Nghiên cứu quy trình xây dựng thư viện cDNA từ xylem của cây bạch đàn uro (eucalyptus urophylla s t blake) trồng tại việt nam

TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA LÂM HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÂY DỰNG THƢ VIỆN cDNA
TỪ XYLEM CỦA CÂY BẠCH ĐÀN URO (EUCALYPTUS
UROPHYLLA S.T. BLAKE) TRỒNG TẠI VIỆT NAM

NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ: 307

Giáo viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Hữu Cường
ThS. Bùi Văn Thắng
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Hiền
Khoá học: 2005 – 2009

Hà Nội, 2009


LỜI CẢM ƠN
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Hữu Cường, Phịng
Cơng nghệ Tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, ThS. Bùi Văn Thắng,
Trường Đại học Lâm nghiệp Việt Nam- những người thầy đã tận tình hướng
dẫn, giúp đỡ tơi trong thời gian thực tập và hồn thành khóa luận này.
Tơi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS. TS. Lê Trần Bình, TS.
Chu Hồng Hà cùng tập thể cán bộ Phịng Cơng nghệ Tế bào thực vật, Viện
Cơng nghệ sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong
suốt thời gian thực tập và hồn thành khóa luận.
Tơi xin gửi lời cám ơn đến CN. Hồng Hà đã tận tình giúp đỡ truyền đạt
cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian hồn thành khóa luận.

Qua đây, tơi cũng xin gửi lời cám ơn chân thành tới các thầy cô trong
khoa Lâm học và các thầy cô trong bộ môn Công nghệ sinh học, trường Đại
học Lâm nghiệp Việt Nam đã hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho tơi trong
suốt q trình học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè, những người đã
ln luôn động viên và giúp đỡ tôi trong thời gian qua.
Hà Nội, tháng 5 năm 2009
Sinh viên

Nguyễn Thị Hiền


BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

DNA

Deoxyribonucleic acid

RNA

Ribonucleic acid

Bp

Base pair

CPP

Copalyl diphosphate

Cs

Cộng sự

E. coli

Escherichia coli

cDNA

Complementary DNA

dNTP

Deoxynucleotide triphosphate

EtBr

Ethidium bromide

LB

Luria and Bertani

Taq

Thermus aquaticus

Kb

Kilobase

PCR

Polymerase Chain Reaction

Rnase

Ribonuclease

v/p

vòng/phút

ESTs

Expressed Sequence Tags

NH4OAc

Amonium Acetate


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme BsrGI
Bảng 3.1. Các thành phần của vector pDONRTM 222
Bảng 3.2: Kích thước đoạn cDNA được chèn vào vector

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Sơ đồ vận chuyển chất của mạch xylem

Hình 1.2. Các bước chính trong việc xây dựng thư viện cDNA
Hình 1.3. Sơ đồ phản ứng BP trong kỹ thuật Gateway
Hình 3.1. Kết quả tách chiết RNA từ mẫu gỗ Bạch đàn
Hình 3.2. Kết quả tách RNA khi loại DNA bằng DNAse
Hình 3.3. Mơ hình tạo cDNA
Hình 3.4. Kết quả phép thử đánh dấu trên đĩa thạch.
Hình 3.4. Sơ đồ vector pDONRTM222
Hình 3.5. Vị trí phân đoạn cDNA được chèn vào vector pDONRTM222
Hình 3.6. Kết quả chọn lọc các dịng tế bào mang vector tái tổ hợp trên
mơi trường chứa kháng sinh Kanamycin
Hình 3.7. Kết quả tách plasmid
Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm cắt
Hình 3.9. Trình tự phân đoạn cDNA số 6
Hình 3.10. So sánh trình tự cDNA số 6 với các trình tự trên Genbank
(bằng BLAST)


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ..........................................................................................................................
2BẢNG CHỮ VIẾT TẮT........................................................................................................
DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................................
DANH MỤC CÁC HÌNH........................................................................................................
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................ 3
1.1. Giới thiệu về cây Bạch đàn (Eucalyptus urophylla S.T. Blake) và những nghiên
cứu bộ gen đối với loại cây này ........................................................................................... 3
1.2. Cấu trúc và vai trò của xylem ở thực vật ................................................................. 4
1.3. Giới thiệu về thƣ viện cDNA ...................................................................................... 5
1.4. Một số kĩ thuật sử dụng trong nghiên cứu tạo thƣ viện cDNA............................... 7
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 12

2.1. Vật liệu và hóa chất .................................................................................................. 12
2.1.1 Vật liệu........................................................................................................................12
2.1.2 Hóa chất ..................................................................................................................... 12
2.1.3 Máy móc, thiết bị ...................................................................................................... 13
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ......................................................................................... 13
2.2.1. Tách chiết RNA ...................................................................................................... 14
2.2.2. Điện di trên gel agarose 1% .................................................................................. 14
2.2.3. Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất ............................................................................... 15
2.2.4. Tổng hợp sợi cDNA thứ 2 và gắn attB1 ............................................................... 16
2.2.5. Phân đoạn kích thƣớc cDNA bằng cột sắc kí ái lực ............................................ 17
2.2.6. Biến nạp vào các dòng tế bào kháng phage ElectroMAXTM DH10BTMT1 trong
môi trƣờng kháng sinh Kanamycin ................................................................................. 19
2.2.7. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp .................................................................................. 19
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................... 22
3.1. Tách chiết RNA tổng số từ mẫu gỗ của Bạch đàn urô .......................................... 22
3.2. Thu các phân đoạn cDNA và kiểm tra chất lƣợng các phân đoạn ....................... 27
3.3. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào kháng phage ElectroMAXTM
DH10BTMT1........................................................................................................................30
3.4. Tách chiết plasmid tái tổ hợp và cắt plasmid bằng Enzyme BrsG I .................... 32
3.5. Đánh giá chất lƣợng cDNA ...................................................................................... 34
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................... 37


1.

