Bước đầu nghiên cứu tinh sạch enzym dehalogenase từ chủng vi sinh vật phân lập tại Việt Nam
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.3 MB, 59 trang )
Luận văn thạc sĩ
Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-------------------------------------
Nguyễn Đàm Lý
BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TINH SẠCH ENZYM
DEHALOGENASE TỪ CHỦNG VI SINH VẬT PHÂN LẬP
TẠI VIỆT NAM
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội – 2014
Nguyễn Đàm Lý
Khóa 2011-2013
Luận văn thạc sĩ
Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-------------------------------------
Nguyễn Đàm Lý
BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TINH SẠCH ENZYM
DEHALOGENASE TỪ CHỦNG VI SINH VẬT PHÂN LẬP
TẠI VIỆT NAM
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. Nguyễn Quang Huy
Hà Nội – 2014
Nguyễn Đàm Lý
Khóa 2011-2013
Luận văn thạc sĩ
Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc nhất
đến PGS. TS. Nguyễn Quang Huy, người Thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cho
em những kĩ năng nghiên cứu cũng như những kiến thức cần thiết trong suốt thời
gian học tập và thực hiện đề tài. Bên cạnh đó Thầy đã tạo điều kiện học tập và
nghiên cứu tốt nhất cho em để em có thể hoàn thành tốt luận văn này.
Tiếp đến em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong Khoa Sinh học,
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn và cung
cấp cho em những kiến thức bổ ích trong suốt khóa học.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô, các anh chị, các
bạn, các em sinh viên trong Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa Sinh, phòng Enzyme
học và Phân tích hoạt tính sinh học, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ
Protein và Enzym, Trung tâm Nghiên cứu Khoa học sự sống, khoa Sinh học đã
hướng dẫn và giúp đỡ em trong thời gian em nghiên cứu tại các phòng thí nghiệm.
Đề tài được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài cấp Đại học Quốc
Gia Hà Nội mã số KLEPT 12-01. Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm trọng
điểm Công nghệEnzym và Protein, nhân dịp này em xin trân trọng cảm ơn sự giúp
đỡ quý báu đó.
Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn bên
cạnh, động viên, ủng hộ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt thời gian
học tập cũng như quá trình hoàn thành khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10 tháng 08 năm 2014
Học viên
Nguyễn Đàm Lý
Nguyễn Đàm Lý
Khóa 2011-2013
Luận văn thạc sĩ
Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
Chƣơng 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 2
1.1. Hợp chất halogen ..................................................................................... 2
1.1.1. Hợp chất halogen hữu cơ ...................................................................... 2
1.1.2. Ứng dụng của hợp chất clo hữu cơ....................................................... 2
1.1.3. Tác hại của hợp chất clo hữu cơ ........................................................... 5
1.2. Tình hình sử dụng hợp chất có chứa clo ở Việt Nam .............................. 7
1.3. Một số phƣơng pháp xử lý hợp chất clo hữu cơ ...................................... 8
1.3.1. Phân hủy bằng tia cực tím (UV) hoặc bằng ánh sáng mặt trời ............ 8
1.3.2. Phân hủy bằng vi sóng Plasma ............................................................. 9
1.3.3. Biện pháp ozon hóa/UV ....................................................................... 9
1.3.4. Biện pháp oxy hóa bằng không khí ƣớt ................................................ 9
1.3.5.
Biện pháp oxy hóa ở nhiệt độ cao .............................................. 9
1.3.6. Phân hủy bằng công nghệ sinh học .................................................... 10
1.4. Giới thiệu về hợp chất 2,2-Dichloropropionate Sodium (2,2 DCPS) ....... 12
1.4.1. Ứng dụng của 2,2 DCPS .................................................................... 12
1.4.2. Ảnh hƣởng của 2,2 DCPS đến sức khỏe con ngƣời ........................... 13
1.4.3. Quá trình phân hủy trong môi trƣờng tự nhiên của 2,2 DCPS ........... 13
1.5. Enzym dehalogenase ............................................................................. 15
Chƣơng 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............ 17
2.1. Nguyên liệu .............................................................................................. 17
2.2. Hóa chất và thiết bị .................................................................................. 17
2.2.1. Hóa chất và môi trƣờng nuôi cấy ....................................................... 17
2.2.2. Máy móc, thiết bị ................................................................................ 18
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................... 18
2.3.1. Phƣơng pháp thu mẫu ......................................................................... 18
2.3.2. Phƣơng pháp phân lập ........................................................................ 18
Nguyễn Đàm Lý
Khóa 2011-2013
Luận văn thạc sĩ
Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm
2.3.3. Phƣơng pháp tuyển chọn các chủng vi sinh vật ................................. 19
2.3.4. Phƣơng pháp phân loại chủng vi sinh vật .......................................... 19
2.3.5. Nghiên cứu các đặc điểm hóa sinh của các chủng vi sinh vật ........... 21
2.3.6. Nghiên cứu các điều kiện sinh trƣởng và khả năng sử dụng một số cơ
chất khác nhau ................................................................................................. 22
2.3.7. Đánh giá khả năng phân hủy hợp chất 2,2 DCPS .............................. 22
2.3.8. Phƣơng pháp nghiên cứu tinh sạch dehalogenase .............................. 24
2.3.9. Phƣơng pháp thống kê sinh học ......................................................... 29
Chƣơng 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 30
3.1. Phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng 2,2 DCPS .............. 30
3.3. Xác định các đặc điểm sinh lý, hóa sinh của chủng H11......................... 33
3.3.1. Nhuộm Gram ......................................................................................... 33
3.3.2. Kết quả chụp ảnh kính hiển vi điện tử quét .......................................... 33
3.3.3. Giải trình tự gen 16S rRNA .................................................................. 34
3.3. Khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ khác nhau của chủng H11 ........ 36
3.4. Nghiên cứu khả năng sinh trƣởng phát triển chủng H11 ......................... 37
3.4.1.Xây dựng đƣờng cong sinh trƣởng của chủng H11 ............................... 37
3.4.2.Tối ƣu các điều kiện cho sự sinh trƣởng của các chủng H11 ................ 37
3.5.Khả năng phân hủy 2,2 DCPS ................................................................. 39
3.5.2.Khả năng phân hủy 2,2 DCPS theo thời gian ........................................ 39
3.6. Bƣớc đầu nghiên cứu tinh sạch dehalogenase từ chủng H11 .................. 39
3.6.2. Xác định hoạt tính enzym dehalogen .................................................... 39
3.6.3. Sắc ký trao đổi anion ............................................................................. 40
3.6.4. Điện di không biến tính protein ............................................................ 41
KẾT LUẬN ..................................................................................................... 44
KIẾN NGHỊ .................................................................................................... 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 46
Nguyễn Đàm Lý
Khóa 2011-2013
Luận văn thạc sĩ
Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. Công thức hóa học một số loại thuốc bảo vệ thực vật phổ biến ......... 4
Hình 2. Sự luân chuyển thuốc BVTV trong môi trƣờng không khí và nƣớc ... 6
Hình 3. Công thức cấu tạo của 2,2 DCPS ...................................................... 12
Hình 4. Đƣờng chuẩn nồng độ NaCl với ion Cl- có trong mẫu ...................... 24
Hình 5. Đƣờng chuẩn nồng đô protein ........................................................... 25
Hình 6. Hình thái một số chủng vi sinh vật trên môi trƣờng thạch MGB ..... 31
Hình 7. Chủng vi khuẩn H11 trên môi trƣờng MGB và MGB bổ sung
Bromothymol blue. ......................................................................................... 32
Hình 8. Hình thái chủng H11 dƣới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại
100 ................................................................................................................. 33
Hình 9. Ảnh hiện vi điện tử quét chủng H11 ở độ phóng đại 5000 ............. 33
Hình 10. Vị trí phân loại của chủng H11 với các loài có quan hệ họ hàng gần.
