Tách dòng gen mã hóa protein vỏ của virut gây bệnh vàng lùn ở lúa (RGSV) tại tỉnh ninh thuận

ĐẶT VẤN ĐỀ
Lúa gạo là một trong những cây lương thực cơ bản nhất phục vụ cho
con người. Đây là nguồn lương thực giàu dinh dưỡng chủ yếu trên thế giới,
đứng thứ ba sau ngơ và lúa mì về sản lượng, cung cấp trên 20% calories, 15%
protein, các chất khoáng - chất xơ cho con người. Chính bởi vậy gạo là nguồn
lương thực chủ yếu hiện nay trong bữa ăn của hàng tỷ người châu Á, châu
Phi, châu Mỹ latin, khu vực Trung đơng và trong tương lai nó vẫn là loại
lương thực hàng đầu.
Từ năm 1999 đến nay, năng suất lúa của Việt Nam hàng năm luôn đạt
mức trên 4000 kg/ha. Từ năm 1990 đến nay Việt Nam luôn đứng thứ năm trên
thế giới về sản lượng lúa (36 triệu tấn thóc/năm 2005) sau Trung Quốc (180
triệu tấn thóc/năm 2005), Ấn Độ (129 triệu tấn thóc/năm 2005), Indonesia (54
triệu tấn thóc/năm 2005) và Bangladesh (40 triệu tấn thóc/năm 2005) [6]. Tuy
nhiên trong thời gian từ năm 2006 – 2008, sản lượng lúa bị giảm sút nghiêm
trọng bởi các bệnh virus do rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal) lây truyền, đặc
biệt là bệnh vàng lùn xảy ra trong thời gian gần đây.
Bệnh vàng lùn do virus thuộc họ Tenuivirus gây ra, có tên gọi virus vàng
lùn (Rice Grassy Stunt Virus- RGSV) gây hại cho lúa qua môi giới truyền
bệnh là rầy nâu. Đầu vụ hè thu 2007, dịch bệnh lại phát triển trên diện rộng ở
các tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long và các tỉnh Nam Trung Bộ với mật độ
rầy nâu rất cao. Do ảnh hưởng của dịch bệnh vàng lùn, sản lượng gạo suất
khẩu năm 2007 đã giảm 1 triệu tấn so với năm 2006 [11], [4]. Tính đến tháng
9/2008, trên diện tích lúa Thu Đơng tại các tỉnh Đồng bằng Sơng Cửu Long,
tổng diện tích nhiễm rầy nâu là 25,198 ha và lúa bị nhiễm bệnh vàng lùn là
3.546,8 ha [2]. Rất nhiều thành tựu đã đạt được trong nghiên cứu các biện
pháp phòng chống rầy nâu - môi giới truyền bệnh vàng lùn gây hại ở lúa chủ
yếu như: nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh thái học của rầy nâu, các biện
pháp phòng trừ bằng thuốc hoá học, sinh vật học, áp dụng các biện pháp kỹ

1

thuật canh tác mới, sử dụng các giống kháng… Tuy nhiên, hiệu quả của các
phương pháp này vẫn chưa cao.
Hiện nay dịch bệnh vàng lùn đang gây hại nặng nề về sản lượng lúa gạo
cho các tỉnh Nam Trung Bộ đặc biệt là tại tỉnh Ninh Thuận. Thông tin về việc
phân loại cũng như cấu trúc phân tử của các chủng virus gây bệnh vàng lùn
cịn đang rất thiếu. Chính vì vậy, cơng tác thu thập các mẫu lúa nhiễm bệnh
vàng lùn và lùn xoắn lá tại các địa phương nằm trong danh sách cơng bố nghi
có dịch để tách dịng và giải mã trình tự gen của RGSV là hết sức cần thiết.
Nhằm đánh giá tính đa dạng di truyền của virus gây bệnh tại các địa phương
khác nhau, từ đó xây dựng chiến lược cho việc phịng trừ loại virus này.
Với những lý do trên, trong thời gian thực tập tốt nghiệp, dưới sự hướng
dẫn khoa học của các chuyên gia tại Viện Công nghệ Sinh học – Viện Khoa
học và Công nghệ Việt Nam, tôi đã thực hiện đề tài: “Tách dòng gen quy
định protein vỏ của virus gây bệnh vàng lùn ở lúa (RGSV) tại tỉnh Ninh
Thuận”.

2


Chƣơng 1
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Tình hình dịch bệnh vàng lùn gây hại lúa trên thế giới và ở Việt Nam
1.1.1. Thế giới
Từ thập kỷ 70 của thế kỷ XX trở lại đây, rầy nâu (Nilaparvata lugens
Stal) đã nổi lên như một vấn đề thời sự trong nghề trồng lúa ở châu Á. Nhiều
trận dịch đã xảy ra trên quy mô rộng lớn chưa từng thấy ở nhiều nước như Ấn
Độ, Indonesia, Triều Tiên, Nhật Bản, Philippin, Đài Loan… gây tổn thất nặng
nề về kinh tế. Rầy nâu phá hoại sẽ làm giảm một phần hoặc toàn bộ sản lượng
lúa. Rầy nâu cịn là mơi giới truyền bệnh virus nguy hiểm cho cây lúa như

bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá, bệnh héo lùn cây lúa ở các Quốc gia châu Á.
Theo thống kê của Dyck và Thomas (1979) thiệt hại do rầy nâu và bệnh
vàng lùn ở châu Á trong năm 1966-1975 lên tới hơn 300 triệu đôla. Trong
thực tế, tác hại này còn lớn hơn. Tại hội nghị quốc tế về rầy nâu họp ở Viện
nghiên cứu lúa quốc tế (IRRI), Philippin tháng 5 năm 1977 và tại Việt Nam
tháng 4 năm 2006, rầy nâu được coi là: “mối đe dọa thường xuyên đối với sản
xuất lúa ở châu Á”.
1.1.2. Việt Nam
Ở nước ta, dịch rầy nâu và các bệnh virus hại lúa (vàng lùn, lùn xoắn lá)
đang gây thiệt hại nghiêm trọng trên hầu hết các vùng lúa trọng điểm cả nước.
Hiện trạng này không chỉ ảnh hưởng đến xuất khẩu lúa gạo mà cịn có nguy
cơ ảnh hưởng đến an ninh lương thực ở trong nước cũng như ở các Quốc gia
khác. Theo báo cáo kết quả 01 năm thực hiện cơng tác phịng chống bệnh dịch
rầy nâu, bệnh vàng lùn trên lúa ở các tỉnh, thành phố Nam Bộ tổng diện tích
bị nhiễm rầy nâu trong tồn vùng năm 2006 và vụ Đơng Xn năm 20062007 là 731.092 ha (chiếm 12,61% diện tích gieo sạ), trong đó diện tích
nhiễm nặng là 67.238 ha. Tổng diện tích nhiễm bệnh vàng lùn của năm 2006
và vụ đơng xn 2007 trong tồn vùng là 237.466 ha (chiếm 4,09% diện tích
gieo sạ), trong đó có 118.021 ha nhiễm nặng.
3


