêng và trên thế giới nói chung.
Bệnh có thể xâm nhiễm vào lợn ở mọi lứa tuổi, tỷ lệ chết thay đổi theo từng
nhóm lợn khác nhau từ 20-100%. Thời gian ủ bệnh 2-5 tuần. Tốc độ lây lan
nhanh trong vòng 3-5 ngày từ một vài cá thể nhiễm bệnh có thể dẫn đến cả đàn
bị nhiễm bệnh. Sự lây lan của bệnh chủ yếu thông qua tiếp xúc trực tiếp giữa lợn
bệnh và lợn khỏe mạnh.
Virus gây bệnh có trong dịch mũi, nƣớc bọt, tinh dịch (trong giai đoạn
nhiễm trùng máu), phân, nƣớc tiểu và phát tán ra mơi trƣờng. Ở lợn mẹ mang
trùng, virus có thể lây nhiễm cho bào thai từ giai đoạn giữa thai kỳ trở đi, virus
cũng đƣợc bài thải qua nƣớc bọt và sữa. Virus có thể phát tán thơng qua các hình
thức: vận chuyển lợn mang trùng, theo gió (có thể đi xa tới 3 km), bụi, bọt nƣớc,
dụng cụ chăn nuôi và dụng cụ bảo hộ lao động nhiễm trùng, thụ tinh nhân tạo và
có thể do một số lồi chim hoang.
Hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp ở lợn lần đầu tiên đƣợc ghi nhận ở

Hoa Kỳ vào năm 1987, vào thời điểm đó, có những mẫu bệnh phẩm lợn khi
phân lập ra virus nhƣng chủng khơng có độc tính và do chƣa xác định đƣợc căn
bệnh nên gọi là “bệnh bí hiểm” (MD: Mystery Swine) và sau đó có tên lần lƣợt
nhƣ sau:


Bệnh tai xanh ở lợn (MDS: Mystery Swine Disease)



Bệnh dịch 89 ở lợn
3




Hội chứng hô hấp và vô sinh ở lợn (SIRS: Swine Infertility and

Respiratory Syndrome)


Bệnh sốt cao-biến ăn-sảy thai ở lợn (HAAT: Hyperthermie Avortements

des Truies)


Bệnh tai xanh (Blue Ear Disease)



Hội chứng dịch sảy thai ở lợn tại Châu Âu (PEARS: Porcine Epidemic

Abortion Syndrome)


Năm 1992, hội nghị quốc tế về sức khỏe gia súc đã đƣợc tổ chức thú y

thế giới nhất trí và cơng nhận bệnh bí hiểm này là Hội chứng rối loạn sinh sản và
hô hấp ở lợn (PRRS).
1.1.2. Nguyên nhân gây bệnh lợn tai xanh
Nguyên nhân gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn do một loại
virus thuộc họ Arteriviridae. Họ Arteriviridae chỉ có một giống Aterivirus bao
gồm hai loại là: Equine Ateritis Virus (EAV) gây viêm động mạch, sẩy thai và
viêm phổi ngựa non và Porcine Respirstory and Reproductive Syndrome Virus
(PRRSV) gây rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn.
Virus PRRS:
Virus PRRS huộc họ Arteriviridae, giống Nidovirales, có cấu trúc vỏ bọc dạng
chuỗi đơn RNA, hình cầu, kích thƣớc 45 - 80 nm và chứa nhân nucleocapsid 25
- 35 nm, trên bề mặt có những gai nhơ ra rõ. Hiện nay có 2 kiểu gen PRRS chính
đƣợc cơng nhận là châu Âu (Nhóm I) có tên gọi là Lelystad và Bắc Mỹ (Nhóm
II) có tên gọi là VR2332. Khi so sánh về di truyền có sự khác nhau rõ rệt
(khoảng 40%) giữa 2 kiểu gen này. Ở châu Á và Nam Mỹ ngƣời ta đã phân lập
đƣợc cả hai kiểu gen. Trong mỗi kiểu gen cũng có các chủng khác nhau.
Các virus PRRS có khả năng phát triển, nhân lên bên trong tế bào đại thực
bào và tiêu diệt đại thực bào. Virus PRRS có thể tiêu diệt tới 40% đại thực bào,
làm phá huỷ phần lớn hệ thống bảo vệ cơ thể khiến cho các vi khuẩn, virus khác
có cơ hội phát triển và gây bệnh.