KẾT LUẬN................................................................................................................ 37

2.

KIẾN NGHỊ .............................................................................................................. 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................................
PHỤ LỤC ................................................................................................................................


MỞ ĐẦU
Rừng bao phủ gần 30% diện tích bề mặt trái đất với diện tích gần 4 tỉ
hecta. Rừng giữ nhiều chức năng quan trọng cho sự sống bao gồm việc duy trì
sự đa dạng sinh học, cung cấp oxy cho khí quyển, ngăn cản sự xói mịn, cung
cấp gỗ và thức ăn (FAO, 2005) [12]. Trong các nghiên cứu phát triển nguồn
vốn gen cây rừng, chúng ta cần chọn lọc các cá thể có những tính trạng q,
mong đợi để nhân dịng và gìn giữ những nguồn gen q cho sản xuất. Tuy
nhiên, việc xác định được các cá thể có những tính trạng q này thường gặp
phải những khó khăn như thời gian sinh trưởng của các lồi cây rừng thường
rất dài (Grattapaglia, 2004) [15]. Những tiến bộ trong các nghiên cứu bộ gen
học đã trở thành công cụ quan trọng và hiệu quả cho các nhà chọn giống lâm
nghiệp trong việc rút ngắn thời gian sàng lọc các cá thể mang những tính
trạng (hoặc gen) quan tâm. Trong những năm qua, các nghiên cứu xác định
các loại gen mã hóa cho các tính trạng q đã được tiến hành rất phổ biến ở
nhiều loài thực vật do bộ gen của các loài này đã được giải mã hoàn chỉnh. Để
thực hiện được các nghiên cứu này các nhà khoa học chọn lọc một cách ngẫu
nhiên các dòng cDNA quan tâm trong thư viện cDNA đã được xây dựng ở
những điều kiện cụ thể, đây là một trong những con đường nhanh và có hiệu
quả cao (Brauetigam et al., 2005) [10]. Bằng việc sử dụng phương pháp này,
nhiều tính trạng đã được phân tích ở các lồi cây rừng như sự hình thành gỗ,
khả năng chịu lạnh… Tuy nhiên, những nghiên cứu này mới chỉ dừng lại ở
việc phân tích sự biểu hiện gen có liên quan đến tính trạng nghiên cứu cụ thể
mà chưa mở rộng tìm hiểu những tác động lên các chu trình trao đổi chất khác
trong cây.
Chi Bạch đàn (Eucalyptus) gồm các loài cây cơng nghiệp có giá trị kinh

tế cao. Gỗ Bạch đàn được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực từ việc trang
trí, đóng các đồ gỗ gia dụng, cho đến xây cất nhà cửa cũng như các cơng trình
xây dựng khác. Những cơng trình nghiên cứu về đặc điểm hình thái, sinh thái,


quá trình sinh trưởng, phát triển của cây Bạch đàn đã được quan tâm chú ý.
Sự sinh trưởng, phát triển của thực vật nói chung và của cây Bạch đàn nói
riêng có liên quan chặt chẽ với nhau và với môi trường sống. Cây Bạch đàn
phát triển nhanh sẽ cho năng suất gỗ lớn, ngược lại cây sinh trưởng chậm, ra
hoa sớm thì năng suất gỗ thấp [15]. Sự khác nhau về khả năng sinh trưởng của
các dòng Bạch đàn có thể là hệ quả của sự khác nhau về biểu hiện của các gen
đặc trưng. Thư viện cDNA từ các dòng cây với khả năng sinh trưởng khác
nhau sẽ là một công cụ cần thiết cho những nghiên cứu sâu hơn về sự biểu
hiện các gen ở mô hay tế bào nghiên cứu. Phương pháp này có nhiều ý nghĩa
quan trọng trong các nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của gen [6].
Chính vì lý do này mà chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên
cứu quy trình xây dựng thư viện cDNA từ xylem của cây Bạch đàn urô
(Eucalyptus urophylla S.T. Blake) trồng tại Việt Nam".


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.

