Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cây râu mèo (orthosiphon aristatus (blume ) miq ) bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro

LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành đƣợc khóa luận với đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy
trình nhân giống cây Râu mèo (Orthosiphon aristatus (Blume.) Miq.)
bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro.” Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo
Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã cho phép và tạo điều kiện cho tơi
làm đề tài nghiên cứu khóa luận tại các phịng thí nghiệm của Viện. Trong
q trình thực hiện đề tài này, tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự động viên, khích
lệ cũng với sự hƣớng dẫn nhiệt tình và chu đáo của các thầy, cơ giáo.
Đặc biệt, tơi xin đƣợc bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn
Văn Việt, Chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ
sinh học Lâm nghiệp, ThS. Đồn Thị Thu Hƣơng đã nhiệt tình hƣớng dẫn và
truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề
tài này.
Tôi cũng xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo cùng toàn thể
các cán bộ đang làm việc, nghiên cứu tại Bộ môn công nghệ tế bào thực vật –
Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp – Trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt
Nam đã tạo mọi điều kiện và giúp đỡ tơi tận tình trong suốt thời gian thực
hiện đề tài.
Mặc dù tôi đã cố gắng nhƣng chắc chắn bài khóa luận vẫn khơng thể
tránh khỏi sai sót. Vì vậy, tôi rất mong nhận đƣợc những ý kiến đánh giá, góp
ý để tạo tiền đề vững chắc hơn cho tôi trong công việc sau này.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà nội, ngày 24 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Ngô Thị Phấn

i


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i
MỤC LỤC ......................................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................. iv
DANH MỤC HÌNH .......................................................................................... v
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ vi
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
PHẦN 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ......................................... 2
1.1. Giới thiệu chung về cây Râu mèo ............................................................ 2
1.1.1. Vị trí phân loại ...................................................................................... 2
1.1.2. Đặc điểm hình thái của cây Râu mèo ................................................... 2
1.1.3. Phân bố ................................................................................................. 3
1.1.4. Đặc điểm sinh thái của cây Râu mèo.................................................... 4
1.1.5. Thành phần hóa học của cây Râu mèo ................................................. 4
1.1.6. Tác dụng dƣợc lý của cây Râu mèo ..................................................... 5
1.1.7. Công dụng của cây Râu mèo ................................................................ 6
1.1.8. Một số nghiên cứu có liên quan đến cây Râu mèo ............................... 7
PHẦN 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........ 13
2.1. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................. 13
2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 13
2.3. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 13
2.4. Địa điểm và điều kiện bố trí thí nghiệm................................................... 13
2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................... 14
2.5.1. Phƣơng pháp luận .................................................................................. 14
2.5.2. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm.............................................................. 14
2.5.3. Phƣơng pháp thu thập và xử lí số liệu ................................................... 18
PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 20
3.1. Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch ............. 20
3.2. Ảnh hƣởng của chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh chồi .................... 22
ii

3.3. Ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ................................... 24
3.4. Ảnh hƣởng của thời gian huấn luyện đến khả năng sống của cây Râu mèo
......................................................................................................................... 26
PHẦN 4. KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ ....................................... 33
4.1. Kết luận .................................................................................................... 33
4.2. Tồn tại....................................................................................................... 33
4.3 Kiến nghị ................................................................................................... 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 34
PHỤ BIỂU ......................................................................................................... 1

iii


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Viết đầy đủ

STT

Từ viết tắt

1

ALT

Alanine transaminase

2

BAP

Benzylamino purine-6

3

CCl4

Carbbon tetrachloride

4

CTTN

Cơng thức thí nghiệm

5

CS

Cộng sự

6

ĐC

Đối chứng

7

ĐHST

Điều hịa sinh trƣởng

8

HCC

Hepatocellular carcinoma- ung thƣ biểu mơ tế bào gan

9

HepG2

Dịng tế bào HCC ở ngƣời

10

HPLC

High-performance liquid chromatography (sắc kí lỏng
hiệu năng cao)

11

IBA

Indole-3- butyric acid

12

Ki

Fufuryamino purine-6

13

MDA

Malonyl diadehyd

14

MIC

Nồng độ ức chế tối thiểu

15

MS

Murashige & Skoog, 1962

16

MTT

3-[4,5-dimetylthiazol-2-yl]-2,5-điphenyltetrazol brom

17

NAA

Naphthylacetic acid

18

Sig

Mức ý nghĩa (Significant)

19

TB

Trung bình

20

XO

Xanthin oxidase

iv


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cây Râu mèo ..................................................................................... 2
Hình 1.2. Hình thái cây Râu mèo ...................................................................... 3
Hình 3.1. Biểu đồ ảnh hƣởng của thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu
sạch .................................................................................................................. 21

Hình 3.2. Mẫu sạch nảy chồi ở CT4 sau 4 tuần .............................................. 22
Hình 3.3. Biều đồ ảnh hƣởng của chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh chồi
......................................................................................................................... 23
Hình 3.4. Cụm chồi Râu mèo (A) và bình chồi Râu mèo (B) trên mơi trƣờng
RM2 ................................................................................................................. 24
Hình 3.5. Biểu đồ ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ ............. 25
Hình 3.6. Rễ cây Râu mèo của cơng thức R2 (0,3 mg/l NAA) ...................... 26
Hình 3.7. Cây con Râu mèo hồn chỉnh trong các mơi trƣờng R1, R2, R3 và
R4 .................................................................................................................... 26
Hình 3.8. Biểu đồ ảnh hƣởng của thời gian huấn luyện đến khả năng sống của
cây Râu mèo .................................................................................................... 27
Hình 3.9. Cây Râu mèo trồng trong bầu sau 7 ngày ở công thức T0 (A) ....... 29
và T3 (B) ......................................................................................................... 29
Hình 3.10. Biểu đồ ảnh hƣởng của thành phần ruột bầu đến khả năng sống của
cây con Râu mèo ............................................................................................. 30
Hình 3.11. Cây Râu mèo mới trồng (A) và sau 1 tháng trồng (B) ở công thức
RB1 .................................................................................................................. 31
Hình 3.12. Cây Râu mèo mới trồng (A) và sau khi trồng 1 tháng (B) ở công
thức RB3.......................................................................................................... 31
Hình 3.13. Cây Râu mèo sau 1,5 tháng ở các cơng thức thí nghiệm .............. 32

v


DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm khử trùng vật liệu cây Râu mèo ......................... 15
Bảng 2.2. Bố trí các thí nghiệm nhân nhanh chồi ........................................... 16
Bảng 2.3. Bố trí các thí nghiệm ra rễ Râu mèo ............................................... 16
Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm ảnh hƣởng của thời gian huấn luyện đến khả năng

sống ................................................................................................................. 17
Bảng 2.5. Ảnh hƣởng của thành phần ruột bầu đến khả năng sống................ 17
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch ... 20
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh chồi .......... 22
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ ......................... 24
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của thời gian huấn luyện đến khả năng sống của cây
Râu mèo ........................................................................................................... 27
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của thành phần ruột bầu đến khả năng sống................ 30