4

Virus tƣơng đối mẫn cảm và dễ dàng bị tiêu huỷ bởi các yếu tố vật lý, hóa
học. Cụ thể, virus bị tiêu huỷ nhanh chóng khi mơi trƣờng có pH<5,5 hoặc
pH>6,5 và tính gây bệnh cũng giảm đi đến 90% ở những môi trƣờng nhƣ vậy;
đối với tác động của nhiệt độ vi rút có thể tồn tại 1 năm trong nhiệt độ lạnh
từ

-200C đến -700C; trong điều kiện 40C vi rút có thể sống 1 tháng; với nhiệt

độ cao, cũng nhƣ các virus khác, PRRSV đề kháng kém: ở 37 0C chịu đƣợc 48
giờ, 560C bị giết sau 1 giờ. Với các hố chất sát trùng thơng thƣờng nhƣ
Chloroform hoặc Ether và mơi trƣờng có pH axit, virus dễ dàng bị tiêu diệt. Ánh
sáng

mặt

trời,

tia

tử

ngoại

vơ

hoạt

virus

nhanh

chóng

( />.Cấu trúc virus PRRS:
Virus PRRS là dạng đa hình thái. Virion có dạng hình cầu hoặc trịn với
kích thƣớc giao động từ 50-65 nm, nhân rỗng chia lớp, đƣờng kính 40 nm và bề
mặt bên ngoài nhẵn với nhiều protein đƣợc gắn vào.
Gen đƣợc bao bọc xung quanh bởi nucleocapsid cấu thành bởi một chuỗi
phân lớp kép các protein homodomer đƣợc bó trong một hình cầu rỗng. Nhân
nucleocapsid đƣợc bao quanh bởi một màng lipid, lớp vỏ bao quanh các protein
cấu trúc đƣợc gắn chặt. Các protein chính hợp thành lớp vở lipid là GP5 và M,
cùng nhau vây quanh ít nhất một nửa tổng số protein virus. GP5 và M hình
thành nên một cầu nối 2 sulfur thơng qua các phần cịn lại trong cả hai protein.
Các protein cấu trúc chính GP2, GP3, GP4 hình thành nên phức hợp chặt ch
trong lớp vỏ lipid và ít nhất với virus PRRS týp 1 thì protein E cũng là một phần
của phức hợp này. Protein ORF5a đƣợc khám phá gần đây đƣợc tin là protein
cấu trúc thứ 8 của virus PRRS, nhƣng sự định hƣớng của nó trong virion và sự
tƣơng tác với các protein cấu trúc khác vẫn cần đƣợc làm rõ.

5


Hình 1.1. Đặc điểm hình thái cơ bản của virus PRRS
( />Đa dạng di truyền của virus PRRS:
Từ những nghiên cứu ban đầu 2 bộ gen khác nhau của virus PRRSv đã
đƣợc định danh, bao gồm genotype 1 (chủng Châu Âu); genotype 2 (chủng Bắc
Mỹ). Mặc dù cấu trúc và hình thái của genotype 1 và genotype 2 là tƣơng tự
nhau, và xuất hiện gần nhƣ đồng thời ở cả 2 châu lục, nhƣng chúng bộc lộ sự
khác nhau về phân tử và đặc tính kháng nguyên rõ rệt. Những chủng virus đầu

tiên (VR2332 và Lelystad(LV)) đóng góp khoảng 60% nucleotide đồng nhất ở
cấp độ gen. Mỗi kiểu gen phân lập đƣợc có sự biến thiên tới 20 % trong chuỗi
nucleotide là do kết quả của sự đột biến ngẫu nhiên (RNA không ổn định) và sự
tái tổ hợp gen. Tỷ lệ đột biến với chủng virus PRRS kiểu gen 1 đƣợc tính tốn là
giữa 1.4x10-2 base thay thế cho một vị trí một năm (s/s/y) và 7.7 2.1x10-2
s/s/y. Tỷ lệ đột biến này khá giống với các virus khác có bản chất RNA. Sự biến
thiên đƣợc phân bố một cách khơng đổi.
Hệ gene của PRRSV có kích thƣớc khoảng 15 kb, với 9 khung đọc mở
(ORF): 1a, 1b, 2a, 2b, 3-7. Glycoprotein 5 (GP5) đƣợc mã hóa bởi ORF 5, là
một trong những thành phần chính của hạt virus với vùng ngoại bào 40 axit
amin và vùng nội bào 50 đến 70 axit amin (Dea S.và Dtg 2000). GP5 có một
đoạn tín hiệu peptide định hƣớng tại đầu cuối N của protein và bị glycosyl hóa
sau dịch mã từ 2 đến 4 vị trí đó là N30, N33, N44 hoặc N51 (Zhou YJ va Đtg
6


2009). Vị trí đƣợc glycosyl hóa rất quan trọng cho q trình hình thành cấu trúc
và duy trì hoạt tính của protein (Ansar và Đtg 2006). GP5 đƣợc biết nhƣ yếu tố
kích thích việc sản sinh kháng thể trung hịa ở lợn và đây là một vấn đề then
chốt của miễn dịch dịch thể. Những chủng PRRSV mang đột biến loại vùng
glycosyl hóa ở GP5 cho thấy khả năng kích thích sinh kháng thể trung hịa cao
hơn chủng dại.
Virus PRRS có tỷ lệ đột biến cao tƣơng tự hoặc cao hơn các virus RNA
khác. Từ khi xuất hiện, sự đa dạng của nó ở Châu Âu ngày càng tăng lên. Việc
xuất nhập những lợn dƣơng tính với PRRS ở các nƣớc / các vùng địa lý khác
nhau đã dẫn tới sự khác biệt ngày càng tăng của các chủng virus PRRS phân lập
đƣợc tại Châu Âu.

