Nghiên cứu khảo sát và tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy tổng hợp enzym chitinase từ chủng vi sinh vật phân lập tại núi luốt trường đại học lâm nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Trƣớc hết tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới T

Ngu n Nhƣ Ngọc- Bộ môn

Công Nghệ Vi Sinh – Hóa sinh, Viện Cơng Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại Học
Lâm Nghiệp đã tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tơi trong suốt q trình học tập
và nghiên cứu.
Tơi cũng xin đƣợc gửi lời cảm ơn đến các thầy cơ bộ mơn Cơng Nghệ Vi
Sinh – Hóa sinh Viện Công Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại Học Lâm Nghiệp đã
tận tình giúp đỡ, dạy bảo trong suốt quá trình làm khóa luận.
Cuối cùng tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã ln quan tâm
tới tơi trong suốt q trình làm khóa luận.
Đâ là lần đầu tiên cá nhân tôi trực tiếp thực hiện nghiên cứu khóa luận do
đó khơng tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận đƣợc sự đóng góp chân
thành của quý thầy cô và các bạn.
Tôi xin chân thành cảm ơn !
Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2018
Sinh viên
Vũ Thị Ngọc Diệp


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 7
CHƢƠNG ITỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ......................................... 2

1.1. Tổng quan về Enzyme chitinase .................................................................... 2
1.1.1. Giới thiệu về Enzyme chitinase .................................................................. 2
1.1.2 Phân loại chitinase........................................................................................ 2
1.2. Nguồn thu nhận Enzyme chitinase................................................................. 6
1.2.1. Enzyme chitinase vi khuẩn.......................................................................... 6
1.2.2. Chitinase từ nấm.......................................................................................... 6
1.2.3.Chitinase thực vật ......................................................................................... 6
1.2.4. Chitinase động vật ....................................................................................... 6
1.3. Các đặc tính cơ bản của enzyme chitinase ..................................................... 6
1.3.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ .............................................................................. 6
1.3.2. Ảnh hƣởng của pH ...................................................................................... 7
1.3.3.Ảnh hƣởng của nguồn cacbon ..................................................................... 7
1.3.4.Ảnh hƣởng của nguồn nitơ ........................................................................... 8
1.3.5. Ảnh hƣởng của nguồn dinh dƣỡng khoáng ................................................. 8
1.3.6. Ảnh hƣởng của các yếu tố khác .................................................................. 9
1.4. Các loại cơ chất của enzyme chitinase ........................................................... 9
1.4.1. Chitin ........................................................................................................... 9
1.4.2. Cấu trúc phân tử của chitin ....................................................................... 10
1.5. Ứng dụng của enzym chitinase .................................................................... 11


1.5.1.Ứng dụng của enzyme chitinase trong kiểm soát nấm bệnh và côn trùng
gây hại thực vật ................................................................................................... 12
1.5.2.Ứng dụng trong dƣợc tổng hợp chitooligosaccharide............................. 12
1.5.3.Ứng dụng chuẩn đoán bệnh truyền nhi m do vi nấm bằng enzyme
chitinase ............................................................................................................... 13
1 6 Đại cƣơng về nấm Trichoderma................................................................... 14
CHƢƠNG II MỤC TIÊU, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 15
2.1.Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 15
Xác định đƣợc các điều kiện nuôi cấy sinh enzyme chitinase từ chủng

Trichoderma atrovirid (Tri 3). ............................................................................. 15
2.2.Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 15
2 3 Đối tƣợng, hóa chất, vật liệu và thiết bị ........................................................ 15
2.3.1.Đối tƣợng nghiên cứu................................................................................. 15
2.3.2.Thiết bị và hóa chất .................................................................................... 15
2.3.3. Mơi trƣờng ni cấy nấm mốc .................................................................. 16
2.4.2.Khảo sát ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp
chitinase của Trichoderma atroviride .................................................................. 18
2.4.3. Khảo sát ảnh hƣởng của nguồn nito đến khả năng sinh tổng hợp chitinase
của chủng Trichoderma atroviride[12]................................................................ 19
244

hảo sát ảnh hƣởng của hàm lƣợng chitin đến khả năng sinh tổng hợp

chitinase của chủng Trichoderma atroviride ....................................................... 19
2.4.5.Khảo sát ảnh hƣởng của các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh tổng hợp
của enzyme chitinase ........................................................................................... 20
2 4 6 Phƣơng pháp xác định hoạt độ chitinase................................................... 20
2 4 7 Xác định đƣờng khử bằng DNS ................................................................ 22
CHƢƠNG 3 ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 23
3.1. Kết quả ảnh hƣởng môi trƣờng và các nguồn Nito Cacbon đến hoạt độ
chitinase của chủng Trichoderma atroviride ....................................................... 23
3.1.1. Ảnh hƣởng của MT đến quá trình sinh tổng hợp enzyme chitinase ......... 23


3.1.2. Ảnh hƣởng của nguồn dinh dƣỡng cacbon ............................................... 25
3.1.3. Khảo sát sự ảnh hƣởng của nguồn Nito .................................................... 25
3.1.4 Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ chất cảm ứng ............................................... 26
3.2. Kết quả khảo sát các yếu tố đến hoạt độ enzym của chủng Trichoderma
atroviride ............................................................................................................. 28