Năm 2008, dịch rầy nâu và các bệnh virus hại lúa tuy đã giảm so với
năm trước nhưng vẫn đang ở mức báo động. Lúa Hè Thu ở khu vực ĐBSCL,
diện tích bị nhiễm rầy nâu: 76.795 ha, trong đó có 4.298 ha bị nhiễm nặng.
Diện tích bị nhiễm rầy nâu tập trung ở các tỉnh Cần Thơ, Bạc Liêu, Tiền
Giang, Vĩnh Long, Sóc Trăng, Đồng Tháp, Trà Vinh. Lúa Thu Đơng diện tích
bị nhiễm rầy nâu lên đến 774 ha, phần lớn diện tích bị nhiễm rầy nâu ở mức
độ nhẹ. Diện tích bị nhiễm vàng lùn xoắn lá trong vụ Hè Thu là 206 ha, tập
trung trên lúa hè thu giai đoạn địng trổ, trong đó diện tích nhiễm nhẹ là 55 ha
(tỷ lệ bệnh từ 5-10%), nhiễm trung bình là 13 ha (tỷ lệ bệnh 10-20%), nhiễm

nặng là 138 ha (tỷ lệ bệnh 20-50%). Diện tích bị nhiễm bệnh vàng lùn xoắn lá
trong vụ Thu Đông là 9.534,4 ha, diện tích tăng chủ yếu tại An Giang và Vĩnh
Long. Diện tích bị nhiễm nặng 3.867,2 ha với tỷ lệ bệnh 20-80%, diện tích bị
nhiễm trung bình 2.767,3 ha với tỷ lệ bệnh 10-20%, diện tích bị nhiễm bệnh
nhẹ: 2.889,9 với tỷ lệ bệnh 3-10%, ở huyện Lấp Vò, tỉnh Đồng Tháp bị nhiễm
17 ha với tỷ lệ bệnh phổ biến từ 5-10%, nơi cao tới 50%.Tính đến tháng
9/2008, trên lúa Thu Đông tại các tỉnh Đồng Bằng Sơng Cửu Long tổng diện
tích nhiễm rầy nâu là 25.198 ha và lúa bị nhiễm bệnh vàng lùn là 3.546,8 ha.

4


Hình 1.1. Lúa bị nhiễm bệnh vàng lùn tại tỉnh Ninh Thuận
1.2. Đặc điểm của virus gây bệnh vàng lùn ở lúa
1.2.1. Đặc điểm hình thái và cấu trúc
Virus vàng lùn lúa cỏ (Rice grassy stunt virus-RGSV) gây hại cho cây
lúa (Oryza sativa L.) ở vùng Nam và Đông Nam châu Á [25]. Virus được phát
tán vòng tròn từ cây này sang cây khác thông qua trung gian rầy nâu
Nilaparvata lugens Stal [25], không truyền qua trứng rầy. RGSV được xếp
vào giống Tenuivirus. Bên cạnh RGSV, giống Tenuivirus còn bao gồm
RRSV, RTSV, RSV, RHBV, MStV, EHBV và UHBV. Tuy nhiên có sự khác
biệt lớn về cấu tạo genome của RGSV so với các virus khác trong giống
Tenuivirus. Đặc điểm chung của RGSV với các lồi khác trong giống
Tenuivirus: Virus có cấu tạo dạng sợi xoắn rộng 6-8 nm và dài 200-2400 nm;
genome là các sợi RNA âm, lưỡng tính (nghĩa là tổng hợp các protein khác
nhau từ sợi RNA âm lẫn sợi RNA dương, hai đầu 5’ của RNA âm và dương
đều chứa đoạn ORF); Đầu 3’ và 5’ của mỗi sợi RNA bổ trợ cho nhau, nên có
khả năng tạo cấu trúc dạng vịng. Trình tự đoạn bổ trợ này tương đối ổn định.

5

Hình1. 2. RGSV nhuộm với uranul acetate (thanh đơn vị : 100nm)
Đặc điểm riêng của RGSV: RGSV trong cây lúa nhiễm bệnh ở
Philippin đã được phân lập và công bố trên NCBI. Độ lớn của bộ gen của
virus RGSV là 25142 nucleotide. Bộ gen của RGSV chứa 6 sợi RNA, trong
khi đó RSV và RHBV chứa 4 sợi RNA, MStV chứa 5 sợi RNA. Mỗi sợi đều
có 17 nucleotide đầu 3’ và 5’ bổ sung với nhau, đoạn 17 nucleotide này ở cả 6
sợi RNA đều giống nhau, ngoại trừ vị trí thứ 15 ở RNA1. Sợi RNA1 dài 9760
nucleotid. Sợi âm RNA1 mã hóa protein 18,9 kDa, sợi dương RNA1 mã hóa
protein 339,1 kDa, protein 339,1 kDa có độ lớn tương tự RNA polymerase
protein mã hóa bởi RNA1 của RSV (37,9%) và phlebovirus (thuộc họ
Bunyaviridea) (36%). Nếu có đột biến dịch chuyển khung đọc -1 sợi âm
RNA1 mã hóa protein 18,2 kDa. Sợi RNA2 dài 4056 nucleotide. Sợi âm
RNA2 mã hóa protein 23,3 kDa, sợi dương RNA2 mã hóa protein 93,9 kDa.
Sợi RNA3 dài 3123 nucleotide. Sợi âm RNA3 mã hóa protein 22,9 kDa, sợi
dương RNA3 mã hóa protein 30,9 kDa. Sợi RNA4 dài 2915 nucleotide. Sợi
âm RNA4 mã hóa protein 19,4 kDa, sợi dương RNA4 mã hóa protein 60,4
kDa. Sợi RNA5 dài 2704 nucleotide. Sợi âm RNA5 mã hóa protein 21,6 kDa,
sợi dương RNA5 mã hóa protein 35,9 kDa, cũng chính là protein vỏ. Sợi

6


RNA6 dài 2584 nucleotide. Sợi âm RNA6 mã hóa protein 20,6 kDa, sợi
dương RNA6 mã hóa protein 36,4 kDa.
Khi so sánh bộ gen của RGSV với các loài virus khác trong họ
Tenuivirus thì nhận thấy RNA5 và RNA6 của RGSV tương tự RNA3 và
RNA4 của các loài virus khác trong họ Tenuivirus. RNA1 và RNA2 của
RGSV tương tự RNA1 và RNA2 của các lồi virus khác trong họ Tenuivirus

Hình1. 3. Sơ đồ cấu tạo bộ gen của RGSV.
Có 2 dịng RGSV. Dịng 1: có 3 dạng phân lập ở Đài Loan: “héo lùn”
gây lùn cây, vàng lá và thường chết cây; lùn lúa cỏ kiểu B: cây đẻ nhánh, lá
hẹp, ngắn và màu nhạt; lùn lúa cỏ kiểu Y: ít lùn và ít đẻ nhánh hơn, chiều
rộng bình thường, màu lá nhạt hoặc bình thường; Dịng 2: Xuất hiện ở
Philippin, bên cạnh các triệu chứng của virus thông thường gây vàng lá lúa và
chết cây thì dịng này gây bệnh trên cả cây lúa có gen kháng có nguồn gốc từ
lúa N. nivara.
7