Hình 1.2. Mơ hình cấu trúc và các khung đọc mở trên hệ gen virus PRRS
( />1.1.3. Tình hình dịch bệnh lợn tai xanh

Lịch sử bệnh


Năm 1987, PRRS lần đầu tiên đƣợc phát hiện tại Hoa Kỳ.



Năm 1988, bệnh này lây lan sang Canada (nằm kế Hoa Kỳ).

7




Đến năm 1990, bệnh lan sang các nƣớc Châu Âu: Đức (1990); các

nƣớc Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ, Anh (1991); Pháp (1992).


Từ năm 1996, PRRS đƣợc phát hiện tại châu Á: Trung Quốc (1996), Việt

Nam (1997), Hàn Quốc (1998), Nhật Bản (1998)


Cho đến nay, rất nhiều nƣớc và lãnh thổ phát hiện PRRS.



Ở Việt Nam, bệnh đƣợc phát hiện vào năm 1997 trên đàn lợn nhập từ Hoa

Kỳ.
Trên thế giới
Theo thống kê của Tom F. Duinhof (4/2014) ngành chăn nuôi lợn của
Đan Mạch thiệt hại 15 triệu bảng mỗi năm do dịch bệnh lợn tai xanh, và con số
này ở Mỹ là 560 triệu bảng. Theo tiến sỹ Trevor Drew - Trƣởng phịng Virus
học, Cơ quan Thí nghiệm Thú y ở Weybridge, Anh, sự biến chủng của PRRS
nhanh một cách bất thƣờng và coi đây là một trong những virus tiến hóa nhanh
nhất
trong
những
virus
mà
ơng
đã
nghiên
cứu
(www.roslin.ed.ac.uk/events/EuroPRRSnetAbstractBook.doc). Thơng thƣờng,
virus lƣu ở vật chủ và gây bệnh hiểm nghèo rồi giảm dần độc lực theo thời gian.
Với PRRS, virus hành xử theo cách ngƣợc lại. Đầu tiên, chủng không độc hại
lƣu hành trên vật chủ ở các trại lợn Bắc Mỹ. Sau đó, chúng biến chủng và độc
lực ngày càng mạnh ở nhiều nƣớc khác nhau. Về tính đa dạng di truyền, dựa vào
kiểu gene (genotype), PRRSV đƣợc chia làm hai loại: kiểu gene châu Âu (type
I), đại diện tƣơng ứng là chủng Lelystad (LV) và kiểu gene Bắc Mỹ (type II), đại
diện tƣơng ứng là chủng VR2332. Tuy bố trí sắp xếp gene giống nhau, nhƣng
đặc tính của các gene, độ dài các gene và đặc tính sinh học (tính gây bệnh và
kháng nguyên - miễn dịch) của các chủng thuộc 2 dòng PRRSV này có khác
nhau. Cụ thể, ngƣời ta đã chứng minh rằng có sự biến dị di truyền mạnh trong cả
2 type phân lập, đƣợc khẳng định qua phân tích trình tự nucleotide và amino
acid của các khung đọc mở của LV và VR-2332. Trình tự amino acid của VR2332 so với LV là 76% (ORF 2), 72% (ORF3), 80% (ORF4 và 5), 91% (ORF6)
và 74% (ORF7), phân tích trình tự cho thấy các virus đang dần tiến hoá do đột

biến ngẫu nhiên và tái tổ hợp trong gen (Murtaugh và đtg, 1995, Nelsen và đtg,
1999, Meng và đtg, 1995, Karpur và đtg, 1997). Hiện nay, PRRSV đƣợc xem
nhƣ là một trong những tác nhân gây bệnh ở lợn nghiêm trọng nhất trên thế giới.
8