vi


ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là quốc gia nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, có hệ
thực vật rất phong phú và đa dạng. Nhiều loài thực vật trong tự nhiên đã và
đang đƣợc con ngƣời biết đến với nhiều giá trị sử dụng về kinh tế, y học,
nghiên cứu,…Trong đó khơng thể khơng nhắc đến nhóm thực vật có tác dụng
dƣợc lý, đƣợc sử dụng phổ biến trong nhiều bài thuốc dân gian và cả trong y
học hiện đại. Tuy nhiên, tình trạng khai thác quá mức và khai khác rừng bừa
bãi đã làm một số loài cây thuốc quý đang ngày càng khan hiếm, trong đó có
cây Râu mèo.
Râu mèo đƣợc biết đến nhƣ là vị thuốc làm tăng lƣợng nƣớc tiểu và
thúc đẩy sự bài tiết urê, các chlorua và acid uric, có tác dụng tốt đối với các
chứng rối loạn đƣờng tiêu hóa, bệnh thấp khớp, đau lƣng, đau nhức khớp
xƣơng. Ngoài ra, Râu mèo cịn có tác dụng tốt đối với bệnh xung huyết gan và
bệnh đƣờng ruột. Hiệu quả của nó là do tác dụng kết hợp của glycosid với các
muối kiềm, các chất giống nhƣ tanin của dầu thơm và của một saponin.
Râu mèo đã và đang đƣợc con ngƣời sử dụng phổ biến trong nhiều bài
thuốc đông y với nhiều tác dụng khác nhau. Tuy nhiên, nguồn dƣợc liệu này
đang ngày càng trở lên cạn kiệt do sự khai thác quá mức của con ngƣời.

Trong khi những nghiên cứu về cây Râu mèo chỉ mới tập trung vào việc điều
tra, mô tả đặc tính sinh học, phân tích thành phần hóa học của cây và nhân
giống vơ tính bằng phƣơng pháp giâm hom. Thêm vào đó, cây tái sinh bằng
bằng hạt lại cho tỷ lệ nảy mầm rất thấp. Chính vì vậy, tôi đã thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cây Râu mèo (Orthosiphon
aristatus (Blume.) Miq.) bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro.” nhằm tạo ra số
lƣợng lớn cây Râu mèo sạch bệnh trong thời gian ngắn, đảm bảo đƣợc nhu
cầu sử dụng của con ngƣời, góp phần chủ động nguồn nguyên liệu làm thuốc
và nâng cao chất lƣợng dƣợc liệu, đƣa công tác sản xuất dƣợc liệu cây Râu
mèo dần đi vào ổn định về số lƣợng và chất lƣợng.

1


PHẦN 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Giới thiệu chung về cây Râu mèo
1.1.1. Vị trí phân loại
Tên khoa học: Orthosiphon aristatus (Blume.) Miq.
Tên đồng nghĩa: Orthosiphon spiralis (Lour.) Merr.
Tên khác: Cây Bông bạc
Họ: Bạc hà (Lamiaceae)
Bộ: Hoa môi (Lamiales)
Lớp: Ngọc Lan (Magnoliopsida)
Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta)

Hình 1.1. Cây Râu mèo [16]
Râu mèo là một lồi thực vật có hoa thuộc chi Orthosiphon trong họ
Bạc hà (Lamiaceae) (còn đƣợc gọi bằng nhiều tên khác nhƣ họ Húng hay họ
Hoa môi). Chi Orthosiphon có khoảng 40 lồi trên thế giới, phân bố rải rác
khắp các vùng nhiệt đới Châu Á, Châu Phi và Châu Dại Dƣơng. Vùng nhiệt

đới Đông Nam Á đƣợc coi là nơi tập trung và có tính đa dạng cao về thành
phần lồi của chi, trong đó Việt Nam có 8 lồi [1].
1.1.2. Đặc điểm hình thái của cây Râu mèo
Râu mèo là cây thảo, sống lâu năm, cao khoảng 0,3- 0,5m, có khi hơn.
Thân mảnh cứng, hình vng, mọc đứng, thƣờng có màu nâu tím, nhẵn hoặc
có ít lơng, ít phân cành. Lá mọc đối, hình trứng, dài 4- 6 cm, rộng 2,5- 4 cm,
2


gốc trịn, đầu nhọn, mép khía răng to, gân lá hơi nổi rõ ở mặt dƣới, cuống lá
dài 3- 4 cm.
Cụm hoa mọc thẳng ở ngọn thân và đầu cành, dài 8- 10 cm, gồm 6- 10
vịng, mỗi vịng có 6 hoa màu trắng hoặc hơi tím; lá bắc nhỏ rụng sớm; đài
hình chng có 5 răng, răng trên rộng, tõe ra ngồi; tràng hình ống hẹp, thẳng
hoặc hơi cong, dài 2 cm, môi trên chia 3 thùy, môi dƣới nguyên; nhị mọc thò
ra ngời hoa, dài gấp 2- 3 lần tràng, chỉ nhị mảnh, nhẵn; vòi nhụy dài hơn nhị
[1].
Quả bế, tự, nhỏ, nhẵn.
Mùa hoa quả: tháng 4 – 7.

Hình 1.2. Hình thái cây Râu mèo [15]
1.1.3. Phân bố
Chi Orthosiphon có khoảng 40 lồi trên thế giới, phân bố rải rác khắp
các vùng nhiệt đới Châu Á, Châu Phi và Châu Dại Dƣơng. Vùng nhiệt đới
Đông Nam Á đƣợc coi là nơi tập trung và có tính đa dạng cao về thành phần
lồi của chi, trong đó Việt Nam có 8 lồi [1].
Râu mèo là cây nhiệt đới tƣơng đối điển hình, mọc tự nhiên phổ biến ở
Ấn Độ, Indonesia, Malaysia, Thái Lan, các nƣớc ở Đông Dƣơng và cả ở Châu
Phi. Cây còn đƣợc trồng ở Ấn Độ, Indonesia, Thái Lan, Cu Ba và Việt Nam
[1].

