Nghiên cứu nuôi cấy huyền phù tế bào cây mật nhân (eurycoma longifolia jack)

1

ỌC
N N
ỌC SƢ P
M
KHOA SINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Nghiên cứu nuôi cấy huyền phù tế bào cây mật nhân
(Eurycoma longifolia Jack)

Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Hương Giang
Chuyên ngành : Cử nhân Sinh Môi Trường
Người hướng dẫn : Võ Châu Tuấn

Đà Nẵng, tháng 5/ 2013


2

MỞ ẦU
1. Tính cấp thiết
Từ xa xưa, con người khơng chỉ biết sử dụng thực vật làm nguồn thực phẩm
mà còn sử dụng chúng để điều trị bệnh tật (Wyk và Wink, 2004). Hàng ngàn năm
qua, các loài cây dược liệu là nguồn cung cấp dược phẩm quan trọng nhất nhằm cứu
lấy sự sống của các bệnh nhân trên toàn thế giới. Theo tổ chức WHO, 80% dân số
thế giới tin cậy vào các phương thức chữa bệnh truyền thống bằng cây dược liệu và

¼ các loại thuốc hiện nay đều có chứa các hoạt chất sinh học chiết xuất từ các cây

dược liệu [60]. Tuy nhiên, hiện nay nguồn khai thác các dược liệu này chủ yếu là từ
tự nhiên, dẫn đến sự cạn kiệt nguồn tài nguyên và mất tính đa dạng di truyền các
lồi thực vật [21]. Do đó, việc tìm ra phương thức thay thế để tạo ra nguồn dược
liệu ổn định là rất cần thiết.
Nuôi cấy tế bào huyền phù thực vật là một trong những lĩnh vực ứng dụng
đạt nhiều thành công nổi bật của công nghệ sinh học thực vật. Kỹ thuật này với
những ưu điểm vượt trội đã mở ra tiềm năng lớn để tăng thu sinh khối trong thời
gian ngắn, tạo nguồn nguyên liệu phục vụ việc tách chiết các hoạt chất sinh học trên
quy mơ cơng nghiệp, góp phần giải quyết những khó khăn về nguồn dược liệu tự
nhiên [6]. Nhiều hoạt chất sinh học dùng làm thuốc đã được sản xuất theo phương
pháp nuôi cấy tế bào thực vật chẳng hạn như Berberin của Yamada và Sato (1981),
Imperatorin của Tsay và cs (1994),...
Cây mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) là cây dược liệu quý được biết đến
nhiều ở các nước Đông Nam Á. Các bộ phận của cây đã được được sử dụng theo
truyền thống để chống sốt rét, cải thiện sinh lý nam giới, chống bệnh tiểu đường,
chống viêm loét và kháng khuẩn [51]. Tuy nhiên, đây là loài cây thân gỗ, sinh
trưởng chậm ngoài tự nhiên, phải trồng mất 5-7 năm mới có thể thu hoạch để dùng
làm thuốc. Mặt khác, sản lượng của cây mật nhân ở Việt Nam đang suy giảm nhanh
chóng do nhu cầu khai thác quá mức, lâm vào tình trạng gần như tuyệt chủng. Vì
vậy việc nghiên cứu tìm ra phương thức sản xuất sinh khối cây mật nhân nhanh và


3
ổn định nhằm cung cấp nguồn nguyên liệu bền vững cho phát triển ngành dược liệu
là vô cùng cấp thiết.
Xuất phát từ những cơ sở trên tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu
nuôi cấy huyền phù tế bào cây mật nhân (Eurycoma longifolia Jack)” nhằm tạo
ra cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu sản xuất các hoạt chất sinh học thông qua
nuôi cấy tế bào trên quy mô công nghiệp.
2. Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định được đường cong sinh trưởng trong nuôi cấy huyền phù tế bào cây mật
nhân.
- Xác định được lượng sinh khối ban đầu thích hợp cho ni cấy huyền phù tế bào
cây mật nhân trong bình tam giác 250ml trên máy lắc.
- Xác định mơi trường thích hợp cho ni cấy huyền phù tế bào cây mật nhân trong
bình tam giác 250ml trên máy lắc.
3. Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát đường cong sinh trưởng nuôi cấy huyền phù tế bào trong bình tam giác,
trên máy lắc.
- Khảo sát ảnh hưởng của lượng sinh khối tế bào ban đầu đến khả năng tích luỹ sinh
khối của tế bào huyền phù.
- Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng (ĐHST) ở các nồng độ
khác nhau đến khả năng sinh trưởng của tế bào huyền phù cây mật nhân.


4

Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lƣợc về kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật
Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một lĩnh vực của công nghệ sinh học thực
vật. Phương pháp này cho phép tách các cơ quan: mô, tế bào đơn, protoplast từ một
cá thể rồi nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo có bổ sung chất điều hịa
sinh trưởng và những điều kiện ni cấy thích hợp để phân hóa thành cơ quan và tái
sinh thành cơ thể hoàn chỉnh [17]. Bên cạnh việc khắc phục những nhược điểm của
biện pháp nhân giống truyền thống, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật còn thể
hiện nhiều ưu điểm vượt trội như tạo ra lượng lớn cây trồng sạch bệnh, đồng nhất
về mặt di truyền trong thời gian ngắn, tạo ra một lượng lớn sinh khối tế bào phục vụ
cho công nghiệp và y dược [1].
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên cơ sở lý luận khoa học là tính

tồn năng và khả năng phân hóa, phản phân hóa của tế bào thực vật. Cuối thế kỷ
19, nhà bác học người Đức Haberlangt (1902) là người đầu tiên đề xuất phương
pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính tồn năng của tế bào. Theo
ông, mỗi tế bào của bất kỳ cơ thể sinh vật nào đều mang tồn bộ lượng thơng tin di
truyền của cả sinh vật đó, vì vậy khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể
phát triển thành cơ thể hồn chỉnh [23].
Tính tồn năng của tế bào đã được khẳng định bằng cơng trình nghiên cứu
của Stewart và cs (1958) khi nuôi cấy mô rễ cà rốt trên mơi trường đặc có nước
dừa và đã thu nhận được khối mô sẹo gồm các tế bào nhu mô. Khi chuyển mô sẹo
này sang môi trường lỏng có cùng thành phần và ni lắc thì nhận được huyền phù
gồm các tế bào riêng lẽ và các nhóm tế bào. Tiếp tục nuôi cấy trên môi trường lỏng,
không cấy chuyển thì thấy hình thành rễ. Đến những năm 60, khi đồng thời Stewart
(1963), Wetherell và Halperin (1963) cùng thông báo rằng tế bào cà rốt tự do khi
nuôi cấy trên môi trường thạch đã tạo thành hàng ngàn phôi, các phôi này phát triển
qua các giai đoạn giống như q trình tạo phơi bình thường ở cà rốt, lúc này tính
tồn năng của tế bào càng được khẳng định.