Từ năm 2005 trở lại đây, 27 nƣớc và vùng lãnh thổ thuộc tất cả các châu
lục (từ châu Đại Dƣơng) trên thế giới đã báo cáo cho Tổ chức Thú y thế giới
khẳng định phát hiện có bệnh Tai xanh lƣu hành. Hiện nay, hội chứng này đã
trở thành dịch địa phƣơng ở nhiều nƣớc trên thế giới, kể cả các nƣớc có ngành
chăn ni lợn phát triển nhƣ Mỹ, Hà Lan, Đan Mạch, Anh, Pháp, Đức... và đã
gây ra những tổn thất rất lớn về kinh tế cho ngƣời chăn ni lên đến hàng trăm
triệu đơ la. Ví dụ: hàng năm Mỹ phải chịu tổn thất cho bệnh tai xanh gây ra
khoảng 560 triệu USD. Các nƣớc trong khu vực có tỷ lệ bệnh tai xanh lƣu hành
rất cao, ví dụ: ở Trung Quốc là 80%. Đài Loan là 94,7% - 96,4%, Philippine là
90%, Thái Lan là 97%, Malaysia là 94%, Hàn Quốc là 67,4% 73,1%.
- Tại Trung Quốc: Theo báo cáo của đoàn chuyên gia quốc tế và chuyên gia
của Trung Quốc đã đƣợc phát hành vào tháng 12/2007, kể từ năm 2006, đàn lợn
của Trung Quốc đã bị ảnh hƣởng nghiêm trọng bởi "Hội chứng sốt cao ở lợn"
do nhiều nguyên nhân, trong đó chủ yểu là virus PRRS và các loại mầm bệnh
này đã làm hàng triệu lợn bị ốm, chết và phải tiêu hủy. Kết quả nghiên cứu toàn
diện của Trung Quốc đã khẳng định chủng virus PRRS gây bệnh tại nƣớc này là
chủng độc lực cao, đặc biệt có sự biến đổi của virus (thiếu hụt 30 acid amin
trong gen). Năm 2007, các tỉnh Anhui, Hunan, Guangdong, Shandong,
Liaoning, Jilin và một số tỉnh khác bị ảnh hƣởng nặng buộc Trung Quốc phải
tiêu hủy tới 20 triệu lợn để ngăn chặn dịch lây lan.
Trƣớc diễn biến phức tạp của dịch tai xanh, Bộ Nông nghiệp Trung Quốc
đang thực hiện chƣơng trình phịng chống bệnh rất quy mơ, riêng chƣơng trình
nghiên cứu, sản xuất vác xin đã đƣợc cam kết chi khoảng 280 triệu Nhân dân tệ
tƣơng đƣơng với 36,5 triệu USD.

- Tại Hồng Kông và Đài Loan đã xác định có cả hai chủng Châu Âu và Bắc
Mỹ cùng lƣu hành, đặc biệt trong cùng một con lợn ở Hồng Kông đã xác định
nhiễm cả hai chủng nêu trên; dịch tai xanh cũng đƣợc thông báo ở Thái Lan từ
các năm 2000 - 2007. Thông báo cho biết các vi rút gây bệnh tai xanh đƣợc phán
lập từ nhiều địa phƣơng thuộc nƣớc này gồm cả chủng dòng châu Âu và chủng
9


dịng Bắc Mỹ. Trong đó, số vi rút thuộc chủng dòng châu Âu chiếm 66,42%,
còn các virus thuộc chủng dòng Bắc Mỹ chiếm 33,58%. Phần lớn ở những quốc
gia này hiện còn đang lƣu hành virus gây bệnh Tai xanh chủng châu Âu hoặc
Bắc Mỹ, là những chủng virus cổ điển độc lực thấp.
- Tháng 9/2007, Nga là nƣớc thứ 3 đã báo cáo chính thức có dịch bệnh Tai
xanh do chủng virus PRRS thể độc lực cao gây ra. (Theo Tài liệu của Cục Thú y).
- Tại hàn Quốc (2005 -2006), khi xét nghiệm 692 mẫu có tỷ lệ dƣơng tính
PRRS là 69,10%, tỷ lệ này ở Philippin 59%.
Tại Việt Nam
Mặc dù virus đã xuất hiện ở Việt Nam từ 15 năm trƣớc đây nhƣng các dịch
bệnh nặng chỉ đƣợc thông báo vào đầu năm 2007 (Tô Long Thành, 2007) và lây
lan khắp 17 tỉnh trên khắp cả nƣớc và gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi
trong nƣớc (Đậu Ngọc Hào và đtg., 2008), với tổng số hơn 60.000 heo mắc
bệnh, số chết và phải tiêu huỷ là hơn 15.000 con, tỷ lệ chết thực do PRRSV lên
đến 15%. Do tình hình dịch bệnh và hệ thống chăn nuôi heo phức tạp ở Việt
Nam, bệnh đã trở nên khơng kiểm sốt và lây lan ngày càng rộng hơn. Số địa
phƣơng có dịch ngày càng mở rộng, số lƣợng gia súc mắc bệnh tăng và thời gian
kéo dài. Nếu nhƣ năm 2007, tồn quốc có 324 xã, phƣờng của 65 quận, huyện
thuộc 18 tỉnh, thành phố có dịch với số lƣợng lợn mắc bệnh là 70.577 con thì
đến năm 2008, dịch đã xảy ra ở 956 xã, phƣờng thuộc 103 huyện của 28 tỉnh,
thành phố; tổng số lợn mắc bệnh là 309.586 con. Trong 6 tháng đầu năm 2010,
dịch heo tai xanh đã lây lan trên diện rộng ở nhiều tỉnh trên khác cả nƣớc, kéo

