tách dòng và thiết kế vector chuyển gen mã hóa protein vỏ từ virus gây bệnh đốm vòng cây đu đủ ở Việt Nam

Mục lục
Mở đầu
Phần 1 Tổng quan tài liệu
1.1. Đặc điểm của cây đu đủ
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại
1.1.2. Giá trị kinh tế
1.1.3. Phân bố
1.1.4. Các bệnh về cây đu đủ
1.2. Đặc điểm virus gây bệnh đốm vòng ở đu đủ (PRSV)
1.2.1. Cấu trúc
1.2.2. Cơ chế lan truyền
1.2.3. Các biện pháp phòng trừ
1.2.4. Gen kháng virus
1.2.5. Những thành tựu trong việc chống lại PRSV ở cây đu đủ
1.2.5.1. Trường đại học Hawaii và đại học Cornell, Mỹ
1.2.5.2. Trường đại học Kasetsart, Thailand và Queensland, Austrailia
1.2.5.3. Trung tâm Công nghệ sinh học, MARDI, Malaysia
1.3. Công nghệ sinh học phân tử và ứng dụng để tạo cây chuyển gen
1.3.1. Một số vector sử dụng trong sinh học phân tử
1.3.1.1 Vector nhân dòng TA-cloning
1.3.1.2 Vector biểu hiện protein pRSET
1.3.1.3 Vector chuyển gen
1.3.2. Một số loại enzim sử dụng trong sinh học phân tử
1.3.2.1 Enzim sao mã ngược (reverse transcriptase)
1.3.2.2 Enzim ligase
1.3.2.3 Enzim DNA polymerase
1.3.2.4 Enzim cắt giới hạn (restriction enzim)
1
1.3.2.5 Enzim Mung-bean nuclease
1.3.3. Một số kỹ thuật sinh học phân tử
1.3.3.1 Kỹ thuật RT-PCR

1.3.3.2 Kỹ thuật Western blotting
1.4. Công nghệ thông tin và ứng dụng trong sinh học phân tử
1.4.1. Phần mềm tin học DNAstar sử dụng trong SHPT
1.4.2. Internet và SHPT.
Phần 2 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1. Nguyên liệu
2.2. Phương pháp
2.2.1. Tách RNA tổng số chứa mRNA mã hoá protein vỏ của virus PRSV
2.2.2. Phương pháp điện di
2.2.3. Thiết kế Primer
2.2.4. Phương pháp RT-PCR
2.2.5. Phương pháp tách và tinh sạch DNA từ gel Agarose bằng ly tâm
2.2.6. Phản ứng ghép nối đoạn gen với vector
2.2.7. Phương pháp xử lý với enzim giới hạn và Mung-bean nuclease
2.2.8. Phương pháp biến nạp
2.2.9. Ki m tra khu n l c ch a vector tái t h p b ng PCRể ẩ ạ ứ ổ ợ ằ
2.2.10. Tách chiết DNA plasmid từ E. coli
2.2.11. Phân tích trình tự nucleotide
2.2.12. Thiết kế vector chuyển gen mang gen PRSVN
2.2.13. Biểu hiện gen CP trong E.coli
2.2.14. Western blotting
Phần 3 Kết quả và thảo luận
Phần 4 Kết luận và đề nghị
Phần 5 Tài liệu tham khảo
2
Mở đầu
Đu đủ là cây ăn quả được trồng phổ biến ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới.
Quả chín để ăn tráng miệng và quả xanh được dùng làm salad. Ngoài ra nhựa đu đủ
còn là nguyên liệu tách chế phẩm enzim papain có giá trị thương mại sử dụng trong
công nghiệp thực phẩm và thuộc da. ở Việt Nam, diện tích trồng đu đủ vào khoảng

2500 ha với sản lượng khoảng 100.000 tấn ước tính đạt 200 - 300 tỉ đồng [17].
Nhưng hạn chế lớn nhất đối với sự phát triển cây đu đủ là sự hoành hành của
bệnh đốm vòng do virus đốm vòng (papaya ringspot virus) gây ra. Virus này thuộc
nhóm Potyirus có vật liệu di truyền là sợi ARN đơn. Khi virus này nhiễm vào cây
đu đủ thì làm cho lá cây có những vòng đốm và mất khả năng quang hợp dẫn đến
giảm nghiêm trọng năng suất và chất lượng quả. Bệnh được truyền do các loại rệp
cây nên lan rộng rất nhanh. Đến nay toàn bộ các vùng trồng đu đủ ở nước ta [17]
cũng như Austrailia [16], Thái Lan [14], Đài Loan [18], Malaysia [10]... và đặc biệt
là Hawaii [5] đều đã bị nhiễm bệnh.
Những phương pháp thường sử dụng để ngăn chặn sự lan rộng của PRSV
như chặt bỏ cây bị bệnh, cách ly vùng bị bệnh [7], sử dụng thuốc trừ sâu để diệt rệp
truyền bệnh hay sử dụng chủng PRSV yếu cho nhiễm vào cây chưa bị bệnh để ngăn
sự nhiễm các chủng mạnh hơn theo cơ chế bảo vệ chéo [19,20]. Nhưng những
phương pháp này chỉ làm giảm sự lan truyền mang tính chất phòng trừ chứ không
thể chống lại bệnh này.
Hiện nay nhờ ứng dụng tiến bộ mới trong kỹ thuật di truyền, người ta đã tạo
ra các giống cây trồng có khả năng kháng lại bệnh do virus gây ra bằng cách đưa
gen mã hoá protien vỏ (coat proetin gene) của virus vào genom của thực vật. Thành
công đầu tiên là ở thuốc lá và cà chua kháng lại virus khảm thuốc lá [12]. Sau đó là
sự kháng lại nhiều loại virus khác như cucumber mosaic virus [1], alfalfa mosaic
3
virus [6] và potato leaf roll virus [4]. Gần đây ở Hawaii đã tạo được dòng đu đủ 55-
1 kháng lại PRSV [2,3]. Dòng đu đủ được chuyển gen này đã trở thành giống
thương mại sau khi lai với giống Kapoho [9]. Nhưng tính kháng của cây đu đủ
chuyển gen này chỉ có hiệu quả đối với các chủng virus của Hawai mà không kháng
với các chủng virus từ các vùng khác [15]. Chính vì vậy mà cần phải tách dòng gen
mã hoá protien vỏ (coat protein gene) từ chính các virus gây bệnh của vùng đó thì
mới có khả năng tạo ra cây kháng bệnh.
Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi đã xây dựng đề tài: " Tách dòng và thiết kế
vector chuyển gen của gen mã hoá protein vỏ (coat protein) từ virus gây bệnh đốm

