Cập nhật các phương pháp xét nghiệm vi sinh mới trong thực hành lâm sàng

Cập nhật

các phương pháp xét nghiệm vi sinh mới
trong thực hành lâm sàng
Phạm Hùng Vân


Khảo sát
trực tiếp

Bệnh
phẩm

KQ nhanh
Độ nhạy kém
Đặc hiệu kém

Hoá
miễn dịch

KQ nhanh
Tự động
Độ nhạy kém
Đặc hiệu kém

Huyết
thanh học

KQ nhanh
Tự động
Độ nhạy kém

Đặc hiệu kém

Nuôi cấy
phân lập

KQ chậm
Tiêu chẩn vàng
Độ nhạy kém


Mâu thuẩn giữa kết quả và thực tế
kết quả cấy với khác thực tế điều trị

 Có thể có mẫu thuẩn nếu bệnh phẩm là loại bệnh phẩm

có tạp nhiễm như đàm, phân, quệt âm đạo, quệt họng, quệt
mủ.. hay quá trình lấy và xét nghiệm bị ngoại nhiễm như cấy
máu, cấy DNT…và vi khuẩn cấy được không phải là vi
khuẩn gây bệnh mà là vi khuẩn quần cư hay tạp nhiễm

 Có thể có mâu thuẩn nếu PTN khơng có đầy đủ các mơi
trường phân lập để có thể cấy được các vi khuẩn thường là
tác nhân gây bệnh nhưng lại rất khó mọc


VI SINH CAP và CAP/COPD
KẾT QUẢ NUÔI CẤY

Nghiên cứu REAL 2016-2017 (N=271)
. Website HHH TP.HCM

12.18

11.81

9.59

7.75

5.17

2.95

2.58

2.21
1.11
0.37

0.74

0.74

1.11
0.37


Mâu thuẩn giữa kết quả và thực tế

“soi

khơng
thấy,
cấy
khơng
ra”

trong khi
lâm sàng
có nhiễm
khuẩn


Tác nhân vi sinh gây CAP ở trẻ em
KÊT QUẢ NUÔI CẤY KHÔNG GIÚP CHO LÂM SÀNG

 Trần Quang Khải (2016)

Luận văn Thạc Sĩ nhi. Thực hiện tại BV. NĐ1. Đối tượng: 66 bệnh
nhi xác định viêm phổi thùy. Mẫu cấy: NTA tin cậy

Cả 66 trường hợp đều cho KQ cấy [-]

 Ngơ Chí Thịnh (2016)

Luận văn CKII nhi. Thực hiện tại BV. NĐ1.
Đối tượng: 48 bệnh nhi viêm phổi nặng không đáp ứng điều trị.
Mẫu cấy: NTA tin cậy

Cả 48 trường hợp đều cho KQ cấy [-]

 Bùi Lê Hữu Bích Vân (2015)

Luận văn Thạc Sĩ nhi. Thực hiện tại BV. NĐ1. Đối tượng: 32 bệnh
nhi CAP không đáp ứng KS bước đầu. Mẫu cấy: NTA tin cậy

Chỉ 6 trường hợp cho KQ cấy [+]


Đa số các trường hợp tiêu chảy
xét nghiệm vi sinh thường âm tính








Tiêu chảy do các nguyên nhân khác như do virus (rotavirus,
norovirus), do thẩm thấu, do đau bao tử, hay do các rối loạn tiêu
hoá khác.
Tiêu chảy do các tác nhân vi khuẩn ngồi khả năng của phịng
thí nghiệm: E. coli (EPEC, ETEC, EIEC, EHEC, VETEC), S. aureus
tiết enterotoxin; Campylobacter Jejuni, Clostridium difficille, Y.
enterocolitica;
Không dùng đúng phương tiện để lấy và chuyên chở bệnh phẩm,
Bệnh nhân đã dùng kháng sinh trước khi lấy mẫu nên không thể
cấy được vi khuẩn gây bệnh có trong phân

Tác nhân lây truyền đường tình dục
các hạn chế phương pháp vi sinh truyền thống






Những tác nhân như C. trachomatis,
Mycoplasma, Ureaplasma, HSV… có vai trị
bệnh lý trong hiếm muộn, trong nhiễm
trùng sinh dục
KSTT chỉ giới hạn cho G. vaginalis,
Candida, N. gonorrhoeae, T. vaginalis
KSTT chỉ có lợi điểm là KQ nhanh, nhưng
có độ nhạy và độ đặc hiệu rất thấp
Khơng có khả năng phát hiện các tác nhân
không thấy được hay không cấy được