......................................................................................................................... 35
Hình 11. Khả năng sinh trƣởng của chủng H11 trên môi trƣờng MGB và
MGB 0.1% cao nấm. ....................................................................................... 37
Hình 12. Khả năng sinh trƣởng của chủng H11 tại các nhiệt độ khác nhau
trên môi trƣờng MGB...................................................................................... 38
Hình 13. Khả năng sinh trƣởng của H11 với các nồng độ cơ chất khác nhau
trên môi trƣờng MGB...................................................................................... 38
Hình 14. Khả năng phân hủy theo thời gian của H11 trên môi trƣờng MGB 39
Hình 15. Kết quả điện di SDS-PAGEsau khi qua cột Q sepharose. .............. 40
Hình 16. Điện di không biến tính protein....................................................... 41
Hình 17. Kết quả điện di SDS-PAGE sau khi qua cột Sephadex G-75. ........ 42
Nguyễn Đàm Lý
Khóa 2011-2013
Luận văn thạc sĩ
Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. Sử dụng của hợp chất clo ở châu Âu năm 2012 ................................. 5
Bảng 2. Mức dƣ lƣợng tối đa cho phép của mộ số thuốc trừ sâu, diệt cỏ gốc
clo trong đất ở Việt Nam ................................................................................... 7
Bảng 3. Thành phần của bản gel điện di không biến tính protein .................. 26
Bảng 4. Thành phần bản gel SDS-PAGE ....................................................... 28
Bảng 5. Đặc điểm các khuẩn lạc trên môi trƣờng MGB có bổ sung cơ chất 2,2
DCPS ............................................................................................................... 30
Bảng 6. Kết quả thử kit API 20NE của chủng H11 ........................................ 36
Nguyễn Đàm Lý
Khóa 2011-2013
Luận văn thạc sĩ
Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm
BẢNG KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT
BVTV
Bảo vệ thực vật
2,2 DCPS
2,2-dichloropropionate sodium
DDT
Dichloro diphenyl trichlorothane
2,4-D
2,4-dichlorophenoxyacetic axit
MGB
Minimal growth bacterium
PVC
Polyvinyl clorua
Nguyễn Đàm Lý
Khóa 2011-2013
Luận văn thạc sĩ
Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm
MỞ ĐẦU
Nhóm hợp chất halogen là nhóm hợp chất đƣợc ứng dụng rộng rãi trong
nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp, y học… Bên cạnh những lợi ích to lớn thì
việc sử dụng một cách tràn lan và không có biện pháp xử lý triệt để đã và đang gây
ra những hậu quả nghiêm trọng đến môi trƣờng, hệ sinh thái và sức khỏe con ngƣời.
Việc sử dụng các phƣơng pháp vật lý, hóa học để giải quyết tình trạng ô nhiễm gây
ra bởi các hợp chất halogen cho hiệu quả cao tuy nhiên đòi hỏi công nghệ hiện đại,
chi phí cao và vấn đề hậu xử lý các sản phẩm tạo thành. Phƣơng pháp sinh học sử
dụng các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải các hợp chất halogen đƣợc đánh
giá là hƣớng nghiên cứu mới có tiềm năng cao không chỉ cho hiệu quả cao mà còn
thân thiện với môi trƣờng, ít tốn kém và mang tính bền vững. Trong tự nhiên tồn tại
một số nhóm vi sinh vật có khả năng sử dụng các hợp chất halogen làm nguồn cung
cấp cacbon duy trì hoạt động sống, chúng chuyên hóa các hợp chất halogen từ dạng
độc hại trở thành dạng ít hoặc không độc với môi trƣờng sinh thái và con ngƣời.
Việt Nam là nƣớc sản xuất nông nghiệp, cùng với điều kiện khí hậu phù hợp
cho sự phát triển của cây trồng nhƣng cũng là cơ hội cho sự lây lan của nhiều loại
sâu bệnh, cỏ dại. Để hạn chế sự phát triển lây lan của sâu bệnh, cỏ dại hàng năm
chúng ta sử dụng một lƣợng lớn thuốc bảo vệ thực vật trong đó có nhóm các hợp
chất halogen. Việc sử dụng hợp chất này nhƣng lại không có biện pháp kiểm soát đã
gây ra tình trạng ô nhiễm môi trƣờng nghiêm trọng, ảnh hƣởng đến sinh thái môi
trƣờng và sức khỏe con ngƣời. Ở Việt Nam hiện chƣa có nhiều nghiên cứu cơ bản
về việc ứng dụng vi sinh vật có khả năng phân giải hợp chất halogen để giải quyết ô
nhiễm môi trƣờng, việc ứng dụng vi sinh vật trong tự nhiên để giải quyết ô nhiễm
môi truờng còn mới mẻ, tiềm năng của phƣơng pháp sinh học còn nhiều đồng thời
để tiếp tục phát triển các đề tài đã đƣợc thực hiện trƣớc đó chúng tôi đã tiến hành
thực hiện đề tài:
“BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TINH SẠCH ENZYM DEHALOGENASE
TỪ CHỦNG VI SINH VẬT PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM” với mục tiêu phân lập
các vi sinh vật có hoạt tính phân giải hợp chất clo trên cơ sở các chủng tuyển chọn
đƣợc bƣớc đầu nghiên cứu tinh sạch enzym có khả năng phân hủy hợp chất có chứa
clo tại Việt Nam.
Nguyễn Đàm Lý
1
Khóa 2011-2013
Luận văn thạc sĩ
Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm
Chƣơng 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.
Hợp chất halogen
1.1.1. Hợp chất halogen hữu cơ
Các hợp chất halogen hữu cơ là một lớp gồm các chất hóa học tự nhiên và
tổng hợp, có chứa một hoặc nhiều gốc halogen gồm Flo, Clo, Brom, Iot kết hợp với
cacbon và các yếu tố khác. Chúng đƣợc ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp, nông
nghiệp, y học... nhƣ sản xuất nhựa, thiết bị y tế, tổng hợp cao su, đặc biệt là sản xuất
thuốc trừ sâu bệnh trong nông nghiệp [19].
Các hợp chất hữu cơ dẫn xuất halogen đều có tính độc cao, chúng là một
trong những nhóm các chất gây ô nhiễm môi trƣờng lớn nhất do việc sử dụng tràn
lan các loại thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu trong nông nghiệp cũng nhƣ việc sản xuất
các loại dung môi, chất dẻo và nhiều chất trung gian cho các sản phẩm hóa tổng
hợp. Việc sử dụng tràn lan thiếu kiểm soát các hợp chất hữu cơ dẫn xuất halogen đã
dẫn đến tình trạng tồn dƣ với khối lƣợng lớn trong môi trƣờng vƣợt qua sự chịu tải
và tái sinh của hệ sinh thái dẫn đến ô nhiễm môi trƣờng hệ sinh thái, ảnh hƣởng đến
sức khỏe cộng đồng [52].