Giới thiệu về cây Bạch đàn (Eucalyptus urophylla S.T. Blake) và

những nghiên cứu bộ gen đối với loại cây này
Chi Bạch đàn (Eucalyptus) thuộc họ Mytarceae gồm hơn 700 loài. Theo
cách phân loại mới nhất thì hai dưới chi của Bạch đàn là Corymbia và
Angophora, tuy nhiên một vài nhà phân loại thực vật lại cho rằng chúng là

những chi độc lập. Cây Bạch đàn có nguồn gốc từ Australia và chúng có thể
sinh trưởng dưới một phổ sinh thái rộng [14]. Ngày nay Bạch đàn là một
trong những cây gỗ lâm nghiệp rất quan trọng được trồng phổ biến ở nhiều
quốc gia trên thế giới với diện tích canh tác khoảng 17 triệu hecta. Trong số
đó thì Eucalyptus grandis, E. globus, E. camandulensis được trồng phổ biến
nhất, chiếm khoảng 80% diện tích canh tác. Ngoài ra, các loài E. nitens, E.
saligna, E. deglupta, E. urophylla, E. tereticornis và E. pilularis cũng được
trồng khá phổ biến. Gỗ từ cây Bạch đàn có thể sử dụng trong xây dựng, cơng
nghiệp giấy. Cây Bạch đàn là lồi cây gỗ sinh trưởng nhanh, chiều cao cây có
thể đạt tới 15 - 20 m, đường kính có thể đạt tới 40 cm. Thân cây thẳng, vỏ
mịn, bao phủ bên ngoài là một loại chất dạng bột [21].
Những nghiên cứu về gen trên cây Bạch đàn bao gồm nhiều khía cạnh về
cấu trúc, chức năng và thành phần trong trình tự của bộ gen. Đặc điểm của bộ
gen, bao gồm trong nhân và ngoài nhân, được xác định dựa trên việc tạo ra
bản đồ liên kết các vị trí chỉ thị phân tử và các locus tính trạng số lượng [15].
Những nghiên cứu về chức năng của gen chủ yếu tập trung vào việc tách dòng
và xác định các gen mới, phân tích sự biểu hiện của gen, định vị gen trên các
locus quy định tính trạng số lượng, mối liên kết giữa tính đa hình DNA và
hình thái cá thể, và cuối cùng là tạo ra các dòng cây chuyển gen mang các tính
trạng mong muốn [22].


1.2.

Cấu trúc và vai trò của xylem ở thực vật
Mạch gỗ thuật ngữ khoa học là xylem (chữ "xylem" bắt nguồn từ 1 từ cổ

điển Hy Lạp (xylon), có nghĩa là "gỗ"), là tổ chức dẫn truyền nhựa nguyên
(khoáng và nước) trong thân cây, chỉ có ở cây gỗ lá rộng. Mạch gỗ chiếm 2030% thể tích thân cây. Cấu tạo mạch gỗ là tập hợp của các tế bào mạch gỗ nối
tiếp nhau thành ống dài theo chiều dọc của thân cây. Quan sát dưới kính hiển

vi, tế bào mạch gỗ có hình dạng: hình trụ, hình trống hoặc viên trụ. Mạch gỗ
là thành phần lớn nhất trong cấu tạo của gỗ nên dễ quan sát nhất, trên mặt cắt
ngang nó có hình trịn hoặc elip nên gọi là lỗ mạch, trên mặt cắt xuyên tâm và
tiếp tuyến nó có dạng ống nên gọi là ống mạch. Mạch gỗ là yếu tố đầu tiên
giúp phân biệt các loại gỗ, là yếu tố làm tăng độ xốp rỗng của gỗ. Số lượng và
kích thước của mạch gỗ ảnh hưởng quyết định đến bề mặt gỗ (lỗ mạch nhiều
và lớn thì thớ gỗ thô). Các chất dinh dưỡng và nước từ đất cùng các chất hữu
cơ sinh ra trong lá cây được phân phối vào các khu vực cụ thể trong cây thông
qua xylem và phloem [7]. Xylem đưa nước và các chất dinh dưỡng từ rễ lên
các phần phía trên của thân cây, còn phloem vận chuyển các chất khác, chẳng
hạn glucose sinh ra từ quá trình quang hợp, là chất hữu cơ tạo ra cho cây
nguồn năng lượng để phát triển và kết hạt. Xylem bao gồm các quản bào, là
các tế bào chết có vách cứng được sắp xếp để tạo ra các ống nhỏ có chức năng
vận chuyển nước. Vách quản bào thông thường chứa lignin. Phloem lại bao
gồm các tế bào sống gọi là các thành viên ống sàng. Giữa các thành viên ống
sàng là các tấm sàng, có các lỗ để cho phép các phân tử đi qua. Các thành
viên ống sàng thiếu các bộ phận như nhân hay ribosom, nhưng các tế bào
cạnh nó (tế bào đồng hành) thì có chức năng duy trì hoạt động của các thành
viên ống sàng. Chuyển động của nước, chất dinh dưỡng, đường và chất thải
được thực hiện nhờ sự truyền dẫn, hấp thụ và thoát hơi nước.


Hình 1.1. Sơ đồ vận chuyển chất của mạch xylem
Các tế bào xylem vận chuyển nước và các chất dinh dưỡng hịa tan trong
nước từ rễ và các lơng rễ mịn lên phía trên tới các bộ phận khác của cây. Các
tế bào rễ còn sống hấp thụ nước chủ động khi thiếu sức hút thốt hơi nước
thơng qua thẩm thấu tạo ra áp lực rễ. Có những khoảng thời gian khi thực vật
khơng có sức hút thốt hơi nước, thông thường là do thiếu sáng hay do các
yếu tố môi trường khác gây ra. Nước trong các mô thực vật có thể di chuyển
tới rễ để hỗ trợ khi hấp thụ thụ động.

1.3.