Ở Việt Nam, Râu mèo phân bố rải rác ở một số tỉnh miền núi nhƣ Cao
Bằng, Thanh Hóa (Vĩnh Lộc), Hà Tây (Ba Vì), Lâm Đồng, Phú Yên (Tuy
3


Hịa), Vũng Tàu- Cơn Đảo (Bà Rịa), Ninh Thuận (Phan Rang), Kiên Giang
(Phú Quốc)…[1].
1.1.4. Đặc điểm sinh thái của cây Râu mèo
Râu mèo thích hợp với mọi loại đất, ƣa khí hậu nóng, ẩm, sinh trƣởng
mạnh vào mua hè và mùa thu nhƣng không chịu đƣợc úng.
Cây ƣa ẩm, ƣa sáng và có thể hơi chịu bóng, thƣờng mọc trên đất giàu
chất mùn ở ven rừng, gần bờ nƣớc hoặc trong thung lũng. Độ cao phân bố của
cây từ khoảng 10m (ở Phú Yên) đến 600m (ở Cao Bằng). Cây sinh trƣởng
mạnh trong mùa xn hè. Mùa đơng có hiện tƣợng bán tàn lụi ở phần thân
cành trên mặt đất. Cây ra hoa quả nhiều hàng năm, tái sinh tự nhiên chủ yếu
từ hạt nhƣng tỷ lệ nảy mầm thƣờng rất thấp. Râu mèo tái sinh chồi khỏe, nhất
là những phần còn lại sau khi bị cắt [1].
1.1.5. Thành phần hóa học của cây Râu mèo
Lá Râu mèo chứa một saponin, một alcaloid, tinh dầu 0,2- 0,6%, tanin,
acid hữu cơ (acid tartric, acid citric và acid glycolic) và dầu béo.
Saponin khi thủy phân cho sapogenin và đƣờng là arabinose và glucose
(hoặc fructose). Phần khơng xà phịng hóa của dầu béo gồm β- sitosterol và αamyrin. Hoạt tính của lá do có hàm lƣợng Kali cao (0,7- 0,8%) và một lƣợng
glycosid đắng là orthosiphonin [1].
Lá khơ và ngọn tƣơi có hoa chứa các chất vô cơ khoảng 12% với hàm
lƣợng Kali cao (600- 700 mg/100g lá tƣơi), favonoid (sinensetin, 3’- hydroxy3, 6, 7, 4’-tetramethoxy flavon, tetramethylscutelarein), các dẫn chất của acid
cafeic (chủ yếu là acid rosmarinic, acid 2,3- dicafeoyltartaric), inositol,
phytosterol (β-sitosterol), saponin, tinh dầu 0,7% [1].
Theo Schmidt S. et al (1985), tinh dầu lá, cành và thân chứa βcaryophylen, β-elemen, humulen, β-bourbonen và 1-octen-3-ol, caryophyllen
oxyd [1].
Cây râu mèo còn chứa methylripariochromen A, orthosiphol A 16,75%,

carotenoid (α-caroten, β-caroten, 3-zeacaroten và cryptoxanthin)[1]. Theo
Takeda Yoshio et al (1993), cây Râu mèo có orthosiphol A, B, D, salvigenin
và một số hợp chất khác [1].

4


1.1.6. Tác dụng dược lý của cây Râu mèo
Cây Râu mèo là một dƣợc liệu đã dùng lâu đời ở Ấn Độ, Indonesia
trong các bệnh về thận và bàng quang. Ở Châu Âu nhập và sử dụng vào cuối
thế kỷ XIX.
Theo tác giả Chow S. Y, Liao J. F (Đài Loan), dịch chiết từ cây Râu
mèo trên chó thí nghiệm bằng đƣờng tiêm truyền tĩnh mạch với liều 18,8
mg/kg/phút có tác dụng tăng cƣờng bài tiết nƣớc tiểu và các chất điện giải
Na+, K+, Cl-. Trên chuột nhắt trắng, Râu mèo bằng đƣờng tiêm xoang bụng
với liều 2- 4 g/kg làm giảm hoạt động vận động của chuột. Trên chó, bằng
đƣờng tiêm tĩnh mạch với liều 0,179 g/kg có tác dụng hạ huyết áp và làm
giảm tần số hô hấp. Dịch chiết bằng cồn của Râu mèo trên chuột nhắt trắng
bằng đƣờng tiêm xoang bụng có LD50= 196 g/kg [1].
Các tác giả Schut G.A và Zwavinng J.H (Hà Lan) đã xác định tác dụng
lợi tiểu của 2 flavon sinensetin và 3’-hydroxy-3,6,7,4’ tetramethoxyflavon của
Râu mèo. Thí nghiệm trên chuột nhắt trắng, chất 3’-hydroxy-3,6,7,4’
tetramethoxyflavon bằng đƣờng tiêm tĩnh mạch với liều 10 mg/kg, lƣợng
nƣớc tiểu thu đƣợc sau 140 phút là 410 mg, còn sinensetin dùng cùng liều
trên, lƣợng nƣớc tiểu thu đƣợc sau 160 phút là 614 mg, trong khi đó ở lô
chuột đối chứng, sau 120 phút, không thu đƣợc một lƣợng nƣớc tiểu nào. Hai
flavon trên dùng với liều 1 mg/kg có so sánh với tác dụng của
hydrochlorothiazid thấy tác dụng lợi tiểu yếu hơn và xuất hiện chậm. Đồng
thời, các tác giả cũng khẳng định 2 flavon trên với liều 10 mg/kg trên chuột
cóng trắng khoog thể hiện tác dụng lợi mật tuy trong y học cổ có ghi nhận là

Râu mèo có tác dụng lợi mật. Xuất phát từ tác dụng điều trị của Râu mèo, 2
tác giả trên đã tiến hành nghiên cứu tác dụng chống viêm và tác dụng kháng
khuẩn của các flavon chiết tách từ Râu mèo. Kết quả cho thấy trên thí nghiệm
gây viêm bằng phƣơng pháp cấy viên bông (cotton- pellet), sinensetin không
thể hiện tác dụng chống viêm. Về tác dụng kháng khuẩn, đã nghiên cứu với
các chủng Escherichia coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus và Enterococcus là những chủng có thể gây nhiễm
đƣờng tiết niệu, kết quả cho thấy cả 3 flavon sinensetin,
tetramethylscutellarein và 3’- hydro- 3,6,7,4’ tetramethoxyflavon đều khơng
có tác dụng kháng khuẩn đối với những chủng đã nêu [1].
5


Về dƣợc lý lâm sàng, theo các tác giả Ấn Độ, Râu mèo rất có ích cho
điều trị bệnh thận và phù thũng. Trên bệnh nhân, Râu mèo có tác dụng làm
kiềm hóa máu, sự có mặt của hoạt chất orthosiphonin và muối kali trong dƣợc
liệu có tác dụng giữ cho acid uric và muối urat ở dạng hòa tan, do đó phịng
ngừa đƣợc sự lắng đọng của chúng để tạo thành sỏi thận. Ở Thái Lan, thí
nghiệm trên những ngƣời tình nguyện khỏe mạnh, dịch chiết Râu mèo có tác
dụng làm tăng sự bài tiết citrat và oxalat; Oxalat với hàm lƣợng cao có thể
tăng nguy cơ hình thành sỏi thận, sự bài tiết citrat đƣợc tăng cƣờng giúp ngăn
ngừa sự hình thành sỏi thận [1].
Ngồi ra, dịch chiết lá Râu mèo có tác dụng hạ đƣờng huyết ở những
bệnh nhân tiểu đƣờng, nhƣng tác dụng này không hằng định, cơ chế tác dụng
có thể là do kích thích sự hình thành glycogen ở gan. Các chất sinensetin và
tetramethylscutellarein có tác dụng ức chế tế bào u báng [1].
Râu mèo có vị ngọt nhạt, hơi đắng, tính mát; có tác dụng thanh nhiệt,
lợi tiểu, tiêu viêm, trừ thấp. Râu mèo làm tăng lƣợng nƣớc tiểu và thúc đẩy sự
bài tiết ure, các chlorua và acid uric. Có tác dụng tốt đối với các chứng rối
loạn đƣờng tiêu hóa, bệnh thấp khớp, đau lƣng, đau nhức khớp xƣơng. Cịn có

