Nuôi cấy huyền phù tế bào

1
Nhóm 7:Nuôi cấy huyền phù tế bào
•
Bản thân mỗi tế bào thực vật là một đơn vị độc lập, nó chứa đựng
tất cả những thông tin di truyền đặc trưng của cơ thể từ đó nó sinh
ra. Cho nên mỗi tế bào có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể mới nhờ
tính toàn năng. Thực vật bậc cao là một nguồn cung cấp các hợp
chất hóa học và dược liệu rất quan trọng. Tuy nhiên trong những
năm gần đây sản lượng các thực vật đó rất khó đảm bảo ở mức ổn
định do hậu quả của một số yếu tố như:
•
- Điều kiện tự nhiên không thuận lợi.
•
- Chi phí lao động ngày càng tăng.
•
- Khó khăn kỹ thuật và kinh tế trong trồng trọt.
•
Phương pháp nuôi cấy huyền phù tế bào (dịch lỏng) của thực vật có
khả năng góp phần giải quyết những khó khăn trên.
2
NỘI DUNG
I. Khái niệm nuôi cấy huyền phù tế bào
II. Lịch sử nghiên cứu
III. Các phương pháp nuôi cấy
IV. Đặc trưng của tế bào nuôi cấy huyền phù
V. Các chỉ tiêu xác định tốc độ sinh trưởng
VI. Ứng dụng của nuôi cấy huyền phù tế bào
VII. Công trình nghiên cứu cụ thể
VIII. Kết luận
3
I. KHÁI NIỆM

♣
Nuôi cấy huyền phù tế bào (cell suspension cultures):
Phương thức nuôi tế bào đơn (single cell) hay cụm
nhiều tế bào (cell aggregate) ở trạng thái lơ lửng
trong môi trường lỏng.
♣
Dịch huyền phù được tạo ra do sự nuôi cấy một
mảnh mô sẹo không có khả năng biệt hóa, trong môi
trường lỏng và được chuyển động trong suốt thời
gian nuôi cấy.
4
♣
Các tế bào tách ra khỏi mô sẹo và phân tán trong
môi trường lỏng.
♣
Sau một thời gian, dịch huyền phù là một hỗn hợp
các tế bào đơn, các cụm tế bào, các mảnh còn lại
của mẫu cấy và các tế bào chết.
I. KHÁI NIỆM
5
♣
1949: Caplin và Steward đã nuôi cấy tế bào thực vật
trên môi trường lỏng có khuấy.
♣
Muis (1954) và Nickell (1956) cho thấy rằng các tế
bào thực vật có thể sinh trưởng được như các cơ
thể vi sinh vật.
♣
1959, Melches và Beckman đã tách và nuôi cấy
thành công tế bào đơn và huyền phù tế bào.

II. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU
6
Nuôi cấy huyền phù tế bào Khoai tây
7
III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY
♣
Tùy điều kiện và mục đích mà có các phương
pháp nuôi cấy tế bào huyền phù khác nhau. Chủ
yếu là phương pháp: Nuôi cấy dịch thể động.
Trong nuôi cấy dịch thể động có hệ thống cung
cấp khí (thổi khí), các khí đều được “vô trùng”.
8
3.1. Nuôi cấy dịch thể động
3.1.1. Nuôi cấy chìm liên tục
♣
Các tế bào được tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng
do chúng được ngâm hẳn vào dung dịch môi trường.
♣
Sự thông khí được thực hiện nhờ máy lắc chạy ở tốc
độ 100 - 150 vòng/phút. Khí đưa vào phải đảm bảo
vô trùng. Quá trình thông khí còn ngăn chặn và làm
giảm sự kết dính của các tế bào với nhau.
III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY
9
III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY
♣
Theo Thomas và Davey
(1975), nuôi cấy huyền
phù tế bào có dung tích
25 ml, tốc độ phù hợp

nhất của máy lắc là 100 –
120 vòng/phút.
♣
Thể tích của môi trường
lỏng cũng phải phù hợp
với kích thước bình nuôi
cấy, thường chiếm 20%
thể tích bình.
Máy lắc tròn
10
♣
Các nuôi cấy quy mô nhỏ và trong những thời gian
ngắn, có thể sử dụng máy khuấy từ ở tốc độ 250
vòng/phút và thời gian cho quá trình nuôi cấy thường
từ 10 – 15 ngày.
♣
Sau đó, các mẫu nuôi cấy phải được cấy chuyển
sang môi trường mới để đảm bảo sự sinh trưởng và
phát triển của các tế bào.
III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY
11
3.1.2. Nuôi cấy chìm tuần hoàn
♣
Các tế bào được nhúng chìm vào môi trường dịch
thể, xen kẽ với những khoảng thời gian được đưa ra
ngoài môi trường.
♣
Quá trình được thực hiện nhờ sự chuyển động “bập
bênh” của các bình nuôi cấy.
III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY

12
III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY
♣
Khi chuyển động:

Khối tế bào ở đầu này được
đưa vào môi trường.