5
Từ những khám phá trên, hàng loạt các báo cáo về tính tồn năng của tế bào
đã được thơng báo, hầu như tất cả các cơ quan đều có thể phát triển phôi. Phôi soma
đã được ghi nhận ở nhiều giống như Atrapoda, Begonia, Citrus, Coffea,
Cymbidium, Hordeum, Kalanchoe, Nicotiana, Panax, Ranumculus, Solanum,
Oryza...
Ngày nay bằng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã nhân giống
và phục tráng hàng loạt các cây trồng có giá trị như khoai tây, lan, thuốc lá, dứa, các
cây lương thực, cây ăn quả.... Việc nhân giống này đã trở thành công nghệ và đã
được áp dụng ở nhiều nước trên thế giới [16, 17, 23, 32, 44].
1.2. Nuôi cấy tế bào thực vật
Mặc dù chỉ mới phát triển ở nửa đầu thế kỉ 20 nhưng kỹ thuật nuôi cấy mô tế

bào thực vật đã đạt được những thành công vượt bậc [6]. Điểm ưu việt của ni cấy
tế bào so với cây mọc ngồi tự nhiên là điều kiện vô trùng, sản xuất được các chất
có hoạt tính sinh học trong thời gian ngắn và trên quy mô công nghiệp, đồng thời
tránh được các biến động về thời tiết và điều kiện đất đai [56].
1.2.1. Nuôi cấy huyền phù tế bào
Nuôi cấy huyền phù tế bào là một lĩnh vực của nuôi cấy tế bào thực vật.
Nuôi cấy huyền phù tế bào chứa các tế bào và các khối tế bào sinh trưởng và phân
tán trong môi trường lỏng. Thường được khởi đầu bằng cách đặt khối mô callus dễ
vỡ vụn trong môi trường lỏng chuyển động. Nuôi cấy huyền phù là sự tiến triển từ
thực vật đến mẫu vật đến cuối cùng là dịch huyền phù [6].
Nuôi cấy huyền phù thường tạo nên sự phân rã tốt hơn với chu kì ni cấy
kéo dài hơn. Ni cấy huyền phù có thể được duy trì bằng cách sử dụng phương
pháp ni cấy từ bình tam giác đến hệ lên men trên quy mô lớn. Tế bào ít khi tập
hợp thành cụm [31]. Ni cấy huyền phù tế bào là phương thức được sử dụng nhiều
nhất để nghiên cứu và sản xuất các chất có hoạt tính sinh học cao và r-protein [56],
bên cạnh đó ni cấy huyền phù thích hợp hơn cho việc sản xuất sinh khối của tế
bào thực vật so với nuôi cấy callus do ni cấy huyền phù có thể duy trì và thao tác
tương tự với các hệ thống lên men được ngập chìm trong mơi trường lỏng [6].


6
1.2.2. Sự sinh trƣởng của tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro
Sinh trưởng trong nuôi cấy tế bào thực vật trải qua 4 pha chính [6]:
+ Pha tiềm phát: là thời kì khởi đầu của q trình ni cấy, số lượng tế bào tăng
thường bằng 0 hoặc không đáng kể. Mặc dù số lượng tế bào không tăng lên nhưng
kích thước tế bào lại tăng trong suốt thời kì này. Thời gian pha này tuỳ thuộc vào
loại và tuổi của mơ cấy, đồng thời cịn phụ thuộc vào mơi trường và lượng sinh khối
ban đầu của q trình nuôi cấy.
+ Pha luỹ thừa: tế bào sinh trưởng và phát triển theo hàm mũ. Khi đạt đến mật độ
nhất định, số lượng tế bào không tăng nữa, môi trường dinh dưỡng cạn kiệt dần và

tế bào đi vào giai đoạn ổn định. Thông thường, các hợp chất thứ cấp được tích luỹ ở
giai đoạn này.
+ Pha cân bằng: tế bào ở trạng thái cân bằng động học, số tế bào mới sinh ra bằng
số tế bào chết đi do đó số lượng tế bào là khơng đổi. Tốc độ sinh trưởng phụ thuộc
vào nồng độ cơ chất.
+ Pha suy vong: số lượng tế bào giảm mạnh, sự chết xuất hiện do sự suy yếu bảo
quản năng lượng của tế bào, do sự tích luỹ các sản phẩm độc tố, trong một số
trường hợp không những xảy ra hiện tượng chết mà còn kèm theo sự phân giải tế
bào.
1.2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến nuôi cấy huyền phù tế bào
1.2.3.1. Môi trƣờng nuôi cấy
Chất dinh dưỡng được cung cấp cho tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro
lấy từ môi trường nuôi cấy. Thành phần cấu tạo nên mơi trường ni cấy được chia
thành 4 nhóm: nước cất (95%), môi trường cơ bản bao gồm nguồn cacbon và chất
khoáng, chất ĐHST và các chất khác như agar, agarose (Phytagel và cs). Vì vậy,
vấn đề cần lựa chọn mơi trường thích hợp cho sinh trưởng, phát triển tối ưu cho
từng giai đoạn của hệ mô trong nuôi cấy mô rất quan trọng. Sự sinh trưởng và phân
chia của tế bào thực vật bị tác động mạnh mẽ bởi sự điều chỉnh của nguồn cacbon,
nồng độ photphat, nguồn cung cấp nitơ và các chất ĐHST [56].
+ Nguồn cacbon: các tế bào chưa có khả năng quang hợp để tổng hợp nên
chất hữu cơ do vậy người ta phải đưa vào môi trường một lượng hợp chất cacbon


7
nhất định để cung cấp năng nượng cho tế bào và mô (Debengh, 1991). Thông
thường, saccharose (2-5%) được sử dụng phổ biến nhất trong nuôi cấy mô thực vật.
Saccharose sẽ được enzyme ngoại bào thuỷ phần tạo ra các đường đơn là glucose và
fructose trong q trình ni cấy. Các nguồn cacbon có thể sử dụng là saccharose,
glucose, fructose và sorbitol [56].
+ Nguồn nitơ: tỷ lệ nguồn nitơ tuỳ thuộc vào lồi cây và trạng thái phát triển

mơ. Thơng thường, nguồn nitơ được đưa vào môi trường ở hai dạng là NH4+ và
NO3- (nitrat). Trong đó, việc hấp thụ NO3- của các tế bào thực vật tỏ ra có hiệu quả
hơn so với NH4+. Nhưng đôi khi NO3- gây ra hiện tượng “kiềm hóa” mơi trường vì
vậy giải pháp sử dụng phối hợp cả hai nguồn nitơ với tỷ lệ hợp lý được sử dụng
rộng rãi nhất.
+ Các nguyên tố đa lượng: bao gồm sáu nguyên tố: nitơ (N), phốt pho(P),
kali (K), canxi (Ca), magiê (Mg) và lưu huỳnh (S), tồn tại dưới dạng muối khoáng, là
thành phần của các môi trường dinh dưỡng khác nhau, được sử dụng ở nồng độ trên
30 ppm (tỷ lệ phần nghìn). Mơi trường ni cấy phải chứa ít nhất 25 mmol/l nitrate
và potassium. Các nguyên tố chính khác, như: Ca, P, S và Mg, nồng độ thường dùng
trong khoảng 1-3 mmol/L [7].
Các môi trường khống khác nhau có hàm lượng và thành phần các chất
khống khác nhau, ví dụ thành phần và nồng độ khống của mơi trường White hoặc
Knop khá nghèo nàn, nhưng lại rất giàu ở môi trường MS và B5. Việc lựa chọn thành
phần và hàm lượng khoáng cho một đối tượng ni cấy là rất khó địi hỏi người làm
cơng tác ni cấy mơ phải có những hiểu biết cơ bản về sinh lý thực vật đối với
dinh dưỡng khống.
+ Nhóm ngun tố vi lượng: Fe, Cu, BO, Zn, Mn, Co, I… là các nguyên tố
rất quan trọng cho sự phát triển của mô và tế bào do chúng đóng vai trị quan trọng
trong các hoạt động của enzym. Chúng được dùng ở nồng độ thấp hơn nhiều so với
các nguyên tố đa lượng để đảm bảo sinh trưởng và phát triển bình thường của cây
[16].
+ Các vitamin: Mặc dù cây ni cấy mơ có thể tự tổng hợp được vitamin,
nhưng không đủ cho nhu cầu (Czocnowki, 1952). Do đó, để cây sinh trưởng tối ưu