3.2.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ............................................................................ 28
3.2.2. Khảo sát ảnh hƣởng của độ ẩm đến khả năng sinh tổng hợp enzyme
chitinase ............................................................................................................... 29
CHƢƠNG 4: ẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................... 30
4.1 Kết Luận ........................................................................................................ 30
4.2. Kiến Nghị ..................................................................................................... 30
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 31
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC VIẾT TẮT

STT

Ký hiệu

Chú thích

1

DNS

3,5 – dinotrosalicylic axit

2

MT

Mơi trƣờng

3

OD

Mật độ quang

4

ΔOD

Hệ số giữa mật độ quang của mẫu thử thứ nhất và thứ
khơng

5

TB

Giá trị trung bình


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Nguồn cơ chất của enzyme chitinase.................................................. 10
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của môi trƣờng và thời gian đến họat độ enzyme chitinase
............................................................................................................................. 23
Bảng 3.2: Ảnh hƣởng của nguồn dinh dƣỡng cacbon đến hoạt độ chitinase thu từ
chủng Trichodermaatroviride .............................................................................. 25
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của nguồn Nito đến hoạt độ chitinase thu từ chủng
Trichoderma atroviride ........................................................................................ 26
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất cảm ứng .......................................... 27

Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của của nhiệt độ đến hoạt độ chitinase ............................ 28
Bảng 3.5. Hoạt độ enzym chitinase thu từ chủng Trichoderma atroviride ....... 29
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của độ ẩm môi trƣờng đến hoạt độ chitinase................... 29


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.2 cấu trúc của chitin ................................................................................ 11
Hình 3.1 Đồ thị ảnh hƣởng của MT rắn và MT lỏng đến hoạt độ chitinase của
chủng Trichoderma atroviride theo thời gian...................................................... 24
Hìnnh 3 2 Phản ứng của chitinase với DN ..................................................... 25
Hình 3 3 phản ứng của chitinase với DN ......................................................... 26
Hình 3.4.Ảnh hƣởng của chất cảm ứng đến hoạt độ chitinase ........................... 27
Hình 3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt độ chitinase ................................... 28


ĐẶT VẤN ĐỀ
Chitin phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên, là polysaccharide phổ biến thứ
hai sau cellulose. Nó là một chuỗi polymer chứa các đơn phân là Nacet lglucosamine đƣợc liên kết bởi liên kết β-1,4-glucoside, có trọng lƣợng
phân tử cao, khơng hịa tan trong nƣớc và các dung mơi hữu cơ khác
Enzyme chitinase là enzym có nhiều ứng dụng quan trọng trong nhiều
lĩnh vực khác nhau, đặc biệt là trong lĩnh vực sản suất thuốc phòng chống sâu
bọ, dƣợc phẩm.....
Hiện na , ngƣời ta đã nghiên cứu chiết tách enzyme chitinase phân giải
chitin từ các nguồn khác nhau: động vật, thực vật, vi khuẩn, nấm... Tuy nhiên,
đối tƣợng đƣợc nghiên cứu nhiều nhất và có khả năng tổng hợp chitinase cao
thuộc chủng Trichoderma. Với nhiều ƣu điểm nhƣ d nuôi cấ , sinh trƣởng và
phát triển nhanh, sản xuất đƣợc nhiều enzyme trong thời gian ngắn Trichoderma
đƣợc sử dụng phổ biến để nuôi cấy thu chitinase.
Để ứng dụng chitinase từ các chủng Trichoderma phân lập tại Việt Nam
trong cơng nghiệp, việc tìm ra cách thu nhận tốt nhất nhằm thu chitinase có hoạt

độ cao là một cơng việc rất cần thiết. Đồng thời việc nghiên cứu để tìm ra các
điều kiện tốt nhất để ứng dụng thu chitinase đạt đƣợc hiệu quả cao nhất là rất có
ý nghĩa
Với thực trạng mghiên cứu và tiềm năng ứng dụng của enzyme chitinase
tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu khảo sát điều kiện nuôi cấy sinh
enzym chitinase từ chủng Trichodrema atroviride phân lập tại Núi Luốt Đại
Học Lâm Nghiệp”

1


CHƢƠNG I
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Tổng quan về Enzyme chitinase
1.1.1. Giới thiệu về Enzyme chitinase
Enzyme Chitinase (poly (1,4 acetyl- β- glucosaminide) glucanhydrolase) là
enzyme thuộc nhóm glycosyl hydrolase thủy phân liên kết (1,4-N-acetyl-βglucosaminide (β-1,4- GlcNAc) của chitin. Enzyme Chitinase đƣợc tạo ra từ
nhiều sinh vật, từ những lồi có thành phần cấu trúc là chitin nhƣ nấm, côn
trùng, giáp xác, đến những loại khơng có chitin nhƣ vi khuẩn, thực vật…Ở
những sinh vật chứa chitin, enzyme chitinase đóng vai trị chính trong q trình
phát sinh hình thái và thành tế bào. Các sinh vật khác tổng hợp enzyme
chitinasvới các mục đích khác nhau Vi khuẩn tổng hợp chitin để phân hủy
chitin tạo ra nguồn carbon. Ở thực vật và động vật enzyme chitinase nằm trong
hệ thống chống lại các tác nhân gây bệnh nhƣ nấm bằng cách phá vỡ thành tế
bào chứa chitin của nấm.
Cơ chất của enzyme chitinase là chitin và một số dẫn xuất của nó. Chitin là
Pol saccharide đƣợc tạo thành nhờ liên kết β-1,4 của các đơn phân Ncetyglucosamine, một trong những dạng Polysaccharide phổ biến trong tự nhiên.
Chitin là thành phần chủ yếu trong cấu trúc bộ xƣơng ngồi của các loại cơn
trùng, vỏ giáp xác và thành tế bào nấm.
Chitin có hoạt tính hóa học thấp, mầu trắng, cứng và có chứa nitrogen, chitin