Khơng có hổ trợ từ kết quả vi sinh
LẠM DỤNG KHÁNG SINH
THẤT BẠI
KS KINH NGHIỆM

LẠM DỤNG KS

THẤT BẠI ĐIỀU TRỊ

ĐỀ KHÁNG KS

LÝ DO NI CẤY THẤT BẠI
LÝ DO CHỦ QUAN KHĨ KHẮC PHỤC
LÝ DO KHÁCH QUAN KHÔNG THỂ KHẮC PHỤC
Tác nhân thường gặp lại khó ni cấy (S. pneumoniae,
Bệnh
nhân dùng
trước phân
nên các
khuẩn
H.
influenzae),
địi kháng
hỏi các sinh
mơi trường
lập ítvicó
sẵn
này khơng
mẫumẫu
đàmnếu
(nhưng
vẫn
Khơng
đánhcịn
giá sống
độ tintrong
cậy của
là mẫu
bị cịn

tạp
trong các
dịch nước
lót phế
nang
mơ phổi)
nhiễm
(đàm,
tiểu,
sinhhay
dục)
Tác nhân
cấy được
tại gửi
cácđến
phịng
 Bệnh
phẩmkhơng
ít đượcni
cấy ngay
do chậm
PTN, thí
do
nghiệmđược
lâm cấy
sàngngay
(vi khuẩn khơng điển hình, virus)
khơng
 Không biết cách đánh giá kết quả nuôi cấy để chọn
đúng VK gây bệnh






VAI TRÒ XÉT NGHIỆM VI SINH
GIẢI PHÁP NÀO PHÙ HỢP?



VI SINH TRUYỀN THỐNG (nuôi cấy, KSTT)
Vẫn cần thiết nhưng không nhạy, không đầy đủ



HUYẾT THANH (kháng thể đặc hiệu)
Không hữu dụng (IgG), kém đặc hiệu (IgM)



HOÁ MIỄN DỊCH (kháng nguyên đặc hiệu)
Khó áp dụng, độ nhạy kém



REAL-TIME PCR (trình tự NA đặc hiệu)
Độ nhạy cao, đặc hiệu cao


Ni cấy

PCR

PCR chính là ni cấy phân tử khuếch đại đoạn gen
PCR đạt độ nhạy ở mức phân tử
Nuôi cấy đạt độ nhạy ở mức tế bào

Định danh dựa vào kiểu hình sinh vật
hóa học biểu hiện từ các kiểu gen

Xác định dựa vào kích thước đoạn gen
hay một trình tự đặc hiệu của đoạn gen


“Streamline” Real-time PCR

ÁP DỤNG DỄ DÀNG TẠI CÁC PHỊNG THÍ NGHIỆM LÂM SÀNG
CÁC BỆNH PHẨM KHÁC NHAU
(Máu, mô, đàm, mủ, dịch cơ thể)

TÁCH CHIẾT DNA/RNA
NKDNARNAprep-MAGBEAD
8 hrs

Một bộ thuốc thử cho DNA và RNA
Chỉ 5 bước thực hiện
Độ nhạy gấp 100 lần thủ cơng
Tương thích cho KingFisher

Các thiết bị KingFisher

tách chiết DNA/RNA

REAL-TIME PCR/RTPCR
NKReal-time PCR/RTPCR kit
Chọn lựa tuỳ tác nhân
Chứng nội kiểm sốt chất ượng
Cùng một chương trình real-time
Tương thích nhiều máy real-time

Các thiết bị Real-time PCR


Multiplex Realtime PCR
PHÁT HIỆN NHIỀU TÁC NHÂN





Cơ sở của Multiplex real-time PCR là
kết hợp nhiều cặp mồi và probe có
các màu huỳnh quang khác nhau để
phát hiện nhiều chỉ tiêu cùng một
lúc. Với các thiết bị real-time 5 màu,
có thể thiết kế multiplex real-time.
Thiết kế multiplex real-time PCR dễ
hơn multiplex PCR nhờ các nồng độ
mồi và probe trong real-time PCR là
thấp hơn trong PCR