1.1.2. Ứng dụng của hợp chất clo hữu cơ
Hợp chất clo hữu cơ đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau
của đời sống nhƣ các sản phẩm nhựa, các dung môi tẩy rửa... Các loại hợp chất này
thƣờng bền vững và khó bị phân hủy nên tồn tại lâu dài trong tự nhiên. Dƣ lƣợng
lớn các loại hợp chất này đƣợc tìm thấy trong đất, nƣớc và không khí qua nƣớc mƣa
vào các hệ thống nƣớc uống và nƣớc sinh hoạt ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời
và các loại sinh vật [18].
Một số ứng dụng quan trọng:
-
Chất dẻo:
Hiện nay, trong cuộc sống hàng ngày con ngƣời sử dụng nhiều các sản phẩm
từ nhựa tổng hợp nhƣ PVC (polyvinyl chlorua), PE (polyethylene), PP
(polypropylene), PS (polystyrene)... trong đó polyvinylclorua (PVC) là loại nhựa
nhiệt dẻo đƣợc sản xuất và tiêu thụ nhiều thứ ba trên thế giới. Clo trong PVC có khả
Nguyễn Đàm Lý
2
Khóa 2011-2013
Luận văn thạc sĩ
Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm
năng kìm hãm sự cháy chính vì đặc điểm này mà PVC gần nhƣ chiếm vị trí độc tôn
trong lĩnh vực xây dựng dân dụng [33].
-
Dung môi:
Dung môi clo là dung môi phổ biến nhất trong số các dẫn xuất halogen.
Trichloroethylene
(CHCl=CCl2)
và
Tetrachloroethylene
(CCl2=CCl2),
Chlorofluorocarbons (CFC),Methylene chloride (CH2Cl2), carbon tetrachloride
(CCl4), Chloroform (CHCl3), 1,1,1-trichloroethane (CH3-CCl)... Dung môi clo đƣợc
ứng dụng trong công nghệ làm lạnh, giặt khô, dập lửa, làm sạch kim loại, tẩy dầu
mỡ, bình xịt ô tô, in ấn, giấy và các ngành công nghiệp dệt may, loại bỏ sơn, ngành
công nghiệp đồ nội thất, sản xuất nhựa nhiệt dẻo. [15,22].
-
Thuốc nhuộm:
Một số loại thuốc nhuộm đƣợc sử dụng để nhuộm len, cellulose, bông và sợi
tổng hợp... có bản chất là dẫn xuất hữu cơ của halogen. Các loại thuốc nhuộm nhƣ
picric acid, indigotin và một số thuốc nhuộm azo sản xuất từ nguyên liệu ban đầu
nhƣ chloroanilines, chlorobenzenes, chloronitrobenzenes, chloroacetic acid. Các
hợp chất hữu cơ dẫn xuất halogen có màu sắc đặc trƣng đƣợc sửdụng đểnhuộm xơ
sợi xenluloz. Clo prinazines và các chất dẫn xuất của chúngđƣợc sửdụng để nhuộm
sợi bông, trong khi thuốc nhuộm có thành phần chloro nhƣ remalan, procilan,
procion đƣợc sử dụng cho nhuộm len và sợi polyamide [57].
-
Dƣợc phẩm
Trong sản xuất dƣợc phẩm, 80% các dƣợc phẩm và vitamin là liên quan đến
clo, nhiều loại thuốc cần có clo để gây tác dụng. Ceclor và Lorabid đƣợc sử dụng để
điều trị nhiễm trùng tai, Toremifene là một loại thuốc chống ung thƣ vú, và
vancomycin kháng sinh tự nhiên đƣợc sử dụng để chống lại nhiễm trùng kháng
penicillin. Clorua benzyl đƣợc sử dụng để tổng hợp các loại thuốc phenobarbital,
benzedrine, và demerol. Thuốc mê hô hấp bao gồm các organofluorines desflurane,
sevoflurane và enflurane (CHClFCF2OCHF2 ). Các hợp chất perfluorocacbon,
chẳng hạn nhƣ perfluorotributylamine ([CF3 CF2 CF2CF2]3N), đƣợc sử dụng để thay
thế máu hoặc chế tạo "máu nhân tạo" và đƣợc sử dụng cho tạo hình động mạch
vành [38].
Nguyễn Đàm Lý
3
Khóa 2011-2013
Luận văn thạc sĩ
-
Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm
Thuốc bảo vệ thực vật:
Hơn 1000 loại thuốc bảo vệ thực vật đã đƣợc sử dụng trong nông nghiệp bao
gồm:
1)
Nhóm thuốc trừ sâu: Benzen hexachloride (BHC), DDT, heptachlor,
chlordane, aldrin, dieldrin, toxaphene, endrin, methoxychlor…
2)
Nhóm thuốc diệt nấm: Pentachloronitrobenzenes, phenol clo, quinon
khử trùng bằng clo, clo benzoquinones, nephthoquinones clo, chloranil…
3)
Nhóm
phụ
gia
bổ
sung:
Chlorophenoxyacetic
acid,
natri
trichloroacetate, 2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid. Hợp chất hữu cơ chứa clo
cũng đƣợc sử dụng nhƣ là nguyên liệu cơ bản để sản xuất của một số thuốc trừ
sâu.
Chlorophenols,
chloroanilines,
atrazine,
chlorobenzenes,
2,2-
Dichoropropionate sodium-nguyên liệu cơ bản đƣợc sửdụng đểsản xuất thuốc diệt
cỏ nhƣ axit chlorophenoxyacetic, dalapon, thuốc diệt nấm- polychlorophenol và
thuốc trừ sâu DDT [35].
Hình 1. Công thức hóa học một số loại thuốc bảo vệ thực vật phổ biến
Vì có ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau do đó con ngƣời tạo
ra các hợp chất clo ngày càng nhiều. Ở các nƣớc càng phát triển thì lƣợng các hợp
chất clo đƣợc sản xuất và sử dụng càng nhiều. Chỉ riêng ở châu Âu năm 2012 đã sử
dụng đến gần 10 triệu tấn hợp chất có chứa clo (bảng 1).
Nguyễn Đàm Lý
4
Khóa 2011-2013
Luận văn thạc sĩ
Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm
Bảng 1.Sử dụng của hợp chất clo ở châu Âu năm 2012 (9.747 triệu tấn) [54]
Ứng dụng của clo ở châu Âu 2012
Triệu tấn
%
Dung môi
279
3,1
Epichlorohydrin
510
5,2
Chloromethanes
453
5,4
Các chất hữu cơ khác
911
9,2
PVC
3.245
33,6
Hợp chất vô cơ
1.398
14,1
Isocyanate & oxygenates
2.951
29,4
Tổng số
9.747
100
1.1.3. Tác hại của hợp chất clo hữu cơ
Việc sử dụng thuốc BVTV trong nông nghiệp đã làm tác động tới môi trƣờng
sinh thái. Định hƣớng của thuốc là diệt sâu hại, cỏ dại..., nhƣng diễn biến thực tế do
thiếu sự kiểm soát thuốc BVTV lại ảnh hƣởng độc tới đất, nƣớc, không khí và các
sản phẩm nông nghiệp, động vật, sức khoẻ con ngƣời đặc biệt những dƣ lƣợng của
những chất do tính độc cao nhƣ chlordane, DDT, picloram,...