vòng cây đu đủ (PRSV) ở việt nam". Với mục đích là tạo được một vector chuyển
gen mang gen mã hoá cho protein vỏ của PRSV của Việt Nam phục vụ cho việc
chuyển gen này vào cây đu đủ tạo ra giống đu đủ mới có khả năng kháng lại PRSV
ở Việt Nam.
4
Phần 1
Tổng Quan tài liệu
1.1 Đặc điểm cây đu đủ
1.1.1 Nguồn gốc và phân loại:
Đu đủ (Carica papaya L.) thuộc giống Carica, chi Caricaeae, họ hai lá
mầm. Trong chi còn 3 giống khác là Cyclimorpha, Jacaratia và Jarilla. Đu đủ đợc
biết có tới 45 loài trong giống Carica (Willis 1973).
Các loài của Carica papaya L. đã đợc tìm thấy dạng dại trong tự nhiên. Nó
có thể đợc bắt đầu từ vùng đất thấp của Trung Mỹ, giữa Nam Mexico và
Nicaragua (Story 1969), có thể từ sự lai giống giữa hai loài Carica Mexico. Đu đủ
đợc phát tán dọc theo đờng biển thơng mại vùng nhiệt đới nhờ những ngời thám
hiểm và nhà buôn vào giữa thế kỷ 16. Năm 1601, ngời Bồ Đào Nha đã phổ biến
cây đu đủ tới ấn độ và Malaca, ngời Tây Ban Nha đã đa cây đu đủ vào Philippin...
Ngày nay, đu đủ có thể thấy trong phạm vi từ vĩ tuyến 32
0
Bắc đến 32
0
Nam của
xính đạo. Nó đợc trồng phổ biến trong đồn điền hoặc mùa vụ tiểu nông.
Đu đủ là loại cây trồng cho quả ăn nhỏ, dạng cây thảo. Cây sinh trởng lâu
năm nhng thời kỳ cây con ngắn, trung bình khoảng 6 tháng. Sau một năm có thể
cho thu hoạch quả chín và sau đó là thu hoạch liên tục trong vòng nhiều năm. Hầu
hết cây trồng mang tính thơng mại chỉ đợc thu hoạch trong vòng 3 hoặc 4 năm trớc
khi tàn lụi và cây trở lên quá cao gây khó khăn cho việc thu hoạch. Một cây cho
sản lợng từ 30 đến 40 kg quả chín trong một năm. Năng suất từ 30 - 40 tấn/ha/năm

và có thể đạt 100 tấn/ha/năm.
5
Đu đủ là cây đa tính, nhiều loài là khác gốc (cây đực và cái riêng rẽ), nhiều
loài là cùng gốc (cây lỡng tính). Cây khác gốc phải đợc thụ phấn chéo do sự chia rẽ
của nhị và nhuỵ hoa và hầu nh sự phân tán của phấn hoa là nhờ gió. Cây cùng gốc
có hoa lỡng tính nên có hiện tợng tự thụ phấn.
1.1.2. Giá trị dinh dỡng và kinh tế của cây đu đủ
Đu đủ đợc sử dụng chủ yếu là quả chín làm món ăn tráng miệng vì quả có
vị ngon, rất giầu vitamin và muối khoáng(Table 1), một phần quả xanh đợc dùng
làm salad, lá xanh dùng để hầm thịt trong một số món ăn truyền thống. Ngoài ra,
nhựa đu đủ còn đợc sử dụng làm nguyên liệu tách chế phẩm papain (chiếm 1%
chất khô của quả xanh) là enzim thơng mại đợc sử dụng trong công nghiệp thực
phẩm và thuộc da. Thêm nữa, đu đủ còn đợc coi là một loại dợc liệu quí: rễ, hoa, lá
đợc dùng rộng rãi trong đông y nh hoa đu đủ đực đợc dùng để trị ho, hạt dùng làm
thuốc chống giun sán, hạ sốt...(Vũ Công Hậu)
Table 1: Thành phần dinh dỡng của quả đu đủ chín (100g)
Thành phần 100g quả chín
Năng lợng 35.0 - 59 cal
Nớc 88.4 - 90.7 g
Protein 1.0 - 1.5 g
Chất béo 0.1 g
Carbohydrates 7.1 - 13.5 g
Ash 0.1 g
Calcium 11.0 - 31.0 mg
Phospho 7.0 - 17 mg
Iron 0.6 - 0.7 mg
Sodium 2.0 - 3.0 mg
Potassium 39 - 337 mg
Carotene 1.16 - 2.43 mg
Vitamin B1 0.03 - 0.08 mg

Vitamin B2 0.7 - 0.15 mg
Niacin 0.1 mg
Vitamin C 69.3 - 71.0 mg
Sản lợng quả đu đủ chín ở nớc ta ớc tính đạt 100.000 tấn/năm. Mỗi kg quả
chín trị giá khoảng 2500đ đến 3500đ thì tổng giá trị đạt từ 2500 - 3500 tỉ đồng
(khoảng 150 -200 triệu USD).
6
Tổng sản lợng quả đu đủ tơi trên thế giới năm 1995 ớc tính đạt 5.9 triệu tấn
đạt giá trị khoảng 15 đến 20 tỉ USD (Sản lợng quả đu đủ hàng năm của một số nớc
sản xuất chính đợc đa ra trong bảng 2).
Bảng 2: Sản lợng quả đu đủ hàng năm của một số nớc
Nớc sản xuất Tổng sản lợng các năm ( x1000 tấn)
1984 1987 1990 1993 1995
Châu Phi 237 247 282 -
Nam Mỹ - - 685 723 754
Bắc Mỹ - - 1697 1738 1872
Hawaii - - - 2866 3208
Thailan - - 206.5 363 342.9
Malaysia - 84.28 - - 66
Philipine - - 65 64.8 58.1
Việt Nam - - - - 100
Indonexia - - 349.6 422.4 714.1
(-) số liệu không đợc xác định
1.1.3. Phân bố
ở nớc ta đu đủ đợc trồng trong vờn nhà ( từ 5 đến 10 cây) của gần 50% hộ
nông dân. Đu đủ cũng đợc trồng tập trung trong các nông trờng hoặc trang trại
vùng đồng bằng sông hồng, ven biển miền trung, đồng bằng sông Mekong và sờn
núi đá vôi. Tổng diện tích vào khoảng 2500 ha gồm khoảng 1250 ha trồng tập
trung (Bảng 3) và 1250 ha trồng trong vờn nhà
Bảng 3: Vùng phân bố tập trung của cây đu đủ ở Việt Nam