V.cholerae
Shigella
V.para
IC
Salmonella


Real-time PCR

ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỢC TÁC NHÂN
Primers
Taq polymerase
dNTP
PCR buffer + MgCl2
Fluorescent agent
DNA của mẫu

Phát hiện

GIỐNG NHƯ PHƯƠNG PHÁP CẤY ĐỊNH LƯỢNG
PHÂN BIỆT TẠP NHIỄM VỚI GÂY BỆNH

Định lượng


Real-time PCR phát hiện tác nhân LRTI
GIẢI PHÁP ĐƠN GIẢN CHO MẪU PHỨC TẠP
Mẫu thử
ĐÀM
Tách chiết

NA

Thực hiện Real-time
PCR

VK
cộng đồng
S. pneumoniae
H. influenzae
M. catarrhalis
S. pyogenes
S. agalactiae
S. suis
H. influenzae b

VK khơng
điển hình
L. pneumophila
M. pneumoniae
C. pneumoniae
B. pertussis
B. parapertussis
C. Trachomatis

VIRUS
Influenzavirus
A, B, C
Para
influenzavirus
1, 2, 3

Rhinovirus
RSV, Measle
Adenovirus

VK
Bệnh viện
S. aureus (MR, MS)
S. epidermidis
E. faecalis,
E. faecium
E. coli,
K. pneumoniae
P. aeruginosa
A. baumannii
E. cloacae

VI NẤM
C. albican,
C. tropicalis
C. parapsilosis
C. krusei, C. glabrate
A. fumigatus,
A. niger, A. terrus,
A. flavus
P. carinii
P. jiroveci

M. tuberculosis

CAP người lớn nhập viện

KẾT QUẢ NUÔI CẤY VS REAL-TIME PCR ĐÀM
34.32

Nghiên cứu REAL 2016-2017 (N-271). Website HHH TP.HCM

Culture [+] (except flora) 42.1%
Predominant pathogens
Gram
Rods
Real-time negative
PCR

20.3

Nuôi cấy

Real-time PCR [+]
Predominant pathogens
11.81

10.7

69%
S. pneumoniae
H. influenzae
12.18
11.44

9.59

7.75

6.64

6.27
2.95
1.11

5.17

2.95
1.11

0.37 0.37

1.48

1.48

4.4
2.96

2.21
0.37

0.74

0.74

0.74

0.74

1.11

0.37

1.85

2.95
1.48

2.58


CAP trẻ em không đáp ứng KS ban đầu
KẾT QUẢ REAL-TIME PCR

Multi-pathogens are predominant
Pathogens

%

Pathogens

%

M. pneumoniae

3.13

S. pneumoniae

34.38

B. pertussis

3.13

S. pneumoniae + M. pneumoniae

15.63

RSV

3.13

S. pneumoniae + virus

E. coli

3.13

S. pneumoniae + virus + HA

K. pneumoniae

3.13

H. influenzae

3.13

H. influenzae + HA

3.13

(+)

87.50

3.13
12.52

Bùi Lê Hữu Bích Vân (N=32). Luận văn Thạc Sỹ (2015)


Viêm phổi thùy ở trẻ em
KẾT QUẢ REAL-TIME PCR

Multi-pathogens are predominant
Pathogens
MTB
MP
PNE
PNE+MP
PNE+MP+MTB
PNE+MC+MP

%
1.52
37.88
13.64
22.73
1.52
3.03

Pathogens
PNE+HI+MC+MP
PNE+HI
PNE+HI+MC
HI+MP
HI
PNE+HA
(+)

%
1.52
4.55
3.03
1.52
1.52
1.52
95.45

Trần Quang Khải (N=66). Luận văn Thạc Sỹ 2016

CAP nặng ở trẻ em

KẾT QUẢ REAL-TIME PCR
Pathogens

%

Pathogens

%

ADE

4.17

PNE+pINF3

2.08

RSV

4.17

PNE+RSV

2.08

pINF3

2.08

PNE+ADE

2.08

MP

4.17

PNE+ECO

2.08

29.17

PNE+KLP

2.08

16.67

PNE+HI

PNE
PNE+MP

Multi-pathogens are predominant

10.42

PNE+MP+ECO

2.08

PNE+HI+MP

2.08

PNE+MP+pINF1

2.08

PNE+HI+MC+MRSA

2.08

PNE+MP+pINF3

2.08

(+)