Không khí là một phần quan trọng trong quá trình luân chuyển và phân tán
thuốc BVTV. Khi con ngƣời sử dụng, thuốc BVTV sẽ phân tán vào không khí, đất
nƣớc bề mặt. Lƣợng mƣa hàng năm sẽ giúp làm sạch bầu không khí đồng thời rửa
trôi thuốc BVTV trên bề mặt để tích tụ trong sông, suối, ao, hồ và thuốc BVTV sẽ
thâm nhập vào nguồn nƣớc ngầm bằng cách ngấm qua đất (hình 2).
Một đặc tính quan trọng của thuốc BVTV trong hệ sinh thái là tính khuếch
đại sinh học. Từ nồng độ sử dụng nhỏ, sau khi vào hệ sinh thái thông qua chuỗi lƣới
thức ăn chất độc đƣợc tích luỹ với nồng độ cao dần qua các bậc dinh dƣỡng. Hầu
hết các loại thuốc BVTV đều độc đối với ngƣời và động vật máu nóng, tuy nhiên
mức độ gây độc của mỗi loại thuốc có khác nhau, có loại thuốc gây độc cấp tính, có
loại thuốc có tính tích luỹ lâu trong cơ thể sống, bền vững trong môi trƣờng. Thuốc
BVTV xâm nhập vào cơ thể con ngƣời bằng các con đƣờng nhƣ qua da, qua miệng,
qua hô hấp và gây ngộ độc đến tính mạng con ngƣời. Khi thuốc bảo vệ thực vật tồn
Nguyễn Đàm Lý
5
Khóa 2011-2013
Luận văn thạc sĩ
Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm
dƣ trong thực phẩm vào cơ thể qua con đƣờng ăn uống, chúng có thể bị loại bỏ theo
khí thở, theo phân hoặc nƣớc tiểu, tuy nhiên không thể tránh khỏi sự chuyển hóa các
chất độc hại này ở trong gan. Một số thuốc bảo vệ thực vật chuyển hóa thành những
sản phẩm ít độc hơn, dễ hòa tan trong nƣớc hơn thì sẽ dễ dàng bị loại bỏ, nhƣng
cũng có những loại hóa chất lại tạo thành những chất trao đổi trung gian độc hơn
(nhƣ paration chuyển thành paraoxon), tích lũy trong một số cơ quan hoặc mô mỡ
gây tổn thƣơng và kèm theo các triệu chứng ngộ độc nguy hiểm. Thuốc bảo vệ thực
vật có trong thức ăn, đồ uống với lƣợng lớn có thể gây ngộ độc cấp tính gây rối loạn
tiêu hóa (nôn mửa, tiêu chảy), rối loạn thần kinh (nhức đầu, hôn mê, co giật hoặc co
cứng cơ...), trụy tim mạch, suy hô hấp rất dễ dẫn dến tử vong. Các kết quả nghiên
cứu cho thấy có đến 90% thuốc BVTV không đạt mục đích mà còn gây nhiễm độc
đất, nƣớc, nông sản [13, 14].
Hình 2. Sự luân chuyển thuốc BVTV trong môi trƣờng không khí và nƣớc[13]
Trên thế giới ƣớc tính có khoảng 39 triệu ngƣời có thể bị ngộ độc cấp tính
hàng năm do ảnh hƣởng của hóa chất BVTV. Trong đó có khoảng 3 triệu ngƣời bị
ngộ độc cấp tính nghiêm trọng và 220 nghìn ngƣời tử vong mỗi năm. Đi đôi với số
lƣợng hóa chất bảo vệ thực vật sử dụng tăng là số ngƣời ngộ độc hóa chất BVTV
cũng tăng, đặc biệt là tại các nƣớc đang phát triển, 99% trƣờng hợp ngộ độc xảy ra
ởcác nƣớc này, cho dù lƣợng tiêu thụ hoá chất bảo vệ thực vật chỉ chiếm 20%. Tuy
nhiên, phần lớn ngƣời nông dân tại các nƣớc này chƣa nhận biết đầy đủ về tác hại
cũng nhƣ nguy cơ do hoá chất bảo vệ thực vật gây ra [58].
Nguyễn Đàm Lý
6
Khóa 2011-2013
Luận văn thạc sĩ
1.2.
Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm
Tình hình sử dụng hợp chất có chứa clo ở Việt Nam
Thực trạng nhiễm độc hoá chất bảo vệ thực vật tại Việt Nam vẫn còn nghiêm
trọng. Thống kê sơ bộ tại 38 tỉnh, thành phố, trong năm 2007 đã xảy ra gần 4.700
vụ, với 5.207 trƣờng hợp bị nhiễm độc hoá chất bảo vệ thực vật và 106 ngƣời đã tử
vong. Năm 2009 có 4.372 vụ nhiễm độc với 4.515 trƣờng hợp, tử vong 138 trƣờng
hợp chiếm tỷ lệ 3,05%. Theo Hà Minh Trung và cộng sự, cả nƣớc hiện có 11,5
triệu hộ nông nghiệp, số ngƣời tiếp xúc nghề nghiệp với hóa chất bảo vệ thực vật ít
nhất cũng tới 11,5 triệu ngƣời [11]. Với tỷ lệ nhiễm độc hóa chất bảo vệ thực vật
mãn tính là 18,26% thì số ngƣời bị nhiễm độc mãn tính trong cả nƣớc lên tới 2,1
triệu ngƣời. Nguyên nhân chủ yếu do tình trạng lạm dụng và sử dụng bừa bãi hoá
chất BVTV trong đó 98% trƣờng hợp lạm dụng hoặc pha đặc hơn so với hƣớng dẫn
trên bao bì 2-3 lần; có từ 84,17% đến 93,23% không sử dụng đầy đủ phƣơng 2 tiện
bảo vệ cá nhân khi phun hoá chất bảo vệ thực vật [7]. Trƣớc thực tiễn sử dụng một
cách tràn lan thuốc BVTV ở Việt Nam, năm 2008 Bộ Tài nguyên và Môi trƣờng đã
đƣa ra quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về dƣ lƣợng hóa chất BVTV trong đất, trong đó
có một số thuốc BVTV có nguồn gốc clo (bảng 2).
Bảng 2. Mức dƣ lƣợng tối đa cho phép của mộ số thuốc trừ sâu, diệt cỏ gốc clo
trong đất ở Việt Nam [59].