dài một cách bất thƣờng (Cục Thú y, Bộ Nông nghiệp và PTNT). Ngay cả trong
khi khơng có dịch bệnh xuất hiện thì ở các trại nuôi lợn virus PRRSV vẫn âm
thầm tồn tại. Một số nghiên cứu về bệnh PRRS trên những trại ni lợn giống
tại các tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ lợn có huyết thanh dƣơng tính với virus
PRRS rất khác nhau (1,3% - 68,29%), vì thế việc quản lý kịp thời diễn biến bệnh
là vô cùng cần thiết. PRRSV cũng khơng là ngoại lệ, mang đặc tính chung của
10


các bệnh gây ra do virus là tính biến đổi di truyền cao. Ngày càng nhiều các
bằng chứng cho thấy PRRSV đa dạng về các đặc tính sinh học, kháng nguyên
cũng nhƣ độc học và chính điều này gây ra các biểu hiện lâm sàng phức tạp hơn.
Thêm vào đó, theo kết quả phân tích của đồn chun gia Tổ chức Nông lƣơng
Liên hiệp quốc (FAO) cho thấy, PRRSV đang lƣu hành tại Việt Nam là chủng
virus có độc lực cao ( Điều này đồng nghĩa, tỷ lệ tử vong cao
hơn và dịch bệnh lan càng nhanh (Chu Hoàng Hà và đtg, 2012-2014).
1.1.4. Sản xuất vacxin phòng dịch bệnh lợn tai xanh
Vì sự nguy hiểm và những thiệt hại lớn về kinh tế mà PRRSV gây ra, việc
kiểm soát sự lây lan của dịch bệnh ln đƣợc địi hỏi. Trong đó, biện pháp miễn
dịch bằng tiêm phịng là cách đơn giản và an toàn nhất để hạn chế dịch bệnh.
Gần đây chỉ có một số lƣợng hạn chế các vacxin bất hoạt và nhƣợc độc cho bệnh
lợn tai xanh sử dụng các chủng của châu Mỹ hoặc châu Âu (Botner và đtg,
1999; Diaz và đtg, 2006; Labarque và đtg, 2003; Van Woensel và đtg, 1998).
Vacxin dạng này có một số nhƣợc điểm nhƣ vacxin bất hoạt hiệu quả bảo vệ
miễn dịch thƣờng khơng cao (Nilubol và đtg, 2004), cịn vacxin nhƣợc độc tạo
ra mức độ bảo vệ tốt đối với các chủng tƣơng đồng, nhƣng lại có nguy cơ phát
triển độc tính trở lại (Meng, 2000). Hiện nay trên thị trƣờng Việt Nam cũng có
hai loại vacxin chống PRRSV dạng này với giá thành khá cao 40.000 đồng/liều,
nhƣng hiệu quả chỉ đạt 40% và chỉ có khả năng điều trị các các triệu chứng lâm
sàng mà không bảo vệ động vật miễn nhiễm với virus. Cho đến nay, thế giới

duy nhất có Trung Quốc sản xuất đƣợc vacxin chống virus PRRS độc lực cao,
tuy nhiên họ chƣa có giấy phép để xuất khẩu loại vacxin trên. Hệ thống biểu
hiện protein tái tổ hợp ở thực vật
Cho đến nay, thế giới duy nhất có Trung Quốc sản xuất đƣợc vacxin chống
virus PRRS độc lực cao, tuy nhiên họ chƣa có giấy phép để xuất khẩu loại
vacxin trên.
Gần đây, một vài hƣớng mới đã đƣợc ứng dụng để phát triển các loại
vacxin chống PRRSV khác nhau, bao gồm vacxin DNA (Hou và đtg, 2008;
Jiang và đtg, 2006b) và virus vector pseudorabies biểu hiện GP5 (Qiu và đtg,
11


2005), adenovirus biểu hiện GP5/M (Jiang và đtg, 2006a), pseudotype
baculovirus biểu hiện GP5/M (Wang và đtg, 2007), virus vaccinia biểu hiện
GP5/M (Zheng và đtg, 2007) và cây thuốc lá biểu hiện GP5 (Chia và đtg,
2010)... Đây là những cơ sở quan trọng cho các nghiên cứu tiếp theo sản xuất
kháng nguyên GP5-M tạo vacxin phòng bệnh lợn tai xanh.
Vacxin đang sản xuất trong nƣớc vacxin nội hiệu lực cao
Để giải quyết vấn đề này, dự án khoa học và công nghệ phát triển sản phẩm
quốc gia “Công nghệ sản xuất vacine phịng hội chứng rối loạn hơ hấp và sinh
sản cho lợn” đƣợc triển khai, với sự chủ trì của Học viện Nông nghiệp Việt
Nam. Đây là dự án nằm trong chƣơng trình Phát triển sản phẩm quốc gia đến
năm 2020 - một trong các chƣơng trình khoa học và công nghệ quốc gia đang
đƣợc triển khai tại Bộ Khoa học và Công nghệ.
Trong giai đoạn đầu (từ tháng 12/2014 đến tháng 1/2017), dự án đã tuyển
chọn thành công 3 chủng virus cƣờng độc (gồm KTY-PRRS-06, KTY-PRRS07, KTY-PRRS-08) với độ vô trùng, thuần khiết đạt 100%. Vaccine cũng đạt
đƣợc sự ổn định về đặc tính sinh học và sinh học phân tử sau 5 lần cấy truyền
trên môi trƣờng tế bào, tính độc trên động vật thí nghiệm và tính kháng ngun.
Ngồi ra, dự án cũng xây dựng thành cơng quy trình tạo chủng giống gốc
virus tai xanh cƣờng độc, tạo thành công 3 chủng tai xanh nhƣợc độc (KTYPRRS-04, KTY-PRRS-09 và KTY-PRRS-05).