tác dụng tốt đối với bệnh xung huyết gan và bệnh đƣờng ruột. Hiệu quả của
nó là do tác dụng kết hợp của glycosid với các muối kiềm, các chất giống nhƣ
tanin của dầu thơm và của một saponin. Dịch chiết bằng nƣớc giàu hoạt chất
hơn (28,8%) [2].
1.1.7. Công dụng của cây Râu mèo
Theo kinh nghiệm dân gian, Râu mèo đƣợc dùng làm thuốc lợi tiểu
trong điều trị bệnh viêm thận, sỏi thận, sỏi mật, tê thấp, phù thũng, viêm gan.
Tài liệu Ấn Độ coi nƣớc hãm lá Râu mèo là thuốc điều trị đặc hiệu các bệnh
thận và bàng quang, ngồi ra cịn điều trị bệnh thấp khớp và bệnh gút [1].
Liều dùng: 5- 12 gr lá hãm với nƣớc sôi, chia làm 2 lần uống trƣớc khi
ăn cơm 15- 30 phút. Nên uống lúc dịch hãm cịn nóng. Hoặc cũng có thể sắc
nƣớc uống. Thƣờng dùng liên tục 8 ngày, nghỉ 2- 4 ngày lại tiếp tục nếu cần
thiết. Có thể nấu thành cao lỏng, mỗi ngày dùng 2- 5 gr cao. Cao lỏng Râu
mèo đƣợc dùng làm thuốc hạ đƣờng huyết trong bênh tiểu đƣờng. Nếu dùng
cả cây Râu mèo thì liều lƣợng hàng ngày là 30- 40 gr, dùng riêng hoặc phối
hợp với các vị thuốc khác [1].
6


Có tài liệu cho rằng, khi cây Râu mèo ra hoa phải ngắt bỏ hoa vì hoa sẽ
làm giảm lƣợng hoạt chất trong lá. Một số bác sĩ Việt Nam và Thụy Điển đã
sử dụng Râu mèo trên lâm sàng cho bệnh nhân ở Bệnh viện Việt Nam- Thụy
Điển ở ng Bí và thấy thuốc khơng làm tăng lƣợng nƣớc tiểu bài tiết trong
vịng 12- 24 giờ và cũng khơng ảnh hƣởng đến bài tiết Na+ [1].
 Một số bài thuốc sử dụng cây Râu mèo:
Chữa viêm thận mãn tính, viêm bàng quang, viêm khớp, phong thấp,
viêm đƣờng ruột: Râu mèo 40 gr, tỳ giải và rễ ý dĩ mỗi vị 30 gr sắc nƣớc uồng
[1].
Chữa sỏi niệu đạo, bệnh đƣờng tiết niệu: Râu mèo 30 gr, chó đẻ răng
cƣa 30 gr và thài lài 30 gr sắc uống trong ngày [2].

Chữa đái ra sỏi, đái ra máu và đái buốt: Râu mèo 40 gr, thài lài trắng 30
gr sắc lấy nƣớc, mỗi lần hòa thêm 6 gr bột hoạt thạch uống trong ngày, chia
làm 3 lần. Uống liền 5 - 7 ngày [1].
Chữa viêm thận, phù thũng: Râu mèo, mã đề, lƣỡi rắn trắng, mỗi vị 30
gr, sắc uống [2].
1.1.8. Một số nghiên cứu có liên quan đến cây Râu mèo
1.1.8.1. Một số nghiên cứu trên thế giới
Theo Lee Wai-Leng et al (2003), mơ sẹo của Râu mèo có thể đƣợc tạo
thành công từ cuống lá, mô và thân khi ni cấy trên mơi trƣờng MS có chứa
nồng độ khác nhau của NAA (0 - 4 mg/l) và 2,4-D (0 - 2 mg/l). Sản lƣợng mô
sẹo tƣơi cao nhất thu đƣợc từ mô lá đã thu đƣợc trên môi trƣờng MS có bổ
sung 1,0 mg/l 2,4-D và 1,0 mg/l NAA. Cơ chất thích hợp cho sự tăng trƣởng
tế bào tốt nhất là 0,75 gr tế bào trong 20 ml môi trƣờng nuôi cấy. Nuôi cấy
huyền phù tế bào sử dụng môi trƣờng MS bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D thúc đẩy
tăng trƣởng tế bào tốt nhất với sinh khối tối đa là 8,609 gr trọng lƣợng tƣơi và
0,309 gr trọng lƣợng khô trong 24 ngày sau khi tiêm truyền. Các tế bào phát
triển trong môi trƣờng MS đƣợc bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D đã đạt đến giai đoạn
phát triển ổn định trong 15 ngày so với các tế bào phát triển trong môi trƣờng
MS đƣợc bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D và 1,0 mg/l NAA đạt đến giai đoạn phát
triển ổn định trong 24 ngày. Môi trƣờng MS đƣợc bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D
đƣợc coi là mơi trƣờng để duy trì sự tăng trƣởng tối ƣu của tế bào cây Râu
mèo trong nuôi cấy huyền phù tế bào với khoảng thời gian 2 tuần [14].
7


Năm 2013, Reshi et al đã nghiên cứu cảm ứng tái tạo mô sẹo nhanh và
tái sinh cây từ lá của cây Râu mèo. Đối với cảm ứng mô sẹo, các chất điều
hòa sinh trƣởng nhƣ 2, 4-D, IAA, NAA đƣợc bổ sung riêng lẻ và kết hợp với
cytokinin BAP. Môi trƣờng hiệu quả nhất để tái tạo mô sẹo và tái sinh chồi là
môi trƣờng MS đƣợc bổ sung 8 mg/l BAP và 2 mg/l NAA, trên đó đã thu