không tan trong nƣớc và hầu hết các dung môi hữu cơ, tan trong hexa fluro
isopropanol, hexa fluroacetone… Hàm lƣợng nitrogen của chitin chiếm từ 58% Trong môi trƣờng base, chitin bị deacetyl tạo thành chitosan.
1.1.2 Phân loại chitinase
Các nhà khoa học phân chitinase thành 3 loại: Dựa vào cấu trúc phân tử,
dựa vào trình tự amino acid, dựa vào phản ứng cắt.
 Dựa vào cấu trúc phân tử
Chitinase đƣợc xếp vào 2 họ Glycohydrolase (enzym thủ phân đƣờng):
2


Họ Glycohydrolase 18
Là họ chitinase lớn nhất với khoảng 180 chi, có cấu trúc xác định gồm 8
xoắn α/β cuộn trịn, đƣợc tìm thấy ở nhiều loại sinh vật nhƣ vi khuẩn, nấm, thực
vật, côn trùng, hữu nhũ và virus Họ này bao gồm chủ yếu là enzyme chitinase,
ngoài ra cịn có các enz me khác nhƣ chitodextrinase, chitobiase và Nacetylglucosaminidase. Trong họ này, chitinase từ các prokaryote chỉ có 2 một
trình tự ngắn đƣợc bảo tồn cao (bao gồm 1 gốc acid glutamic đƣợc bảo tồn)
giống với enzyme của eukaryote (10% của toàn bộ các gốc giống nhau). Tuy
nhiên, cả 2 loại chitinase đều có cùng domain xúc tác barrel (βα)8. Trong cả 2
enzyme, rãnh gắn cơ chất đều nằm ở đầu C của sợi β trong cấu trúc barrel (βα)8
và gốc acid glutamic cho proton xúc tác có 1 vị trí tƣơng đƣơng

hơng giống

với các glycoside hydrolase khác, chitinase họ 18 có cơ chế phản ứng bất
thƣờng bao gồm việc tác động lên nhóm N-acetyl của cơ chất trên nguyên tử C
anomer. Việc này dẫn đến việc tạo ra chất trung gian bao gồm vòng pyranose
của glucosamine kết hợp với vịng 5 oxazoline.

Hình 1.1. Cấu trúc khơng gian của chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18
Họ Glycohydrolase 19

3


Họ này gồm hơn 130 chi, thƣờng thấy chủ yếu ở thực vật nhƣ cà chua
(Solanum tuberosum), cải (Arabidopsis thaliana), đậu Hà Lan (Pisum sativum),
ngồi ra cịn có ở xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus
influenzae… Chúng có cấu trúc hình cầu có cuộn giống lysozyme (EC 3.2.1.17)
của động vật và phage, bao gồm một cuộn α + β và hoạt động thông qua cơ chế
nghịch chuyển.
Thực vật và vi sinh vật nhƣ Streptomyces tạo chitinase thuộc cả 2 họ, trong
khi côn trùng và hầu hết sinh vật khác chỉ tạo chitinase thuộc họ glycohydrolase 18.
 Dựa vào trình tự amino acid:
Dựa vào trình tự đầu amin (N), sự định vị của enz me, điểm đẳng điện,
peptid nhận biết và vùng cảm ứng, ngƣời ta phân loại enzyme chitinase thành 5
nhóm:
- Nhóm I: là những đồng phân enzyme trong phân tử có vùng đầu N giàu
cysteine chứa khoảng 40 acid amin (giống với vùng đầu N ở hevein và các
enzyme khác có ái lực đối với chitin hay N-acetylglucosamine) nối với tâm xúc
tác thông qua một đoạn giàu glycin hoặc prolin ở đầu carboxyl (C)(peptid nhận
biết). Vùng giàu cysteine có vai trò quan trọng đối với sự gắn kết enz me và cơ
chất chitin N ở hevein và các enzyme khác có ái lực đối với chitin hay Nacetylglucosamine) nối với tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu glycin hoặc
prolin ở đầu carboxyl (C)(peptid nhận biết). Vùng giàu cysteine có vai trị quan
trọng đối với sự gắn kết enz me và cơ chất chitin nhƣng không cần cho hoạt
động xúc tác. Các vùng gắn chitin này không phải luôn đóng vai trị quan trọng
trong việc tăng cƣờng hoạt tính xúc tác enzyme mà chúng cần để tạo các đặc
tính sinh học riêng biệt cho chitinase ở nhiều loài khác nhau. Ở nấm men, vùng
gắn chitin nằm ở đầu C giúp định vị chitinase trên thành tế bào nấm men, đóng
vai trị trong việc phân tách tế bào mẹ khỏi các tế bào chị em. Ở thuốc lá và
nhiều loài thực vật khác, các chitinase này nằm trong không bào và đƣợc cảm
ứng từ sự nhi m nấm, vi khuẩn hay virus Chitinase nhóm I của thuốc lá có vùng