Đặc biệt, dự án cũng đã đăng ký 9 trình tự gene các chủng giống virus tại
Ngân hàng gene thế giới và sản xuất đƣợc 209.000 liều vaccine có hiệu lực 80%
(tức là ít nhất 80% số lợn đƣợc tiêm vaccine s chống lại đƣợc sự tấn công của
virus) và thời gian thuốc có hiệu lực ít nhất là 4 tháng.
“Từ các chủng giống đƣợc tạo và chủng giống virus nghiên cứu đƣợc,
nhóm nghiên cứu có thể sản xuất ra các loại vaccine phòng bệnh tai xanh ở lợn.
Ƣu điểm của nghiên cứu này là tạo ra chủng giống gốc để sản xuất vaccine phân
lập của Việt Nam, ổn định tất cả các mặt về đặc tính sinh học, đặc tính sinh học
phân tử, đặc tính kháng nguyên... So với vaccine phòng bệnh tai xanh ở lợn do
12


nƣớc ngồi sản xuất, vaccine trong nƣớc có tỷ lệ tƣơng đồng kháng nguyên với
virus gây bệnh cao hơn” - tiến sỹ Trịnh Đình Thâu - Trƣởng khoa Thú y, Học
viện Nông nghiệp Việt Nam, chủ nhiệm đề tài - cho biết.
Vaccine trên cũng đã đƣợc thử nghiệm ở chuột và lợn. Kết quả cho thấy,
virus chọn ra đƣợc bảo đảm sự an tồn, thuần khiết và có tính suy yếu miễn dịch
tốt, có khả năng bảo hộ tốt. Đây là một trong những yếu tố quan trọng đối với
việc sản xuất sản phẩm vaccine hiệu quả cao, đáp ứng đƣợc khả năng phòng,
chống bệnh lợn tai xanh.
Ƣu điểm về hiệu quả kinh tế: Vaccine phòng bệnh tai xanh ở lợn do Việt
Nam sản xuất có giá dao động từ 30.000-35.000 đồng/liều; trong khi đó, vaccine
ngoại nhập có giá cao gấp 2-3 lần, từ 60.000-80.000 đồng/liều. Điều có ý nghĩa
hơn cả của nghiên cứu này là từ đây, Việt Nam có thể chủ động đƣợc nguồn
vaccine phịng bệnh cho vật nuôi mà không phải phụ thuộc vào nguồn nhập
khẩu - vốn nhiều biến động.Tiến sỹ Thâu nói thêm: “Hiện vaccine phòng bệnh
tai xanh đang trong giai đoạn sản xuất thử và chuẩn bị chuyển giao cho doanh
nghiệp tự sản xuất. Dự kiến năm 2018, sản phẩm s đƣợc đƣa ra thị trƣờng. Sau
nghiên cứu này, chúng tôi s ứng dụng các tiến bộ khoa học và công nghệ đã đạt
đƣợc để sản xuất thêm các loại mới nhƣ vaccine tái tổng hợp”. Theo các chuyên

gia, việc sản xuất thành công vaccine phòng bệnh tai xanh ở lợn mang lại hiệu
quả kinh tế lớn cho ngành chăn nuôi và ngành nông nghiệp Việt Nam, góp phần
chủ động đƣợc nguồn vaccine, giảm giá thành sản phẩm (Tạp chí chăn ni
22/9/2017).
1.2. Hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật
Cho tới nay có hai phƣơng pháp để biểu hiện protein tái tổ hợp trong thực
vật: biểu hiện tạm thời và tạo cây chuyển gen (Mason và Arntzen, 1995).
Hệ thống biểu hiện tạm thời là một phƣơng pháp rất hữu ích để phân tích
khả năng biểu hiện của một protein đích trong thực vật vì phƣơng pháp này
nhanh, khơng bị ảnh hƣởng bởi vị trí gắn gen đích trong tế bào thực vật và có
thể tiến hành biểu hiện trong các mơ đã biệt hóa hồn tồn nhƣ lá (Fischer và
13