đƣợc nhiều chồi sau 15 ngày cảm ứng mô sẹo. Tất cả các chồi ni trong ống
nghiệm có chiều dài 3-5 cm đƣợc chuyển sang mơi trƣờng ra rễ có bổ sung
nồng độ IBA khác nhau. Phản ứng ra rễ tốt nhất đƣợc quan sát thấy trên mơi
trƣờng lỏng ½ MS có bổ sung 3 mg/l IBA. Các cây con thu đƣợc đã đƣợc làm
cứng và thích nghi bằng cách chuyển sang các cốc nhựa chứa đất vô trùng
trong 3-4 tuần và sau đó đƣợc đƣa đến cánh đồng, ở đây có 85% số cây sống
sót đến giai đoạn trƣởng thành [10].
Năm 2015, Reshi et al đã tiến hành nghiên cứu nhân giống cây Râu
mèo. Thân và cụm hoa đƣợc cấy vào môi trƣờng MS đƣợc bổ sung các chất
ĐHST nhóm auxin và cytokinin với các nồng độ khác nhau. Số lƣợng chồi tối
đa đạt đƣợc là 25 ± 0,78 và 17 ± 0,67 ở 5 mg/l BAP + 2,5 mg/l Ki và 3 mg/l
BAP + 1,5 mg/l Ki từ mắt ngủ và phát hoa tƣơng ứng. Các chồi in vitro đƣợc
chuyển sang mơi trƣờng lỏng ½ MS có bổ sung nồng độ IAAvà IBA khác
nhau. Sự ra rễ tốt nhất đã thu đƣợc trên mơi trƣờng có 2 mg/l IBA cho tối đa
12 ± 0.67 rễ/chồi. Cây con hoàn chỉnh đƣợc trồng vào các cốc nhựa chứa đất
vô trùng và phân trùng quế với tỷ lệ 1: 1. Sau 3 tuần huấn luyện trở nên cứng
cáp, các cây con đƣợc chuyển đến trồng ngoài đồng ruộng với tỷ lệ sống sót
95% [11].
Dorothy et al (2016) đã thực hiện nghiên cứu nhằm làm sáng tỏ trạng
thái tế bào học in vitro khi nuôi cấy mô sẹo từ lá của Râu mèo. Các mô lá
đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng MS đƣợc bổ sung các chất điều hòa sinh
trƣởng khác nhau nhƣ 2,4-D, IAA, NAA và BAP ở các nồng độ khác nhau.
Mô sẹo tốt nhất đã thu đƣợc trong môi trƣờng MS bổ sung 2,4-D (5 mg/l).
Phân tích tế bào học của các đột biến nhiễm sắc thể đƣợc thực hiện trên các
mô sẹo nuôi cấy sơ cấp cũng nhƣ mô sẹo nuôi cấy sau 3 tháng. Số lƣợng
nhiễm sắc thể khơng nhìn thấy các biến dị và các tế bào đƣợc nghiên cứu
quan sát đƣợc là lƣỡng bội (2n = 28). Thành phần và nồng độ của các chất
điều hịa sinh trƣởng có ảnh hƣởng đến sự mất ổn định nhiễm sắc thể với các
8

khối đa nhân và phôi. Những quan sát này chỉ ra rằng các biến dị di truyền có
thể phát sinh trong q trình ni cấy tế bào [9].
Reshi et al (2017) đã nghiên cứu đánh giá hoạt tính bảo vệ gan trong
ống nghiệm của chiết xuất từ lá cây Râu mèo chống lại độc tính do rƣợu gây
ra khi sử dụng dòng tế bào HepG2. Trong nghiên cứu, các phân đoạn lá đƣợc
nuôi cấy trên môi trƣờng MS đƣợc củng cố bằng các chất bổ trợ khác nhau.
Mức độ bảo vệ gan của chất chiết xuất đƣợc xác định bằng cách đo tỷ lệ phần
trăm khả năng sống của tế bào bằng xét nghiệm MTT. Kết quả nghiên cứu
cho thấy, tỷ lệ hình thành mơ sẹo tối đa (94%) thu đƣợc trong mơi trƣờng MS
có bổ sung 2 mg/l 2,4-D. Các tế bào HepG2 đã đƣợc xử lý trƣớc với các nồng
độ khác nhau (dƣới liều độc hại) của chiết xuất từ lá và lá trong 72 giờ sau khi
nhiễm độc rƣợu. Kết quả cho thấy rằng dịch chiết từ lá xử lý sơ bộ tế bào
HepG2 cho khả năng sống của tế bào là 90% so với các tế bào HepG2 đƣợc xử
lý trƣớc bằng silymarin cho thấy khả năng sống của tế bào là 81%. Chiết xuất
từ mô sẹo lá cũng cho thấy hoạt động bảo vệ gan đáng kể, trong đó chiết xuất
mơ sẹo ethanolic đƣợc dùng để xử lý trƣớc tế bào HepG2 cho thấy khả năng
sống sót 82% sau khi nhiễm độc rƣợu. Kết quả cho thấy tỷ lệ sống sót của tế
bào HepG2 phụ thuộc vào liều lƣợng [13].
Reshi et al (2017) đã nghiên cứu đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của
chloroform, petroleum ether, ethyl acetate, methanol, ethanol và dịch chiết có
nguồn gốc từ lá của Râu mèo chống lại Bacillus cereus, Bacillus subtiltis,
Staphylococcus aure Proteus mirabilis và Klebsiella pneumoniae. Trong
nghiên cứu, các đoạn lá đƣợc cắt thành các mảnh nhỏ hình vng có kích
thƣớc 1-2 cm và đƣợc ni cấy trên mơi trƣờng MS có bổ sung các chất bổ
trợ khác nhau. Hiệu quả kháng khuẩn đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp
khuếch tán đĩa, sau đó xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phƣơng
pháp pha loãng nối tiếp hai lần. Kết quả nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ hình thành
mơ sẹo tối đa thu đƣợc từ các đoạn lá đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng MS
đƣợc bổ sung 2, 4-D (2 mg/l). Chiết xuất Ethanolic từ lá cho thấy hoạt động

ức chế tối đa với vùng ức chế 28 mm đối với P. mirabilis với giá trị MIC là
0,32 mg/ml. Trong số các chiết xuất từ mô sẹo, chiết xuất etanolic cho thấy
hiệu quả sinh học tối đa đối với S. aureus với vùng ức chế 26 mm và giá trị
MIC là 0,64 mg/ml. Kết quả cho thấy rằng cả chiết xuất từ mơ sẹo có nguồn
9