đầu C giàu c stein đóng vai trị là vùng gắn chitin.
4


- Nhóm II: là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác
có trình tự amino acid tƣơng tự ở chitinase nhóm I, thiếu đoạn giàu cysteine ở
đầu N và peptid nhận biết ở đầu C. Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm và vi
khuẩn Chúng đƣợc cảm ứng bởi các tác nhân bên ngoài. Ở thực vật, các protein
nhóm II thuộc loại protein kháng bệnh và đƣợc tế bào tiết ra dƣới nhiều điều
kiện stress khác nhau.
- Nhóm III: Trình tự amino acid hồn tồn khác với chitinase nhóm I và II,
nhƣng rất giống về trình tự với lysozyme ở Hevea brasiliensis, vì thế chúng
mang hoạt tính lysozyme. Ở thực vật, các chitinase nhóm III là các protein
kháng bệnh và đƣợc tiết ra ngoại bào.
- Nhóm IV: là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm,
41-47% trình tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tƣơng tự nhƣ chitinase
nhóm I và khá giống với chitinase vi khuẩn. Trong phân tử cũng có đoạn giàu
c steine nhƣng kích thƣớc phân tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase nhóm I
. - Nhóm V: dựa trên những dữ liệu về trình tự, ngƣời ta nhận thấy vùng
gắn chitin (vùng giàu cysteine) có thể đã giảm đi nhiều lần trong q trình tiến
hóa ở thực vật bậc cao.
• Dựa vào phản ứng phân cắt:
Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin-1,4-βchitobiosidase, N-acetyl-β-D-glucosaminidase (exochitinase) và chitobiase.
Endochitinase là enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách ngẫu nhiên tạo các
đoạn oligosaccharide, đã đƣợc nghiên cứu từ dịch chiết môi trƣờng nuôi cấy
nấm mốc Trichoderma harzianum (2 loại endochitinase: M1=36kDa,
pI1=5,3±0,2 và M2=40kDa, pI2=3,9), Gliocladium virens (M=41kDa, pI=7,8).
Chitin-1,4-β-chitobiosidase là enzyme phân cắt chitin (exochitinase) từ đầu
không khử tạo thành các sản phẩm chính là các chitobiose, cụ thể enzyme này
đƣợc thu từ Trichoderma harzianum (M=36kDa, pI=4,4±0,2). N-acetyl-β-Dglucosaminidase (exochitinase) (EC 3.2.1.30) là enzyme phân cắt chitin từ một

đầu cho sản phẩm chính là các monomer N-acetyl-D- glucosamin. Chitobiase là
5


enzyme phân cắt chitobiose thành 2 đơn phân N-acetyl-D- glucosamin. Ngồi
ra, đối với chitosan - dẫn xuất deacetyl hóa của chitin, chitosanase (EC
3.2.2.132) xúc tác thủy phân chitosan tạo thành các oligosaccharide tƣơng ứng.
1.2. Nguồn thu nhận Enzyme chitinase
1.2.1. Enzyme chitinase vi khuẩn
Vi khuẩn sản sinh enzyme chitinase nhằm đáp ứng nhu cầu dinh dƣỡng.
chúng thƣờng đƣợc tổng hợp nhiều loại chitinase để có thể phân cắt đƣợc các
loại chitin đa dạng trong tự nhiên Nhƣ vậy, chitinase vi khuẩn đóng vai trị quan
trọng cho chu trình chitin tự nhiên.
Enz me chitinase đƣợc tìm thấy trong vi khuẩn: Chromobacterum,kelebsella,
pseudomomonas,… và đặc biệt là ở nhóm Streptomycetes.
1.2.2.Chitinase từ nấm
Chitinase cũng đƣợc tạo ra bởi các loại nấm sợi, hàm lƣợng hoạt độ
chitinase đƣợc tìm thấy ở các chủng nấm là cao hơn so với các chitinase tìm
thấy ở các nguồn khác nhau. Các chủng nấm mốc cho chitinase cao nhƣ:
Trichoderma, Gliocladium, Calvatia… Đặc biệt là ở các loài nấm lớn nhƣ
Lycoperdon,Coprinus…..
1.2.3.Chitinase thực vật
Các thực vật bậc cao có khả năng tạo enz me chitinase nhƣ: cao su (
Hevea brasiliensis), thuốc lá ( Nicotiana), lúa, lúa mì, bắp cải, khoai tâ , đậu Hà
lan, đậu nành, củ từ… và đặc biệt một số loài tảo biển cung cấp enzyme
chitinase.
1.2.4.Chitinase động vật
Enzyme chitinase có thể thu nhận từ một số động vật nguyên sinh và từ các
mơ, tuyến khác nhautrong hệ tiêu hóa của nhiều loại động vật khơng xƣơng: ruột
khoang giun trịn, thân mềm chân đốt, ta có thể thu nhận đƣợc enzyme chitinase