đtg., 1999).Trong những năm gần đây biểu hiện tạm thời của protein trong thực
vật trở nên một quy trình chiếm ƣu thế hơn so với việc tạo ra những cây chuyển
gen ổn định vì nó đạt đƣợc sự biểu hiện protein ở mức độ cao. Hiện nay, có hai
phƣơng pháp cho phép tiến hành biểu hiện tạm thời protein tái tổ hợp trong thực
vật: sử dụng virus thực vật làm vector và agroinfiltration.
Đối lập với phƣơng pháp biểu hiện tạm thời, hƣớng nghiên cứu biến nạp bền
vững đƣợc định nghĩa bằng việc gắn gen đích vào hệ gen của tế bào thực vật.
Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium là kỹ thuật đƣợc sử dụng rộng
rãi để chuyển gen vào cây hai lá mầm nhƣ thuốc lá (Fischer và Emans, 2000),
cây đậu (Prasad và đtg., 2004). Nhìn chung, gen đích đƣợc gắn vào vector nhị
thể, vector này có khả năng sao chép đƣợc trong cả E. coli và vi khuẩn
Agrobacterium. Các dịng cây chuyển gen đƣợc phân tích mức độ biểu hiện của
protein tái tổ hợp. Những cây mang một bản sao của gen đích và có mức độ biểu
hiện cao nhất s đƣợc lựa chọn để tạo dòng thuần. Dịng thuần mang tính trạng
mong muốn s đƣợc trồng nhà kính, và protein tái tổ hợp đƣợc tinh sạch. Thơng
thƣờng để tạo ra cây chuyển gen thì phải mất khoảng 3-9 tháng thời gian này

phụ thuộc vào từng đối tƣợng thực vật sử dụng để chuyển gen.

Hình 1.3. Cây N. benthamiana
14


N. benthamiana đƣợc sử dụng nhƣ một sinh vật mô hình để thực hiện các
nghiên về thực vật đặc biệt lĩnh vực virus học thực vật vì:
+ Khả năng phát triển đồng nhất và ổn định trên môi trƣờng nuôi cấy đơn
giản, rẻ tiền với tốc độ nhân dòng nhanh
+ Đáp ứng tốt với quy trình chuyển gen bằng Agrobacterium
+ Các tác nhân gây bệnh nhƣ nhiều loài: Virus, nấm, vi khuẩn, lớp nấm
trứng … đều có thể dễ dàng lây nhiễm cho N. benthamiana
Hiện nay, N. benthamiana đang nhanh chóng đƣợc phổ biến nhƣ một cây
mơ hình trong nghiên cứu sinh học thực vật, đặc biệt là trong các nghiên cứu về
protein thực vật, hệ thống biểu hiện protein và tinh chế protein từ thực vật. Vì
vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng N. benthamiana làm cây mục tiêu
và cây mơ hình cho agroinfiltration, tạo nền tảng cho sản xuất công nghiệp
protein tái tổ hợp.
1.3. Sản xuất protein tái tổ hợp tạm thời bằng phƣơng pháp agroinfiltration
Agroinfiltration là phƣơng pháp đã đƣợc ứng dụng và biểu hiện thành
cơng các protein tái tổ hợp trên nhiều lồi thực vật. Tuy nhiên phổ biến nhất
nhất là hai loài Nicotiana benthamiana và Nicotiana tabacum. Để biểu hiện
protein mức độ cao, những cấu trúc này đƣợc điểu khiển dƣới một promoter cơ
bản, ví dụ nhƣ Cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S (Kay R và đtg., 1987),
hoặc protein quan tâm đƣợc đƣa vào trong một hệ thống biểu hiện virus thực vật
cải biến (Rybicki EP., 2010, Gleba và đtg., 2007). Nhiều nghiên cứu đã biểu
hiện và sản xuất thành công kháng nguyên của virus cúm gia cầm H5N1 với
hàm lƣợng cao nhƣ 200 mg HA/ kg lá tƣơi (Shoj vàđtg, 2009); 675 mg HA/kg
(Mortimer vàđtg, 2012); 400 mg NA/kg (Mett vàđtg. 2008)…

Bằng cách sử dụng hệ thống biểu hiện tạm thời này, Vaquero và đtg đã biểu hiện
thành công scFv; chuỗi nặng, chuỗi nhẹ của kháng thể cũng nhƣ phân tử kháng
thể đầy đủ kháng lại carcinoembryonic antigen. Phân tử kháng thể đầy đủ có thể
biểu hiện bằng cách tiêm đồng thời vào lá cây hai chủng vi khuẩn
Agrobacterium mang riêng biệt chuỗi nặng và chuỗi nhẹ. Thông thƣờng phƣơng
15