Giới thiệu về thƣ viện cDNA
Bộ gen của sinh vật có số lượng gen rất lớn, tuy nhiên số lượng gen mã

hóa protein chiếm một phần nhỏ. Trong số các gen mã hóa protein, ở mỗi loại
tế bào, mỗi loại mơ chỉ có một số gen nhất định hoạt động và biểu hiện. Thời
gian hoạt động và biểu hiện của gen trong mỗi loại tế bào, mô khác nhau tùy
thuộc giai đoạn sinh trưởng phát triển của cơ thể [6, 20].
Tách chiết và tinh sạch RNA thông tin (mRNA) của tế bào, mô ở từng
thời điểm nhất định thu được số loại mRNA tương ứng với số gen đang hoạt
động trong tế bào. Sử dụng kỹ thuật phiên mã ngược từ mRNA tạo nên các
cDNA tương ứng, mỗi cDNA được gắn vào một vector tách dòng, tạo nên các
dòng cDNA khác nhau [6].


Tập hợp gồm nhiều phân đoạn cDNA đã được tách dòng và lưu giữ
trong một tập hợp các dòng tế bào chủ gọi là thư viện cDNA, thư viện cDNA
từ một cơ quan hay bộ phận của cơ thể sẽ là một tập hợp bao gồm các gen
biểu hiện ở mơ, cơ quan tại thời điểm đó [4]. Trong trường hợp này là thư
viện các gen biểu hiện ở xylem của cây Bạch đàn nâu (Eucalyptus urophylla).
cDNA được tạo ra từ phân tử mRNA và do đó nó là sản phẩm biểu hiện của
một gen. Ở các tế bào sinh vật nhân chuẩn, do phân tử mRNA phải trải qua
quá trình splicing nên cDNA khơng chứa các đoạn khơng phiên mã (intron)
[9]. Trong các nghiên cứu sinh học phân tử thì thư viện cDNA là một cơng cụ
hữu ích vì sản phẩm biểu hiện của các gen có thể được xác định một cách dễ
dàng [22].

Xây dựng thƣ viện cDNA
Tách chiết và thu thập

mRNA

Enzyme phiên
mã ngƣợc

Chèn vào
plasmid

Sinh trƣởng

Đƣa plasmid vào
vi khuẩn

Tách chiết
plasmid và tinh
sạch DNA

Giải trình tự

Hình 1.2. Các bƣớc chính trong việc xây dựng thƣ viện cDNA
Bạch đàn là một trong những loài cây quan trọng nhất mang lại giá trị
kinh tế cao bởi những thuộc tính của gỗ Bạch đàn, cung cấp nguồn nguyên


liệu trong công nghệ sản xuất giấy, dầu. Năm 2008, Susana và cộng sự đã tiến
hành xây dựng một thư viện cDNA từ cây Bạch đàn E. globulus được xử lý ở
điều kiện nhiệt độ thấp. Tác giả đã chọn lọc được hơn 9913 dịng cDNA trong
số này thì đã định danh được 8737 trình tự biểu hiện ESTs [12]. Thư viện này
cung cấp nguồn nguyên liệu rất có giá trị cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm
xác định các gen và các nhân tố tham gia vào các quá trình điều hịa sinh tổng

hợp thành tế bào ở điều kiện nhiệt độ thấp.
1.4.

Một số kĩ thuật sử dụng trong nghiên cứu tạo thƣ viện cDNA

1.4.1. Kĩ thuật tách RNA tổng số
Các phân tử RNA không bền, dễ bị phân hủy bởi các enzyme là các
ribonuclease (RNase). Hơn nữa, các RNase lại có mặt ở khắp mọi nơi (có rất
nhiều trên đầu ngón tay của người thao tác…) có hoạt tính rất cao và rất bền
vững với các tác nhân thường dùng để loại bỏ enzyme [3]. Vì những lý do đó,
việc tách chiết RNA địi hỏi nhiều biện pháp thận trọng để tránh mọi tạp
nhiễm bởi các RNase từ môi trường: thao tác trong điều kiện vô trùng, mọi
dụng cụ, hóa chất đều được khử trùng bằng nhiệt hay hóa chất, tránh mọi tiếp
xúc với dụng cụ bằng tay trần… [6, 17].
Phương pháp tách chiết RNA toàn phần cũng bao gồm các bước cơ bản
như đối với DNA:


Tế bào, mô được nghiền trong dung dịch gồm chất tẩy mạnh

(SDS, sarcosyl) ở nồng độ cao, tác nhân gây biến tính protein mạnh
(guanidinium thiocyanate), chất khử (2-mercaptoethanol). Hai loại hóa chất
sau (guanidinium thiocyanate vaf 2- mercaptoethanol) có tác dụng ức chế
hoạt động của RNase nội bào và tách các protein liên kết khỏi phân tử RNA.


Các protein được loại bỏ khỏi mẫu qua xử li phenol:chloroform

và li tâm.