Vùng phân bố Diện tích (ha)
Vùng núi và trung du phía bắc
- Sơn La
- Lạng Sơn
500
Đồng bằng sông Hồng
- Hà Nội
- Hng Yên
- Nam Hà
- Ninh Bình
250
Ven biển miền trung
- Nghệ An
100
7
- Thanh hoá
Đồng bằng sông Mekong
- Ninh Thuận
- Nha Trang
- Tây Ninh
- Tiền Giang
500-550
1.1.4. Các bệnh và sâu hại của cây đu đủ
- Bệnh đốm vòng: Hạn chế lớn nhất đối với sự phát triển cây đu đủ là sự
hoành hành của bệnh đốm vòng do virus đốm vòng (papaya ringspot virus) gây ra.
Khi virus này nhiễm vào cây đu đủ thì lá cây có những vòng đốm, các gân lá xoăn
lại và phồng lên làm mất khả năng quang hợp, ở quả có những vòng xanh ô lu. Cây
chậm phát triển dẫn đến giảm nghiêm trọng năng suất và chất lợng quả. Bệnh đợc
truyền do các loại rệp cây nên lan rộng rất nhanh. Hiện nay tất cả các vùng trồng
đu đủ ở nớc ta đều đã bị nhiễm bệnh kể cả khi lấy hạt của những cây đu đủ không

bị bệnh đem gieo thì cũng chỉ khoảng 4- 5 tháng sau khi trồng cha kịp thu hoạch
đã thấy xuất hiện triệu trứng bệnh.
- Rệp sáp, rệp mình mềm, bọ nhảy... ngoài việc hút nhựa gây tác hại trực
tiếp còn là vật truyền bệnh PRSV nhất thiết phải trị bằng những thuốc hiện có nh
Bi 58ND, Mipcin 20ND, Trebon 10ND, Applaud-BAM 50ND.... Những cây đu đủ
trồng lẻ tẻ, không chăm sóc có rất nhiều loại côn trùng và thực sự là những ổ dịch
nếu không phá bỏ thì nghề trồng đu đủ rất khó phát triển.
- Tuyến trùng: tấn công vào rễ, gây những nốt sần. Bệnh bị nặng ở nơi đất
cát, nơi đã trồng đu đủ nhiều vụ. Phòng trị bằng luân canh, đổ formalin 4% 25cc
vào mỗi hố trồng.
- Nhện đỏ: Gây hại chủ yếu vào mùa khô, đẻ trứng ở phía dới lá, cả sâu non
và sâu trởng thành đều hút nhựa làm cho phiến lá mất diệp lục, chuyển màu vàng.
Trị bằng Kelthane hoặc nếu không dùng Trebon phun vào dới lá.
- Bệnh nấm Helminthosporium: gây cháy lá làm cho lá bị biến màu và khô
rụng (Phun Kitazin 0,2% có thể hỗn hợp với vôi 1%)
- Bệnh phấn trắng: do nấm Oidium caricae gây ra (phun Benomyl, Zineb và
cácthuốc thuộc nhóm lu huỳnh)
8
- Bệnh nấm Phytophtora: Vừa hại rễ, vừa hại quả. Nấm ở trong đất khó
phòng trị, ở Hawaii ngời ta dùng thuốc xông hơi để trị. Tạo những điều kiện không
thuận lợi cho nấm phát triển nh: trồng trên lip đất cao, luân canh, tránh cuốc xới
làm đứt rễ.
1.2. Đặc điểm của PRSV
1.2.1 Cấu trúc
PRSV thuộc loại potyvirus, nhóm gồm có khoảng 160 loại khác nhau.
Nhóm potyvirus là lớn nhất và quan trọng nhất về sự ảnh hởng đến kinh tế của
virus gây bệnh ở thực vật. Những virus của nhóm này có genome là sợi RNA đơn
cuốn vòng với kích thớc 780x12nm. Nó chứa khoảng 10kb liên kết với protein ở
đầu 5' (VPg) và có đuôi polyA đầu 3' (Shukla et.al 1994). Sợi RNA genome này đ-
ợc bao bọc bằng vỏ protein (Capsid). Vỏ protein là sự lặp lại của những tiểu phần

nhỏ là protein vỏ (coat protein). RNA genome của PRSV đợc dịch mã trong tế bào
chủ tạo ra polyprotein. Polyprotein này thuỷ phân tạo ra 12 protein trong đó có
protein vỏ (viral coat protein).
Trong suốt quá trình nhiễm trong tế bào chủ, virus sử dụng nguyên liệu của
tế bào chủ để tạo ra những bản sao genome cũng nh các protein của nó. Sau đó
RNA và những tiểu phần protein vỏ tự lắp ráp với nhau tạo ra những virus hoàn
chỉnh riêng biệt có khả năng nhiễm sang các tế bào khác trong cây hoặc sang các
cây khác nhờ côn trùng.
Genome của virus mã hoá khoảng 12 loại protein. Một vài loại thì chức
năng của nó không hoàn toàn đợc xác định, một vài loại thì có nhiều chức năng
khác nhau. Một số chức năng đã đợc xác định là vỏ protein, nhân, thân hình trụ,
phần bổ trợ liên quan đến sự truyền nhờ côn trùng, helicase và nhiều protease,
replicase, protein liên kết genome, ATPase.
1.2.2. Cơ chế lan truyền của PRSV
PRSV đợc truyền dễ dàng đến tế bào chủ thân thuộc nhờ nhiều loài rệp cây
khác nhau với phơng thức không liên tục. Virus đợc truyền không liên tục nhờ rệp
cây là vì sự tồn tại trong vật truyền trung gian là rất ngắn, ngắn hơn cả thời gian
9
tồn tại của virus trong dịch chiết lá cây. Trong quá trình truyền không liên tục,
virus đợc truyền sang côn trùng sau khi sinh trởng một thời gian ngắn trong cây bị
nhiễm và có thể đợc truyền tới một hoặc vài cây ngay lập tức hay sau nhiều giờ. Có
sự khác nhau trong vật truyền đặc hiệu của từng loại virus riêng biệt trong nhóm
thậm chí giữa các dạng sinh học của cùng một loại virus. Điều này nói lên rằng cơ
chế của sự tơng tác virus - vector vợt ra ngoài tính chất sinh học chung của virus và
vector truyền của nó [ ].
1.2.3. Các biện pháp phòng trừ
- Sử dụng các chất hoá học tiêu diệt rệp truyền bệnh.
- Loại bỏ các cây bị bệnh, tránh trồng gần các cây họ bầu bí là ký chủ của
các côn trùng truyền bệnh.
- Cách ly với các vùng có cây bị bệnh. Các vùng cách ly có thể tạm thời