S
TT
Giới hạn dƣ lƣợng tối đa
Tên hoạt chất
(mg/kg)
1
DTT
0,01
2
2,2-DCPS
0,1
3
Atrazine
0,1
4
Aldrin
0,01
5
Endrin
0,01
6
2,4-D
0,1
7
Benthiocarb
0,1
8
Chlordane
0,01
Nguyễn Đàm Lý
7
Khóa 2011-2013
Luận văn thạc sĩ
Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm
Theo báo cáo của Vụ Khoa học công nghệ và Môi trƣờng (Bộ Nông nghiệp
và Phát triển nông thôn), lƣợng thuốc BVTV nhập vào Việt Nam là 77.000 tấn, tổng
lƣợng thuốc BVTV trôi nổi không đƣợc phép sử dụng đang lƣu trữ cần tiêu hủy trên
cả nƣớc là 150 tấn thuốc nƣớc và thuốc bột. Chúng đặc biệt nguy hiểm vì thuộc vào
nhóm POP (nhóm chất ô nhiễm hữu cơ khó phân hủy) - do đó gây ra những nguy cơ
đối với môi trƣờng và sức khỏe con ngƣời. Các chất này bao gồm: aldrin,
chlordane, DDT,…[1, 50].
Những năm gần đây, do diện tích đất canh tác ở nƣớc ta bị thu hẹp ngƣời sản
xuất bắt buộc phải thâm canh tăng vụ, thay đổi cơ cấu giống cây trồng…, kéo theo
đó là việc tăng sử dụng phân bón, thuốc bảo vệ thực vật. Bên cạnh đó, do khí hậu
biến đổi bất thƣờng nên tình hình sâu bệnh diễn biến phức tạp hơn, vì vậy số lƣợng
và chủng loại thuốc BVTV sử dụng cũng tăng lên. Nếu nhƣ trƣớc năm 1985, khối
lƣợng thuốc BVTV dùng hàng năm khoảng 6.500 - 9.000 tấn thì từ năm 1991 đến
nay lƣợng thuốc sử dụng biến động từ 25-38 ngàn tấn [64]. Việc sử dụng thuốc
BVTV không rõ nguồn gốc xuất xứ và cùng với đó các loại bao bì, chai lọ đựng
thuốc BVTV không đƣợc xử lý đúng cách cũng đang là mối nguy cơ đe dọa
nghiêm trọng tới sức khỏe cộng đồng và gây ô nhiễm môi trƣờng.
1.3.
Một số phƣơng pháp xử lý hợp chất clo hữu cơ
1.3.1. Phân hủy bằng tia cực tím (UV) hoặc bằng ánh sáng mặt trời
Các phản ứng phân huỷ bằng tia cực tím (UV), bằng ánh sáng mặt trời
thƣờng làm gãy mạch vòng hoặc gẫy các mối liên kết giữa Clo và Cacbon hoặc
nguyên tố khác trong cấu trúc phân tử của chất hữu cơ và sau đó thay thế nhóm Cl
bằng nhóm Phenyl hoặc nhóm Hydroxyl và giảm độ độc của hoạt chất. Ƣu điểm
của biện pháp này là hiệu suất xử lý cao, chi phí cho xử lý thấp, rác thải an toàn
ngoài môi trƣờng. Tuy nhiên, nhƣợc điểm của biện pháp là không thể áp dụng để xử
lý chất ô nhiễm chảy tràn và chất thải rửa có nồng độ đậm đặc. Nếu áp dụng để xử
lý ô nhiễm đất thì lớp đất trực tiếp đƣợc tia UV chiếu không dày hơn 5mm. Do đó,
khi cần xử lý nhanh lớp đất bị ô nhiễm tới các tầng sâu hơn 5mm thì biện pháp này
ít đƣợc sử dụng và đặc biệt trong công nghệ xử lý hiện trƣờng [60].
Nguyễn Đàm Lý
8
Khóa 2011-2013
Luận văn thạc sĩ
Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm
1.3.2. Phân hủy bằng vi sóng Plasma
Biện pháp này đƣợc tiến hành trong thiết bị cấu tạo đặc biệt. Chất hữu cơ
đƣợc dẫn qua ống phản ứng (Detector Plasma) sinh ra sóng phát xạ electron cực
ngắn (vi sóng). Sóng phát xạ electron tác dụng vào các phân tử hữu cơ tạo ra nhóm
gốc tự do và sau đó dẫn tới các phản ứng tạo SO2, CO2, [HPO3]2-, Cl2, Br2, … ( sản
phẩm tạo ra phụ thuộc vào bản chất thuốc BVTV).
Kết quả thực nghiệm theo biện pháp trên ở một số loại thuốc BVTV đã phá
huỷ đến 99% (với tốc độ từ 1,8 đến 3 kg/h).
Ƣu điểm của biện pháp này là hiệu suất xử lý cao, thiết bị gọn nhẹ. Khí thải
khi xử lý an toàn cho môi trƣờng. Tuy nhiên, nhƣợc điểm của biện pháp này là chỉ sử
dụng hiệu quả trong pha lỏng và pha khí, chi phí cho xử lý cao, phải đầu tƣ lớn [60].
1.3.3. Biện pháp ozon hóa/UV
Ozon hoá kết hợp với chiếu tia cực tím là biện pháp phân huỷ các chất thải
hữu cơ trong dung dịch hoặc trong dung môi. Kỹ thuật này thƣờng đƣợc áp dụng để
xử lý ô nhiễm thuốc trừ sâu ở Mỹ. Phản ứng hoá học để phân huỷ hợp chất là:
Thuốc trừ sâu, diệt cỏ + O3
CO2 + H2O + các nguyên tố khác
Ƣu điểm của biện pháp này là sử dụng thiết bị gọn nhẹ, chi phí vận hành
thấp, chất thải ra môi trƣờng sau khi xử lý là loại ít độc, thời gian phân huỷ rất
ngắn. Nhƣợc điểm của biện pháp là chỉ sử dụng có hiệu quả cao trong các pha lỏng,
pha khí. Chi phí ban đầu cho xử lý là rất lớn [60].
1.3.4. Biện pháp oxy hóa bằng không khí ƣớt
Biện pháp này dựa trên cơ chế oxy hoá bằng hỗn hợp không khí và hơi nƣớc
ở nhiệt độ cao > 350oC và áp suất 150 atm. Kết quả xử lý đạt hiệu quả 95%. Chi phí
cho xử lý theo biện pháp này chƣa đƣợc công bố [60].
1.3.5. Biện pháp oxy hóa ở nhiệt độ cao (thiêu đốt, nung chảy, lò
nung chảy)
Biện pháp oxy hoá ở nhiệt độ cao có 2 bƣớc chính:
- Bƣớc 1: Tách chất ô nhiễm ra hỗn hợp đất bằng phƣơng pháp hoá hơi
chất ô nhiễm.
Nguyễn Đàm Lý
9
Khóa 2011-2013
Luận văn thạc sĩ
Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm
- Bƣớc 2: Là bƣớc phá huỷ chất ô nhiễm bằng nhiệt độ cao. Dùng nhiệt độ
cao có lƣợng oxy dƣ để oxy hoá các chất ô nhiễm thành CO2, H2O, NOx, P2O5.
Ƣu điểm của biện pháp xử lý nhiệt độ cao là biện pháp tổng hợp vừa tách
chất ô nhiễm ra khỏi đất, vừa làm sạch triệt để chất ô nhiễm; khí thải rất an toàn cho
môi trƣờng (khi có hệ thống lọc khí thải). Hiệu suất xử lý tiêu độc cao > 95%; cặn
bã tro sau khi xử lý chiếm tỷ lệ nhỏ (0,01%).