8
một số vitamin nhóm B được bổ sung vào mơi trường với lượng nhất định tuỳ theo
từng hệ mô và giai đoạn nuôi cấy. Các vitamin inositol, B1 (thiamin) và B6
(pyridocin) là những vitamin cơ bản nhất thường dùng trong môi trường nuôi cấy

với nồng độ thấp khoảng 0,1-1mg/l Linsmaier và Skoog đã khẳng định vitamin B1
là cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của tế bào và rất quan trọng đối với
nuôi cấy mô sau khi nghiên cứu kĩ lưỡng sự có mặt của nó trong mơi trường MS
[16].
+ Dung dịch hữu cơ: có thành phần khơng xác định như nước dừa, dịch
chiết nấm men,... được bổ sung vào mơi trường có tác dụng kích thích sinh trưởng
mô sẹo và các cơ quan. Nước dừa đã được sử dụng vào nuôi cấy mô từ năm 1994.
Trong nước dừa thường chứa các acid amine, acid hữu cơ, đường, ARN và ADN.
Đặc biệt trong nước dừa cịn có chứa những hợp chất quan trọng cho nuôi cấy mô
như: myoinoxitol, các hợp chất có hoạt tính auxine, các gluxid của cytokinin [16].
+ Chất làm đông cứng môi trường: Agar (thạch) là một loại polysacharid
của tảo có khả năng ngậm nước khá cao 6-12g/l. Độ thống khí của mơi trường
thạch có ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng mô nuôi cấy. Nồng độ thạch dao động
trong khoảng 6-10g/l tuỳ thuộc mục tiêu ni cấy.
+ Các chất điều hồ sinh trưởng: Các phytohormon là những chất có tác
dụng ĐHST ở thực vật. Các phytohormon có thể chia thành 5 nhóm: Auxine,
cytokinin, giberillin, ethylen, abscisic acid. Sự phối hợp hay lựa chọn nồng độ các
chất ĐHST sẽ là yếu tố quyết định đến sự thành cơng của q trình ni cấy.
- Auxine: Nhóm này gồm có các chất chính là: IBA, IAA, NAA, 2,4-D trong
nuôi cấy mô thực vật auxine thường được sử dụng để kích thích sự phân chia tế
bào, biệt hố rễ, hình thành mơ sẹo, kìm hãm sự phát triển chồi và tạo ra các rễ phụ
[16]. Lấy ví dụ cụ thể, 2,4-D được bổ sung với nồng độ cao nhằm thúc đẩy sự tăng
sinh của callus [56].
- Cytokinin: Được bổ sung vào mơi trường chủ yếu để kích thích sự phân
chia tế bào và quyết định sự phân hoá chồi bất định từ mô sẹo và cơ quan. Các hợp
chất thường sử dụng là: KIN, BAP, Zip, Zeatin… Tuỳ vào từng hệ mơ và mục đích
ni cấy mà cytokinin được sử dụng ở các nồng độ khác nhau. Ở nồng độ thấp (10-


9

7

- 10-6M) chúng có tác dụng kích thích sự phân bào, ở nồng độ 10-6- 10-5M chúng

kích thích sự phân hố chồi. Trong ni cấy mơ để kích thích sự nhân nhanh người
ta thường xử dụng cytokinin với nồng độ 10-6- 10-4 [3].
- Gibberellin: Nhóm này có khoảng 20 loại hormone khác nhau nhưng quan
trọng nhất là GA3. GA3 có tác dụng kích thích nảy mầm của các loại hạt khác nhau,
kéo dài các lóng đốt thân cành. Bên cạnh đó GA3 cịn có tác dụng phá ngủ của các
phơi, ức chế tạo rễ phụ (Picrick, 1987) cũng như tạo chồi phụ (Street, 1973). Ngồi
ra, nó cịn có tác dụng ảnh hưởng đến sự ra hoa của một số thực vật và có tác dụng
rút ngắn thời gian sinh trưởng dinh dưỡng của cây.
- Abscisic acid (ABA): là chất ức chế sinh trưởng tự nhiên nhưng vẫn được
dùng trong nuôi cấy tế bào in vitro. ABA có ảnh hưởng âm tính đến mơ ni cấy,
khi ABA tương tác với BAP cho hệ số nhân chồi cao hơn khi dùng BAP riêng rẽ
[3]. ABA được sử dụng để gây phôi soma trong hệ thống nuôi cấy mô thực vật và
trong nghiên cứu giống cây tổng hợp. Chống thoát hơi nước, tăng thời gian thích
ứng với điều kiện khí hậu của cây nuôi cấy mô và làm giảm sự mất nước của lá
[55].
- Ethylen: có biểu hiện tác động hai chiều, nó kìm hãm sự hình thành chồi ở
giai đoạn sớm nhưng lại kích thích sự phát triển chồi ở giai đoạn muộn. Trong một
số trường hợp, ethylen có tác dụng kích thích hình thành rễ nhưng một số trường
hợp nó lại kìm hãm q trình này [16].
1.2.3.2. iều kiện ni cấy
Trong nuôi cấy mô tế bào các yếu tố của môi trường vật lý được quan tâm đó
là ánh sáng, độ ẩm, nhiệt độ.
+ Ánh sáng: Ánh sáng có ảnh hưởng tới mẫu cấy thông qua thời gian chiếu
sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng. Với đa số các lồi cây, thời gian
chiếu sáng thích hợp là 8-12 giờ/ngày. Cường độ ánh sáng ảnh hưởng đến quá trình
phát sinh hình thái mơ ni cấy. Cường độ ánh sáng cao kích thích sinh trưởng của

mơ sẹo trong khi cường độ thấp gây nên sự tạo chồi (Ammirato, 1986). Nhìn
chung, cường độ ánh sáng thích hợp cho mơ ni cấy là từ 1000 - 7000 lux
(Moresin, 1974). Bên cạnh thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng thì chất lượng