không bị bệnh nhng do sự bùng phát của PRV thì các vùng trên cũng sẽ bị nhiễm.
Điều này thấy rõ ở các vùng trồng đu đủ qui mô lớn ở Hawaii (isherwood,1994)
Các phơng pháp này chỉ áp dụng đợc khi cây cha bị nhiễm bệnhvà mang
tính chất phòng trừ chứ không thể chống lại đợc bệnh này
- Cơ chế kháng chéo: sử dụng một chủng PRV yếu cho nhiễm vào cây (ví
dụ chủng HA5-1) để ngăn chặn sự lây nhiễm của các chủng PRV mạnh hơn. Nhợc
điểm của phơng pháp này là các cây bị nhiễm chủng PRV yếu tuy có các dấu hiệu
bị bệnh nhẹ hơn nhng thiệt hại về sản lợng cũng lên tới 10-20%.(Yeh và
Gonsalves, 1994).
1.2.4. Gen kháng virus
Từ nhiều năm, ngời ta đã biết cây cỏ có thể trở nên kháng đối với các chủng
virus gây bệnh nếu trớc đó gây nhiễm chúng với cùng loại hay với virus tơng tự.
Hiện tợng này gọi là bảo vệ chéo. Hình nh protein vỏ của thể virus đóng vai trò
quyết định đối với tính kháng chéo, bởi vì khi gen CP của nhiều loại virus RNA đ-
ợc thể hiện trong cây (cũng không nhất thiết phải có sự biểu hiện gen mã hoá
protein vỏ ở mức độ cao) thì phản ứng bảo vệ chéo biểu hiện. Tính kháng virus còn
có thể đạt đợc khi biến nạp thực vật với DNA có những đoạn mã hoá RNA vệ tinh.
Cơ chế bảo vệ chéo còn cha đợc giải thích đầy đủ nhng có thể giả thiết rằng giữa
10
thể virus gây nhiễm và tế bào chủ có sự hoà trộn sản phẩm biểu hiện của gen nên
đã tạo ra tính kháng virus của cây.
Bằng việc sử dụng các tiến bộ trong kỹ thuật di truyền, ngời ta đã chuyển
gen CP của virus vào giống đu đủ, tạo cho cây có khả năng kháng bệnh virus. Đây
là một thành tựu lớn của công nghệ sinh học trong việc chống lại bệnh PRSV. Các
dòng đu đủ chuyển gen này sẽ góp phần có hiệu quả trong việc phòng trừ bệnh
PRSV.
1.2.5. Những thành tựu trong việc chống lại PRSV ở cây đu đủ
Trên thế giới đã có nhiều phòng thí nghiệm làm về chuyển gen ở thực vật,
nhng đối với sự chuỷên gen CP để tạo cây kháng PRSV thì chỉ có một số phòng thí
nghiệm nổi bật là:

1.2.5.1. Trờng đại học Hawaii và đại học Cornell, Mỹ
Hai nơi này đã đi tiên phong trong việc chuyển gen CP vào đu đủ để kháng
bệnh đốm vòng và đã mở ra một phơng pháp mới cho việc tạo các giống cây trồng
kháng bệnh virus. Nhóm các nhà khoa học gồm có:
Dr. Dennis Gonsalves, Khoa bệnh học thực vật, đại học Cornell, tham gia
trong việc tách phân lập gen CP từ virus PRSV.
Dr. Jerry Slightom thiết kế cấu trúc gene CP dùng cho chuyển gen
Dr. Maureen Fitch (USDA) chuyển gen CP vào đu đủ.
Dr. Richarh Manshardt, Khoa trồng trọt, đại học Hawaii, tham gia kiểm tra
và khảo nghiệm các dòng cây chuyển gen.
Nhóm nghiên cứu này đã đa Gen CP của dòng virus PRSV HA 5-1 vào
vector pGA482 và chuyển thành công vào giống đu đủ "Sunset" bằng súng bắn
gen. Họ đã tạo ra hai dòng đu đủ mang tên 55-1 và 63-1 có mang gen CP trong
genom và đã kiểm tra bằng lai Southern và ELISA. Kết quả thử nghiệm khả năng
kháng bệnh của thế hệ R1 từ dòng 55-1 cho thấy nó có tính kháng bệnh rất cao
(chỉ có 5% của 128 cây đợc thử nhiễm bệnh) đối với các dòng virus tách từ
Hawaii. Nhng không kháng đợc các dòng tách từ nơi khác (vd: Thailand). Vì thịt
quả của dòng 55-1 có mầu hồng không phù hợp với thị trờng nên dòng 55-1 này đã
đợc lai với giống Kapoho tạo ra dòng "Rainbow" có thịt quả mầu vàng mang đầy
11
đủ các đặc tích của giống gốc. Hiện nay dòng "Rainbow" đã đợc đăng ký bản
quyền và trở thành giống đu đủ chuyển gen thơng mại đầu tiên có khả năng kháng
lại PRSV.
1.2.5.2 Trờng đại học Kasetsart, Thailand và Queensland, Austrailia
Nhóm nghiên cứu gồm có:
Dr. Tom Burn, Dr. Kanokawan Kanokawaree, Dr. Supart Attathom
Đại học Kasetsart, Thailand
Dr. Srimake Chaowphongphang, đại học Queensland, Austrailia.
Để kiểm soát bệnh PRV thì từ năm 1987 Thailand đã tạo ra các giống có
khả năng chịu bệnh cao theo phơng pháp bảo vệ chéo nhng hiệu quả không cao.

Năm 1995, Thailand đã có chơng trình phát triển cây đu đủ chuyển gen kháng
bệnh PRSV đợc tài trợ của ACIAR kết hợp giữa trờng đại học Kasetsart, Thailand
và Queensland, Austrailia.
Gen CP đã đợc tách từ các chủng virus của Thailand. Gen này đợc chuyển
vào hai giống Khak-Dum và Khak-Nual bằng phơng pháp bắn gen với nguyên liệu
là phôi non qua giai đoạn mô sẹo. Hiện nay họ cũng đã thu đợc cây chuyển gen,
đang thử nghiệm tính kháng PRSV.
1.2.5.3. Trung tâm Công nghệ sinh học, MARDI, Malaysia
Nhóm nghiên cứu gồm
Dr. Hassan Matd Daud tách phân lập gen CP từ các chủng virus của Malaysia.
Dr. Tan Chong Seng thiết kế cấu trúc CP gen, đa vào vector p2K7 dùng cho
chuyển gen bằng súng bắn gen và vector pCAMBIA2300 dùng cho chuyển gen
bằng Agrobacterium.
Dr. Vilasini Pillai: chuyển gen CP vào giống đu đủ Ekotika.
Hiện nay đã thu đợc cây chuyển gen Ro đợc khẳng định bằng lai southern nhng
cha đợc thử khả năng kháng bệnh.
1.3. Sinh học phân tử và ứng dụng để tạo cây chuyển gen
1.3.1. Một số vector sử dụng trong sinh học phân tử
12
1.3.1.1. Vector nhân dòng TA- cloning
Vector này đợc thiết kế riêng cho việc nhân dòng và xác định trình tự
nucleotit của một đoạn gen nào đó. Do tính chất của sản phẩm phản ứng PCR khi
sử dụng enzim Taq DNA polymerase để nhân lên một đoạn gen nào đó thì bao giờ
trên mỗi mạch đơn hai đầu của sản phẩm cũng gắn d thêm một dATP vào nên
vector TA-cloning đợc thiết kế dạng mở và trên mỗi mạch đơn ở hai đầu có gắn
thêm một dTTP. Vì vậy, đoạn DNA sản phẩm của phản ứng PCR có thể gắn trực
tiếp vào vector nhờ T4 ligase. Xung quanh điểm chèn đoạn DNA này có vị trí nhận
biết của một số enzim giới hạn để dễ dàng cho việc thiết kế cấu trúc gene sau này.
Phía trái của điểm chèn đoạn DNA là lac promoter cho việc biểu hiện của gen
lacZ, trùm qua điểm chèn là đoạn gen lacZ mã hoá 146 a xít amin của -