1.2.2. Ký chủ và truyền bệnh
a) Dấu hiệu cây bệnh
Triệu chứng ban đầu chưa thấy rõ giữa cây bệnh và cây lúa bình
thường. Bụi lúa bệnh chỉ hơi ngả màu xanh nhạt, đơi khi có những lá màu
vàng đến cam. Thời gian sau cây lúa bệnh có vẻ kém phát triển hơn (lúc này
rất dễ nhầm lẫn với hiện tượng kém dinh dưỡng nên nơng dân thường bón
thêm phân đạm). Nhìn tồn cảnh thấy lúa hồi xanh khơng đều sau khi cấy, lá
hẹp và dựng đứng, lá có màu vàng, mềm và hơi rũ hoặc lá có màu xanh đậm
có thể có nhiều đốm màu rỉ sắt. Thời kỳ đẻ nhánh, bụi lúa bệnh đẻ quá nhiều
nhánh, bụi lúa to hơn, vẫn có chiều cao tương đương với các bụi khác, chưa
khác biệt lắm. Càng về sau nhìn tồn cảnh thấy lúa phát triển không đều do
bụi lúa bị bệnh không phát triển chiều cao, cuối cùng các bụi lúa bệnh sẽ khơ
và lụi dần như cháy rầy từng chịm ( có khác là có khi cịn chen những nhánh
lúa cịn xanh trong 1 bụi lúa do bị nhiễm khơng đều ở ruộng mạ). Khi trỗ
thường khơng có gié hoặc gié có hạt lép [12].
b) Tác nhân
Bệnh vàng lùn do virus RGSV gây ra qua môi giới truyền bệnh là rầy
nâu Nilaparvata lugens Stal. RGSV không được truyền qua hạt của cây lúa

bệnh hoặc qua phấn hoa. Virus cũng không được truyền qua bằng cách tiếp
xúc giữa cây lúa khỏe mạnh với cây lúa bệnh, không lây qua nguồn nước hay
khơng khí .Virus được truyền dạng bền vững qua các tuổi của rầy và nhân mật
số trong rầy ký chủ, nhưng không được truyền qua trứng rầy. Lúa nhiễm bệnh
giảm năng suất trên những giống mẫn cảm và khi mật độ rầy trên ruộng cao
[25].
Rầy nâu truyền virus gây bệnh từ cây này sang cây khác, từ ruộng này
sang ruộng khác. Rầy nâu dùng vịi chích hút nhựa cây làm cho cây lúa bị khơ
héo. Khi rầy nâu chích vào thân, lá lúa để lại chỗ chích một vệt nâu cứng, cản
trở sự luân chuyển nước và chất dinh dưỡng làm thân, lá bị khô héo. Mật độ
rầy cao gây ra hiện tượng cháy rầy. Rầy có khả năng truyền bệnh trong suốt
8


q trình sống của nó sau khi tiếp nhận mầm bệnh khoảng 1 giờ. Khả năng
nhiễm bệnh tăng nếu kéo dài thời gian rầy hút nhựa cây lúa mang bệnh [20].
Khi lúa bị nhiễm virus có nhiều bó sợi được quan sát trong nhân và tế
bào chất hoặc trong các thể có màng bao bọc hiện diện ở phần tế bào chất của
các tế bào diệp lục. Quần thể mật số cao của rầy nâu và rầy xanh làm vector
truyền bệnh nhanh chóng và gây thiệt hại kép (vừa thiệt hại do rầy vừa thiệt
hại do bệnh) là rất nghiêm trọng. Đồng thời, sự thâm canh, canh tác nhiều vụ
liên tục là môi trường lây lan rất thuận lợi cho bệnh nguy hiểm này. Ngoài ra
giống lúa nhiễm rầy là điều kiện thuận lợi cho bệnh phát triển trên diện rộng
[12].
1.3. Các biện pháp phòng trừ
1.3.1. Biện pháp truyền thống
Sự phát triển và lây truyền bệnh virus tùy thuộc vào số lượng cây mang
nguồn bệnh, số lượng và sự hoạt động của côn trùng truyền bệnh, sự mẫn cảm
của giống lúa với virus, với côn trùng truyền bệnh và thời tiết. Trước hết phải
thực hiện canh tác lúa theo tinh thần 3 G, 3 T, trong đó khơng bón thừa N,

giảm mật độ sạ cấy, giảm sử dụng thuốc hóa học nhằm tạo thế cân bằng sinh
học trên diện rộng, bón phân cân đối tạo sức đề kháng cho cây lúa, sạ cấy
thưa tạo điều kiện cho ánh sáng xuyên qua tán, sương mù sẽ tan nhanh trên lá,
do nhiệt độ tăng, ẩm độ giảm trong tán tạo thế bất lợi cho sâu bệnh phát triển.
Nên thăm đồng thường xuyên để phát hiện rầy thật sớm. Ngăn chặn
bệnh suốt thời kỳ đầu của giai đoạn sinh trưởng (giai đoạn mạ đến đẻ nhánh),
bằng cách nhổ bỏ những cây lúa bị bệnh, cỏ dại trong ruộng, trên bờ, xung
quanh ruộng, vì rầy nâu có thể tiếp tục chích hút cây lúa bị bệnh và mang
virus phát tán đi nơi khác, cây lúa bị bệnh còn tồn tại trên ruộng sẽ là mầm
mống chứa virus, cày ải phơi đất sẽ diệt mầm virus trong gốc rạ. Ở những
vùng vừa có dịch bệnh virus xảy ra: cày lật gốc rạ ngay sau khi thu hoạch.
Gieo sạ đồng loạt trên diện rộng, nhằm hạn chế di chuyển của quần thể rầy,
do chuyển tiếp nguồn thức ăn cho nên rầy mang virus lây lan ra diện rộng, do
9


vậy khơng nên gieo trồng rải rác có liên quan đến vụ 3, chỉ nên tập trung 2 vụ
(cách nhau tối thiểu 30 ngày). Dịch bệnh vàng lùn có liên quan mật thiết đến
thời vụ gieo sạ liên tục trên ruộng, cả không gian và thời gian đều tối hảo để
dịch bệnh phát tán.Tăng cường sức đề kháng của lúa đối với virus, sử dụng
một số chất kích kháng có thể hạn chế sự phát triển của virus trong cây lúa
như K2HPO4, CuCl2 cho xử lý hạt, Humid acid (Risopla V) 1-1,5 kg/ha, bón
lót thì càng tốt. Khi phát hiện có rầy nâu cánh dài ở giai đoạn mạ với mật độ
từ 7-10 con/tép thì phải phun thuốc trừ rầy ngay vì đây là rầy mới di chuyển
đến và khả năng rầy mang mầm bệnh là rất cao. Có thể dùng các loại thuốc
trừ rầy nâu như Actara, Applaud, Butyl… Tuy sử dụng thuốc hóa học có thể
làm giảm mật số rầy nhưng vẫn không thể giải quyết được bệnh vàng lùn, vì
sự truyền bệnh có thể xảy ra giữa rầy và cây lúa trong khoảng thời gian rất
ngắn.
Nên dùng giống kháng rầy, lúa giống có chất lượng tốt vì giống kháng