1.3.Các đặc tính cơ bản của enzyme chitinase
1.3.1.Ảnh hưởng của nhiệt độ

6


Nhiệt độ có ảnh hửơng rất lớn đến phản ứng enzym. Tốc độ phản ứng của
enzyme không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ. Tốc độ phản ứng của
enzyme sẽ tăng lên một nhiệt độ nhất định Vƣợt qua nhiệt độ đó tốc độ phản
ứng của enzyme sẽ giảm và dẫn đến mức triệt tiêu. Nếu đƣa mức nhiệt độ cao
hơn mức nhiệt độ tối ƣu, hoạt độ enzym sẽ giảm và có thể sẽ khơng phục hồi
đƣợc hoạt tính.
Nhiệt độ tối ƣu của đa số enzyme chitinase ở vi sinh vật hoạt động là
40°C, và bị vô hoạt khi ở 55°- 65°C.Nguồn thu enzym chitinnase khác nhau thì
nhiệt độ tối ƣu khác nhau thì nhiệt độ tối ƣu và độ bền nhiệt độ sẽ khác nhau.
Theo Takashi và cộng sự 2002 Aspergillus sp tổng hợp chitinase có hoạt
tính cao nhất ở điều kiện nhiệt độ là 37°C.
1.3.2. Ảnh hưởng của pH
pH tối ƣu của các enz m chitinase cũng khác nhau phụ thuộc vào nguồn
thu và cơ chất.
pH tối ƣu của enzyme chitinase có nguồn gốc thực vật khoảng 4-9. Trong
khi đó, enz m chitinase thu nhận từ động vật là 4,8- 7,5 và vi sinh vật là 3,5- 8.
Đa số enzym chitinase thu nhận từ nấm mốc bền vững ở pH 4,0 đến 6,0
và nhanh chóng mất hoạt tính trong điều kiện trung tính. Aespergillus sp. Tổng
hợp chitinase có hoạt tính cao nhất ở điều kiện pH= 5-6 (Takashi và cộng sự,
2002). Nguy n Thị Hồng Thƣơng và các đồng tác giả, 2003 nghiên cứu trên
Trichoderma haianum chỉ ra rằng pH thích hợp cho nấm nả sinh trƣởng tạo
chitinase có hoạt tính cao khoảng pH= 4-6.
1.3.3.Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Chitinase là một loại enzyme cảm ứng hay cấu trúc Do đó, một trong các

yếu tố quan trọng của sự sinh tổng hợp enzym chitinase là chọn đúng cơ chất
cho chủng nấm.
Chitin đƣợc bổ sung vào mơi trƣờng ni cấy sẽ cảm ứng hóa sự tổng hợp
enz m chitinase Nhƣ vậy sự có mặt của của chitin trong môi trƣờng dinh dƣỡng
là điêu kiện bắt buộc.
7


Chủng nấm đƣợc nuôi cấy trên nguồn cacbon khác nhau (glucose, fuctose,
saccharose...) tạo enzym chitinase cao nhất cịn mơi trƣờng có chitosa và
cellulose hồn tồn khơng thu đƣợc enzym này. Nghiên cứu của Jesus de la
Cruz và cộng sự chỉ ra rằng Trichoderma atroviride chỉ tạo ra chitinase kho có
nguồn cacbon từ chitin chứ không từ nguồn khác nhƣ cellulose ha chitosan
1.3.4.Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Nito cũng có vai trị rất quan trọng trong sự sinh tổng hợp enzym chitinase
bởi vi sinh vật. Nguồn nito chủ yếu ở dƣới dạng muối nitrat và amoni Đối với
vi sinh vật sử dụng (

là hiệu quả hơn cả.

Các dạng nitơ hữu cơ (pepton, cao nấm men...) phối hợp với nguồn nito vơ
cơ có tác dụng tốt đến sự sinh tổng hợp enzyme chitinase.
Trong nuôi cấy bán rắn khi môi trƣờng đƣợc cung cấp nitơ từ 2 nguồn là
Muối (

và cao nấm men thì sản lƣợng chitinase tăng từ 4-10% so với

sử dụng riêng lẻ.
Theo nghiên cứu của Kapat và cộng sự (1996), Khi loại ure ra khỏi môi
trƣơng nuôi câ se làm tăng khả năng tổng hợp chitinase. Takashi và cộng sự

(2002) nghiên cứu khả năng sinh chitinase từ nấm sợi Aspergillus sp. Đã chỉ ra
rằng hoạt tính chitinase cao khi sử dụng nguồn nito từ (

.

1.3.5. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng khống
Ngồi nguồn cacbon, nito thì các ngun tố khống cũng có tác dụng nhất
định đối với q trình phát triển của vi sinh vật, chúng cần thiết cho sự duy trì
cân bằng sinh lý tế bào. Các ngun tố khống bao gồm các nguyên tố vi lƣợng
nhƣ Mn, Cu, Fe,

đƣợc bổ sung dạng muối vô cơ nhƣ

H2PO4, MgS04... Mỗi

nguyên tố khống có chức năng riêng đối với vi sinh vật nhƣ photpho tham gia
thành phần cấu tạo của axit nucleic, Photophoprotein, Phopholipit và nhiều
coenzym quan trọng nhƣ ATP, NADP, ADP

các loại kim loại nà đóng vai trị

quan trọng để sinh tổng hợp chitinase từ một số vi sinh vật.