galactosidase giúp cho việc chon lọc khuẩn lạc xanh/trắmg. Vector này mang vùng
gen tự sao mã ColE1 origin biểu hiện số lợng cao bản sao trong E.coli và gen chọn
lọc là hai gen kháng kanamycin và Ampicillin. Đặc biệt, có trình tự bắt cặp bổ
sung của hai đoạn mồi M13 forward và M13 reverse nằm ở hai bên của điểm chèn
phục vụ cho việc xác đinh trình tự đoạn DNA đợc chèn vào (hình )
Hình : Bản đồ vector TA-cloning pCR2.1
13
1.3.1.2. Vector biểu hiện protein pRSET
Vector pRSET có nguồn gốc là các vector biểu hiện pUC, đợc thiết kế cho
sự biểu hiện protein và tinh chế protein ở mức độ cao trong E. coli. Sự biểu hiện ở
mức độ cao của các trình tự DNA đợc đa vào vector pRSET đợc tạo ra do sự điều
khiển của T7 promoter. Đoạn DNA đợc đa vào vị trí trong khung dịch mã với trình
tự mã hoá đoạn peptid tín hiệu tận cùng đầu N, một bộ mã khởi đầu dịch mã ATG,
một đoạn trình tự mã hoá 6 a xít amin histidine có chức năng là vùng liên kết với
kim loại trong protein đợc dịch mã. Vùng liên kết kim loại của đoạn peptide tín
hiệu cho phép tinh chế protein tái tổ hợp một cách đơn giản bằng sắc ký ái lực.
Một đoạn trình tự có tính năng làm ổn định cho sự sao mã có nguồn gốc từ gen 10
của phagơ T7. Một đoạn trình tự qui định vị trí cắt của enzim enterokinase trên
chuỗi peptide nằm giữa vùng liên kết với kim loại và protein tái tổ hợp, có tác dụng
loại bỏ đoạn peptide tín hiệu đầu N từ protein tái tổ hợp đã tinh sạch.
Trong pRSET, vị trí MCS (multiple cloning site) có vị trí cắt của 10 enzim
giới hạn: BamH I; Xho I; Bgl II; Pst I; Pvu II; Kpn I; Nco I; EcoR I; BstB I và Hind
III. Theo đó, để tạo ra đúng protein tái tổ hợp chá đoạn pepetide tín hiệu cần phải
chèn đoạn DNA vào một trong những vị trí trong MSC sao cho đúng khung dịch
mã với mã khởi đầu ATG của vector. Vector pRSET có 3 loại pRSET A, B và C
(hình 2) chỉ khác nhau đoạn trình tự giữa vùng mã cho đoạn peptide tín hiệu và
MCS. Để biểu hiện đúng protein đã đợc mã hoá bởi trình tự DNA, yếu tố quyết
định đầu tiên là vị trí cắt giới hạn phải thích hợp cho sự lai ghép đoạn DNA và sau
đó là vector nào sẽ duy trì đợc khung dịch mã của vector và đoạn DNA đợc chèn
vào.

Vector tái tổ hợp pRSET đợc chuyển vào E. coli TOP 10F để nhân dòng và
duy trì. Muốn biểu hiện protein tái tổ hợp thì cấu trúc vector này phải đợc chuyển
14
vào E. coli BL21 (DE3) là chủng E. coli biểu hiện T7 polymerase dới sự điều
khiển của lacUV5 promoter và một plasmid biểu hiện T7 lysozyme. Sự biểu hiện
của T7 polymerase cần thiết cho sự tổng hợp protein tái tổ hợp, khi có mặt IPTG tế
bào đợc cảm ứng để biểu hiện T7 RNA polymerase ở mức độ cao và làm tăng sự
tổng hợp protein tái tổ hợp.
15
1.3.1.3. Vector chuyển gen ở thực vật
1.3.1.3.1 Ti - Plasmid
Năm 1974, Zaenen và cộng sự đã phát hiện ra A. tumefacien mang một cấu
trúc di truyền ngoài nhiễm sắc thể là một plasmit khổng lồ (Ti-plasmid) chứa gen
liên quan đến sự tạo thành khối u ở vết thơng cây bị chúng xâm nhập[32]. Ti-
plasmit là một đoạn phân tử ADN mạch vòng, sợi kép có trọng lợng phân tử bằng
3-5% so với trọng lợng phân tử của nhiễm sắc thể vi khuẩn. Với kích thớc khoảng
200kb, trong tế bào chúng tồn tại nh một đơn vị sao chép độc lập.
Mặc dù đợc tách ở các chủng Agrobacterium khác nhau, song tất cả Ti-
plasmit qua phân tích di truyền cho thấy, chúng đều chứa đựng ba vùng quan
trọng. Vùng T-ADN và vùng vir (virulence) có liên quan trực tiếp đến sự hình
thành khối u. Vùng còn lại là vùng dị hoá opine (opine catabolism region) [28].
- Cấu trúc và chức năng của vùng T-ADN: Nghiên cứu trình tự gen trên
vùng T-ADN ở các Ti-plasmit khác nhau ngời ta thấy rằng T-ADN đợc giới hạn
bởi các đoạn trình tự lặp lại gần nh hoàn toàn khoảng 25 bp đợc gọi là đoạn đầu
biên (T-ADN border sequence). Chúng là dấu hiệu nhận biết cho quá trình chuyển
T-ADN vào tế bào thực vật. ở đoạn đầu biên bên phải có chứa yếu tố cis, cần thiết
cho quá trình chuyển T-ADN vào tế bào cây chủ. Đoạn đầu biên bên trái giữ vai
trò để quá trình chuyển T-ADN kết thúc bình thờng. T-ADN mang rất nhiều gen
và biểu hiện trong quá trình chuyển hoá của tế bào thực vật. Các phân tích trình tự
gen trên T-ADN cho thấy T-ADN cũng mang các dấu hiệu khởi đầu phiên mã (hộp