là biện pháp có hiệu quả kinh tế nhất. Tuy nhiên, giống kháng đối với rầy nâu
chưa hẳn là kháng đối với virus, hơn nữa bệnh vàng lùn là sự phối hợp của 3
loại virus (RGSV, RRSV, RTSV), do vậy công tác thanh lọc giống kháng là
khá phức tạp, cần có sự hổ trợ về kinh phí để thực hiện các nghiên cứu này.
Trong cơ cấu giống lúa đang trồng phổ biến ở ĐBSCL (63 giống- kết quả
điều tra của Viện Lúa ĐBSCL 2005), một số ít giống lúa tỏ ra chống chịu tốt
rầy nâu và bệnh vàng lùn, có thể kể đến OM4498, OM4495, AS996,
OM2395. Ngồi ra, một số giống khác với diện tích nhỏ trong sản xuất như
OM576, IR50404, IR59606, MTL141, MTL392, MTL384 cũng tỏ ra chống
chịu tốt. Một số giống lúa mới trong sản xuất thử tỏ ra chống chịu tốt với rầy
nâu và bệnh vàng lùn là OM5930, MTL384, MTL392, MTL466, MTL499,
MTL500 [11].

10


1.3.2. Biện pháp sinh học
Từ năm 2003 đến nay tại Sóc Trăng đã áp dụng chế phẩm sinh học trên
đồng ruộng, và đã cho kết quả khả quan, chế phẩm sinh học dựa trên nuôi cấy
các loại nấm kháng rầy trong tự nhiên, rồi đưa loại nấm này ra đồng ruộng,
rầy nâu gặp nấm sẽ mang bệnh rồi truyền bệnh sang rầy khác, bằng phương
pháp này có thể diệt trừ rầy nâu một cách hiệu quả mà không gây ảnh hưởng
đến sức khỏe con người. Tuy nhiên hiện nay phương pháp này cũng gặp nhiều
hạn chế: hạn chế về mặt qui mơ (mỗi lần áp dụng chỉ trên diện tích vài chục
ha đất), hạn chế về công nghệ chế biến, mưa sau khi phun sẽ làm trôi thuốc,
phun thuốc phải trúng rầy, mưa nhiều, nắng nhiều cũng làm ảnh hưởng tới
chất lượng chế phẩm và hạn chế về mặt thời gian (rầy nâu không bị tiêu diệt
ngay sau khi phun thuốc).
1.3.3. Biện pháp sinh học phân tử
1. Nghiên cứu genome virus gây bệnh vàng lùn ở các vùng dịch trong

nước. Thu thập mẫu, nhân dịng, giải mã trình tự gen và so sánh với tư
liệu trên ngân hàng gen quốc tế.
2. Xác định các gen mã hóa protein vỏ và thiết kế các vector chuyển gen.
3. Xác định khả năng kháng rầy của gen GNA (snowdrop lectin –
Galanthus niavilis agglutinin).
4. Xây dựng qui trình chuyển gen vào cây lúa
5. Chuyển gen GNA và gen CP của RGSV vào cây lúa
6. Kiểm tra khả năng kháng virus của các dòng cây chuyển gen.
1.4. Ứng dụng Sinh học phân tử trong nghiên cứu bệnh virus
1.4.1. Kỹ thuật phân tích axit ribonucleic (RNA)
a) Tách chiết RNA tổng số ở thực vật
Ngoài màng tế bào thực vật cịn có lớp thành cenllulose vững chắc. Mặt
khác, các phân tử RNA không bền dễ bị phân hủy bởi các enzyme
ribonuclease (Rnase). Hơn nữa, các Rnase lại có mặt ở khắp nơi (có rất nhiều
trên đầu ngón tay của người thao tác, …) có hoạt tính rất cao và rất bền vững
11


với các tác nhân thường dùng để loại bỏ enzyme (việc xử lý nhiệt độ 90ºC
trong 1 giờ không làm mất hoạt tính của Rnase). Vì những lý do đó việc tách
chiết RNA đòi hỏi nhiều biện pháp thận trọng để tránh mọi tạp nhiễm bởi các
Rnase từ môi trường, thao tác trong điều kiện vô trùng, mọi dụng cụ, hóa chất
đều được khử trùng bằng nhiệt hay hóa chất, tránh mọi tiếp xúc với dụng cụ
bằng tay trần. Chính vì vậy việc tách chiết RNA từ tế thực vật gặp phải những
khó khăn phức tạp nhất định. Cho đến nay có nhiều phương pháp tách chiết,
tinh sạch RNA khác nhau từ nhiều đối tượng thực vật. Nhưng có thể tách
chiết RNA tổng số từ thực vật theo nguyên tắc
1. Nghiền các mô, mẫu tế bào thực vật bằng biện pháp cơ học: Nghiền
mô trong đá khô, nitơ lỏng bằng cối chày sứ để phá vỡ thành tế bào
cenllulose, giải phóng các thành phần bên trong tế bào.

2. Sử dụng đệm có chất tẩy để phá vỡ màng tế bào, giải phóng DNA,
RNA.
3. Sử dụng hóa chất để bảo vệ DNA, RNA khỏi sự phân hủy của các
nuclease nội bào.
4. Sử dụng các hóa chất như chlorofrom, isoamyl alcohol, phenol… để
loại protein và các tạp chất ra khỏi DNA, RNA.
5. Dịch chiết sau khi làm sạch protein được ủ với enzyme DNAase để
phân hủy DNA.
6. Gây kết tủa RNA bằng cồn ethylic, hoặc isopropanol để tách RNA
tổng số.
b) Phản ứng RT-PCR
Phản ứng này nhằm nhân bản các cDNA từ mẫu ban đầu là RNA. Đầu
tiên, RNA tổng số hoặc mRNA được làm mẫu để tổng hợp các sợi đơn nhờ
enzym phiên mã ngược Reverse Transcriptase. Tiếp đến các cDNA này được
nhân bản trong phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Như vậy, chúng ta không
nhất thiết phải sàng lọc cDNA từ ngân hàng cũng thu được một phân tử
cDNA đặc hiệu cho một gen. Đối với một cặp mồi đặc hiệu cho một gen, số
12


lượng sản phẩm RT-PCR ứng với các mẫu RNA từ các loại tế bào khác nhau
cho phép so sánh mức độ phiên mã của gen đó. RT-PCR được xem là phản
ứng bán định lượng đối với mRNA.
c) Kỹ thuật điện di
Điện di DNA là một phương pháp đặc biệt quan trọng trong nghiên cứu
sinh học phân tử vì đây là phương pháp duy nhất để có thể quan sát được
DNA bằng mắt thường. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương
pháp điện di trên gel Agarose để xác định chất lượng của DNA. Sản phẩm
DNA được điện di trên Agarose tạo thành các giải băng khác nhau. DNA
mang điện tích âm sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương. Tốc độ di chuyển