10
ánh sáng cũng ảnh hưởng khá rõ tới sự phát sinh hình thái của mơ ni cấy. Ánh
sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng, cịn ánh sáng
xanh thì ức chế sự vươn cao của chồi nhưng lại ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của
mơ sẹo. Chính vì vậy mà trong phịng thí nghiệm thường sử dụng ánh sáng của đèn
huỳnh quang với cường độ 2000 - 3000 lux.
+ Nhiệt độ: là nhân tố có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào và các
quá trình trao đổi chất của mô nuôi cấy. Nhiệt độ cho phép tế bào thực vật có thể
sinh trưởng và phát triển trong điều kiện in vitro là từ 23°C đến 29°C (Endress
1994; Fowler 1988).
+ Độ ẩm: Trong các bình ni cấy thì độ ẩm tương đối luôn bằng 100% nên
ta không cần phải quan tâm nhiều đến độ ẩm khi nuôi cấy mô.
+ pH môi trường: Các mô tách rời sinh trưởng tốt trên mơi trường có pH 5,0
– 7,5. Đây là phạm vi pH của dịch nỗn (6,0). Nói chung pH mơi trường được điều
chỉnh 0,5 đơn vị cao hơn giá trị mong muốn để bù đắp cho sự thay đổi không thể
điều chỉnh trong quá trình khử trùng [7].
Trên thực tế pH của mơi trường vì nó ảnh hưởng khá rõ nét tới khả năng hồ tan
các chất khống trong mơi trường, Sự ổn định của môi trường, khả năng hấp thụ
chất dinh dưỡng của cây. Nếu pH thấp (<4,5) hoặc (>7,0) đều gây ức chế sinh
trưởng, phát triển của cây trong nuôi cấy in vitro. Độ pH thường được sử dụng
trong ni cấy mơ tế bào thực vật nói chung từ 5,6 - 6.
+ Lượng sinh khối ban đầu: Theo Helgeson (1979), khối lượng mẫu ban
đầu đưa vào ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh trưởng và phát triển của tế bào ni
cấy in vitro. Cần phải có một lượng tế bào tối thiểu ban đầu thích hợp là 3-5g/dm3
hoặc 0,5 – 2,5 × 105 tế bào/ml.

1.2.4. Các nghiên cứu trong nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất dƣợc liệu
Các cây dược liệu đang được nghiên cứu tập trung trở lại trên toàn cầu. Việc
sản xuất cây dược liệu đặc trưng bởi sự an toàn ngược lại với việc sản xuất dược
liệu từ hoá chất được biết đến bởi sự khơng an tồn cho người sử dụng và cho mơi
trường. Hơn 1/3 dân số thế giới dùng các lồi thực vật và dịch chiết của các loài


11
thực vật để nâng cao sức khoẻ. Hơn 30% tổng số loài thực vật hiện nay được dùng
làm thuốc hiện nay [42]. Trong những năm gần đây, việc ứng dụng các thành tựu
công nghệ sinh học trong nhân giống, tạo dược liệu in vitro ở các loài cây thuốc
quý đang được quan tâm và đã đạt một số kết quả nhất định.
1.2.4.1. Các nghiên cứu trên thế giới
Ngành công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật ra đời hàng năm mang lại
lợi ích rất lớn cho các quốc gia trên thế giới. Bên cạnh khắc phục được các nhược
điểm của canh tác truyền thống, nó cịn thể hiện ưu điểm vượt trội: tạo ra lượng lớn
cây giống sạch bệnh, đồng nhất về mặt di truyền trong thời gian ngắn, tạo sinh khối
tế bào làm nguyên liệu cho công nghiệp và y dược [1].
Nghiên cứu về Zaleya decandra, một loại cây thân bị có nguồn gốc từ Nam
Phi có chứa nhiều alkaloid có hoạt tính dược liệu như morphine, coideine,
papaverine cho thấy rằng callus của tế bào cây này phát triển tốt nhất trên mơi
trường MS có chứa 1,0 mg/l 2,4-D và 2,0 mg/l TDZ [53]. Cây cỏ ban một loại cây
có nguồn gốc từ châu Âu, tên khoa học là Hipericum perforatum với tác dụng đặc
hiệu chữa trị bệnh trầm cảm, chống suy nhược và chống virus hiệu quả đã được
nghiên cứu về việc hình thành chồi từ rễ và callus bởi các nhà khoa học người Nhật
Bản, qua cơng trình nghiên cứu này, họ đã chỉ ra rằng callus được hình thành từ
chồi lá trên mơi trường MS có chứa 0,5 mg/l NAA + 0,1mg/l BA ở 25ºC trong bóng
tối. Callus sau khi được hình thành chuyển sang môi trường được chiếu sáng 3000
lux, 16 giờ/ngày. Rễ sẽ được hình thành từ callus sau 4 tuần [38].
Năm 2007, trên nghiên cứu về callus của lồi mộc thơng hoa nhỏ có tên khoa

học là Clematis gouriana cho thấy sự phát triển callus mạnh mẽ nhất ở môi trường
MS có chứa 1,0 mg/l BAP và 0,3 mg/l NAA. Callus được hình thành lập tức được
chuyển sang mơi trường MS có chứa 4,0 mg/l FAP + 0,5 mg/l IBA để khối callus
có thể phát sinh lồi cây này có tác dụng trị thống phong và quả làm thuốc bổ và lợi
tiêu hố, làm thuốc xổ, làm ra mồ hơi, lợi tiểu và lợi tiêu hoá chồi [50]. Cây màng
màng hoa vàng tên khoa học là Cleome viscosa chứa hàm lượng cao beta carotene,
vitamin C và các chất khống, có tác dụng chữa các bệnh bạch hầu, đau đầu, nôn
mửa, viêm phổi... Loài cây này được nghiên cứu nhằm tạo ra nhiều callus cung cấp


12
cho quá trình tách chiết các hợp chất dược liệu. Cơng trình nghiên cứu năm 2011
cho thấy callus phát triển tốt nhất trên mơi trường có chứa 2,0 mg/l IAA, lượng
callus phát sinh chiếm 59% số lượng mẫu và đạt khối lượng tươi là 84,1± 0,55 mg
[18].
Các nhà khoa học Ấn Độ nghiên cứu trên cây dầu mè Jatropha curcas đã
phát hiện ra callus của loài cây này sinh trưởng tốt nhất trên mơi trường MS có bổ
sung 0,5mg/l 2,4 D và 2% CW, callus hình thành và phát triển nhanh chóng sau 7
đến 30 ngày ni cấy. Trong ni cấy huyền phù tế bào dầu mè, lượng sinh khối thu
được nhiều nhất là vào ngày thứ 21 trên môi trường có chứa 0,5 mg/l 2,4-D với mật
độ tế bào là 1%. Từ ngày thứ 30, sinh khối tế bào giữ ở mức ổn định [51]. Vitex
negundo được biết đến với tên Việt Nam là cây ngũ trảo là một loại Đơng dược có
tác dụng chống khuẩn, giảm đau, kháng viêm và tăng đề kháng. Nghiên cứu cho
thấy môi trường MS có bổ sung 3,0 mg/l 2,4-D + 1,0 mg/l NAA cho phát sinh và
tăng sinh callus nhanh nhất. Callus sáng màu và bở [29].
Nghiên cứu về nuôi cấy huyền phù cây cam thảo Glycyrrhiza inflata đã khảo
sát được đường cong sinh trưởng trên đối tượng này có sinh khối đạt cực đại tại
ngày thứ 21 với sinh khối tươi đạt 50g/ L-1 khi tiến hành chuyển 5g callus vào 80ml
mơi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D, 0,5mg/l NAA, 0,5mg/l 6-BA với tốc độ
lắc 120vòng/phút [61]. Rahman và cs (2012) đã nghiên cứu nuôi cấy huyền phù tế

bào cây cam thảo dây Abrus precatorius đã chỉ ra rằng, đường cong sinh trưởng
trong nuôi cấy tế bào cây này đạt đỉnh tại thời điểm từ 6-8 ngày nuôi cấy trên mơi
trường có bổ sung 0,5 mg/l BAP và 1,0 mg/l NAA. Lồi cây này có tác dụng chữa
nóng sốt, chữa say, giải độc cơ thể, rễ được dùng làm thuốc để chữa bệnh lậu, kinh
nguyệt quá nhiều [54].
Bên cạnh đó,việc nghiên cứu tế bào cây ma hồng nhằm tách chiết một loại
alkaloid có tên ephedrine cho thấy rằng sinh khối tươi callus được hình thành trên
mơi trường MS bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D và 1,0 mg/l KIN, lượng ephedrine tách được
lên tới 14,06 mg/g callus khô [34].