TATA) và kết thúc phiên mã (hộp AATAAA). Gen tồn tại trên T-ADN đợc chia
làm hai hệ chính [11]:
+ Hệ thứ nhất là gen gây ung th onc, gen này mã hoá sinh tổng hợp auxin
và cytokinin, kết quả làm cho các tế bào phân chia liên tục và biến đổi hình dạng
tạo ra các nốt sần trên cây.
16
+ Hệ gen thứ hai mã hoá cho các enzim cần thiết trong quá trình tổng hợp
opine. Vi khuẩn sử dụng opine làm nguồn năng lợng cung cấp cacbon và nitơ.
Dạng opine đợc tổng hợp trong khối u có thể là nopaline, octopine, agropine,
manopine và agrocinopine phụ thuộc vào các chủ Agrobacterium sinh ra khối u
ban đầu [11]. Đây cũng là cơ sở để phân loại các chủng Agrobacterium.
+ Vùng các gen độc tố của Ti-plasmit: Vùng các gen độc tố (vir) phụ trách
quá trình gây cảm ứng tạo đoạn T-ADN và vận chuyển T-ADN tới nhân tế bào vật
chủ. Có tới 24 gen vir nằm trong vùng này của Ti-plasmit dạng octopine. Các gen
này đợc bố trí trong 8 operon ký hiệu virA đến virH, tạo thành cấu trúc regulon [11].
- Sự biểu hiện của các gen vir đợc điều khiển bởi hệ thồng gồm hai thành
phần là protein VirA và protein VirG. Protein VirA là định vị trên màng tế bào, nó
có khả năng tự phosphoryl hoá ở gốc histidine 474 và gốc photphat này đợc
chuyển tới protein VirG. Sau đó protein VirG hoạt hoá sự phiên mã của các gen
vir khác [14].
Tuy nhiên các hoạt động cần thiết cho quá trình tạo T-ADN và hình thành
phức hợp T (T- complex) là do các gen virC, virD và virE điều khiển. Operon của
virD mã hoá sinh tổng hợp 4 protein VirD1, VirD2, VirD3 và VirD4. VirD2 là một
endonuclease có chức năng nhận biết và làm đứt gẫy T-ADN tại vùng đầu biên
cùng với sự có mặt của VirD1. Đoạn ADN "định vị nhân" trong gen virD2 giúp
cho sự định hớng của phức hợp T tới nhân tế bào thực vật. Hai protein VirC1 và
VirC2 đợc mã hoá bởi locus virC, protein VirC1 giữ vai trò thúc đẩy sự tạo thành
T-ADN nhờ sự liên kết với trình tự đoạn gia tốc (overdrive) [26], operon virE mã
hoá sinh tổng hợp protein VirE1 và VirE2. VirE2 liên kết với T-ADN ở một đoạn
không đặc hiệu, có chức năng giữ cho T-ADN không bị đứt gẫy [5]. Hơn thế nữa

VirE2 giữ cho T-ADN có cấu trúc thẳng không bị gấp quấn và đoạn "định vị
nhân" VirE2 đã giúp cho sự vận chuyển của phức hợp T tới nhân tế bào thực vật.
Có thể nói locus lớn nhất trong vùng vir là virB , mã hoá cho 11 protein từ VirB1-
VirB11. Một số trong những protein này nằm trên màng và dờng nh chúng tạo ra
các lỗ màng cần thiết cho quá trình vận chuyển phức hợp T vào trong tế bào thực
vật [24].
17
1.3.1.3.2 Hệ vector nhị thể
Kích thớc lớn của Ti-plasmit gây không ít khó khăn trong chuyển nạp gen
thông qua Agrobacterium. Mặt khác các enzim giới hạn có thể cắt ADN của Ti-
plasmit ở nhiều chỗ khác nhau, trong khi đó công nghệ gen lại cần những có vị trí
cắt duy nhất cho hoạt động của một số enzim giới hạn [3]. Ngoài ra mặc dù các
gen onc đợc dùng làm chỉ thị chọn lọc có tính trội, nhng chúng lại cản trở quá trình
tái sinh bình thờng ở thực vật [31].
Với các lí do trên đây, các nhà khoa học đã cải tiến Ti-plasmit thành một
hệ vector nhị thể gồm có vector chuyển gen (Ti-plasmid tái tổ hợp) và vector bổ trợ
(helper Ti-plasmid).
- Vector chuyển gen: Có cấu trúc từ Ti-plasmid với đoạn T-DNA đợc cắt bỏ
hết các gen không cần thiết nh gen onc và gen tổng hợp opine ở giữa hai trình tự
biên trái (T-border left) và biên phải (T-border right), gắn thêm một số thành phần
tạo ra cấu trúc mới gồm: i) các replicon để ADN plasmit có thể vừa tự nhân trong
cả E. coli và Agrobacterium; ii) các gen chọn lọc, gen đánh dấu và iii) vùng có
nhiều điểm cắt của các enzim giới hạn nằm ở giữa hai trình tự biên trái (T-border
left) và biên phải để chèn gen mong muốn.
- Vector bổ trợ: cấu trúc gồm tất cả các gen vir đợc tách và đa vào chung
một plasmid với đầy đủ promotor để gen hoạt động, các replicon để ADN plasmit
có thể vừa tự nhân trong Agrobacterium và các gen chọn lọc, gen đánh dấu.
Hai cấu trúc này cùng đợc đa vào Agrobacterium, Khi các gen trên vector bổ trợ
hoạt động thì các sản phẩm của nó sẽ tác động tới đoạn T-DNA trên vector chuyển
gen dẫn đến sự chuyển đoạn T-DNA sang tế bào thực vật.

1.3.1.3.3 Vector chuyển gen pCAMBIA2300
Vector pCAMBIA2300 đợc Leon Smith thuộc trung tâm CAMBIA thiết kế
năm 1997 để làm vector chuyển gen vào thực vật. Vector có kích thớc 8742bp với
các thành phần theo sơ đồ:
18
1.3.2. Một số loại enzim thông dụng trong sinh học phân tử
1.3.2.1 Enzim phiên mã ngợc (reverse transcriptase)
Cùng với các enzim giới hạn, enzim phiên mã ngợc có vai trò quyết định
trong quá trình hình thành ngành sinh học phân tử, enzim này do các retrovirus
sản sinh nhằm sao chép bộ gen RNA của chúng trong tế bào chủ. Hiện nay trên thị
trờng có hai loại enzim phiên mã ngợc có nguồn gốc từ AMV (Avian
Myeloblastosis Virus) và thông dụng hơn là từ Mo-MLV (Moloney Murine
Leukemia Virus) vì enzim này hoạt động ở 42
0
C nên đã làm giảm sự tạo vòng của
sợi mRNA. Cả hai loại enzim này đều có hoạt tính 5' - 3' DNA polymerase sử
dụng sợi mRNA làm khuôn mẫu với đoạn mồi là đoạn RNA hoặc DNA có đầu 3'-
OH tự do để sao chép ngợc tạo ra sợi cDNA.
1.3.2.2 Enzim DNA ligase
19
Enzim DNA ligase đợc sử dụng để kết nối hai đoạn DNA. Nó xúc tác cho
phản ứng tạo khung liên kết photphodiester bởi gắn đầu 5'-photphat và đầu 3'-OH
của hai đoạn DNA theo sơ đồ:
5'...pApCpG
-OH
pApApTpTpCpGpT...3'
3'...TpGpCpTpTpApAp
HO-
GpCpAp...5'
Mg