phụ thuộc vào kích thước phân tử, dạng cấu trúc phân tử DNA, nồng độ
Agarose, điện thế, nhiệt độ và thành phần chất điện di. Dựa vào kích thước
từng đoạn gen được nghiên cứu và khả năng phân tách của gel Agarose sẽ
chọn nồng độ thích hợp nhất nhằm mục đích xác định khoảng kích thước các
băng khi điện di cùng thang DNA chuẩn.
1.4.2. Kỹ thuật DNA tái tổ hợp
a) Khái niệm về DNA tái tổ hợp
DNA tái tổ hợp là DNA được tạo ra từ hai hay nhiều nguồn vật liệu
khác nhau. Phân tử DNA tái tổ hợp được tạo ra nhờ kỹ thuật ghép nối các
đoạn DNA của các cá thể khác nhau trong cùng một loài, hoặc của các loài
khác nhau.
Kỹ thuật tái tổ hợp DNA được thực hiện qua nhiều công đoạn phức tạp,
tinh vi nhưng thực chất gồm các bước chủ yếu sau đây:
1. Nuôi tế bào cho plasmid để tạo vector chuyển gen và nuôi tế bào cho
để cung cấp DNA.
2. Tách chiết DNA plasmid và DNA tế bào cho. Bước này còn được gọi
là phân lập gen.

13


3. Cắt cả hai đoạn DNA (DNA plasmid và DNA tế bào cho) bằng cùng
một loại enzym giới hạn (restriction enzyme - RE). Ví dụ, sử dụng
enzym giới hạn Endonuclease EcoRI tạo ra đầu so le.
4. Trộn chung DNA plasmid đã bị cắt với DNA tế bào cho cũng đã bị cắt
bởi một enzym giới hạn như đã nêu ở trên.
5. Bổ sung enzym nối ligase để tạo ra DNA tái tổ hợp hoàn chỉnh.
6. Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ (vi khuẩn E.coli) và nhân
dòng.
7. Chọn lọc và tạo dòng tế bào vật chủ (vi khuẩn) mang DNA tái tổ hợp

và theo hoạt động biểu hiện của gen thông qua sản phẩm của gen lấy
từ tế bào cho.
b) Các enzym chủ yếu dùng trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp
 Enzym giới hạn (restriction endonuclease –RE)
Có khả năng nhận biết và phân cắt DNA tại một vị trí có các nucleotide
sắp xếp theo một trật tự. Tùy thuộc vào khoảng cách giữa vị trí nhận biết và vị
trí cắt để phân biệt enzym giới hạn thành các loại khác nhau. Các enzym nhận
biết và cắt ngay tại một vị trí được xếp vào loại II. Đây là những enzym được
sử dụng nhiều trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp.
Enzym giới hạn nhận biết và cắt trình tự đặc hiệu gồm bốn đến tám
nucleotide. Đặc điểm của các trình tự này là đối xứng, tức là trình tự
nucleotide tại vị trí cắt trên hai sợi đơn đều giống nhau theo cùng một chiều
(5'→3' hoặc 3'→5'). Enzym có thể cắt hai sợi đơn DNA tại cùng một điểm tạo
ra hai đầu bằng. Những enzym đó được gọi là enzym cắt đầu bằng. Bên cạnh
đó, tại vị trí nhận biết, enzym giới hạn có thể cắt hai sợi đơn DNA lệch nhau
vài nucleotide tạo ra hai đầu có các sợi so le nhau. Những enzym này được
gọi là enzym cắt đầu so le. Enzym tạo đầu so le rất thông dụng trong kỹ thuật
DNA tái tổ hợp do DNA ligase nối các đoạn DNA đầu so le với hiệu suất cao
hơn rất nhiều so với các đoạn đầu bằng [18].

14


 Enzym nối (Ligase)
Enzym nối Ligase là enzym nối quan trọng trong tế bào. Các enzym
này xúc tác hình thành các liên kết photphodieste để nối các đoạn axit nucleic
với nhau. DNA ligase xúc tác nối hai đoạn DNA với nhau, RNA ligase xúc
tác nối các đoạn RNA với nhau. Trong công nghệ DNA tái tổ hợp, DNA
ligase là enzym chủ yếu được sử dụng rộng rãi. Có một số loại enzym nối
khác nhau, nhưng enzym T4 DNA ligase kết hợp với hai loại enzym T4

polynucleotide kinase và alkaline phosphatase được sử dụng rộng rãi nhất
trong các thí nghiệm về cơng nghệ di truyền [18].
Có ba loại enzym nối thường được dùng trong Công nghệ di truyền.
Enzym E.coli DNA ligase được tách chiết từ vi khuẩn E.coli, xúc tác cho
phản ứng nối hai đoạn trình tự DNA có đầu so le. Enzym T4 DNA ligase được
tách chiết từ phage T4 xâm nhiễm vào E.coli có chức năng giống như E.coli
DNA ligase nhưng lại có khả năng nối hai đoạn trình tự DNA có đầu bằng và
là enzym nối được ưa chuộng nhất hiện nay. Enzym T4 RNA ligase tách chiết
từ phage T4 xâm nhiễm E.coli, có khả năng nối hai trình tự RNA bằng các liên
kết phosphodiester [7].
 Enzym polymerase
Các enzym polymerase xúc tác cho quá trình sao chép các axit nucleic
(DNA, hoặc RNA) được sử dụng nhiều trong Công nghệ di truyền. Các
enzym này tổng hợp axit nucleotide theo nguyên tắc bổ sung với nhau dựa
theo mạch khuôn. Quá trình tổng hợp mạch mới bổ sung diễn ra theo chiều từ
5'→3'. Gồm hai nhóm:
- Các DNA polymerase
Enzym DNA polymerase I (pol I) là enzym DNA polymerase I xúc tác
cho việc lấp đầy chỗ trống trên phân tử DNA, hoặc mạch đơn của DNA ngắn.
Enzym DNA polymerase I xúc tác tổng hợp mạch đơn mới đồng thời có vai
trị trong việc sửa chữa các sai sót trong q trình sao chép DNA. Ngoài chức
năng tổng hợp, enzym DNA polymerase I cịn có hoạt tính exonuclease, có
15


nghĩa là nó có khả năng thủy phân liên kết giữa các nucleotit từ hai đầu của
phân tử DNA, cắt rời từng nucleotit theo cả hai chiều 5'→3' và 3'→5'. Trong
nhiều trường hợp, enzym DNA polymerase I được sử dụng trong kỹ thuật
xác định trình tự DNA bằng phương pháp dideoxy, tổng hợp mẫu dị có đánh
dấu phóng xạ, hoặc thiết kế các vector mạch đơn.