13
Cây Amanu (Petiveria alliacea) là một loài cây mọc dại ở vùng rừng rậm
Amazon. Cây được sử dụng rộng rãi tại các nước Nam Mỹ trong điều trị các chứng
đầy hơi, chống co thắt, chống viêm và nhiễm khuẩn. Ngoài ra, cây này cịn có tác
dụng lợi tiểu, chữa viêm khớp và cả bệnh mất trí nhớ. Nghiên cứu ni cấy ni
cấy huyền phù để quan sát hình thái tế bào cho thấy rằng, tế bào nuôi cấy trong môi
trường lỏng có màu vàng sáng, các khối tế bào rời rạc ở giai đoạn đầu với kích
thước từ 0,5 – 1 mm diameter. Đường cong sinh trưởng trên môi trường có chứa
22,6 M 2,4-D cho sinh khối đạt đỉnh sau 6 tuần nuôi cấy [25].
1.2.4.2. Các nghiên cứu trong nƣớc
Nằm ở vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, Việt Nam được đánh giá là nước đứng
thứ 16 trên thế giới về sự phong phú, đa dạng sinh vật, trong đó độ đa dạng về cây cỏ
khoảng 10.386 loài thực vật có mạch đã được xác định, dự đốn có thể tới 12.000 loài,
trong số này, nguồn tài nguyên cây làm thuốc chiếm khoảng 30% (Trần Cơng Khánh,
2002). Chính vì vậy mà việc phát triển công nghệ nuôi cấy mô tế bào đối với các loài
cây dược liệu ngày càng được chú trọng hơn trong thời gian gần đây.
Hà thủ ô đỏ là một dược liệu quý được sử dụng như một loại thảo dược mang
lại sự trường xuân cho con người. Bên cạnh đó, Hà thủ ơ đỏ cịn có một số cơng
dụng khác: rễ và thân có tính kháng khuẩn, chống xơ cứng động mạch, chống co thắt

ruột, sử dụng để cầm máu, dùng làm thành phần của thuốc trợ tim, làm thuốc giảm
đau và làm thuốc bổ; lá và rễ dùng làm thuốc bổ gan và thận, chống lão hóa; thân
điều trị chứng mất ngủ, suy nhược thần kinh, có thể dùng để trị bệnh nấm ngồi da,
tồn cây dùng để giải nhiệt hạ sốt. Các hợp chất có giá trị trong cây Hà thủ ơ đỏ:
emodin, physcion, rhein, lecithin, catechin(Dương Tấn Nhựt, 2006; Đỗ Tất Lợi,
2005). Lin (2003) đã xác định các cây Hà thủ ô đỏ có nguồn gốc in vitro sẽ cho tỉ lệ
các chất emodin và physcion cao hơn so với cây ngoài tự nhiên. Một trong những
kỹ thuật để nhân nhanh số lượng cây này được biết đến là tạo phôi soma. Nghiên cứu
của Huỳnh Thị Đan San trên loài cây này đã chỉ ra rằng mô sẹo 8 tuần tuổi trên môi
trường MS có bổ sung NAA 2mg/l kết hợp với BA 0,5 mg/l chuyển sang mơi
trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l (1 tuần) và MS không bổ sung chất điều hòa


14
sinh trưởng thực vật sau 2 tuần xuất hiện khối phơi hình cầu. Tiếp tục chuyển phơi
hình cầu sang mơi trường MS có bổ sung NAA 0,5 mg/l kết hợp với BA 0,5 mg/l và
10% CW những phơi hình cầu tiếp tục phát triển qua giai đoạn phơi hình tim và phôi
tử diệp. Mô sẹo tăng sinh nhanh trên môi trường có bổ sung 2,0 mg/l NAA và
0,5mg/l BA [11].
Một cây thuốc khác rất quý ở Việt Nam đó là cây trinh nữ hồng cung (Crinum
latifolium) có tác dụng điều trị xung huyết, thấp khớp, đắp mụn nhọt và áp xe. Dịch
trinh nữ hoàng cung được dùng để nhỏ chữa đau tai (Võ Văn Chi, 1997). Gần đây, tác
dụng chống ung thư của trinh nữ hoàng cung đã được phát hiện làm nó trở thành cây
thuốc tiềm năng có giá trị chữa bệnh ung thư. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng mơ sẹo
hình thành sau khi ni cấy từ 7 đến 30 ngày. Môi trường cho tỉ lệ tạo mơ sẹo đối với
củ cây trinh nữ hồng cung tốt nhất là MS bổ sung 30g/l saccharose, 7g/l agar và 2,5
mg/l NAA cho tỉ lệ tạo mô sẹo sau 20 ngày đạt tới 93,75% [5].
Với cơng trình dịng hố cây thanh hao (Artemisia annua L.) in vitro Nguyễn
Thị Kim Uyên và cs (2007) đã nhân giống trên môi trường LV bổ sung BAP, NAA
và 2,4-D riêng rẽ thì khơng kích thích phát sinh phơi soma nhưng khi bổ sung

NAA và 2,4-D lại kích thích tạo rễ. Bổ sung kết hợp BAP 0,5mg/l và NAA 0,5mg/l
cho tế bào soma phát sinh đồng đều; cả BAP, NAA và 2,4-D đều có tác dụng kích
thích tăng tế bào soma và mơi trường thích hợp nhất cho nuôi cấy tăng sinh tế bào
soma là mơi trường LV có bổ sung BAP 0,5mg/l + NAA 0,5mg/l. Qua nghiên cứu
cũng thấy rằng, cần thiết nuôi cấy tế bào soma trong điều kiện có chiếu sáng trên
mơi trường bán rắn và lỏng [25]. Năm 2007, cơng trình nghiên cứu ni cấy tế bào
cây thơng đỏ - lồi cây q hiếm có giá trị chiết xuất taxol phịng chống bệnh ung thư
cho thấy môi trường nuôi cấy cơ bản WPM bổ sung CW (10%), vitamin B1 (5mg/l),
glycin (5mg/l), saccharose (30g/l), BA (0,1mg/l), NAA (0-1-3-5-7mg/l). Tỷ lệ phát
sinh phôi soma cao nhất 93,33% (với mẫu nuôi cấy là thân) và 96,67% (với mẫu
nuôi cấy là lá) ở nồng độ NAA (3mg/l), kết quả tương tự 90% (mẫu thân) và 93,33%
(mẫu lá) được ghi nhận với nồng độ NAA (5mg/l). Trọng lượng tươi tế bào soma
tăng lên cao nhất 2,10g (với mẫu nuôi cấy là thân) và 2,23g (với mẫu nuôi cấy là lá)
ở nồng độ NAA (3,0 mg/l), kết quả được ghi nhận thấp hơn 1,57g (mẫu thân) và