Khối tế bào ở đầu kia tiếp xúc
với không khí.
♣ Steward và cộng sự (1952)
cũng đã thiết kế những bình
nuôi cấy đặc biệt theo
phương pháp nuôi cấy chìm
tuần hoàn.
Hệ thống nuôi cấy chìm tuần hoàn
13
III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY
3.2. Nghiên cứu nuôi cấy huyền phù tế bào bằng
Bioreactor:
♣
Hệ thống nuôi cấy được thông khí hoặc được trao đổi
khí.
♣
Môi trường nuôi cấy có thể dễ dàng thay mới theo từng
thời kỳ.
♣
Tế bào thực vật nhạy cảm với stress hơn vi khuẩn nên hệ
thống bioreactor cho nuôi cấy tế bào thực vật yêu cầu
thường xuyên cải thiện hệ thống thông khí và hệ thống

trộn môi trường.
♣
Tế bào thực vật cần ánh sáng cho quang hợp nên cần có
sự liên kết giữa bioreator với hệ thống chiếu sáng.
14
Tổng hợp lượng lớn sinh khối tảo
15
♣
Takayama và Miasawa là những người đầu tiên sử dụng
bioreactor vào nhân giống cây trồng: nhân củ siêu nhỏ
khoai tây, củ giống hoa ly, hoa lan hồ điệp.
♣
Công nghệ này cho phép nhân nhanh vô hạn các giống
cây trồng nhờ thiết bị bioreactor hoàn toàn tự động hóa.
VD: 1 bioreactor vibro-mixer trang bị với các ống silicone
có khả năng sản xuất 100.000 phôi vô tính của cây trạng
nguyên trong 1lit dịch huyền phù nếu như dung dịch đó
được đặt trên 1tấm giấy lọc và phát triển trong 4 tuần.
III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY
16
♣ Bioreactor sử dụng
trong nuôi cấy mô
tế bào thực vật
được cải tiến từ các
loại bioreactor trong
nuôi cấy tế bào vi
sinh.
III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY
17
♣ Thuận lợi:


Thể tích nuôi cấy
tăng giúp sản xuất
nhiều hơn mà
không cần những kĩ
thuật cao cấp.

Hầu hết các bình
bioreactor được
thiết kế với cơ chế
khuấy bằng cơ học
hay thổi khí để duy
trì nuôi cấy gần như
đồng dạng.
III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY
Hệ thống bioreactor nuôi cấy rễ
tơ nhân sâm Hàn Quốc
18

Khi thao tác nuôi cấy liên tục, môi trường nuôi cấy
và môi trường vật lí có thể được kiểm soát thích
hợp cho sinh trưởng. Điều này không thể thực hiện
với hệ thống nuôi cấy bình tam giác.
♣ Nhược điểm: đòi hỏi thiết bị hiện đại và đắt tiền,
vận hành phức tạp đặc biệt là khâu chống nhiễm
cho huyền phù nuôi cấy.
III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY
19
Bioreactor trong phòng Nuôi cấy mô tế bào và công
nghệ tế bào thưc vật -Viện DT nông nghiệp

20
♣
Nuôi cấy huyền phù tế bào cần một lượng mô sẹo
khá lớn, xấp xỉ 2 – 3 g/100ml dung dịch môi trường
(Helgeson, 1979).
♣
Sau một thời gian, dịch huyền phù là một hỗn hợp
các tế bào đơn, các cụm tế bào, các mảnh còn lại
của mẫu cấy và các tế bào chết.
IV. ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG
NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ
21
♣
Mức độ tách rời của các tế bào phụ thuộc vào đặc
tính của các khối tế bào xốp và có thể được điều
chỉnh bởi thành phần môi trường.
VD: trong nhiều trường hợp, tăng tỷ lệ
Auxin/Cytokinin sẽ sản sinh nhiều khối tế bào xốp.
♣ Theo King và Street (1977), không có một quy trình
chuẩn nào cho nuôi cấy huyền phù tế bào.
IV. ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG
NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ
22
♣
Sinh trưởng và phát triển của tế bào nuôi cấy:

Pha lag: bắt đầu khi đưa mô sẹo vào môi trường, kéo
dài cho tới lần phân bào đầu tiên.

Pha tăng tốc: các tế bào bắt đầu phân chia và số lượng

tế bào tăng dần.

Pha hàm số mũ: số lượng tế bào tăng theo hàm số mũ.

Pha ổn định: số lượng tế bào đạt cực đại và không đổi
theo thời gian, số tế bào sinh ra (do phân bào) xấp xỉ
số tế bào chết đi.
IV. ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG
NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ
23
IV. ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG
NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ
Thời gian
Số
lượng
tế
bào
Pha lag
Pha tăng
tốc
Pha hàm số mũ
Pha
ổn định
24
♣
Để duy trì quá trình nuôi cấy, các tế bào cần được
cấy truyền vào giai đoạn sớm của pha ổn định.

Thời điểm cấy truyền cụ thể dựa vào kinh nghiệm,
nói chung là nên bắt đầu khi mật độ tế bào cực đại.


Mật độ tế bào cực đại trong khoảng 18 – 25 ngày,
với huyền phù sinh trưởng mạnh có thể ngắn hơn, từ
6 – 9 ngày.
IV. ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG
NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ
25
♣
Ở lần cấy truyền đầu tiên, dịch nuôi cần được lọc
nhằm loại bỏ cụm tế bào lớn, các mảnh từ mẫu cấy
ban đầu, sau đó dùng pipet để lấy dịch cấy truyền.
♣
Lượng tế bào đem cấy truyền phải đủ lớn để đảm
bảo mật độ tế bào, vì khi thấp quá các tế bào sẽ
không sinh trưởng được.
VD: đối với tế bào cây sung dâu (Acer
pseudoplatanus) mật độ thích hợp 9 – 15.10
3
tb/ml.
IV. ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG
NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