Trong thực tế enzym DNA polymerase I ít được sử dụng mà người ta
sử dụng một sản phẩm thủy phân của nó được gọi là đoạn Klenow. Đoạn này
vẫn giữ được hoạt tính của polymerase và exonuclease 5'→3'. Đoạn Klenow
được sử dụng khi cần sao chép một phân tử DNA mạch đơn vì chức năng
exonuclease bị thiếu khả năng cắt đầu 3'→5' nên enzym này khơng thể thủy
phân mạch đơn làm khn trong q trình tổng hợp DNA mới.
Enzym T4 DNA polymerase có nguồn gốc từ thể thực khuẩn T4 (phage
T4) xâm nhiễm vào vi khuẩn E.coli. Hoạt tính của enzym T4 DNA polymerase
tương tự đoạn Klenow. Do nó có hoạt tính exonuclease 3'→5' mạnh nên
thường được sử dụng để tổng hợp mẫu dị có độ phóng xạ cao.
Enzym Taq polymerase được tách chiết xuất từ vi khuẩn chịu nhiệt
Thermophilus acquaticus. Enzyme Taq polymerase thường được sử dụng
trong việc nhân gen trong kỹ thuật chuỗi trùng hợp (kỹ thuật PCR). Enzym
Taq có khả năng tăng cường sự bắt cặp tạo DNA bổ trợ (cDNA) nhưng không
hoạt động trên các phân tử RNA.
Enzym phiên mã ngược (Reverse transcriptase). Enzym này có khả
năng tổng hợp DNA một mạch gọi là DNA bổ trợ (cDNA) từ khuân mRNA,
hoặc từ một đoạn polynucleotide được tổng hợp bằng con đường hóa học.
Nhờ có enzym phiên mã ngược này mà có thể tổng hợp được hầu hết các gen
riêng biệt nào đó nếu như có mặt mRNA của gen đó. Các cDNA mạch đơn
có thể biến thành DNA mạch kép nhờ DNA polymerase và được gọi là cDNA
mạch kép. Đoạn cDNA mạch kép có thể gắn vào plasmid rồi biến nạp vào vi
khuẩn, từ đó tạo dịng cDNA. Nếu cDNA có nguồn gốc từ một gen thì ta tạo
được dịng gen. Trong trường hợp mRNA trưởng thành khi đã ở ngoài nhân
16


thì ta sẽ thu được dịng gen chỉ chứa những đoạn mã hóa (exon). Khơng có
đoạn mã hóa (intron) [18].
- Các enzym RNA polymerase

Có ba loại enzym RNA polymerase thường được dùng trong thực tế, đó
là SP6 RNA polymerase, T3 RNA polymerase và T7 RNA polymerase. Các
enzym này xúc tác quá trình phiên mã tổng hợp RNA từ mạch khuân của
phân tử DNA theo chiều từ 5'→3' (mạch khn có chiều 3'→5'). Trên thực tế
RNA polymerase được ứng dụng trong tổng hợp mẫu dò RNA và trong việc
nghiên cứu quá trình phiên mã tổng hợp mRNA [7].
c) Vector sử dụng trong kỹ thuật tách dịng
Để có thể lưu trữ và nhân bản một đoạn DNA (hoặc một gen) đến một
số lượng mong muốn, một trong các phương pháp thông dụng là gắn đoạn
DNA đó vào vector. Saou đó vector được đưa vào té bào nhận. Sử dụng bộ
máy tái bản DNA của tế bào nhận, vector được tái bản tạo ra số lượng lớn các
bản sao giống hệt vector ban đầu. Với những nhiệm vụ như vậy, vector cần
phải có các đặc tính cơ bản sau: Có vị trí để ghép nối đoạn DNA lạ vào (vị trí
đa điểm tách dịng-polycloning site). Đây là những vị trí duy nhất trên vector.
Có tâm sao chép (origin of replication - ori) được nhận biết bởi bộ máy tái
bản DNA của tế bào nhận, cho phép vector tái bản một cách tích cực trong tế
bào nhận. Có gen chỉ thị (marker gene) giúp cho việc phân biệt tế bào nhận
vector mang DNA lạ với các tế bào khác. Gen chỉ thị thường là gen quy định
khả năng chống chịu kháng sinh.
Tùy thuộc vào kích thước các đoạn DNA cần lưu giữ mà chọn các
vector khác nhau. Hầu hết các vector sử dụng hiện nay là các DNA tái tổ hợp.
Chúng được thiết kế nhằm đạt được hiệu suất sử dụng tối ưu nhất cho từng
mục đích nghiên cứu phổ biến nhất là các plasmide [18].
Plasmid
Plasmid là những phân tử DNA dạng vòng, tồn tại trong tế bào vi
khuẩn và nằm ngoài nhiễm sắc thể. Plasmid có kích thước thay đổi trong
17


khoảng 1kb đến vài trăm kb. Trong tự nhiên, các plasmid có thể tái bản đồng

thời với nhiễm sắc thể hoặc có khả năng tái bản độc lập. Các plasmid thường
mang những gen chống chịu kháng sinh, vì vậy những gen đó được sử dụng
như các chỉ thị (marker) để chọn lọc tế bào chứa plasmid.
Có nhiều loại plasmid được thiết kế có mang hai hay nhiều gen chỉ thị
và vị trí đa điểm tách dịng gồm nhiều gen chỉ thị và vị trí đa điểm tách dịng
gồm nhiều vị trí nhận biết của các enzym giới hạn. Kích thước plasmid được
thiết kế sao cho không lớn giúp plasmid nhân bản rất nhanh trong tế bào nhận.
Đặc biệt vị trí đa điểm của plasmid thường được thiết kế nằm trong một gen
chỉ thị. Khi đoạn DNA xen vào một trong các điểm này, chúng gây bất hoạt
gen chỉ thị. Do đó, tế bào nhận plasmid gắn DNA lạ sẽ khơng tổng hợp được
sản phẩm của gen chỉ thị. Sự thiếu vắng sản phẩm của gen chỉ thị có thể liên
quan đến sự chuyển màu của mơi trường ni cấy. Vì thế dựa vào màu sắc
chúng ta có thể chọn được tế bào nhận plasmid gắn DNA lạ [7].

Hình1.4. Cấu tạo vector pBT (Phan Trọng Hoàng và cộng sự 2005)
18


Ví dụ, các plasmid pBT có vị trí đa điểm nằm trong trình tự của gen chỉ
thị mã hóa cho β-galactosidase. Khi pBT có gắn DNA lạ enzym khơng được
tổng hợp. Nếu chúng ta cho vào môi trường nuôi cấy cơ chất của enzym, cơ
chất khơng bị chuyển hóa nên tế bào nhận pBT gắn DNA lạ sẽ có màu trắng.
Ngược lại, những tế bào nhận pBT có gen chỉ thị nguyên vẹn, chúng sẽ có
màu xanh tạo ra do cơ chất bị chuyển hóa bởi β-galactosidase.
Q trình đưa plasmid vào vector được gọi là biến nạp. Tế bào có khả
năng tiếp nhận plasmid được gọi là tế bào khả biến [7].
d) Các loại tế bào chủ
Một loại tế bào vật chủ lý tưởng là tế bào cần phải dễ nuôi, dễ giữ và
nhân giống, lại chấp nhận được nhiều loại vector. Vi khuẩn E.coli đáp ứng
các yêu cầu của tế bào vật chủ lý tưởng và được sử dụng rộng rãi trong kỹ