RNA hòa tan trong pha nước được tủa bằng ethanol và được thu

nhận lại qua li tâm. RNA có thể được bảo quản trên một năm dưới dạng tủa


trong dung dịch ethanol hoặc đông lạnh ở -700C trong nước có chứa Rnasin
(một chất ức chế RNase).
1.4.2. Kĩ thuật biến nạp plasmid vào E.coli
i) Biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt
Plasmid là những phân tử DNA có kích thước nhỏ (2-5Kb) dạng vịng,
có khả năng tái bản độc lập, không phụ thuộc vào sự tái bản của bộ gen tế
bào. Trong sinh học phân tử, plasmid được ứng dụng trong tách dịng gen
nhằm nhân nhanh một số lượng khơng hạn chế gen quan tâm của một khuẩn
lạc đã được biến nạp
Một số plasmid được sử dụng nhiều trong tách dòng gen là plasmid
pBR322, pUC18… [1, 2].
Năm 1982, Griffith đã mơ tả q trình biến nạp ở vi khuẩn trong thí
nghiệm nổi tiếng của ơng về “ngun lý biến nạp’’. Tuy nhiên, khơng phải tất
cả các vi khuẩn đều có khả năng biến nạp. Để biến nạp có hiệu quả, các tế bào
vi khuẩn cần trở nên khả biến. Để đạt được điều này, người ta giữ các tế bào
vi khuẩn trong dung dịch CaCl2 lạnh, khi đó các tế bào trở nên khả biến. Các
tế bào vi khuẩn được cấy trải trên mơi trường chọn lọc có kháng sinh và cơ
chất tạo màu để nhân lên các tế bào có plasmid, mỗi tế bào sẽ phát triển thành
một dịng riêng biệt. Trong q trình biến nạp, chỉ có một lượng nhỏ tế bào
khả biến được biến nạp. Biến nạp là một kỹ thuật quan trọng có thể tạo ra
khoảng 109 các tế bào biến nạp khi sử dụng 1μg DNA [1, 2].
ii) Biến nạp bằng phương pháp xung điện
Kỹ thuật biến nạp DNA plasmid bằng phương pháp xung điện là phương
pháp biến nạp có hiệu quả cao đồng thời rút ngắn thời gian thí nghiệm. Ở đây

tế bào được đặt ở trong một xung điện ngắn, xung điện này làm xuất hiện
những lỗ tạm thời ở trên màng tế bào, những phân tử DNA có thể đi vào bên
trong tế bào [2, 11].


1.4.3. Kĩ thuật PCR từ khuẩn lạc (colony-PCR)
Hiện nay có rất nhiều phương pháp để xác định tế bào vi khuẩn có
plasmid mang gen mong muốn hay khơng, như phương pháp colony- PCR,
cắt plasmid bằng các enzyme hạn chế, hoặc PCR từ plasmid. Trong đó
phương pháp colony-PCR cho phép phát hiện nhanh khuẩn lạc mang plasmid
tái tổ hợp mong muốn. Phương pháp này có ưu điểm nhanh, ít tốn kém và đơn
giản.
Hiện nay, kỹ thuật này được ứng dụng rất rộng rãi trong nghiên cứu sinh
học phân tử. Nguyên tắc của kỹ thuật colony-PCR là dựa trên nguyên tắc
PCR, chỉ khác là mẫu DNA được thay bằng DNA plasmid giải phóng từ
khuẩn lạc. Ở nhiệt độ cao (940-950C), màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ, giải
phóng plasmid tái tổ hợp. Plasmid tái tổ hợp này sẽ làm khuôn cho phản ứng
PCR nhân gen bằng cặp mồi đặc hiệu [16, 23].
1.4.4. Kỹ thuật Gateway


Kĩ thuật Gateway là một kĩ thuật dịng hóa phổ biến, nó mang lại

hiệu quả cao và nhanh chóng khi phân tích chức năng, biểu hiện protein và
dịng hóa đoạn DNA. Dựa vào điểm đặc hiệu trong hệ thống tái tổ hợp của
pDONRTM222. Kĩ thuật Gateway cho phép chuyển đoạn cDNA vào vector
pDONRTM222, thay thế việc sử dụng enzyme cắt giới hạn và enzyme nối hiệu
quả [9, 13].
Kỹ thuật Gateway trong in vitro là phản ứng hợp nhất và loại bỏ. Mục
đích là di chuyển cDNA vào hệ thống vector pDONRTM222. Kỹ thuật này

gồm có 2 phản ứng tái tổ hợp cơ bản: phản ứng BP để tách dòng cDNA và
phản ứng LR dùng để biểu hiện dịng cDNA. Mục đích của nghiên cứu này là
tách dịng thư viện cDNA nên chúng tôi chỉ phải tiến hành phản ứng BP.

Hình 1.3. Sơ đồ phản ứng BP trong kỹ thuật Gateway


Các bước trong phản ứng BP:


Những đoạn cDNA được đưa vào vector nhận, ở bên sườn có hai

điểm tái tổ hợp (adapter attB1 ở đầu 3’ và attB2 ở đầu 5’)


Chuyển đoạn gen quan tâm vào vector đích (Destination). Vector

này chứa hai điểm tái tổ hợp (attP1 và attP2) ở giữa hai điểm có đoạn gen
chọn lọc âm tính ccdB.


Trộn cDNA với vector nhận, cDNA sẽ vào vector nhận những

điểm xác định theo thứ tự phân tử


attB và attP là hai điểm để tái tổ hợp, vì vậy attB1 phản ứng với

attP1, còn attB2 phản ứng với attP2.