8


1.3.6.Ảnh hưởng của các yếu tố khác
Nguồn cacbon, Nitơ, các ngu ên tố vơ cơ có ảnh hƣởng đến sự sinh tổng
hợp enzym chitinase bởi vi sinh vật.
Các yếu tố khác nhƣ pH của môi trƣờng dinh dƣỡng, phƣơng pháp nuôi cấy

, nhiệt độ, thời gian nuôi cấ và điều kiện ni câ , đều có ảnh hƣởng đến sự
tạo ra enzym chitinase.
Nhiệt độ có ảnh hƣởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp enzym
chitinase của nấm mốc cũng nhƣ tính chất của enzym tổng hợp, mối lồi có
nhiệt độ thích hợp khác nhau. Tuy nhiên các vi sinh và tổng hợp enz m đều
không bền với nhiệt độ và bị kìm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ
thích hợp. Nhiệt độ tối ƣu của của nấm tổng hợp enzym chitinase là 30°C- 32
Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng: khi dùng phƣơng pháp nuôi bề mặt, pH
mơi trƣờng ít ảnh hƣởng đến q trình sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật, hơn
nữa pH môi trƣờng hầu nhƣ khơng tha đổi trong qua trình phát triển vi sinh vật.
Ngƣợc lai, trong phƣơng pháp nuôi cấy chìm pH mơi trƣờng ảnh hƣởng rất
lớn đến sự phát triển và sinh tổng hợp chitinase của vi sinh vật .
1.4.Các loại cơ chất của enzyme chitinase
1.4.1.Chitin
Chitin là một polyme sinh học rất phổ biết trong tự nhiên và đứng hàng
thứ hai chỉ sau cellulose. Chitin tham gia vào thành phần cấu tạo và vách tế bào
nấm, cấu tạo nên bộ khung xƣơng của vỏ tôm, cua, côn trùng, các động vật giáp
xác ...Trong các loại nguyên liệu này, chitin liên kết chặt chẽ với Protein, Lipid,
cả muối vô cơ (Ca

) và các sắc tố.

9


Bảng 1.1. Nguồn cơ chất của enzyme chitinase
Tỉ lệ phần hữu cơ trong trọng
lƣợng khan

Nguồn

Chitin %

Protein %

Buthus (bọ cạp)

31,9

68,1

Juygale ( nhện)

38,2

61,8

23,7

76,3

1. Lớp nhện.

2. Lớp côn trùng
Châu chấu 2 cánh cứng periplameta
3. Lớp bọ cánh cứng

35.0

Pyliscus

4. Loài bƣớm

37,4

62,6

44,2

55,8

Cencer

71,4

13,3

Eugagurus

69,0

31,0

Boubyx(con tằm ấu trùng )
5. Lồi tơm cua

Từ thực vật bậc thấp. Nguồn gốc của chitin trong thực vật giới hạn ở một
số loài nấm và tảo. Trong nấm chitin đóng vai trị nhƣ cellulose trong các loài
cây.
Ngƣời ta đƣa các giả thiết khác nhau về sự hiện diện của chitin hoặc
cellulose không hiện diện đồng thời.

Chitin khơng hiện diện mơt mình trong lớp vỏ ngồi của nấm mà nó đƣợc
liên kết với những thành phần khác Lƣợng Chitin đƣợc tính chế từ một số lồi
nấm thơng thƣờng từ 3 %- 5%.
1.4.2. Cấu trúc phân tử của chitin
Cấu trúc phân tử của Chitin có dạng

.

Chitin là một dạng polysaccharide gồm các tiểu phân N- actyl DGlucosamine kết hợp lại với nhau theo liên kết β (1 4). Liên kết của chitin là
10


poly [β- (1

)-2- acetanido-2- deoxy- D- glucopyranase]. Chitin có cấu trúc

tinh tể và nó cấu tạo thành một mạng lƣới sợi hữu cơ Vì thế mà chitin làm tăng
độ bền, độ cứng và điểm tựa cho các sinh vật.
Chitin có cấu trúc lạp thể gồm 3 dạng nhƣ : α, β và γ, sự khác nhau này thể
hiện ở sự sắp xếp các chuỗi. Các chuỗi α–chitin xếp xuôi, ngƣợc xen kẽ nhau,
tuy nhiên, chúng có một cặp xếp cùng chiều, ở chuỗi β – chitin các chuỗi sắp
xếp theo một chiều nhất định, còn ở chuỗi γ – chitin có các cặp chuỗi xếp cùng
chiều so le với một chuỗi ngƣợc chiều trong cấu trúc.

Hình 1.2 cấu trúc của chitin
1.5. Ứng dụng của enzym chitinase
Enzym chitinase có vai trị rất quan trọng trong công nghiệp, nông nghiệp
nhƣ: trong sản xuất thuốc trừ sâu, trong kiểm soát muỗi... Và nhiều nghành khác
nhƣ: dƣợc, thu nhận tế bào trần,...
11

Trong quá trình sản xuất thuốc trừ sâu, thuốc chitin kiểm soát muỗi đều
bổ xung thêm enzyme chitinase một cách hiệu quả. Nhờ có enzyme chitinase mà
tăng hiệu quả . enzym chitinase sẽ làm kìm hãm sự sinh trƣởng của sâu bệnh hại.
Chitinase là các biopolymer chứa các gốc N- acetyl- glucozamin liên kết
với nhau bởi mối liên kết β-1,4- glucoside Lƣợng kitin trong xác, vỏ tôm, cua,
ốc rất nhiều. Nhiều loại NS thuộc chi Trichoderma, Glyladium,Chaetomium,...
có khả năng sinh enz m chitinase, giúp tăng cƣờng khả năng tiêu diệt các loại
nấm gây bệnh và chống các lồi cơn trùng có vỏ kitin.
1.5.1.Ứng dụng của enzyme chitinase trong kiểm sốt nấm bệnh và cơn trùng
gây hại thực vật
Đặc tính sinh học chủa chitinase đã đƣợc nhiều nhà khoa học nghiên cứu
và ứng dụng trên nhiều lĩnh vực khác nhau. Nhiều cơng trình trên thế giới cho
thấy chitinase có khả năng kiểm sốt nấm bệnh và cơn trùng gây hại thực vật.
Ngƣời ta có thể sử dụng chinase nhƣ một tác nhân điểu chỉnh sinh học an
toàn và d phân hủy thay cho thuốc trừ sâu hóa học. Ở đâ việc ức chế bằng
enzyme chitinase tinh sạch đƣợc thực hiện bằng cách cho enzyme tiếp xúc với
nấm hay côn trùng.
Enzyme chitinase ức chế nấm, côn trùng và chân đốt bao gồm nhiều loại
sâu bệnh hai. Nấm bị ức chế bởi ezyme chitinase bao gồm Fusarium,
Gliocladium, Rhizotania, Trichoderma, Ustilago, Botryis….Côn trùng bị kìm
hãm bởi chitinase gồm Lepidoptera: (trichoplusia(sâu cải),Pieris rapae (ấu
trùng cây vải).
1.5.2.Ứng dụng trong y dược tổng hợp chitooligosaccharide
Hiện nay hoạt tính sinh học của chitooligoccharide ngà