thuật tạo và tách dòng gen. Do tính chất đặc biệt của tế bào lý tưởng nên
E.coli được nghiên cứu tỷ mỷ về cơ chế di truyền, phân lập và tạo nên nhiều
chủng khác nhau. Các nghiên cứu đó làm cơ sở cho kỹ thuật DNA tái tổ hợp
và Công nghệ di truyền.
E.coli là vi khuẩn gram âm, có hình que (dài khoảng 1µm), khơng gây
bệnh, thường gặp trong ruột người. E.coli có một nhiễm sắc thể (phân tử
DNA) dạng vịng nằm trong vùng nhân. Kích thước của các phân tử DNA này
khoảng 4×106 cặp bazơ. Các quá trình biểu hiện của gen như phiên mã, dịch
mã được xảy ra đồng thời. Sau khi mRNA được tổng hợp sẽ sử dụng ngay để
dịch mã mà không qua các bước sửa đổi sau phiên mã vì gen của chúng
khơng có các intron (đoạn khơng mã hóa). Do vậy, E.coli được coi là tế bào
chủ đơn giản nhất. Rất nhiều thí nghiệm tách dịng gen ở các phịng thí
nghiệm đang sử dụng E.coli làm tế bào chủ.
Tùy thuộc mục đích sử dụng mà chọn một loại tế bào vật chủ thích hợp
nhất. Ngồi tế bào chủ là nhân sơ như E.coli người ta còn sử dụng tế bào chủ
nhân chuẩn như: tế bào nấm men, tế bào thực vật và động vật [18].

19


e) Tạo, tách, và chọn lọc dòng DNA tái tổ hợp
Mục đích của việc tạo dịng là nhằm mục đích thu được một lượng lớn
bản sao của một trình tự DNA xác định. Chính xác hơn, tạo dịng chính là
chọn lọc trong một thư viện gen dòng vi khuẩn tái tổ hợp cần tìm – tức tập
hợp vi khuẩn cùng bắt nguồn từ một tế bào vi khuẩn ban đầu có mang vector
tái tổ hợp cần tìm. Các bước cơ bản của phương pháp tạo dòng.
Chọn và xử lý vector. Việc chọn lọc vector phụ thuộc vào nhiều yếu tố,
kích thước các đoạn DNA muốn tạo dịng, mục đích tạo dịng,…Trước hết,
vector được cắt ở một vị trí xác định bằng một enzym giới hạn. Sau đó, hai
đầu chỗ mối cắt được xử lý để chúng không thể nối trở lại, vector chỉ có thể

trở lại dạng vịng ban đầu khi hai chỗ mối cắt được nối với một trình tự DNA
lạ. Điều này nhằm tránh sự hình thành của các dịng vi khuẩn mang vector
khơng tái tổ hợp.
Xử lý DNA cần tạo dòng (insert). Trước hết cần chọn lọc sơ khởi các
đoạn DNA có kích thước gần nhau và tương ứng với loại vector đã chọn. Sau
đó, hai đầu của các DNA này cần được xử lí cho phù hợp với hai đầu chỗ mối
cắt của vector (bằng cách cắt bởi cùng một enzym giới hạn để tạo các đầu so
le tương hợp chẳng hạn,…).
Tạo vector tái tổ hợp. Vector và DNA cần tạo dòng đã được xử lý sẽ
được trộn chung theo một tỷ lệ nhất định với sự hiện diện của enzym ligase.
Ligase xúc tác cho phản ứng nối vector với insert tạo thành vector tái tổ hợp.
Vector tái tổ hợp sau đó sẽ được tinh sạch thông qua tách chiết và tủa.
Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ. Cơng đoạn này nhằm mục
đích sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vector tái tổ hợp thành một
số lượng lớn bản sao. Tùy thuộc loại tế bào chủ, người ta sử dụng một kỹ
thuật chuyển thích hợp. Loại tế bào thơng dụng nhất là E.coli. Quá trình này
gọi là biến nạp, biến nạp vào E.coli được thực hiện như sau: Xử lý tế bào
E.coli bằng sốc nhiệt trong 2 phút ở 42ºC rồi ủ plasmid tái tổ hợp làm cho khả
năng dung nạp tăng lên hàng trăm lần. Sau khi plasmid mang đoạn DNA lạ
20


biến nạp chui được vào tế bào E.coli, chúng vẫn cịn ngun vẹn, đồng thời tế
bào chủ vẫn sống bình thường. Trong quá trình sinh trưởng của E.coli,
plasmid tái tổ hợp được sao chép tạo thành dòng DNA (gen) lạ. Để xác định
tế bào chủ E.coli đã tiếp nhận plasmid tái tổ hợp hay chưa, người ta gắn gen
kháng với chất kháng sinh vào plasmid tái tổ hợp hay chưa, người ta gắn gen
kháng với chất kháng sinh vào plasmid tái tổ hợp. Nhờ đó có thể phát hiện sự
dung nạp thơng qua tính bền vững với kháng sinh đã được đánh dấu.
Chọn lọc dòng DNA tái tổ hợp đặc hiệu. Sau khi biến nạp DNA vào tế

bào vật chủ thì ở trong tế bào vật chủ DNA biến nạp được nhân bản, từ đó
chúng tạo ra được dịng DNA. Bước tiếp theo chúng ta cần kiểm tra, chọn lọc
đúng dịng gen mong muốn. Ví dụ, vector tái tổ hợp (pBT) được biến nạp vào
tế bào khả biến E.coli DH5α sau đó được cấy chuyển trên mơi trường LB đặc
có bổ sung ampicillin 100mg/l, X-gal, IPTG. Sau đó ủ đĩa peptri ở 37ºC trong
16 giờ. Trên mơi trường có chứa kháng sinh, X-gal, IPTG sẽ phát triển hai
loại khuẩn lạc xanh và trắng Tất cả các khuẩn lạc này là những khuẩn lạc đã
được biến nạp plasmid chứa gen kháng sinh ampicillin. Những khuẩn lạc màu
trắng là các dòng tế bào mang plasmid có gen lacZ bị phá vỡ có thể do DNA
lạ chèn vào hoặc do đứt gẫy đầu vector trước khi đóng vịng. Những khuẩn
lạc màu xanh là những khuẩn lạc của vi khuẩn E.coli chứa plasmid pBT
nguyên vẹn sẽ có gen lacZ hồn chỉnh sản xuất ra β-galactosidase. Enzym
này phân hủy cơ chất X-gal có trong mơi trường tạo nên dẫn xuất indol, dẫn
xuất này ngồi mơi trường sẽ bị oxy hóa tạo thành màu xanh. Ở đây người ta
sẽ quan tâm đến những khuẩn lạc trắng để đem đi kiểm tra xem plasmid có
mang đoạn gen quan tâm không (Chạy phản ứng colony-PCR) [7].