Sản phẩm của hai sự tái tổ hợp sẽ tạo ra một plasmid như mong

muốn và các sản phẩm phụ. Plasmid mới có hai sự lựa chọn: kháng kháng
sinh và chọn lọc âm tính.
1.4.5. Kĩ thuật xác định trình tự nucleotide
Những phương pháp xác định trình tự acid nucleic đang được sử dụng
hiện nay đều được cải tiến từ phương pháp enzyme học thông qua việc sử
dụng các dideoxynucleotide. Phương pháp này dựa vào sự tổng hợp nhờ
enzyme DNA polymerase mạch bổ sung cho trình tự DNA mạch đơn cần xác
định. Đặc trưng của phương pháp này là ngồi bốn loại nucleotide thơng
thường còn sử dụng thêm bốn loại dideoxynucleotide là những
deoxynucleotide trong đó nhóm 3’-OH được thay bằng H. Điều này khiến cho
các deoxynucleotide khơng cịn khả năng hình thành các cầu nối
phosphodiester, do đó ngừng q trình tổng hợp. Trong kỹ thuật xác định
trình tự nucleotide tự động, mỗi dideoxynucleotide được đánh dấu bằng một
fluorchrome có màu khác nhau. Như vậy, tất cả oligonucleotide cùng chấm
dứt tại một loại dideoxynucleotide sẽ có cùng màu [8]. Sau khi điện di trong
ống vi mao quản, tạo ra một dãy các phân đoạn DNA hơn kém nhau một


nucleotide. Thiết bị phát sáng huỳnh quang (detector) phát hiện các băng theo
thời gian, băng nào xa nhất được phát hiện trước. Detector phát tín hiệu lên
máy. Detector là một thiết bị khuếch đại tín hiệu. Kết quả xác định trình tự sẽ
được xử lý bằng phần mềm máy tính chuyên dụng [2, 5].


CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

Vật liệu và hóa chất

2.1.1 Vật liệu
Vật liệu là các mẫu gỗ cây Bạch đàn urô do Trung tâm cây rừng, Viện
Khoa học lâm nghiệp Việt Nam cung cấp.
- Vector pDONRTM222 (Invitrogen)
- Các dòng tế bào kháng phage Electro MAXTMDH10BTM T1
(Invitrogen)
- Gateway BP ClonaseTM Enzyme Mix
Khóa luận được thực hiện tại Phịng thí nghiệm Cơng nghệ tế bào thực
vật, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
2.1.2 Hóa chất
Thang ADN 1 kb (Fermentas); Kit tinh sạch ADN (QIAquick Gel
Extraction Kit), và tách chiết plasmid (QIAprep Spin Miniprep Kit)
(QIAGEN); TA cloning Kit (Invitrogen); Sequencing Kit (Applied
Biosystems); Các hóa chất thông dụng khác (ampicillin, IPTG, X- gal,
agarose,...) của hãng Merck, Sigma, Amersham Pharmacia Biotech.
+ Dung dịch tách chiết plasmid : dung dịch I bao gồm Tris HCl, 25mM,
pH 8.0; EDTA, 10mM, pH 8.0; Glucose 50 mM, dung dịch II bao gồm NaOH
0,2M; SDS 1%; dung dịch III bao gồm đệm Acetate kali 3M, pH 5.5; dung
dịch chloroform: isoamylalcohol (24:1); dung dịch TE (10 mM Tris-HCl pH
8.0; 1mM EDTA)
+ Dung dịch điện di ADN: dung dịch đệm TAE 50X: Tris base: 121 g,
Axit acetic lạnh: 28.6 ml; 0.5 M EDTA pH 8.0: 50 ml, nước khử ion vừa đủ:
500 ml, Agarose 1%; Ethidium bromide (EtBr). Đệm kiểm tra mẫu ADN
(Loading buffer) 5X: Tris- HCl 1 M pH8.0: 1ml; EDTA 0.5M pH8.0: 0.2 ml;
Glycerol: 2.0 ml; Bromphenol Blue 1%: 2.0 ml


+ Môi trường LB, Yeast extract: Trypton: 10 g; NaCl: 10 g; pH = 7,4

(chuẩn bằng NaOH 1 N)
2.1.3 Máy móc, thiết bị
Máy PCR System 9700 (Applied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac
300 (Bio- Rad, Mỹ), máy soi ADN (Mini- translluminatior, Bio- Rad, Mỹ ),
máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy Vortex
(Minishaker, IKA, Đức), máy ly tâm, cùng các trang thiết bị khác của Phịng
Cơng nghệ tế bào thực vật và Phịng thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ gen,
Viện Cơng nghệ sinh học.
2.2.

Phƣơng pháp nghiên cứu
Sơ đồ thí nghiệm tổng quát:
1. Bắt đầu với mRNA
2. Gắn với mồi oligo dTattB2-Biotin

3. Tổng hợp sợi thứ nhất
và sợi thứ 2 của cDNA
4. Gắn với adapter attB1

Thu 20 phân đoạn để
kiểm tra
5. Tái tổ hợp cDNA đã biến
đổi và vector pDONRTM222
với enzyme BP Clonase

6. Tạo các dịng cDNA có vị
trí attL; các sản phẩm tạo ra là
các gen ccdB tự do
7. Biến nạp và E.coli và chọn
các khuẩn lạc kháng