15
1,67g (mẫu lá) ở nồng độ NAA (5mg/l) [12].
Phạm Thị Bích Ngọc và cs (2008) nghiên cứu sự phát sinh chồi từ mô sẹo
cây dây chiều (Tetracera scandens L.) là một nguồn dược liệu quan trọng, góp phần
điều trị một số bệnh như: phù thận, lợi tiểu, gout…Mô sẹo được tạo ra từ lá trên
mơi trường MS có bổ sung 2,5 mg/l 2,4-Dvà 0,5 mg/l BA. Trước khi cảm ứng tạo
chồi, mơ sẹo được tăng trưởng trên mơi trường có bổ sung 0,5 mg/l BA và 0,5 mg/l
GA3. [8].
Cây bèo đất có tên khoa học là Drosera burmani là một lồi thảo dược chứa
nhiều hợp chất thứ cấp có giá trị y dược như: plumbagin, 7-methyljuglone, quercetin,
myrictin, trong đó nhóm chức quinone nổi bật với tác dụng kháng lao, chống ung thư,
chữa phong, chống hen suyễn... Kết quả nghiên cứu về mô sẹo và dịch huyền phù cho
thấy môi trường tạo mô sẹo tốt nhất là Gamborg’s B5, saccharose 20g/l, casein
100mg/l, PVP 1g/l. Hoocmon thích hợp để cảm ứng tạo mô sẹo là 2,4-D 0,2mg/l, NAA

0,2 mg/l. Kiểu tăng sinh mô sẹo tối ưu nhất là nuôi cấy huyền phù tế bào và giúp khối
tế bào tăng trưởng mạnh nhất vào ngày thứ 12 [10].
Trầm hương tên khoa học là Aquilaria crassna có tác dụng ức chế sự co bóp
tự chủ của hồi tràng và chống co thắt cơ trơn do histamin và acetylcholin gây ra.
Ngồi ra, nó thường được dùng điều trị các chứng đau ngực, đau bụng, nấc, nơn,
hen suyễn, thận khí hư... Khi ni cấy tế bào soma trên môi trường lỏng, với sinh
khối ban đầu nuôi cấy là 1g/65ml trên mơi trường có bổ sung 2,4-D, tế bào soma phát
sinh nhanh, có màu trắng trong; mơi trường có bổ sung BAP + NAA + KIN +
vitamin B5 cho tế bào soma trắc đục sữa [2].
1.3.
1.3.1.

iới thiệu về cây mật nhân
ặc điểm hình thái
Cây mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) thuộc họ Thanh thất

(Simaroubaceae), bộ Sapindales. Mật nhân là loài cây gỗ nhỏ, cao từ 2 – 8m, cá
biệt có cây cao hơn. Thân nhỏ, ít phân cành, lá kép lông chim một lần lẻ, mọc so le.
Mỗi lá kép gồm từ 21 – 41 lá chét, mọc đối, hình bầu dục, cuống lá rất ngắn, gốc lá
thn, đầu nhọn, mặt trên bóng, mặt dưới có lơng màu xám. Hoa chùm kép mọc ở
thân hoặc đầu cành, cuống có lơng màu rỉ sắt. Hoa màu vàng hoặc đỏ nâu mọc


16
thành chùm, đơn tính khác gốc nên mỗi cây chỉ trổ hoa đực hoặc hoa cái. Hoa nở
vào tháng 3 – 4. Đài hoa có 5 – 6 lá đài nhỏ hình tam giác, có tuyến ở lưng. Tràng
hoa 5, cũng có tuyến. Bầu có 5 nỗn, hơi dính ở gốc. Quả hạch, hình trứng dài 1 –
2cm, rộng 0,5 – 1cm, vỏ nhẵn có rãnh dọc, khi chín quả màu đỏ sẫm chứa 1 hạt.
1.3.2. Phân bố
Mật nhân là một trong những loài thảo mộc nhiệt đới phổ biến, có xuất xứ từ

các quốc gia Đơng Nam Á như Malaysia, Indonesia Việt Nam, Campuchia,
Myanmar và Thái Lan [24]. Mật nhân mọc hoang ở vùng núi, trong các rừng thưa,
dưới tán các cây gỗ lớn [27].
Tại Việt Nam, mật nhân có mặt trong vườn quốc gia Bái Tử Long, khu Bảo
tồn thiên nhiên Đồng Sơn – Kỳ Thượng, Hoành Bồ, Quảng Ninh, một số rừng ở
Tây nguyên. Trong đó có cả ở Quảng Nam như các huyện Phước Sơn, Đông Giang,
Tây Giang, Nam Giang.
1.3.3. Thành phần hoá học
Rất nhiều hợp chất hữu cơ của cây mật nhân đã được tách chiết và mô tả, đặc
biệt là các hợp chất từ rễ loài cây này. Chúng bao gồm cathin-6-one, alkaloids, βcarboline alkaloids, quassinoids, quassinoid diterpenoids,
tirucallane

-type

triterpenes,

squalene

deri-vatives,

eurycomaoside,
biphenylneolignans,

eurycolactone, laurycolactone and eurycomalactone [20, 22, 43, 48, 49].
1.3.4. Tác dụng dƣợc lý
Tất cả các bộ phận của cây đều được sử dụng cho sản xuất thuốc chữa bệnh
(Jiwajinda và cs, 2002; Osman và cs, 2003). Lá được sử dụng để điều trị tiêu chảy,
sốt, sưng tuyến, chảy máu, bệnh phù, ho dai dẳng, tăng huyết áp, giảm đau trong
xương và bệnh sốt rét. Vỏ nghiền thành bột được sử dụng để điều trị vết thương, u
nhọt, lở loét do bệnh giang mai và đau đầu. Rễ được nghiền thành bột hoặc dịch

chiết từ rễ được sử dụng như thuốc bổ cho phụ nữ để phục hồi sau khi sinh (Bedir
và cs, 2003) [27].
Các hợp chất như các quassinoids, canthin-6-alkaloids, alkaloids- βcarboline, eurycomaoside, các dẫn xuất của squalene và biphenylneolignans đã


17
được tìm thấy ở rễ. Một số các thành phần này đã được chứng minh là có khả năng
gây độc tế bào, chống sốt rét, chống các khối u, hạ sốt (Ismail và cs, 1999;
Jagananth và cs, 2000, Jiwajinda và cs, 2002; Abd Razak, 2007). Ngoài ra, các chất
chiết xuất từ cây này đã được chứng minh là tăng tính cường dương ở nam giới và
kích thích tình dục [30].
Năm 2010, nghiên cứu của Bhat R và Karim AA về đặc điểm thực vật học
và đặc tính dược lý quan trọng của cây mật nhân đã nhận thấy các bộ phận của cây
chứa rất nhiều các hợp chất có hoạt tính sinh học khác nhau như eurycomaoside,
eurycolactone, eurycomalactone, eurycomanone, và pasakbumin-B trong số đó các
alkaloit, quassinoids chiếm một phần lớn. Chúng được sử dụng để chống sốt rét,
chống ung thư, tăng khả năng sinh lý ở nam giới, chống bệnh tiểu đường, kháng
khuẩn và hạ nhiệt [24].
1.3.5. Các nghiên cứu trên đối tƣợng
Kuo và cs đã nghiên cứu và tách chiết gần 65 hợp chất hữu cơ từ rễ của mật
nhân trong đó có các hợp chất như eurycomalide A; eurycomalide B; 13, 21dihydroxyeurycomanol và 5, 14, 15-trihydroxyklaineanone [45]. Trong một nghiên cứu
khác, Chan và cs đã phát hiện ra một loại quassinoid glycoside mới có tên
eurycomanol-2-O-β-D glycopyranoside có khả năng chống sốt rét [26], còn Tada và
cs đã tách chiết được 4 loại quassinoid có khả năng chống viêm loét [59].
7 loại quassinoid khác được tìm thấy từ lá cây mật nhân. Những hợp chất này
có khả năng chống lại các khối u ác tính và kháng khuẩn [40]. Hussein và cs (2005)
đã nghiên cứu về sự nhân giống cây mật nhân thông qua sự phát sinh phôi vô tính.
Kết quả cho thấy, phơi callus có năng suất cao (60%) thu được khi thực hiện
phương pháp cắt lá mầm như loại 4 nuôi cấy trong môi trường MS cơ bản có chứa
0,5 mg/l KIN và 1,0 mg/l 2,4-D. Số phôi callus cao nhất (45 ± 2) trong môi trường