gốc từ lá và lá đều có hiệu quả chống lại vi khuẩn thử nghiệm Gram (+) và
Gram (-) [12].
1.1.8.2. Một số nghiên cứu ở Việt Nam
Theo Nguyễn Lê Tú Trâm và cs. (2010), mô sẹo cây Râu mèo đƣợc tạo
ra từ lá cây in vitro trên môi trƣờng MS có sự kết hợp của 2,4-D và NAA.
Mơ sẹo bở và có trọng lƣợng tƣơi cao nhất sau 4 tuần ni mẫu lá trên mơi
trƣờng MS có bổ sung 1mg/l 2,4-D và 1 mg/l NAA. Các mô sẹo này đƣợc
chuyển sang mơi trƣờng MS lỏng có 1 mg/l 2,4-D để duy trì điều kiện tăng
trƣởng tốt cho sự ni cấy dịch treo tế bào Râu mèo [8].
Cũng trong năm 2010, Đặng Uy Nhân đã tiến hành khảo sát thành phần
hóa học của lá cây Râu mèo đƣợc trồng ở miền Trung Việt Nam. Từ cao eter
dầu và cao chloroform đã cơ lập đƣợc bốn hợp chất kí hiệu từ RM1- RM4.
Qua phân tích, các cấu trúc của các hợp chất lần lƣợt đƣợc xác định là 5hydroxyl-6,7,3’,4’-tetrametoxyflavon (RM1), eupatorin (RM2), sinensetin
(RM3) và orthosiphol (RM4). Bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
ghép đầu dò tử ngoại UV/Vis nghiên cứu đã xác định đƣợc hàm lƣợng
eupatorin và sinensetin trong lá Râu mèo khô lần lƣợt là 15,88 mg/kg và
17,33 mg/kg [5].
Năm 2012, Nguyễn Ngọc Hồng và cs. đã tiến hành nghiên cứu tác dụng
bảo vệ gan của cao chiết ehtyl acetate từ cây Nghể lông dày và Râu mèo trên
mô hình gan chuột bị gây độc mãn tính bằng carbon tetrachloride. Trong
nghiên cứu này, tác dụng bảo vệ gan của cao chiết ethyl acetate cây Nghể và
Râu mèo chống lại carbbon tetrachloride (CCl4) gây độc trên gan trên mơ
hình gây tổn thƣơng gan chuột mãn tính trong thời gian 8 tuần đƣợc nghiên

cứu và so sánh khả năng bảo vệ gan của các cao chiết ethyl acetat với
silymarin- hợp chất có khả năng bảo vệ gan chống lại nhiều loại chất độc hiệu
quả. Kết quả thử nghiệm cho thấy, ở cùng liều thử nghiệm là 16 mg/kg, cao
chiết ethyl acetat cây Râu mèo có khả năng làm giảm 55% hoạt tính ALT
trong huyết tƣơng so với nhóm chứng độc, tƣơng đƣơng khả năng làm giảm
hoạt tính ALT của silymarin trong khi khả năng làm giảm hoạt tính ALT
huyết tƣơng của cao chiết ethyl acetat cây Nghể là làm giảm 65% hoạt tính
ALT so với nhóm chứng độc, có khả năng làm giảm hoạt tính cao hơn
silymarin. Kết quả thu đƣợc cho thấy, cao chiết ethyl acetat của cây Nghể và
10


cây Râu mèo có tác dụng tốt trong việc bảo vệ gan chống lại CCl4 gây độc
tính mãn và có nhiều triển vọng trong việc sử dụng điều trị các bệnh về viêm
gan cấp và mãn tính, phịng ngừa bệnh xơ gan [3].
Năm 2013, Đỗ Thị Quỳnh Nga và cs. đã nghiên cứu về tác dụng chống
oxi hóa của cao chiết diệp hạ châu - Râu mèo trên thƣc nghiệm. Đề tài này
đƣợc thực hiện với mục đích tìm hiểu tác dụng chống oxi hóa, ức chế XO của
cao chiết từ Diệp hạ châu và Râu mèo trên chuột nhắt trắng. Nghiên cứu đã
khảo sát hoạt tính ức chế xanthin oxidase (XO) của cao Diệp hạ châu, cao
Râu mèo và cao phối hợp Diệp hạ châu – Râu mèo với các tỷ lệ phối hợp
khác nhau. Xác định khả năng ức chế peroxi hóa lipid của mẫu nghiên cứu
qua việc xác định hàm lƣợng malonyl diadehyd (MDA). Kết quả thu đƣợc là
cao chiết phối hợp Diệp hạ châu – Râu mèo ở tỷ lệ phối hợp 4:1 có hoạt tính
ức chế XO với IC50 là 43,83 µg/ml. Tỷ lệ phối hợp 1 phần cao đặc Diệp hạ
châu và 1 phần cao khô Râu mèo cho hiệu quả ức chế oxi hóa tối ƣu nhất, ở
nồng độ 50 µg/ml là 66,79% tƣơng đƣơng với hoạt tính của trolox ở nồng độ
5 mM (63,49%) [4].
Phạm Thị Thúy và cs. (2018) đã tiến hành nghiên cứu nhân giống vơ
tính cây Râu mèo bằng phƣơng pháp giâm hom. Kết quả nghiên cứu cho thấy:

sử dụng IBA, IAA và NAA với nồng độ 500, 1000 và 1500 ppm cho tỷ lệ ra
rễ bình quân tƣơng ứng là 98,52%; 98,52%; 98,89% và công thức đối chứng
là 94,44%, trong khi đó lại khơng ảnh hƣởng đến tỷ lệ ra rễ của hom cây Râu
mèo. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, tuổi hom hầu nhƣ không ảnh hƣởng đến
tỷ lệ ra bật mầm, tỷ lệ ra rễ và tỷ lệ sống của cây hom. Thời vụ ảnh hƣởng đến
số lƣợng rễ của cây hom trong điều kiện cùng sử dụng một loại chất kích
thích sinh trƣởng và cùng nồng độ [6].
Năm 2019, Phạm Thị Thúy và cs. đã tiến hành nghiên cứu định lƣợng
một số hợp chất trong cây Râu mèo thu hái đƣợc tai tỉnh Thái Nguyên.
Nghiên cứu đã tiến hành phân tích hàm lƣợng một số hoạt chất trong thân, lá
cây Râu mèo phân bố tại tỉnh Thái Nguyên. Bằng việc sử dụng phƣơng pháp
định tính bằng máy sắc ký lớp mỏng và định lƣợng bằng máy sắc ký lỏng hiệu
năng cao (HPLC), đã xác định đƣợc một số hợp chất hóa học của cây Râu
mèo bao gồm sinensetin, acid ursolic, acid rosmarinic. Trong đó, sinensetin
giao động từ 0,0112 đến 0,0195%, bình quân chung là 0,0154% hàm lƣợng
11


chất khô. Acid rosmarinic giao động từ 0,0769 đến 0,2231%, bình qn chung
là 0,1618% hàm lƣợng chất khơ. Acid ursolic giao động từ 0,0055 đến
0,0301%, trung bình là 0,0146% hàm lƣợng chất khô [7].
Các nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam mới chỉ tập trung vào phân
tích, mơ tả thành phần hóa học của cây Râu mèo, trong khi các nghiên cứu về
nhân giống loài cây này bằng in vitro chỉ có rất ít hoặc là nhân giống bằng
phƣơng pháp giâm hom.