càng đƣợc

nghiên cứu sâu. Trong y học, ngƣời ta sử dụng các oligomer chitohexaose và

chitiheptaose là làm tác nhân kháng ung thƣ Enz me chitinase của Vibrio
alginolyticus phân cắt huyền phù chitin thành chtopentanose và chitotriose
enz me N,N’- diacet lchitobiase đƣợc sử dụng rộng rãi làm nguyên liệu khởi
đầu cho sinh tổng hợp ccas hợp chất có hoạt tính sinh học. Chitinase thu nhận từ
12


S. griseus có khả năng thủy phân chitin huyền phù thành chitobiose tiếp tục
đƣợc cải biến hóa học thành một dẫn xuất disaccharide mới 2- acetamido-2
deoxy-D-allop ranose Đâ là chất nên chất ức chế chung gian để tổng hợp lên
enzyme.
1.5.3.Ứng dụng chuẩn đoán bệnh truyền nhiễm do vi nấm bằng enzyme
chitinase
Các loại nấm chính liên quan đén các bệnh nhân AIDS là: Candidosis,
Cryptococcosis (nấm men), Histoplasmosis, Coccidioimycosis (nấm lƣỡng tính).
Những nguồn kháng nguyên của nấm có thể hoạt động nhƣ là một nhân tố ngăn
chặn tế bào T trong sự phát triển của AIDS. Một lƣợng nhỏ kháng nguyên của
nấm có thể kích thích phản ứng mi n dịch nhƣng sự thừa thãi kháng nguyên có
thể gâ ra tác động ngƣợc lên tính mi n dịch của tế bào Do đó, điều cần thiết là
việc điều trị phải tiến hành nhanh chóng và có hiệu quả trƣớc khi những tình
trạng trên có điều kiện lan rộng.
Hiện nay, các nhà khoa học đã đề xuất một phƣơng pháp chuẩn đoán mới
các bệnh nhi m do nấm bằng cách sử dụng enz me chitinase đã đƣợc phân lập
tạo dòng từ Vibro paraahemolyicus (đặt tên là chitinase VP1), nó kết hợp chặt
chẽ với chitin và có thể sử dụng nhƣ một mẫu dị trong việc chuẩn đoán với độ
nhạy cao nhận diện một cách đặc hiệu các vách tế bào nấm hay những vết chồi
nấm men trong những lát cắt mẫu mô bệnh.
Chế phẩm thuốc mới
Hiện nay, các nhà khoa học đề nghị sử dụng chitinase với các tác nhân
kháng nấm có thể chấp nhận khác nhằm bổ trợ cho hoạt động nội sinh của

chitinase. Các tác nhân đó bao gồm
Amphotericin B và những phức chất có cấu trúc tƣơng tự nystatin và
pyramycin
5-fluorocyosin và các dẫn xuất azol nhƣ fluconazole, ketoconazole…
Enzyme chitinase có thể phát huy hiệu quả các tác nhân kháng nấm ở liều
lƣợng không gây tác dụng phụ cho bệnh nhân. Ngoài ra, việc kết hợp giữa
13


enz me chitinase và laminarinase đƣợc ghi nhận là hữu hiệu hơn trong việc tấn
công vào vách tế bào nấm.
Các nhà khoa học đã thử nghiệm hoạt tính kháng nấm của enzyme
chitinase tái tổ hợp trong cơ thể chuột và thỏ bị nhi m nấm khác nhau thuộc
Aspergillus, Candida.. hiệu quả của sự điều trị với tác nhân kháng nấm đƣợc
ƣớc lƣợng trên 3 điểm:
+ Giảm tỷ lệ chết.
+ Giảm số lƣợng tế bào nấm đƣợc nuôi cấy từ cơ quan.
+ Giảm mức độ lƣu thông kháng ngu ên nấm.
1.6. Đại cƣơng về nấ