bổ sung 1,0 g/l than hoạt tính. Sau đó chuyển các phôi soma trưởng thành vào trong
môi trường MS cơ bản bổ sung 1,0 mg/l KIN thì tạo ra 90% cây non tái sinh [36].
Nghiên cứu của Rosli và cs về các yếu tố ảnh hưởng đến sự tích lũy hợp chất 9methoxycanthin-6-one trong nuôi cấy callus Eurycoma longifolia Jack. 9-


18
methoxycanthin-6-one là 1 hợp chất có khả năng chống khối u với thành phần môi
trường và các yếu tố vật lí khác nhau. Kết quả cho thấy, 9 methoxycanthin-6-one
được tạo ra nhiều nhất (3,84 mg/g-1 DW khô) trong môi trường ¾ MS cơ bản với
hàm lượng đường là 2% (w/v) bổ sung 2,0 mg/l dicamba và điều kiện pH =5.5 (1,53
mg/g-1 DW). Nghiên cứu này cho thấy rằng việc sản xuất thành công của 9methoxycanthin-6-1 trong nuôi cấy in vitro có tiềm năng trong sản xuất quy mơ lớn
trong hệ lên men [57].
Nghiên cứu của Jiwajinda và cs về các loại quassinoids chống hoạt động
thúc đẩy khối u và chống ký sinh trùng từ cây mật nhân. Kết quả nghiên cứu cho
thấy, 14,15 β-dihydroxyklaineanone (5, IC50 = 5 mM) là hợp chất hoạt động mạnh
nhất để ức chế khối u do virus Epstein–Barr. Chất 11-Dehydroklaineanone và 15βO-acetyl-14-hydroxyklaineanone cho hoạt động hiệu quả để chống sốt rét (IC50 =
2 mg / ml). Vì vậy, mật nhân đã được đề xuất là cây thuốc có giá trị dược liệu cao
do sự xuất hiện của một loạt các quassinoids [41]. Mahmood và cs đã nghiên cứu
xác định và tối ưu hóa auxine phù hợp để kích thích mơ sẹo cây mật nhân. Việc
ni cấy kích thích mơ sẹo với các bộ phận lá, cuống lá, thân, rễ, rễ sợi, lá mầm và
phôi đã thành công khi sử dụng các loại auxine khác nhau như 2,4-D, IAA, NAA,
picloram và dicamba. Kết quả các thí nghiệm sau 1 tháng cho thấy sự hiện diện của
2,4-D là thích hợp nhất [46].
Trong nghiên cứu về sự ra rễ của cây mật nhân in vitro Hussein S và cs đã
tiến hành khảo sát ảnh hưởng của chất ĐHST và lượng cacbon thích hợp nhất cho
việc tạo rễ, kết quả xác định được mơi trường thích hợp nhất cho sự tạo rễ từ cây
mật nhân là MS có bổ sung 50g saccharose và 3mg/l NAA [37].
Panjaitan và cs (2012) đã thành công trong việc nghiên cứu về khả năng bảo
vệ tế bào gan từ dịch chiết tế bào rễ cây mật nhân với dung môi là metanol và nước
[52]. Khả năng chống bệnh sốt rét của cây mật nhân cũng đã được nghiên cứu bởi

các nhà khoa học Nhật Bản khi họ phân tích được 4 loại quassinoid, bổ sung thêm
vào danh mục các hoạt chất sinh học có trong cây mật nhân [59]. Một nghiên cứu
khác lại cho thấy rằng, cây mật nhân có khả năng chống lại chứng căng thẳng thần
kinh. Kết quả nghiên cứu trên chuột cho thấy rằng dịch chiết từ cây mật nhân làm


19
giảm hưng phấn thần kinh ở chuột, số lần giảm căng thẳng nhiều nhất được xác
định khi cho chuột uống dịch chiết của cây mật nhân lên đến 18 ± 0,4 lần. Nghiên
cứu này mở ra một phương thuốc mới để chữa các chứng bệnh căng thẳng thần kinh
ở người [19].


20

Chƣơng 2
Ố TƢỢN

V P ƢƠN

P ÁP N

ÊN CỨU

2.1. ối tƣợng nghiên cứu
Tế bào callus được tạo ra từ rễ của cây mật nhân in vitro.

Hình 2.1. Cây mật nhân ngồi tự nhiên

Hình 2.2. Cây Mật nhân in vitro

Hình 2.3. Tế bào callus tạo từ rễ cây
mật nhân in vitro

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Các thí nghiệm được tiến hành từ tháng 10/2012 đến tháng 5/2013 tại phịng
thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học Thực vật, khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học
Sư phạm – Đại học Đà Nẵng.


21
Sơ đồ thí nghiệm
Callus tạo từ rễ cây mật nhân in vitro

Nhân sinh khối callus

Nuôi cấy tế bào huyền phù trong bình tam giác, trên máy
lắc dưới ảnh hưởng của các điều kiện khác nhau

Lượng sinh khối
ban đầu

Chất ĐHST

Xác định điều kiện và mơi trường ni cấy thích hợp cho sinh
trưởng của tế bào
2.2.1. Phƣơng pháp nuôi cấy callus
Khối callus được hình thành từ rễ có màu vàng sáng, rắn và rời rạc được tách
thành những khối callus nhỏ hơn (đường kính khoảng 5mm) ni cấy trên mơi
trường cơ bản MS có 30g saccharose, 8g agar, bổ sung 2,0 mg/l 2,4-D và 0,5 mg/l

KIN. Callus được cấy chuyển lên cùng môi trường mỗi 2 tuần một lần để nhân sinh
khối làm nguyên liệu để nuôi cấy huyền phù.
2.2.2. Phƣơng pháp nuôi cấy huyền phù tế bào cây mật nhân
+ Khảo sát đƣờng cong sinh trƣởng
Nuôi cấy huyền phù được thực hiện bằng cách chuyển 3g callus (2 tuần tuổi)
vào bình tam giác 250ml chứa 50 ml môi trường MS lỏng có chưa 3% saccharose,
bổ sung 2,0 mg/l 2,4-D và 0,5 mg/l KIN. Ni ở tốc độ lắc 120 vịng/phút. Sinh
khối của tế bào được thu và xác định cứ 3 ngày 1 lần trong suốt 21 ngày để xây
dựng đường cong sinh trưởng của tế bào.
+ Khảo sát ảnh hƣởng của lƣợng sinh khối tế bào ban đầu đến khả sinh
trƣởng của tế bào