12


PHẦN 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu chung:
Xây dựng đƣợc kỹ thuật nhân giống cây Râu mèo (Orthosiphon aristatus
(Blume.) Miq.) bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro.
Mục tiêu cụ thể:
- Xác định đƣợc phƣơng pháp tạo mẫu sạch cây Râu mèo;
- Xác định đƣợc môi trƣờng nhân nhanh chồi Râu mèo hiệu quả;
- Xác định đƣợc môi trƣờng ra rễ tạo cây hồn chỉnh thích hợp nhất;
- Xác định đƣợc thời gian huấn luyện và thành phần giá thể phù hợp cho
trồng cây Râu mèo ngoài vƣờn ƣơm.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 đến khả
năng tạo mẫu sạch;
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ chất ĐHST đến khả năng nhân
nhanh chồi;
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất ĐHST đến khả năng ra rễ in vitro;
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian huấn luyện đến khả năng sống và
sinh trƣởng của cây ngoài vƣờn ƣơm;
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của thành phần ruột bầu đến khả năng sống và
sinh trƣởng của cây in vitro trồng ngoài vƣờn ƣơm.
2.3. Vật liệu nghiên cứu
- Đối tƣợng nghiên cứu: cây Râu mèo (Orthosiphon aristatus (Blume.)
Miq.)
- Vật liệu nuôi cấy ban đầu: thân, cành cây Râu mèo bánh tẻ đƣợc cung
cấp bởi Trung tâm nghiên cứu và sản xuất thuốc Suối Hai của bệnh viện Y
học cổ truyền Bộ Công an.
2.4. Địa điểm và điều kiện bố trí thí nghiệm.
- Địa điểm: phịng thí nghiệm Công nghệ Tế bào thực vật của bộ môn
Công nghệ tế bào - Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trƣờng Đại học
Lâm nghiệp.

13


- Điều kiện bố trí thí nghiệm: Các thí nghiệm đƣợc tiến hành trong điều
kiện nhân tạo tại phịng thí nghiệm ở điều kiện:
+ Ánh sáng: thời gian chiếu sáng 12 - 16h/ngày
+ Cƣờng độ chiếu sáng: 2000 - 3000 lux.
+ Nhiệt độ phịng ni cấy: 25 ± 20C.
+ Độ ẩm trung bình: 60 – 70%.
+ pH mơi trƣờng: 5,7 - 5,8.
2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.5.1. Phương pháp luận
- Các nhân tố là chỉ tiêu nghiên cứu phải đƣợc chia thành các cơng thức
khác nhau và phải có cơng thức đối chứng.
- Các nhân tố không phải là chỉ tiêu nghiên cứu phải đảm bảo tính đồng
nhất giữa các cơng thức thí nghiệm.
- Thí nghiệm phải lặp lại 3 lần.
- Số mẫu thí nghiệm phải đủ lớn (≥ 30 mẫu/thí nghiệm)
2.5.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm
2.5.2.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch
a) Khử trùng ngoài box cấy
Các cành Râu mèo bánh tẻ đƣợc làm sạch bằng cách cắt bỏ hết lá, cắt
thành các đoạn dài vừa phải với kích thƣớc của bình đựng mẫu khử trùng. Sau
đó, tiến hành rửa qua bằng nƣớc. Các cành Râu mèo sẽ tiếp tục đƣợc rửa sạch
bằng xà phòng, sử dụng các chổi chuyên dụng để làm sạch hết các vết bẩn
bám ở bề mặt và các kẽ của thân cây.
Sau khi cọ sạch, tiến hành cho mẫu vào bình scoot và lắc mẫu bằng xà
phịng loãng trong khoảng 5 phút. Lặp lại nhƣ vậy khoảng 3 lần và tráng mẫu
sạch xà phòng bằng nƣớc sạch ở mỗi lần rồi mới tiếp tục thực hiện.

b) Khử trùng trong box cấy
Cành Râu mèo sau khi đƣợc khử trùng bên ngoài sẽ đƣợc đƣa vào bên
trong box cấy vô trùng. Tráng lại mẫu bằng nƣớc cất vô trùng đã chuẩn bị sẵn
khoảng 3 lần. Sau đó, tiến hành khử trùng bằng cách lắc với dung dịch HgCl2
0,1% trong thời gian khác nhau tƣơng ứng với 5 công thức thí nghiệm nhƣ
bảng 2.1. Lắc mạnh và đều tay đến khi hết các thời gian khử trùng tƣơng ứng
thì tráng sạch mẫu bằng nƣớc cất.
14


Mẫu sau khi khử trùng đƣợc cắt bỏ bớt những phần mô bị thâm do ngấm
dung dịch thủy ngân hoặc những phần mẫu quá già và cắt thành các đoạn (3 4 cm) có chứa ít nhất 2 mắt ngủ, sau đó cấy trên mơi trƣờng dinh dƣỡng cơ
bản MS, bổ sung 30 g/l sucrose; 6 g/l agar. Tiến hành ni các bình mẫu và
theo dõi thống kê các chỉ tiêu.
Các thí nghiệm đƣợc bố trí với 5 cơng thức và các thời gian khử trùng
khác nhau nhƣ bảng 2.1 dƣới đây.
Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm khử trùng vật liệu cây Râu mèo
CTTN

Thời gian khử trùng
Lần 1

Tỉ lệ mẫu
sạch (%)

Lần 2

CT1

5 phút

0 phút

CT2

7 phút

0 phút

CT3

9 phút

0 phút

CT4

4 phút

5 phút

CT5

5 phút

5 phút

Tỉ lệ mẫu nảy
chồi (%)

Mẫu sau khi cấy vào môi trƣờng nuôi cấy khởi đầu đƣợc đem đi nuôi
trong phịng ni mẫu, tiến hành theo dõi kiểm tra mẫu thƣờng xuyên để đảm
bảo độ ẩm và nhiệt độ phòng nuôi ổn định, cứu hoặc loại bỏ ngay những mẫu
bị nhiễm nấm hoặc khuẩn để tránh lây lan sang các mẫu còn lại.
2.5.2.2. Ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh chồi
Sau khi thu đƣợc chồi Râu mèo ở thí nghiệm 1, các chồi Râu mèo có
hình thái mập, xanh, tiến hành cắt đoạn chồi có chứa ít nhất 2 lá mầm cấy vào
các môi trƣờng nhân nhanh khác nhau.
Môi trƣờng nuôi cấy đƣợc sử dụng là môi trƣờng: MS + 30 g/l sucrose +
6 g/l agar + chất ĐHST đƣợc bố trí theo các cơng thức khác nhau về loại chất
và hàm lƣợng của mỗi loại nhƣ bảng 2.2 dƣới đây.