Hạn chế của biện pháp này là chi phí cho xử lý cao, không áp dụng cho xử lý
đất bị ô nhiễm kim loại nặng, cấu trúc đất sau khi xử lý bị phá huỷ, khí thải cần phải
lọc trƣớc khi thải ra môi trƣờng [60].
1.3.6. Phân hủy bằng công nghệ sinh học
Việc loại bỏ có hiệu quả tồn dƣ thuốc BVTV là một trong các khó khăn
chính mà nền nông nghiệp phải đối mặt. Vi sinh vật đất đƣợc biết đến nhƣ những cơ
thể có khả năng phân huỷ rất nhiều thuốc BVTV dùng trong nông nghiệp. Trong
những năm gần đây xu hƣớng sử dụng vi sinh vật để phân huỷ lƣợng tồn dƣ thuốc
BVTV một cách an toàn đƣợc chú trọng nghiên cứu [60].
Biện pháp phân huỷ thuốc BVTV bằng tác nhân sinh học dựa trên cơ sở sử
dụng nhóm vi sinh vật có sẵn môi trƣờng đất, các sinh vật có khả năng phá huỷ sự
phức tạp trong cấu trúc hoá học và hoạt tính sinh học của thuốc BVTV. Nhiều
nghiên cứu cho thấy rằng trong môi trƣờng đất quần thể vi sinh vật trong môi
trƣờng đất luôn luôn có khả năng thích nghi đối với sự thay đổi điều kiện sống. Ở
trong đất, thuốc BVTV bị phân huỷ thành các hợp chất vô cơ nhờ các phản ứng ôxy
hoá, thuỷ phân, khử oxy xảy ra ở mọi tầng đất và tác động quang hoá xảy ra ở tầng
đất mặt. Tập đoàn vi sinh vật đất rất phong phú và phức tạp. Chúng có thể phân huỷ
thuốc BVTV và dùng thuốc nhƣ là nguồn cung cấp chất dinh dƣỡng, cung cấp
cacbon, nitơ và năng lƣợng để chúng xây dựng cơ thể. Quá trình phân huỷ của vi
sinh vật có thể gồm một hay nhiều giai đoạn, hình thành các sản phẩm trung gian và
cuối cùng dẫn tới sự khoáng hóa hoàn toàn sản phẩm thành CO2, H2O và một số
chất khác không độc hại. Một số nhóm thuốc BVTV thƣờng chỉ bị một số loài vi
sinh vật phân huỷ. Tuy nhiên một số loài vi sinh vật có thể phân huỷ đƣợc nhiều
thuốc BVTV trong cùng một nhóm hoặc ở các nhóm thuốc khá xa nhau [32]. Các
Nguyễn Đàm Lý
10
Khóa 2011-2013
Luận văn thạc sĩ
Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm
nghiên cứu cho thấy nhiều vi sinh vật có khả năng phân huỷ 2,4-D, trong đó có
Achrombacter, Alcaligenes, Corynebacterrium, Flavobaterium, Pseudomonas,…
Yadav và cộng sự đã phát hiện nấm Phanerochaete Chrysosporium có khả năng
phân huỷ 2,4-D và rất nhiều hợp chất hữu cơ quan trọng có cấu trúc khác nhƣ
Clorinated phenol, PCBs, Dioxin, Monoaromatic và Polyaromatic hydrocacbon,
Nitromatic [51]. Chủng Aerobacter aerogenes chuyển hoá thuốc trừ sâu DDT và
chủng Alcaligenes denitrificans NTB-1 phát triển trên môi trƣờng 2,4dichlorobenzoate trong điều kiện hiếu khí [5]. Ngoài các vi khuẩn hiếu khí nhóm vi
khuẩn kỵ khí thuộc chi Dehalococcoides có khả năng khử clo của nhiều hợp chất
chứa clo nhƣ Trichloethylene, Vinylchloride….[5] Ở Việt Nam, Nguyễn Thị Kim
Cúc và Phạm Việt Cƣờng đã tiến hành phân lập và tuyển chọn một số chủng thuộc
chi Pseudomonas có khả năng phân huỷ đƣợc metyl parathion và đạt đƣợc kết quả
khả quan [6].
Quá trình phân hủy thuốc BVTV của sinh vật đất đã xẩy ra trong môi trƣờng
có hiệu suất chuyển hoá thấp. Để tăng tốc độ phân huỷ thuốc BVTV và phù hợp với
yêu cầu xử lý, ngƣời ta đã tối ƣu hoá các điều kiện sinh trƣởng và phát triển của vi
sinh vật nhƣ: pH , môi trƣờng, độ ẩm, nhiệt độ, dinh dƣỡng, độ thoáng khí, bổ sung
vào môi trƣờng đất chế phẩm sinh vật có khả năng phân huỷ thuốc BVTV.
Một số trở ngại có thể sử dụng vi sinh vật trong xử lý sinh học là những điều
kiện môi trƣờng tại nơi cần xử lý, nhƣ sự có mặt của các kim loại nặng độc, nồng
độ các chất ô nhiễm hữu cơ cao có thể làm cho vi sinh vật tự nhiên không phát triển
đƣợc và làm chết vi sinh vật đƣa vào, giảm đáng kể ý nghĩa đáng ý nghĩa thực tế
của xử lý sinh học [60].
Hiện nay với những kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại có thể tạo ra những
chủng vi khuẩn có khả năng phân huỷ đồng thời nhiều hoá chất độc hại mà không
yêu cầu điều kiện nuôi cấy phức tạp và không gây hại cho động thực vật cũng nhƣ
con ngƣời. Phƣơng pháp này sẽ đƣợc ứng dụng rộng rãi trong tƣơng lai sau các
nghiên cứu ký lƣỡng [29].
Nguyễn Đàm Lý
11
Khóa 2011-2013
Luận văn thạc sĩ
1.4.
Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm
Giới thiệu về hợp chất 2,2-Dichloropropionate Sodium (2,2 DCPS)
2,2–dichloropropionate sodium (2,2 DCPS), tên thông dụng là Dalapon. Là
dạng muối Na của axit 2,2-dichloropropionic.
Hình 3. Công thức cấu tạo của 2,2 DCPS
2,2 DCPS có tính độc thấp, thuốc gây ngứa và đôi khi ảnh hƣởng tới da. Đây
là loại thuốc trừ cỏ đƣợc sử dụng sau khi hạt nảy mầm, nhóm dẫn xuất alifatic, do
công ty Pepro (Pháp) tạo ra từ năm 1944. Thuốc có dạng bột khi hòa vào nƣớc, có
màu trắng đến trắng ngà. Thuốc dễ hòa tan trong nƣớc và dung môi hữu cơ. Trong
dung dịch nƣớc ở nhiệt độ 25oC thuốc ít phân hủy, khi nhiệt độ trên 50o C bị phân
hủy nhanh tạo thành rƣợu ethylic và axít clohydric dẫn đến mất tác dụng và ăn mòn
kim loại. Vì vậy khi đã pha thuốc cần dùng ngay, không để qua ngày. Ngoài ra
thuốc cũng dễ hút ẩm làm chảy nƣớc và chuyển qua màu nâu, cho nên cần bảo quản
thuốc nơi khô ráo và bao bì kín [61].