++
Bacteriophage T4 DNA ligase
ATP
5'...pApCpGpApApTpTpCpGpT...3'
3'... TpGpCpTpTpApApGpCpAp...5'
Enzim thờng dùng trong SHPT là T4 DNA ligase tách từ thực khuẩn thể T4,
có cấu trúc là một chuỗi polypepetit với trọng lợng phân tử là 68kDa, hoạt động tối
u ở pH7,5 đến 8,0 và cần có phụ tố là ion Mg
++
và ATP
1.3.2.3. Enzim DNA polymerase
DNA polymerase xúc tác cho phản ứng tổng hợp chuỗi polynucleotit từ các
mononucleotit. Quá trình tổng hợp luôn đợc kéo dài từ đầu tận cùng 3'-OH của
đoạn mồi. Enzim này chủ yếu đợc ứng dụng cho phản ứng PCR. Trớc đây, khi mới
phát minh ra PCR vào năm 1985 thì enzim đợc sử dụng là T4 polymerase (enzim
Klenow). Nhng điều hạn chế là enzim này chỉ hoạt động ở nhiệt độ thấp (37
0
C),
nên sau này đã đợc thay thế bằng các DNA polymerase chịu nhiệt. DNA
polymerase chịu nhiệt đầu tiên đợc tách từ chủng vi khuẩn Thermus aquaticus Yt1
phân lập từ suối nớc nóng ở vùng Yellow store. Trong số các enzim chịu nhiệt thì
Taq DNA polymerase đợc dùng phổ biến hơn vì nó đã đợc sản xuất từ E.coli bằng
kỹ thuật ADN tái tổ hợp. Ngoài ra còn một số các enzim khác cũng thờng đợc sử
dụng nh:
enzim Taq Vent Tth Pfu Bst
Nguồn E.coli đợc biến
nạp gen Taq
DNA polumerase
tái tổ hợp
Thermococus

litoralis
Thermus
thermophilus
HB8
Pyrococcus
furiosus
Mesophilic
bacterim
bacillus.
Stearothermop
hilus T-3468
Mr 94kDa - 92kDa 92kDa 76kDa
Tốc độ tổng hợp
(nucleotit/s)
75 >80 >25 >60 >120
20
Độ bền với
nhiệt độ
97,5
0
C
95
0
C
92,5
0
C
10'
40'
130'

130'
130'
-
-
20'
-
> 2h
>3h
-
-
-
[MgCl
2
]opt 1,5mM 2,0mM 1,5mM 1,5-2mM 1,5mM
[KCl]opt 50mM 10mM 80mM 10mM 80mM
1.3.2.4 Enzim cắt giới hạn (restriction enzim)
enzim giới hạn là công cụ cơ bản phục vụ cho sinh học phân tử, đợc sử dụng
để xác định đặc điểm của trình tự nucleotide của đoạn DNA, tạo ra các đoạn cắt
DNA phục vụ cho lai ghép DNA. Enzim giới hạn là một loại enzim của vi khuẩn
có tác dụng giúp chúng chống lại những DNA ngoại lai xâm nhập. Enyme đợc tinh
chế lần đầu tiên vào năm 1970 từ Haemophilus influenzae Rd. enzim giới hạn đợc
chia làm 3 loại dựa trên sự cắt DNA đặc hiệu hay không đặc hiệu và các yếu tố phụ
cần cho hoạt tính của enzim.
+ Enyme giới hạn loại I: là những enzim cắt DNA ở những vị trí không đặc
hiệu cách xa vị trí liên kết hoặc vị trí ghi nhận trình tự các nucleotide trên mạch
DNA khoảng 7000bp và để cho enzim hoạt động cần 3 phụ tố là Mg2+, ATP và
adenozylmethionyl.
+ Enzim giới hạn loại III: enyme này cũng cắt ở những vị trí không đặc hiệu
nhng vị trí cắt cách vị trí nhận biết chỉ khoảng 25 đến 27bp và cần hai phụ tố là
ATP và Mg2+.

Hai loại enzim này do vị trí cắt không đặc hiệu nên không đợc sử dụng
trong kỹ thuật gen.
+ enzim giới hạn loại II: loại này chỉ cần Mg2+ cho hoạt tính phân cắt DNA
và vị trí cắt của nó rất đặc hiệu. Điểm cắt ngay tại nơi enzim gắn vào hoặc kề cận.
Phần lớn vị trí nhận biết của enzim này là một trình tự gồm 4 đến 6 bp (đôi khi là 7
đến 8bp). Khi chúng cắt chuỗi DNA kép thì sẽ tạo thành các đoạn cắt giới hạn có
đầu tận cùng bằng hoặc tù với trình tự các nucleotide đặc trng và xác định.
1.3.2.5 Enzim Mung-bean nuclease
21
Mung-bean nuclease đợc tinh chế từ mầm cây đậu xanh (mung bean) có
hoạt tính nuclease. Enzim này chỉ cắt sợi RNA hoặc sợi đơn DNA mà không cắt
DNA sợi đôi thậm chí cũng không cắt ở trong những điểm mở trên sợi DNA. Nó đ-
ợc dùng để loại bỏ đầu dích sau khi sử lý với enzim giới hạn khác, tạo ra các đầu
bằng giúp cho việc gắn nối các đoạn DNA đợc dễ dàng hơn.
5'...pApCpG
-OH
pApApTpTpCpGpT...3'
3'... TpGpCpTpTpApAp
HO-
GpCpAp...5'
Mung Bean nuclease Zn
++

<100mM NaCl
5'...pApCpGp + CpGpT...3'
3'... TpGpCp GpCpAp...5'
1.3.3 Một số kỹ thuật sinh học phân tử
1.3.3.1 Kỹ thuật điện di phân tích ADN
Phân tử RNA và DNA với các đoạn cắt có khối lợng khác nhau đợc tách ra
khi di chuyển trong điện trờng từ cực âm sang cực dơng của máy điện di. với nồng

độ agarose, điện thế và cờng độ thích hợp thích hợp thì có giải phân tách các đoạn
DNA kích thớc khác nhau.
Nồng độ gel agarose Độ phân giải (Kb)
0,3
0,6
0,7
0,9
1,2
1,5
2
60 - 5
20 - 1
10 - 0,8
7 - 0,5
6 - 0,4
4 - 0,2
3 - 0,1
- Kỹ thuật điện di cho phép phát hiện vệt DNA 10ng khi nhuộm với
ethidium bromide. Ethidium là một chất tơng đồng với các bazơ nên nó xen kẽ
vào sợi DNA, dới ánh sáng UV thì phát quang và độ phát quang tỉ lệ thuận với l-
ợng DNA. Chiều dài bớc sóng tối u là 254nm nhng để trách làm đứt gãy sợi DNA
trong thực tế dung bớc sóng 300nm. Sự chuyển động của DNA phụ thuộc vào hai
yếu tố:
22
- Độ lớn của đoạn DNA: những đoạn DNA kích thớc bé chuyển động nhanh
hơn và sự chuyển động có mối quan hệ logarit với độ dài đoạn DNA.
- Kiểu hình của DNA: Điều này thờng thấy đối với plasmid dạng siêu xoắn,
sợi vòng, sợi thẳng. Vì vậy để tách và phân biệt kích thớc plasmid thờng phải dùng
một số enzim giới hạn để cắt plasmid tạo ra dạng mạch thẳng.
1.3.3.2. Kỹ thuật điện di phân tích protein