22
Nuôi cấy với lượng sinh khối tế bào ban đầu khác nhau: 1; 3; 5g trong bình
tam giác 250 ml chứa 50 ml mơi trường MS lỏng có 30g saccharose; 8g agar bổ
sung 2,0 mg/l 2,4-D và 0,5 mg/l KIN; tốc độ lắc 120 vòng/phút. Theo dõi sự tăng
sinh khối tế bào qua 21 ngày nuôi cấy. Thu và xác định sinh khối tươi và khô của tế
bào cứ 3 ngày 1 lần trong suốt 21 ngày nuôi cấy để xác định khả năng sinh trưởng
của tế bào.
+Khảo sát ảnh hƣởng của chất

ST đến khả năng sinh trƣởng của tế

bào
Chuyển 3g callus vào trong bình tam giác 250ml có chứa 50ml mơi trường
MS có bổ sung NAA nồng độ từ (0,5-2,5mg/l); 2,4-D nồng độ từ (0,5-2,5mg/l)
riêng rẽ và 1,5mg/l NAA phối hợp với KIN (0,5-2mg/l) để khảo sát sự tích luỹ sinh
khối tế bào qua 15 ngày nuôi cấy.
Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH xấp xỉ 5,8 trước khi khử trùng ở

121°C trong nồi áp suất. Các thí nghiệm ni cấy in vitro được duy trì ở nhiệt độ 25
± 2ºC, điều kiện chiếu sáng 2000 lux và thời gian chiếu sáng 8-10h/ngày. [6]
2.2.3. Phƣơng pháp xác định sinh khối tế bào
+Sinh khối tươi: Dịch huyền phù tế bào được lọc qua giấy lọc và cân để xác
định sinh khối tươi.
+Sinh khối khô: Sinh khối tươi của tế bào được sấy ở nhiệt độ 50 0C đến khối
lượng không đổi, cân để xác định khối lượng khô.
2.2.4. Xử lí thống kê
Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần, số liệu được xử lý bằng chương trình xử lý
thống kê Statistix version 9.0


23

Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sát đƣờng cong sinh trƣởng của nuôi cấy huyền phù tế bào
Khi chuyển 3g callus vào bình tam giác chứa 50 ml mơi trường MS lỏng có
30g saccharose bổ sung thêm 2,0 mg/l 2,4-D; 0,5 mg/l KIN để theo dõi đường cong

Sinh khối tế bào (g)

sinh trưởng của tế bào huyền phù trong 21 ngày. Kết quả được trình bày ở hình 3.1.

8

0.4

7

0.35

6

0.3

5

0.25

4

0.2

3

0.15

2

0.1

Khối lượng tươi

1

0.05

Khối lượng khơ
0

0
3

6

9

12

15

18

21

Thời gian (ngày)
ình 3.1. ƣờng cong sinh trƣởng của tế bào huyền phù cây mật nhân
Kết quả nghiên cứu cho thấy sinh khối tế bào đạt cực đại ở ngày thứ 15 với
7,53g tươi (0,35g khô). Sau khi đạt đỉnh, sinh khối tế bào giảm dần, lượng sinh khối
giảm cịn 4,77 g tươi (0,22g khơ) sau 18 ngày ni cấy và chỉ cịn 3,26 g tươi (0,12g
khơ) sau 21 ngày nuôi cấy. Lúc này dịch tế bào chuyển sang màu vàng nâu. Có thể
giải thích điều này là do sự tích luỹ các sản phẩm như phenol trong mơi trường do
q trình chuyển hố và trao đổi vật chất của tế bào. Hơn nữa, thời kì này chất dinh


24
dưỡng trong bình đã được tiêu thụ nhiều và cạn kiệt, tế bào chậm sinh trưởng, phát
triển và có thể chết làm dung dịch bên trong bình tam giác hố nâu

ình 3.2. Ni cấy tế bào mật nhân
trên máy lắc

Hình 3.3. Bình tam giác 250ml
chứa tế bào huyền phù

ình 3.4. Sinh khối tƣơi (a) và khô (b) sau 15 ngày nuôi cấy
Đường cong sinh trưởng cho thấy pha tiềm phát của tế bào có thời gian gần 3
ngày. Sau đó tế bào đi vào pha sinh trưởng nhanh kéo dài trong vịng 12 ngày. Pha
cân bằng rất ngắn, sau đó tế bào bước vào pha suy vong sau 18 – 21 ngày nuôi cấy.


25
So sánh với một số nghiên cứu khác, thời gian ni cấy huyền phù tế bào cây
mật nhân trong bình tam giác trên máy lắc tương đương với tế bào cây Curcuma
zedoaria (14-16 ngày) (Nhi, 2005) và Gymnema sylvestre (15 ngày) (Lee và cs,
2006). Tuy nhiên khi nghiên cứu nuôi cấy huyền phù tế bào cây cây cam thảo dây
Abrus precatorius, Rahman và cs (2012) đã chỉ ra rằng đường cong sinh trưởng
trong nuôi cấy tế bào cây này đạt đỉnh tại thời điểm từ 6-8 ngày nuôi cấy [54].
Trong khi đó khi khảo sát đường cong của cây Glycyrrhiza inflata, kết quả lại cho
thấy rằng sinh khối tế bào đạt đỉnh tại thời điểm tại ngày thứ 21 với sinh khối tươi
đạt 50g/ L-1[61].
Một số cơng trình nghiên cứu về nuôi cấy huyền phù ở Việt Nam lại cho kết
quả khác. Cơng trình nghiên cứu đối với cây bèo đất (Drosera burmani) của Quách
Ngô Diễm Phương và cs (2010) cho thấy đường cong sinh trưởng đạt đỉnh tại thời
điểm ngày thứ 12 [10]. Năm 2012, Dương Tấn Nhựt và cs đã nghiên cứu nuối cấy nuôi
cấy huyền phù tế bào cây kiwi lại cho thấy, nhóm tác giả đã sử dụng sinh khối tế bào
thu được ở ngày thứ 16 trong nuôi cấy để làm nguyên liệu cho các thí nghiệm của mình
[9].
Vậy đường cong sinh trưởng trong ni cấy huyền phù của mỗi loài thực vật

khác nhau là khác nhau. Kết quả nghiên cứu của tôi cho thấy, thời điểm 15 ngày là
thích hợp nhất để thu sinh khối của tế bào mật nhân.
3.2. Ảnh hƣởng của lƣợng sinh khối nuôi cấy ban đầu lên sinh trƣởng của tế
bào
Lượng sinh khối ban đầu đưa vào nuôi cấy là một trong những nhân tố quan
trọng trong nuôi cấy tế bào thực vật, nó ảnh hưởng đến các sản phẩm trao đổi chất
của q trình ni cấy (Liang và cs 1991, Rokem và cs 1985).
Kết quả đã cho thấy rằng mật độ tế bào trong bình tam giác phụ thuộc vào
lượng sinh khối mà chúng ta đưa vào ban đầu. Lượng sinh khối ban đầu này có vai
trị quan trọng đến sự tích luỹ sinh khối và các sản phẩm trao đổi chất. Kết quả
nghiên cứu được trình bày ở hình 3.5.