15


Bảng 2.2. Bố trí các thí nghiệm nhân nhanh chồi
Hệ số nhân
nhanh
NAA
(lần)

Chất ĐHST (mg/l)

CT
TN

BAP

Kinetin

RM1

0,3

0,3

0,1

RM2

0,5

0,3

0,1

RM3

0,7

0,3

0,1

RM4

0,3

0,3

-

RM5

0,3

-

0,1

RM6

0,5

0,3

-

RM7

0,5

-

0,1

RM8

0,7

0,3

-

RM9

0,7

-

0,1

ĐC

-

-

-

Tỉ lệ chồi
hữu hiệu
(%)

Đặc điểm
chồi

2.5.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ
Những chồi khỏe mạnh, xanh, mập có chiều dài từ 2 cm trở lên thu
đƣợc từ thí nghiệm 2 sẽ đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng tạo rễ MS + 20 g/l

sucrose + 6 g/l agar và bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng NAA với nồng độ
khác nhau đƣợc bố trí nhƣ bảng 2.3 dƣới đây.
Bảng 2.3. Bố trí các thí nghiệm ra rễ Râu mèo
CT
TN

NAA
(mg/l)

R0
R1
R2
R3
R4

0
0,1
0,3
0,5
0,7

Tỉ lệ chồi ra
rễ (%)

Số rễ trung
bình/ chồi
(rễ)

Chiều dài rễ
trung bình

(cm)

Chất
lƣợng rễ

2.5.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến khả năng sống
Các cây in vitro hoàn chỉnh đạt tiêu chuẩn sẽ đƣợc đƣa ra nhà lƣới để
huấn luyện cho dần thích nghi với điều kiện mơi trƣờng bên ngồi. Các cây
con đƣợc huấn luyện bằng cách để nguyên lắp bình, để trong cùng một chỗ
với điều kiện chiếu sáng nhƣ nhau và theo dõi trong suốt thời gian huấn
luyện. Các thí nghiệm đƣợc trình bày ở bảng 2.4.
16


Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm ảnh hƣởng của thời gian huấn luyện đến khả
năng sống
CTTN

Số ngày huấn
luyện (ngày)

T0
T1
T2
T3

0
5
7
10

Số cây
huấn
luyện
(cây)

Tỷ lệ số cây sống (%)
Sau khi
Ra bầu sau
huấn luyện
7 ngày

Đặc điểm
cây con

2.5.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần ruột bầu đến khả năng sống
và sinh trưởng
Sau khi huấn luyện, cây con đủ tiêu chuẩn sẽ đƣợc rửa sạch thạch và
trồng vào bầu đất hỗn hợp tại vƣờn ƣơm. Cây Râu mèo in vitro khi đƣợc
trồng ra vƣờn ƣơm ngoài tỉ lệ sống cao cũng cần có khả năng sinh trƣởng tốt.
Ở giai đoạn đầu khi đƣa cây ra trồng, thành phần ruột bầu có vai trị quan
trọng giúp cây có khả năng hấp thụ nƣớc và chất dinh dƣỡng tốt.
Thí nghiệm đƣợc tiến hành với các thành phần ruột bầu đƣợc bố trí nhƣ
bảng 2.5 dƣới đây. Trong đó, 2 thành phần đƣợc sử dụng là đất tầng B và trấu
hun với tỷ lệ phối trộn khác nhau ở mỗi cơng thức thí nghiệm. Các cây con
đƣợc chăm sóc với cùng điều kiện ánh sáng, lƣợng nƣớc tƣới cũng nhƣ chế độ
tƣới nƣớc.
Bảng 2.5. Ảnh hƣởng của thành phần ruột bầu đến khả năng sống
CT
TN

Thành phần ruột
bầu

RB1

100% Đất tầng B
25% trấu hun +
75% đất tầng B
50% trấu hun +
50% đất tầng B
75% trấu hun
+25% đất tầng B
100% trấu hun

RB2
RB3
RB4
RB5

Tỷ lệ
cây
sống
(%)

Số cây
thí
nghiệm

17

Độ vƣợt chiều
Chất
cao cây TB lƣợng cây
(cm)
con


Sau khi trồng 4 tuần, thống kê các chỉ tiêu để đánh giá tỷ lệ sống và sự
sinh trƣởng của cây con sau khi trồng ngoài vƣờn ƣơm.
2.5.3. Phương pháp thu thập và xử lí số liệu
2.5.3.1. Phương pháp thu thập số liệu
 Chỉ tiêu thu thập số liệu cho thí nghiệm tạo mẫu sạch:
- Tỷ lệ mẫu sạch (%) =

x 100

- Tỷ lệ mẫu bật chồi (%) =

x 100

 Chỉ tiêu thu thập số liệu cho thí nghiệm nhân nhanh chồi:
 Hệ số nhân nhanh (lần) =
 Tỷ lệ chồi hữu hiệu (%) =

x 100

 Đặc điểm chồi: màu sắc, kích thƣớc, to hay bé
 Chỉ tiêu thu thập số liệu cho thí nghiệm ra rễ:
 Tỷ lệ chồi ra rễ (%) =

x 100

 Số rễ trung bình =
 Chiều dài rễ trung bình =
 Đặc điểm của rễ: hình dạng, màu sắc,...
 Chỉ tiêu thu thập số liệu cho thí nghiệm huấn luyện cây con:
 Tỷ lệ cây sống (%) =

x 100

 Đặc điểm của cây: khỏe hay yếu, màu sắc lá, kích thƣớc,...
 Chỉ tiêu thu thập số liệu cho thí nghiệm ảnh hưởng của thành phần ruột
bầu:
 Tỷ lệ cây sống (%)
 Độ vƣợt (cm) = chiều cao cây sau – chiều cao cây khi trồng
 Số rễ TB/cây
 Chiều dài rễ TB (cm)
 Đặc điểm cây con: hình dạng, màu sắc
 Số liệu đƣợc thu thập bằng phƣơng pháp thống kê

18


2.5.3.2. Phương pháp xử lý số liệu
Xử lý số liệu thống kê bằng phần mềm Excel và SPSS.
So sánh giữa các cơng thức thí nghiệm bằng chỉ tiêu về tỉ lệ mẫu nảy
chồi, tỉ lệ mẫu sạch, tỷ lệ chồi ra rễ, tỷ lệ số cây sống bằng tiêu chuẩn khi bình
phƣơng (χ2).
Nếu Sig (xác suất của χ2) nhỏ hơn 0,05 thì các chỉ tiêu sinh trưởng có

sự sai khác giữa các cơng thức thí nghiệm.
Nếu Sig (xác suất của χ2) lớn hơn 0,05 thì các chỉ tiêu sinh trưởng
khơng có sự sai khác giữa các cơng thức thí nghiệm.
So sánh giữa các cơng thức thí nghiệm về Hệ số nhân nhanh (lần)
chồi, chiều dài rễ, số rễ TB/ cây bằng chỉ tiêu phân tích phƣơng sai một nhân
tố.
Nếu Sig (xác suất của H hoặc F) nhỏ hơn 0,05 thì các chỉ tiêu sinh
trưởng có sự sai khác giữa các cơng thức thí nghiệm.
Nếu Sig (xác suất của H hoặc F) lớn hơn 0,05 thì các chỉ tiêu sinh
trưởng khơng có sự sai khác giữa các cơng thức thí nghiệm.

19