Phơng pháp này dùng để xác định sự có mặt và trọng lợng phân tử của
protein. Nguyên tắc của kỹ thuật là dựa vào tính chất liên kết giữa acrylamide và
bisacrylamide theo tỉ lệ 29:1 tạo ra dạng chuỗi polyacrylamide có tác dụng nh một
rây phân tử. Các protein sau khi kết hợp với chất tích điện âm SDS sẽ di chuyển
đợc trong điện trờng từ cực âm sang cực dơng. Khi cho protein di chuyển qua bản
gel acylamide trong điện trờng thì theo thời gian các protein có trọng lợng phân tử
khác nhau sẽ phân bố trên các vị trí khác nhau của bản gel. Protein nào có trọng l-
ợng phân tử nhỏ hơn sẽ di chuyển về cực dơng nhanh hơn. Tuỳ vào nồng độ của
acrylamide mà có thể phân tách đợc các protein với giải trọng khác nhau theo
bảng:
Nồng độ gel acrylamide (%) Giải trọng lợng phân tách (kD)
15
10
7,5
5
12 ữ 43
16 ữ 68
36 ữ 94
57 ữ 212
Sau khi dừng điện di, vạch protein trên gel đợc phát hiện bằng nhuộm gel
với chất màu là Coomassie Brillian Blue R250 hoặc muối nitrate Bạc. So sánh vị trí
của các protein này với thang protein chuẩn ta sẽ xác định đợc trọng lợng phân tử
của chúng. Phơng pháp này có thể phát hiện vạch protein với hàm lợng 10ng.
Ngoài ra, phơng pháp còn có thể xác định số chuỗi polypeptit của phân tử
protein bằng cách bổ sung vào đệm mẫu protein -Mecaptoetanol. Chất này sẽ cắt
các cầu liên kết disulfua giữa các chuỗi polypeptit tạo các tiểu phần nhỏ. So sánh
băng điện di khi không có -Mecaptoetanol ta sẽ biết đợc phân tử protein cấu trúc
từ bao nhiêu tiểu phần cùng với kích thớc phân tử của các tiểu phần.
23
1.3.3.3. Kỹ thuật RT-PCR

Kỹ thuật RT-PCR là sự kết hợp của hai phản ứng sao mã ngợc (reverse
transcription) và PCR để nhân lên một đoạn gen quan tâm từ RNA tổng số trong
đó có chứa RNA thông tin gồm hai giai đoạn
- Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất (sơ đồ):

dNTP Reverse
transcriptase
Do tính chất mRNA của tế bào eukaryot bao giờ cũng đợc gắn thêm một
đoạn đuôi poly(A) nên trong điều kiện invitro với sợi khuôn là mRNA có trong
RNA tổng số, nếu ta sử dụng một đoạn mồi oligo(dT) khoảng 12 đến 18 base thì
đoạn mồi này sẽ bắt cặp bổ sung với đuôi poly(A) của mRNA. Khi có mặt enzim
reverse transcriptase và các dNTP tự do, ở nhiệt độ 42
0
C trong 2h đoạn mồi này sẽ
đợc kéo dài tạo thành các sợi DNA mới bổ sung với mRNA. Nh vậy sợi cDNA thứ
nhất đã đợc tổng hợp. Để tăng hiệu quả của quá trình tổng hợp, lợng oligo(dT) đợc
cho vào lớn hơn rất nhiều lợng mRNA và chất kìm hãm RNase cũng đợc đa vào để
bảo vệ cho RNA khỏi bị phân huỷ bởi RNase.
24
Cấu trúc mũ
đầu 5'
AAA(A)
n
đuôi poly(A) đầu 3'
mRNA
Cấu trúc mũ
đầu 5'
AAA(A)
n
đuôi poly(A) đầu 3'

Oligo(dT)
12-18
primer
3'-OH 5'
AAA(A)
n
đuôi poly(A) đầu 3'
Oligo(dT)
12-18
primer
3'-OH 5'
5' 3'
cDNA : mRNA
- Khuếch đại gen quan tâm bằng PCR: Sau khi sợi cDNA thứ nhất đợc tổng
hợp thì kỹ thuật PCR đợc áp dụng để nhân gen quan tâm với các cặp mồi đặc hiệu
cho gen đó. Trớc tiên sợi cDNA tách khỏi mRNA bởi nhiệt, sau đó đoạn mồi 1 sẽ
kết cặp bổ sung với sợi cDNA thứ nhất để tổng hợp sợi DNA thứ hai. Tiếp theo các
sợi DNA kép này sẽ đợc nhân lên sau mỗi vòng lặp của phản ứng.
1.3.3.4. Kỹ thuật Western blotting
Kỹ thuật western blotting là kỹ thuật lai protein-protein. Protein mẫu sau
khi đợc phân tách bằng điện di gel acrylamide sẽ đợc chuyển sang cố định trên
một chất giá cũng bằng điện di. Chất giá thờng sử dụng là các loại màng khác nhau
nh màng nitrocellulose, diazophenylthio (DPT), diazobenzyloxymethyl (DBM),
nylon...Protein đã cố định trên màng sẽ đợc phát hiện bằng phản ứng miễn dịch
kép gồm hai giai đoạn
+ Protein mẫu cố định trên màng đóng vai trò một kháng nguyên sẽ kết hợp
với protein khác có tính chất là một kháng thể kháng lại protein này (kháng thể thứ
nhất). Kháng thể đợc tạo ra nhờ gây phản ứng miễn dịch khi tiêm protein mẫu vào
thỏ hoặc chuột và sau đó tách lấy kháng thể từ huyết thanh của chúng.
+ Kháng thể thứ nhất lại tiếp tục đợc lai với kháng thể thứ hai (kháng thể

kháng globulin miễn dịch anti-immunoglobulin) đã đợc gắn với một protein có
hoạt tính enzim thờng là peroxidase củ cải ngựa hoặc alkaline phosphatase. Chính
các enzim này sẽ phân huỷ cơ chất BCIP/NBT từ không màu thành màu xanh giúp
chúng ta quan sát đợc sự có mặt và vị trí của protein mẫu trên bản gel.
1.4. ứng dụng công nghệ tin học trong sinh học phân tử
1.4.1 Phần mềm tin học DNAstar sử dụng cho sinh học phân tử
Cùng với sự phát triển của SHPT, Công nghệ thông tin đã phát triển mạnh
mẽ và đợc ứng dụng vào nhiều lĩnh vực trong đó có sinh học phân tử. Có nhiều hệ
thống phần mềm khác nhau nh NTSYSpc dùng để vẽ cây phân loại các loài nhờ
xử lý các số liệu của kỹ thuật RADP, Vector NTI dùng để vẽ sơ đồ các plasmide,
CP/gene dùng phân tích trình tự nucleotide và protein. Nhng tiện dụng nhất là hệ
thống phần mềm DNAstar của một nhóm các nhà khoa học Mỹ. Phần mềm này
25