Trichoderma

Trichoderma phân bố rộng rãi trong tự nhiên, hiện diện trên nhiều loại đất
và các tàn dƣ thực vật.
 Nấm Trichoderma ở giai đoạn đầu của quá trình ni cấy có màu trắng
về sau chuyển dần sang màu xanh.
 Nấm Trichorderma sinh sản vơ tính bằng bào tử, bào tử có dạng hình
trứng, màu xanh lục đính trên nhƣng sợi nấm.
 Trichoderma phát triển mạnh trên môi trƣờng thạch PDA và bào tử dài
khoảng 6 -9,7µm Nhƣng bào tử này có thể nhìn rõ trên kính hiển vi cuống bào

tử có thể mọc đơn nhƣng phổ biến mọc thành cặp. Các nhánh phát sinh vng
góc hoặc gần vng góc với trục chính.
 Đa số trichoderma sinh trƣởng tốt ở pH 5 một số chủng khác sinh
trƣởng ở pH 7-8.
 Về nhiệt độ có nhiều chủng ƣa nhiệt ở (25 - 30 )
 Ngày nay Trichoderma đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nhƣ
sản xuất chitinase ứng dụng trong phịng trừ sâu bệnh. Ngồi khả năng kiểm sốt
mầm bệnh thực vật Trichoderma cịn có khả năng cải tạo đất trong đó làm tăng
độ phì nhiêu cho đất nhờ khả năng cải tạo đất trồng làm tăng độ phì nhiêu cho

14


đất nhờ khả năng phân giải một số phân lập hòa tan do nhiều enzyme phân hủy
ngoại bào nhƣ cellulose
CHƢƠNG II
MỤC TIÊU, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.Mục tiêu nghiên cứu
Xác định đƣợc các điều kiện nuôi cấy sinh enzyme chitinase từ chủng
Trichoderma atrovirid (Tri 3).
2.2.Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng đến khả năng
sinh enzyme chitinase từ chủng Trichoderma atroviride (Tri 3)
Nghiên cứu khảo sát ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấ đến khả năng sinh
tổng hợp enzyme chitinase.
2.3.Đối tƣợng, hóa chất, vật liệu và thiết bị
2.3.1.Đối tượng nghiên cứu
Trichoderma atroviride (Tri 3) do bộ mơn Vi Sinh – Hóa Sinh, Viện Công
Nghệ Sinh Học- Trƣờng Đại Học Lâm Nghiệp Hà Nội cung cấp.

2.3.2.Thiết bị và hóa chất
Thiết bị
STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12

Thiết bị
Box cấy vô trùng ( Box laminar PII)
Tủ ấm (Menmmert)
Nối hấp khử trùng(Lequenx)
Cân điện tử (AL300)
Kính hiển vi quang học
Bếp điện/ bếp từ
Tủ sấy
Lị vi sóng
Má đo pH
Máy lắc
Máy ly tâm lạnh
Đĩa petri, ống đong, bình thủy tinh, 100ml,

15

Xuất xứ
Đức
Đức
Pháp
Mỹ
Đức
Việt Nam
MỸ
Mỹ
Nhật
Đức
Đức
Việt nam, trung Quốc


250ml, 500ml, 1000ml, ống Falcon, giấy
cân, đèn cồn

 Hóa chất
Các hóa chất đƣợc sử dụng trong nghiên cứu là các hóa chất thơng dụng có
ở Viện Cơng Nghệ inh Trƣờng Đại Học Lâm nghiệp (do Việt Nam, Trung
Quốc sản xuất nhƣ: cao thịt , cao nấm men, agar, pepton, glucose và nhiều hóa
chất khác).
2.3.3. Mơi trường ni cấy nấm mốc
 MT 1 Czapek lỏng [4,5,6]
FeSO4.7H2O: 0,1 g

NaNO3: 3,5g

Dịch chitin 1%: 30 ml

K2HPO4: 1,5g

Nƣớc: 1000 ml

MgSO4.7H2O: 0,5g

pH = 5,5 . Khử trùng 1atm/30phút

KCl: 0,5g

Saccharose: 20 g

 MT 2 Môi trƣờng rắn khảo sát khả năng sinh tổng hợp hoạt độ
enzyme thủy phân chitinase từ các chủng nấm sợi[2]

Trấu: 50g

KCl 0,05g

Cám: 40g

MgSO4.7H2O: 0,05g

Saccharose: 4g

Chitin: 10g

(NH4)2SO4 0,1g

Nƣớc 60%

Urê 2,2g
CaCl2 0,1g

16


17


 MT 3 Phương pháp đo vòng phân giải bằng phương pháp vặn nút
chai [2,3,4]
MT 3
Thành phần

Khối lƣợng

Agar

20g

Dd chitin 1%

40ml

Nƣớc

Định mức đến 1000ml

PH= 5,5 , Thanh trùng ở 120°C
2.4.Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1.Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy dến hoạt
độ chitinase của chủng Trichoderma atroviride
Sử dụng MT 1 Czapek lỏng và MT 2 rắn để tiến hành khảo sát ảnh hƣởng
của môi trƣờng nuôi cấ đến hoạt độ chitin của chủng Trichoderma.
Ở MT1 và MT 2 đầu tiên tiến hành cấy chủng Trichoderma atroviride sau
đó ni ở nhiệt độ 30

trong khoảng thời gian 24, 48, 72, 96, 120 giờ. Sau đó

tiến hành thu dịch enzyme thơ rồi tiến hành xác định hoạt độ chitinase.
2.4.2.Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp
chitinase của Trichoderma atroviride
 Nguyên tắc:
Dựa vào phƣơng pháp đo hoạt độ bằng má đo quang phổ OD để xác
định hoạt độ của chitinase xác định đƣợc nguồn cacbon thích hợp nhất đối với
chủng Trichoderma atroviride.
Sử dụng 3 nguồn cacbon để tiến hành khảo sát là: saccharose, lactose,
glucose,
Tiến hành nghiên cứu theo bƣớc sau:

18