pháp biểu hiện tạm thời này phù hợp để kiểm tra sự biểu hiện của protein tái tổ
hợp trong tế bào thực vật, đồng thời cũng để kiểm tra sự hoạt động của cấu trúc
vector vừa thiết kế trƣớc khi tiến hành tạo cây chuyển gen (Fischer và Emans,
2000).
Agroinfiltration đƣợc ứng dụng phổ biến nhất trên hai loài N. benthamiana
và N. tabacum. Để biểu hiện protein mức độ cao, những cấu trúc này đƣợc điểu
khiển dƣới một promoter cơ bản, ví dụ nhƣ Cauliflower mosaic virus (CaMV)
35S (Kay R và đtg., 1987), hoặc protein quan tâm đƣợc đƣa vào trong một hệ
thống biểu hiện virus thực vật cải biến (Rybicki EP., 2010, Gleba và đtg., 2007).
Nhiều nghiên cứu biểu hiện và sản xuất thành công kháng nguyên của virus cúm
gia cầm H5N1 với hàm lƣợng cao nhƣ 200 mg HA/kg lá tƣơi (Shoj và đtg.,
2009); 675 mg HA/kg (Mortimer và đtg., 2012); 400 mg NA/kg (Mett và đtg.,
2008)…

16


Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu
Biểu hiện tạm thời protein tái tổ hợp GP5-M bằng phƣơng pháp

agroinfiltration trên cây thuốc lá N.benthamiana.
2.1.2. Nội dung nghiên cứu
- Thiết kế vector tách dòng pRTRA tái tổ hợp gen mã hóa kháng nguyên
GP5-M.
- Thiết kế vector chuyển gen pCB301 tái tổ hợp gen mã hóa kháng nguyên
GP5-M
- Tạo chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector pCB301-gp5-m100xELP tái tổ hợp.
2.2. Vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Chủng vi khuẩn
Chủng Escherichia coli DH5α đƣợc sử dụng để nhân và chọn dòng gen.
Chủng A. tumefaciens C58C1 mang yếu tố phiên mã FUS3 đƣợc sử dụng
để đồng biểu hiện tạm thời với vector đích mang gen biểu hiện protein tái tổ hợp
dƣới sự kiểm soát của promoter CaMV 35S, do Phịng Cơng nghệ tế bào thực
vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
2.2.2. Các vector và vật liệu thực vật
- Trình tự 100xELP trong vector pRTRA đƣợc tổng hợp và mô tả bởi
Scheller và đồng tác giả (2004). Vector pRTRA-35S-H5-100xELP (Hoang,
2012) đƣợc thiết kế từ vector gốc pRTRA35S-TBAG-100xELP của Floss et al.,
(2010a). Vector chuyển gen pCB301-Kan (dựa vào pCB301 của Xiang và đồng
tác giả, 1999), plasmid mang gen gp5-m của virus PRRS chủng Việt Nam, ký
hiệu pGEM-PRRS (VN07196) và cây thuốc lá N. benthamiana do Phòng Công
nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp.

17


Cây thuốc lá N. benthamiana đƣợc cung cấp bởi Phòng Công nghệ tế bào
thực vật Viện Công Nghệ Sinh Học – Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ
Việt Nam.
2.2.3. Các cặp mồi sử dụng

Bảng 2.1. Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu
STT
I.
1
2
II.
1
2

Tên mồi
Trình tự (5’-3’)
Mồi dùng trong khuếch đại gen gp5-m có gắn thêm các vị trí cắt của
enzyme giới hạn BamHI
AGGGATCCGCCAGCAACAACAAC
GP5-BamHI-F
CATAGGTCCAGGTCCGAGACGACCCCAT
GP5-GPGP-MTG
BamHI-R
Mồi dùng trong giải trình tự gen gp5-m trên vector pRTRA
35S-SQF
CACTGACGTAAGGGATGACGC
35STerm
CTGGGAACTACTCACACA

2.3. Hóa chất, thiết bị
2.3.1. Hố chất
Kit tách chiết RNA từ thực vật GenElute TM Total RNA Miniprep
(Sigma), kit tách chiết plasmid QIAprep Spin Miniprep , kit thôi gel QIAquick
Gel Extraction và kit tinh sạch DNA QIAamp DNA mini của hãng QIAGEN,
thang DNA 1 Kb, protein (Fermentas).

Các loại enzyme hạn chế của Fermentas.
Các hoá chất khác nhƣ: Yeast extract, NaCl, Agarose, Sucrose, Trypton,
KCl, Tris HCl, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCl2, Glycerol, CaCl2, Ethanol 70%,
nƣớc khử ion; các loại kháng sinh kanamycin, rifamycine, spectinomycin và các
hóa chất thơng dụng khác của các hãng Fermentas, Invitrogen, Merck, Sigma,
Amersham Pharmacia Biotech…
Kháng thể kháng cmyc đƣợc tổng hợp từ khuẩn bởi phòng thí nghiệm
trọng điểm-Viện Cơng nghệ sinh học, kháng thể anti-mouse IgG cộng hợp HRP
(Promega - USA), kháng nguyên scFv (50 ng/µl) có trình tự cmyc đƣợc tổng
hợp bởi phịng thí nghiệm trọng điểm-Viện Cơng nghệ sinh học, hóa chất hiện
18