1.4.1. Ứng dụng của 2,2 DCPS
Hợp chất 2,2–dichloropropionate sodium đƣợc dùng trừ cỏ và ít có hiệu quả
với cỏ lá rộng. Trong thời gian sử dụng cần ẩm độ không khí cao giúp thuốc đƣợc
hấp thu tốt hơn. Dalapon nên phun ở nồng độ 0,75-1,0% và phun 2-3 lần với chu kỳ
2-3 tuần/lần. Nếu chỉ phun một lần ở liều lƣợng cao, thuốc phá hủy mạch dẫn của lá
làm ngăn cản quá trình lƣu dẫn thuốc xuống rễ, thân ngầm. Ngoài ra do thuốc dễ bị
mƣa rửa trôi, nên tránh mƣa ít nhất 6 giờ sau khi sử dụng. Sau khi sử dụng, thuốc
mau phân hủy bởi nhiều loại vi sinh vật, riêng với cây cao su thuốc không gây hại
cho những bộ phận đã hóa nâu, nhƣng gây cháy lá và chết chồi non. Ở Việt Nam,
2,2 DCPS thƣờng đƣợc dùng để trừ cỏ một lá mầm và hai lá mầm kể cả lau, sậy, cỏ
tranh hay các loại cỏ có bộ rễ ăn sâu dƣới đất. Nếu dùng cho khai hoang, phục hóa
thì dùng với liều 20kg/ha trở lên. Để trừ cỏ cho ngô, mía, cây ăn quả, cây công
Nguyễn Đàm Lý
12
Khóa 2011-2013
Luận văn thạc sĩ
Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm
nghiệp thì dùng 2-5 kg/ha. Thuốc có tác dụng nội hấp nên thâm nhập vào lá cỏ rất
nhanh (cũng có thể thâm nhập qua rễ cỏ) làm rối loạn sinh lí nên lá biến dạng, than
cong queo, giòn, dễ gãy và cuối cùng bị chết. Thuốc có hiệu lực trong 2-3 tuần.
Thông thƣờng phun thuốc trừ cỏ lúc trƣớc gieo cấy cây trồng khoảng 3 tuần [40].
1.4.2. Ảnh hƣởng của 2,2 DCPS đến sức khỏe con ngƣời
Ảnh hƣởng với môi trƣờng: Với hàm lƣợng vƣợt quá 2660ppm (part per
million) trong môi trƣờng đất sẽ gây ức chế, kìm hãm các vi sinh vật đồng hóa nitơ
trong đất. Với nồng độ lớn gây ảnh hƣởng đến năng suất, chất lƣợng hoa màu,
lƣơng thực [23]. Ảnh hƣởng tới sức khỏe con ngƣời: Khi tiếp xúc với nồng độ cao
và trong thời gian dài có các triệu chứng nhƣ dị ứng da, bỏng da, có hại cho mắt, hệ
hô hấp, mệt mỏi, chán ăn, tiêu chảy, nôn mửa, làm chậm xung thần kinh trung
ƣơng, có thể gây trầm cảm. Một số nghiên cứu trƣớc đây đƣợc thực hiện ở chó và
chuột cho thấy có sự tăng trọng lƣợng thận ở động vật ăn liều rất cao trong ngày.
Trong một thí nghiệm, cho chuột và chó cho ăn với liều lƣợng tƣơng ứng
50mg/kg/ngày và 1100mg/kg/ngày thì sau hai năm với chuột và một năm với chó
cho thấy mức tăng trung bình nhẹ trọng lƣợng thận [12].
1.4.3. Quá trình phân hủy trong môi trƣờng tự nhiên của 2,2 DCPS
Muối 2,2 DCPS thủy phân chậm trong nƣớc tạo ra axít pyruvic và Cl-, khả
năng phân hủy càng tăng khi tăng nhiệt độ. Sau 175 giờ, mức độ thủy phân của 2,2
DCPS ở 25oC ở các nồng độ dung dịch 1%, 5% và 18% lần lƣợt là 0,41%, 0,61% và
0,8%; pH môi trƣờng củng ảnh hƣởng tới quá trình thủy phân, ở giá trị pH = 2,3,
60oC trong 30 giờ lƣợng 2,2 DCPS bị phân hủy là 20%. Cùng điều kiện nhƣ vậy
nhƣng với giá trị pH = 12 thì lƣợng 2,2 DCPS bị phân hủy là 50%.
2,2 DCPS chịu ảnh hƣởng của quá trình quang phân. Khi một dung dịch 2,2
DCPS (0,25M) đƣợc chiếu với ánh sáng UV ở 253,7 nm ở 49oC thì 70% bị phân
hủy trong vòng 7 giờ. Axít pyruvic đƣợc hình thành sau đó đƣợc decarboxyl hóa
thành acetaldehyde, cacbon dioxide và một lƣợng nhỏ chất 1,1-dichloroethan (24%) và một loại polymer không tan trong nƣớc. Theo các báo cáo trƣớc đây thì thời
Nguyễn Đàm Lý
13
Khóa 2011-2013
Luận văn thạc sĩ
Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm
gian bán rã bằng thủy phân của 2,2 DCPS ở nồng độ <1%, nhiệt độ dƣới 25oC là
khoảng vài tháng .
Quá trình phân hủy hóa học và vật lý đối với 2,2 DCPS diễn ra chậm ở nhiệt
độ phòng tạo thành axít pyruvic, axít hydrochloric và natri clorua. Đốt cháy 2,2
DCPS ở nhiệt độ 900oC thì sản phẩm tạo thành bao gồm carbon monoxide, carbon
dioxide, clo và axít chlohydric [16, 29].
Hiện nay, sự phân hủy 2,2 DCPS trong môi trƣờng đất chủ yếu là nhờ vi sinh
vật. Một số chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng 2,2 DCPS làm nguồn cung cấp
carbon cho quá trình trao đổi chất của chúng. 2,2 DCPS dễ dàng bị loại bỏ bởi các
loài nhƣ: Pseudomonas, Agrobacterium, Nocardia, Alcaligenes, Arthrobacter và
Bacillus...[24]. Hirsch và Alexander nghiên cứu cho thấy 89% tới 100% hàm lƣợng
2,2 DCPS bị phân giải sau 3 tuần trong môi trƣờng đất chứa các chủng thuộc chi
Nocardia và Pseudomonas [44]. Schwarze và cộng sự đã phân lập đƣợc 5 chủng vi
khuẩn có khả năng phân hủy 2,2 DCPS đó là Agrobacterium tumefaciens RS4, A.
Tumedaciens RS5, Xanthomonas maltophilia RS6, Comamonas acidovorans RS7
và Alcaligenes xylosoxidans ssp. denitrifcans RS9 [27].