21


Chƣơng 2
MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu nghiên cứu
Đề tài tiến hành nhằm tách dòng gen quy định protein vỏ của virus gây
bệnh vàng lùn ở lúa (RGSV), góp phần xác định trình tự bộ gen của RGSV tại
tỉnh Ninh Thuận.
2.2. Nội dung nghiên cứu
Để thực hiện được mục tiêu đặt ra, để tài thực hiện những nội dung
chính sau:

- Thu thập mẫu lá lúa nghi nhiễm bệnh tại tỉnh Ninh Thuận.
- Tách chiết RNA tổng số để thực hiện phản ứng RT – PCR với cặp mồi
đặc hiệu.
- Nhân dòng, giải mã xác định trình tự nucleotide đoạn gen CP.
- So sánh trình tự đoạn gen CP của RGSV tại tỉnh Ninh Thuận với các
trình tự khác của Việt Nam và các trình tự trên Thế giới đã công bố trong
GenBank.
- Đánh giá mức độ đa dạng di truyền.
2.3. Vật liệu nghiên cứu
2.3.1. Vật liệu thực vật
Vật liệu thực vật sử dụng trong nghiên cứu là mẫu lá lúa nghi bị nhiễm
bệnh tại tỉnh Ninh Thuận.
2.3.2. Hóa chất
 Chủng vi khuẩn tách dịng E.coli DH5α.
 Vector tách dịng pBT (Phan Trọng Hồng và các cộng sự, 2005).
 Mồi đặc hiệu (TS. Nguyễn Trung Nam và các cộng sự, 2008).
 Mồi pUC18 (Fermentas, Đức).

22


Bảng 2.1 Trình tự mồi đặc hiệu và mồi pUC
Tên mồi

Trình tự mồi

RGSV-CP-F

5'-CTATACACTACGCTAAAGGCTI-3'

RGSV-CP-R

5'-GTGTAAGATGGGTAAAGTGCAI-3'

pUC18-F1

5'-GAGGGTTTTCCCAGTCACGA -3'

pUC18-R1

5'GCGGATAACAATTTCACACA-3'

- Các cặp mồi dùng để tách dịng gen mã hóa protein vỏ được tổng hợp
bởi hãng Invitrogen (Mỹ). Các hóa chất sinh học phân tử và các thiết bị đều
được các hãng nổi tiếng như Fermentas (Đức), Bioneer (Hàn Quốc),
Invitrogen (Mỹ)... cung cấp.
- Trizol Reagents dùng cho tách RNA tổng số (Invitrogen, Mỹ).
- Kit cho phản ứng RT – PCR (Super ScripTX III One step RT – PCR
System with Platinum® Taq High Fidelity) (Invitrogen, Mỹ).
- Kit thôi gel và Kit tinh sạch Plasmid (Bionerr, Hàn Quốc).
- Thang DNA chuẩn (Fermentas, Invitrogen).
- Enzyme Taq polymerase (Fermentas, Đức).
- Các hóa chất thơng dụng khác như: Ampicillin, IPTG, X-gal,
agarose... (Merck, Sigma, Amersham Pharmacia Biotech).
- Các hóa chất cho phản ứng PCR, H2O khử DEPC.
2.3.3. Thiết bị
Các máy móc, thiết bị của phịng Cơng nghệ tế bào thực vật (Viện
Cơng nghệ Sinh học) và máy xác định trình tự gen tự động của Phịng thí
nghiệm trọng điểm Cơng nghệ gen (Viện Công nghệ Sinh học).

23


2.3.4. Địa điểm nghiên cứu
Phịng Cơng nghệ Tế bào Thực vật – Viện Công nghệ Sinh học – Viện
Khoa học và Cơng Nghệ Việt Nam, 18 Hồng Quốc Việt – Cầu Giấy – Hà
Nội.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Tách RNA tổng số
Quy trình tách chiết RNA của virus từ mẫu lá lúa nghi nhiễm bệnh
được thực hiện theo hướng dẫn của bộ Kit Trizol Reagents, gồm các bước
sau:
1. Cân 200-250 mg mẫu lá lúa nghi nhiễm bệnh.
2. Nghiền nhanh trong nitơ lỏng, đảm bảo mẫu phải được nghiền hoàn
toàn và tránh enzyme cắt RNA.
3. Lấy ngay 200 mg lá đã nghiền vào ống eppendorf 2 ml.
4. Bổ sung 1000 µl Trizol Reagents (thao tác trong tủ hút).
5. Lắc đều trong 10 phút ở nhiệt độ phòng (trên máy lắc).
6. Bổ sung 200 µl Chloform: Isoamyl (tỷ lệ 24:1) (thao tác trong tủ hút).
Đảo đều ở nhiệt độ phòng trong vòng 5 phút cho tủa tan hết.
7. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C.
8. Hút 500-600 µl dịch nổi (pha trên) cho vào ống eppendorf 1,5 ml.
9. Bổ sung 500 µl Isopropanol (lạnh) lắc nhẹ ống eppendorf để RNA kết
tủa. Ủ trong đá từ 10 ÷ 20 phút.
10. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C.
11. Thu tủa rửa lại bằng 500 µl cồn 700 (lạnh).
12. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút.
13. Lặp lại bước 11 và 12 một lần.
14. Để khơ rồi bổ sung 30 µl nước đã xử lý bằng DEPC 0,01%.
Khác với DNA, RNA là loại phân tử không bền, dễ bị phân huỷ bởi các

RNAase ở khắp mọi nơi, các RNAase có hoạt tính rất mạnh và bền (thậm chí
việc xử lý nhiệt ở 1000C trong vịng 1 giờ cũng khơng làm mất hoạt tính của
24


RNAase) nên việc tách chiết RNA đòi hỏi phải thận trọng để tránh mọi tạp
nhiễm chứa RNA từ môi trường. Tất cả các dụng cụ được xử lý DEPC cẩn
thận trước khi tiến hành thí nghiệm.
Bước đầu tiên trong quá trình tách chiết RNA là phải nghiền mẫu thực
vật trong nitơ lỏng giúp phá vỡ tế bào và giải phóng các thành phần tế bào,
đòi hỏi thao tác phải nhanh,. Sau khi nghiền mẫu thành dạng bột mịn phải bổ
sung ngay Trizol Reagents vì nếu khơng nuclease nội bào sẽ tham gia nhanh
chóng kết tủa protein, polysaccharide có trong hỗn hợp. Việc bổ sung thêm
chloroform: isoamin (24:1) có tác dụng kết tủa các hợp chất trên và tách pha
tốt trong ly tâm. Sản phẩm RNA tổng số được hoà tan trong nước DEPC
0,01% có tác dụng ngăn cản q trình RNAase phân giải RNA.
2.4.2. Phản ứng RT_PCR
Thành phần hỗn hợp phản ứng và chu kỳ nhiệt của phản ứng được tối
ưu hố được trình bầy ở Bảng 2.2 và Bảng 2.3:
Bảng 2.2 Thành phần phản ứngRT_ PCR
Thành phần

Thể tích (∑=25 µl)

H20 deion

10,3

Đệm RT_PCR 5X

5

RGSV – CP - F

0.75

RGSV – CP - R

0.75

dNTPs (10 mM)

1

Hỗn hợp enzym (Reverse

1

transcriptase, Taq polymerase)
Chất ức chế Ribonuclease tái tổ hợp

0,2

Rnase OUTTM
RNA tổng số

1

25