2.2.1. Tách chiết RNA
Quy trình chiết tách RNA từ gỗ Bạch đàn gồm các bước sau:
- Nghiền nhanh mẫu gỗ trong Nitơ lỏng, đảm bảo mẫu phải được nghiền
triệt để và tránh enzym cắt RNA
- Chuyển ngay khoảng 400g mẫu vào ống eppendorf 2ml
- Bổ sung 700µl đệm tách
- Lắc đều bằng voltex
- Ủ 650 C trong 10 phút
- Thêm 700µl Chloroform: isoamyl alcohol (24:1)
- Lắc mạnh để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút
- Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 20 phút ở 40C
- Hút 600µl dịch nổi phía trên vào ống I
- Thêm 700µl Chloroform: isoamyl (24:1)
- Lắc mạnh để ở nhiệt độ phòng 5 phút
- Ly tâm 13000 vịng /phút trong 20 phút ở 40C
- Hút 50µl phần dịch phía trên sang ống I
- Thêm 150µl LiCl vào ống I sau đó ủ 40C qua đêm
- Li tâm thu cặn, sau đó rửa bằng cồn lạnh 2 lần
- Làm khơ rồi bổ sung 50µl nước deion và bảo quản mẫu
2.2.2. Điện di trên gel agarose 1%
Quy trình:
- Chuẩn bị gel: cho 1g agarose vào 100ml TAE 1X. Đun sơi đến khi
agarose tan hồn tồn. Để cho agarose nguội xuống khoảng 55°C, đổ dung
dịch vào khuôn gel điện di đã cài sẵn răng lược. Sau 30-60 phút, khi gel
agarose đã đông cứng, gỡ khay gel cài vào bể điện di. Đổ đệm TAE 1X ngập
bản gel agarose khoảng 2mm, tháo lược ra khỏi bản gel
- Tra mẫu: trộn mẫu theo tỷ lệ (2µl DNA/ 1μl đệm tra mẫu 10X: 7µl
H2O) và tra vào giếng

- Điện di: điện thế dùng để điện di từ 60- 80V. DNA chuyển từ cực âm
sang cực dương. Quan sát sự di chuyển của bromophenol (màu xanh) để biết
lúc nào ngừng điện di
- Nhuộm DNA: nhuộm DNA bằng Ethidium Bromide (EtBr). Bản gel
được lấy ra khỏi khay điện di và đưa vào dung dịch EtBr 0,5 μg/ ml trong thời
gian khoảng 15 phút trên máy lắc nhẹ
- Soi DNA: soi trên máy UV và chụp ảnh bằng máy Gen-Doc
2.2.3. Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất
Trong kỹ thuật Gateway BP, vector pDONRTM 222 có trình tự attP bổ
sung với trình tự attB, chính vì vậy khi attB2 được gắn vào sợi thứ nhất, quá
trình tái tổ hợp giữa cDNA và vector nhận sẽ không cần sử dụng đến enzyme
giới hạn.
Thành phần phản ứng:
mRNA +H2O

: 9µl

Biotin-attB2 oligo dT

: 1µl

dNTPs

: 1µl

Tổng phản ứng

: 11µl

Giữ phản ứng ở 650C trong 5 phút, và 450C trong 2 phút (1)
Thêm vào ống effendorf mới thành phần như sau (2)
5X First Strand Buffer

:4µl

0,1 M DTT

: 2µl

H2O

: 1µl

Ống I + ống II = 18µl
Ủ phản ứng ở 450C trong 2 phút
Bổ sung Super Script II RT : 2µl
Ủ phản ứng ở 450C trong 60 phút.
Sản phẩm được sử dụng làm nguyên liệu để tổng hợp mạch cDNA thứ 2.


2.2.4. Tổng hợp sợi cDNA thứ 2 và gắn attB1
- Sợi thứ nhất cDNA đã gắn adapter attB2 ở đầu 3’ được tổng hợp tạo
thành cDNA mạch kép. Các bước tiến hành như sau :
- Đặt ống eppendorf chứa 19µl cDNA trong đá. Giữ ống trong đá khi
thêm thành phần phản ứng:
Nước khử DEPC

: 92µl

5X Second Strand Buffer

: 30µl

10mM dNTPs

: 3µl

E.coli DNA Ligase (10U/ µl)

: 1µl

E.coli DNA Polymerase I (10U/ µl)

: 4µl

E.coli Rnase H (2U/ µl)

: 1µl

Tổng thể tích

: 150µl

- Trộn hỗn hợp nhẹ nhàng bằng pipet và ly tâm trong 2 phút để mẫu
ngưng đều xuống. Ủ ở 16oC trong 2h.
- Thêm 2µl T4 DNA Polymerase. Mix nhẹ bằng pipet. Ủ ở 16oC trong 5
phút
- Thêm 10µl EDTA 0,5M pH=8.0 để dừng phản ứng.

- Thêm 160µl phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1) và đảo
bằng tay khoảng 30 giây
- Ly tâm ở 14000 v/p trong 5 phút tại nhiệt độ phịng. Chuyển phần dịch
lỏng phía trên sang ống 1,5ml
- Thêm vào phần vừa chiết ra các chất sau
Glycogen (20 µg/µl)

: 1µl

7.5 M NH4OAc

: 80µl

100% ethanol

: 600µl

- Đặt mẫu ở đá hoặc ở tủ -80oC trong 10 phút. Ly tâm 14000 v/p trong
25 phút ở 4oC.
- Cẩn thận chuyển phần dịch nổi sang ống khác (tránh hút phần dưới).
Sau đó thêm 150µl ethanol 70%.