91.67
Ngô Chí Thịnh. Luận văn CK. II 2017 (N=48)


Tác nhân vi sinh CAP out-patient
Real-time PCR kết hợp nuôi cấy (N=232)

66.81

66.81

Real-time PCR [+]
Nuôi cấy [+]
Real-time PCR kết hợp nuôi cấy
SP
HI
MC
GAS
GBS
Hib
SAU
SE
Efecl
Eaero
Eco

S. pneumoniae
H. influenzae
M. catarrhalis
Streptococci Group A
Streptococci Group B
H. influenzae type b
S. aureus
S. edipermidis
E. faecalis
E. aerogenes
E. coli

11.64

Eclo
Eagg
Pmira
PSA
PS?
AB
Fungi
MY
MP
BP

E. cloacae
E. agglomerans
P. mirabilis
P. aeruginosa
Pseudomonas sp.
A. baumannii
Mycoplasma
M. pneumoniae
B. pertussis

0.86

2.59

FluA
FluB
Para1
Para2

Rhino
hMPV
RSV
Adeno

Fluenzavirus A
Fluenzavirus B
Parainfluenza 1
Parainfluenza 3
Rhinovirus
Human Metapneumovirus
Respiratory Syncytialvirus
Adenovirus
10.8%

27.2%

11.21

10.34

7.76

7.33

92.7%
82.8%
94.0%

2.59

0.43 0.86 0.86

1.72

2.59

0.86

7.76

6.90

6.03
0.43

2.16

0.86

2.59

3.88

2.59 1.72

4.31
1.29

Nghiên cứu EACRI 2017-2018). Hội Lao và Bệnh Phổi VN

0.86 1.29


Tác nhân vi sinh CAP out-patient
PHÂN TÍCH ĐƠN VÀ ĐA TÁC NHÂN

Mono Bacteria

2.16

SP+CA

1.29 SP+HI+CA

5.17

Mono Virus

2.59

SP+Virus

3.45 SP+HI+Virus

8.19

Mono SP

5.17

SP+CA+Virus

2.16 SP+HI+CA+Virus

0.86

Mono HI

7.76

SP+Virus+Fungi

0.86 SP+HI+CA+HA

4.31

0.43 SP+HI+CA+Virus+HA

1.72

0.43 SP+HI+Fungi

0.43

SP+HI

20.69 SP+Fungi

HI+Virus

1.72

SP+CA+Virus+HA

SP+HA
3.02 HIỆN
1.29 SP+HI+CA+Fungi
PCR PHÁT
ĐA SỐ LÀ ĐA
TÁC NHÂN

HI+CA

0.43

HI+CA+virus

0.43

SP+HA+Fungi

0.43 SP+HI+HA

7.33

HI+CA+HA

0.43

SP+Virus+HA

1.29 SP+HI+HA+Fungi

0.43

HI+HA

1.72

SP+Virus+HA+Fungi

0.43 HA

0.86

HI+HA+Fungi

0.86

CA+Fungi

0.43 HA+Fungi

1.29

HI+Virus+HA

1.29

CA+HA

0.86 HA+Virus

0.43

Virus+Fungi

0.43

CA+Virus+HA

0.43 HA+Virus+Fungi

0.43

HI: H. influenzae, SP: S. pneumoniae,
CA: Community bacteria (M. catarrhalis, M. pneumoniae),
HA: Hospital bacteria (Gram [-], gram [+])

Negatine

KQ nghiên cứu EACRI (2017-2018). Hội Lao và Bệnh Phổi VN

6.03


Phát hiện cúm H1N1, H5N1, và các cúm khác
CHỈ CÓ GIẢI PHÁP REAL-TIME PCR VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ
Bệnh phẩm

QUỆT MŨI SAU
QUỆT HỌNG
MÁU (GĐ CẤP)

Multiplex RT-real-time PCR
FluA, H1N1, H5N1
FluA [+] H1N1 [+]

FluA [+] H5N1 [+]

Sử dụng mồi và taqman probe của CDC
Độ nhạy đạt 45 copies/ml

Chỉ FluA [+]

Giải trình tự
Cúm khác



Tác nhân vi sinh gây tiêu
chảy: sẽ bị lôi ra ánh sáng