Bản chất của quá trình phân hủy 2,2 DCPS của vi sinh vật là nhờ vào sự hoạt
động của enzym đƣợc gọi là chung là enzym dehalogenase, đƣợc xác định và định
danh bởi Jensen (1957) [50]. Các nghiên cứu phân lập vi khuẩn có khả năng hình
thành dehalogenase đã đƣợc thực hiện Jing và Huyop, 2008, 2012 [28, 17];
Schwarze và cộng sự, 1997 [44]; Hamid và cộng sự, 1982 [21]; Motosugi và cộng
sự, 1982 [36]; Allison và các cộng sự, 1982 [16]; Hardman và Slater, 1981 [12].
Các nghiên cứu đều cho thấy trong điều kiện nuôi cấy và làm giàu trên môi trƣờng
dinh dƣỡng có bổ sung cơ chất 2,2 DCPS các chủng vi sinh vật có thể sinh trƣởng
và sản sinh ra dehalogenase.
Ở Việt Nam, hiện nay chƣa có nhiều nghiên cứu về phân hủy hợp chất 2,2
DCPS bằng con đƣờng sinh học sử dụng các vi sinh vật, phần lớn các nghiên cứu
chỉ tập trung vào các hợp chất trong thuốc trừ sâu nhƣ DDT, hay Dioxin [6,9,1].
Đây có thể coi là những nghiên cứu mang tính định hƣớng đầu tiên góp phần vào
Nguyễn Đàm Lý
14
Khóa 2011-2013
Luận văn thạc sĩ
Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm
việc giải quyết ô nhiễm hay tồn dƣ thuốc trừ cỏ 2,2 DCPS trong môi trƣờng đất,
nƣớc, không khí ở Việt Nam.
1.5.
Enzym dehalogenase
Dehalogenases là nhóm gồm nhiều enzym xúc tác cho việc loại bỏ các
nguyên tử halogen từ các hợp chất hữu cơ có chứa halogen liên kết với cacbon. Các
enzym thuộc nhóm này từ vi sinh vật đã đƣợc thu hút rất nhiều sự quan tâm của các
nhà khoa học vì chúng có thể ứng dụng cho ngành công nghiệp hóa chất và công
nghệ môi trƣờng. Một số enzym thuộc nhóm này đã đƣợc phát hiện, tách chiết và
nghiên cứu [28]. Sự phân tách của halogen khỏi liên kết với sự tham gia của các
enzym xúc tác theo nhiều cơ chế khác nhau: (i) Loại nhóm halogen là quá trình thay
thế nhóm halogen bởi nguyên tử hydro. (ii) Loại nhóm halogen với có sự tham gia
của phân tử oxy. Phản ứng trong nhóm này đƣợc xúc tác bởi monooxygenases
(hoặc dioxygenases). (iii) Thủy phân các dẫn xuất nhóm halogen, phản ứng thủy
phân đƣợc xúc tác bởi halidohydrolases, nhóm halogen đƣợc thay thế bởi sự tham
gia của nucleophin một nhóm hydroxy có nguồn gốc từ nƣớc. (iv) "Thiolytic"
dehalogenation, một số nhóm vi khuẩn phân hủy dichloromethane với sự tham gia
của glutathione S-transferase xúc tác sự hình thành của một liên kết glutathione Schloromethyl dẫn tới với việc khử clo.(v) Loại bỏ nhóm halogen khỏi phân tử qua
việc hình thành của một liên kết đôi. (vi) Loại bỏ nhóm halogen có sự tham xúc tác
của hydratase [38]. Hiện nay cách thức để thu nhận enzym dehalogen chủ yếu là
nuôi cấy các chủng vi sinh vật trong môi trƣờng dinh dƣỡng có bổ sung cơ chất là
dẫn xuất halogen làm nguồn cung cấp carbon. Một số chủng vi khuẩn có khả năng
sản sinh enzym dehalogenase đã đƣợc phân lập nhƣ Methylobacterium sp. HJ1(Jing
và Huyop;2007, 2008) [24], Pseudomonas putida (Motosugi và cộng sự., 1982)
[36], Xanthobacter autotrophicus GJ10 (Janssen và cộng sự, 2005) [26],
Pseudomonas B6P (Mesri và cộng sự,2009) [34] và Rhizobium sp. (Berry và cộng
sự, 1979) [20]. Hầu hết, các vi khuẩn sản sinh dehalogenase đều có hơn 1 loại
dehalogenase. Cho đến nay chỉ mới phát hiện duy nhất 1 loài có khả năng sản sinh
ra 3 loại đồng phân dehalogenase đó là Rhizobium sp. Nó có thể sản sinh ra 3 đồng
Nguyễn Đàm Lý
15
Khóa 2011-2013
Luận văn thạc sĩ
Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm
phân halogenase đó là: Dehalogenase L (DehL), Dehalogenase E (DehE),
Dehalogenase D (DehD) để phân hủy các dẫn xuất halogen của axít propionic trong
đó có 2,2 DCPS đƣợc phân hủy bởi dehalogenase E [19].
Tùy vào các chủng vi sinh vật khác nhau và vị trí nhóm chlo đƣợc cắt trên
dẫn xuất hợp chất halogen mà DehE có trọng lƣợng phân tử khác nhau. Hiện nay có
một số DehE đã đƣợc phân lập và tinh sạch từ các chủng nhƣ: Rhizobium sp. có
trọng lƣợng phân tử 32 kDa trên cơ chất 2-chloropropionic acid; Methylobacterium
sp. HJ1 có kích thƣớc 36 kDa và là một ―dimer protein‖, hoạt động tốt nhất ở pH
7,2, nhiệt độ 35oC, bị bất hoạt ở 50oC trong vòng 15 phút; Rhizobium sp. có kích
thƣớc 62 kDa khi điện di không biến tính...[45, 22, 20].
Nguyễn Đàm Lý
16
Khóa 2011-2013
Luận văn thạc sĩ
Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm
Chƣơng 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu
Các chủng vi sinh vật dùng trong nghiên cứu đƣợc tuyển chọn từ các chủng
vi khuẩn phân lập từ mẫu đất thu thập tại khu vực Làng hoa Ngọc Hà – Ba Ðình –
Hà Nội. Đây là nơi có sử dụng thƣờng xuyên thuốc bảo vệ thực vật trong việc trồng
hoa, và khu tái chế rác thải Triều Khúc. Các mẫu sau khi thu thập đƣợc bảo quản
lạnh và chuyển về phòng thí nghiệm phân tích trong thời gian 24 giờ.
2.2. Hóa chất và thiết bị
2.2.1. Hóa chất và môi trƣờng nuôi cấy
Môi trường chọn lọc MGB (1 lít) [49].
100 ml BS 10 (BS là dung dịch muối khoáng cơ bản)
100 ml TMSS 10 (TMSS là dung dịch muối của các kim loại)
800 ml H2O
Dung dịch Basal Salts (BS) 10/1 lít
K2HPO4.3H2O
42.5g
(NH4)2 SO4
20g
NaH2PO4.3H2 O
10g
Dung dịch Trace Metals Salts Solution (TMSS) 10/1 lít
MgSO4.7H2 O
2g
FeSO4.7H2 O
120mg
MnSO4.4H2 O
23mg
ZnSO4.1H2 O
18mg
CoCl2.6H2 O
10mg
EDTA 0,5M
pH=7,5
Nguyễn Đàm Lý
17
Khóa 2011-2013