- Ly tâm mẫu ở 4oC trong 2 phút 14000 v/p. Cẩn thận bỏ phần dịch nổi.
Rửa bằng cồn 70 %. Làm khô cDNA bằng máy Speed-Vac trong 2-3 phút
hoặc để ở nhiệt độ phòng trong 5-10 phút.
- Bổ sung 18µl nước khử DEPC.
Gắn attB1
attB1 có kích thước ngắn, là các oligonucleotide sợi đôi mang một đầu
bằng (để gắn với cDNA sợi đơi) và một đầu dính (để gắn với đầu tận cùng

tương ứng trong vector)
Sau khi tổng hợp được sợi thứ 2, thu được cDNA mạch kép đã gắn một
adapter attB2 ở đầu 3’. Sau đó, tiến hành gắn một adapter attB1 vào đầu 5’
của cDNA mạch kép.
i) Thành phần phản ứng gồm có:
cDNA

: 18µl

5X Adapter Buffer

: 10µl

attB1 Adapter (1µg/µl)

: 10µl

0,1M DTT

: 7µl

T4 DNA Ligase (1U/ µl)

: 5µl

Tổng thể tích

: 50µl

ii) Mix nhẹ nhàng bằng pipet và ủ ở 16oC trong 24 giờ

2.2.5. Phân đoạn kích thƣớc cDNA bằng cột sắc kí ái lực
2.2.5.1.

Phân đoạn cDNA

Q trình rửa cột như sau :
- Dùng ethanol 20% để chảy hoàn toàn
- Bổ sung 0,8 ml buffer TEN. Để cột chảy hoàn tồn
- Lặp lại bước rửa 3-4 lần.
Q trình phân đoạn cDNA :
- Đặt ống 1,5 ml dưới cột phân đoạn.
- Bổ sung mẫu vào giữa cột và để chảy hoàn toàn
- Mỗi giọt xuống một ống 1,5 ml tương ứng với một phân đoạn


Để kiểm tra chất lượng và nồng độ của cDNA ta tiến hành thử nghiệm
bằng phép thử đánh dấu trên đĩa thạch.
2.2.5.2.

Kiểm tra bằng phép thử đánh dấu trên đĩa thạch (Plate

Spotting)
- Chuẩn bị dung dịch agarose 1% đun nóng để agarose tan hồn tồn
- Bổ sung 10µl Ethidium Bromide (10μg/ml)
- Đổ ra đĩa petri để khô bề mặt
Dùng marker để xác định phân đoạn cDNA. Đặt 1µl pEXP7 vào hàng
trên của đĩa. Chấm các mẫu nhỏ của dung dịch cDNA vào đĩa petri. Soi dưới
tia UV để xác định các nồng độ các phân đoạn cDNA.
Ethidium Bromide có khả năng xen vào các liên kết đôi của mạch cDNA
kép và có thể thấy được khi soi dưới ánh sáng của tia UV. Phép thử này nhằm

phát hiện kiểm tra cDNA là mạch đơn hay mạch kép, đồng thời xác định được
hàm lượng của cDNA mạch kép tạo thành.
2.2.5.3.

Thực hiện phản ứng tái tổ hợp giữa attB-cDNA và vector

pDONRTM222
Mạch cDNA kép đã được gắn adapter ở 2 đầu được thực hiện phản ứng
tái tổ hợp BP với pDONRTM222 vector nhờ cơng nghệ Gateway® BP:
- Thành phần phản ứng gồm có:
cDNA-adapter

: 1µl

pDONRTM222

: 1µl

5X BP Buffer

: 2µl

H2O

: 3µl

Enzyme BP CloneTM: 3µl
Tổng

: 10µl

Ủ phản ứng ở 25oC trong 20 h.
Sau 20h thêm 2µl proteinase K để ức chế sự họat động của enzyme BP
ClonaseTM


2.2.6. Biến nạp vào các dòng tế bào kháng phage ElectroMAXTM
DH10BTMT1 trong môi trƣờng kháng sinh Kanamycin
TIẾN HÀNH
- Mỗi ống chứa 9μl cDNA. Thêm vào đó 50μl tế bào kháng phage
Electro MAXTMDH10BTMT1, mix nhẹ nhàng bằng pipet.
- Chuyển toàn bộ mẫu ở trên vào cuvet 0,1cm để lạnh. Cẩn thận khơng
để tạo bọt
- Xung điện theo chương trình cài đặt
Điện thế

2.0kV

Điện trở

200Ω

Capacity

25μF

- Cho 1ml S.O.C vào cuvette và hút ra ống nước (15ml)
- Lắc 200 v/p ở 37oC trong 1h
- Lấy 200μl hỗn hợp chứa tế bào đã biến nạp cấy trải trên đĩa petri chứa
môi trường LB đặc bổ sung kháng sinh Kanamycin (50mg/l).

- Bảo quản tế bào đã biến nạp: bổ sung 1200μl SOC và 800μl Glyxerin.
Giữ ở -800C.
2.2.7. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp
2.2.7.1.

Sàng lọc các khuẩn lạc mang đoạn cDNA

Thành phần phản ứng colony-PCR:
Đệm PCR 10X

: 2,5 μl

MgCl2 (25mM)

: 2,5 μl

Mồi xuôi (10 pmol/μl )

: 1,0 μl

Mồi ngược (10 pmol/μl )

: 1,0 μl

dNTPs (10 mM)

: 2,0 μl

Taq DNA polymerase (5 u/ μl) : 0,2 μl
Nước khử ion

Khuẩn lạc
Tổng thể tích là 25μl

: 15,8 μl