Nghiên cứu chiết tách, phân lập và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của hợp chất 6 hydroxy 2,6 dimethyl 2,7 octadienoic acid từ phân đoạn dichloromethane của hoa đu đủ đực

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA HÓA

NGUYỄN ĐỖ NHẬT ANH

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, PHÂN LẬP VÀ HOẠT TÍNH
GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA HỢP CHẤT
6-HYDROXY-2,6-DIMETHYL-2,7-OCTADIENOIC ACID
TỪ PHÂN ĐOẠN DICHLOROMETHANE CỦA HOA ĐU ĐỦ ĐỰC

LUẬN VĂN CỬ NHÂN HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
ThS. Đỗ Thị Thúy Vân

Đà Nẵng - Năm 2020


Nghiên cứu chiết tách, phân lập và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của hợp chất 6hydroxy-2,6-dimethyl-2,7-octadienoic acid từ phân đoạn dichloromethane hoa đu đủ đực
(Carica L.)
Study on extraction, isolation and cancer cell toxicity activity of compound 6-hydroxy2,6-dimethyl-2,7-octadienoic acid from the dichloromethane extract of male Carica
papaya flowers (Carica L.)
SVTH: Nguyễn Đỗ Nhật Anh
Lớp 16CHDE, Khoa Hóa, Trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng
GVHD: ThS. Đỗ Thị Thúy Vân
Khoa Hóa Học, Trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng
Summary
From the original raw papaya flower material, by various methods, the extracts were extracted
with the corresponding organic solvents: n-hexane, chloroform, dichloromethane, ethyl
acetate. By column chromatography, thin chromatography has isolated a pure compound,

symbolized as CP9. The result of determining the pure substance structure by modern
spectroscopic method: 1H-NMR, 13C-NMR and HSQC, HMBC spectroscopy spectroscopy,
concluded that this pure compound is 6-hydroxy-2,6- dimethyl-2,7-octadienoic acid (CP9).
After testing the cytotoxic activity of compound CP9 on cell lines of lung cancer (A549), liver
cancer (Hep 3B), breast cancer (MCF-7), concluded that the compound CP9 exhibited cancer
cell toxic activity on all 3 cell lines
Keywords. Male carica papaya L.; 6-hydroxy-2,6- dimethyl-2,7-octadienoic acid (CP9)
1. Đặt vấn đề
Trong những năm gần đây, theo đà phát triển

phần đã trở về khám phá các tài nguyên thiên

của nền kinh tế, đời sống vật chất và tinh

nhiên thực vật phong phú, đó là nguồn

thần của người dân được cải thiện đáng kể.

nguyên liệu quý giá mà thiên nhiên ban tặng.

Để có thể đáp ứng đủ và tốt các nhu cầu của

Để duy trì và khai thác tối ưu hóa nguồn

người dân thì khơng thể thiếu các dược

ngun liệu quý đó, con người đã vận dụng

phẩm, thực phẩm chức năng bổ sung. Hiện

các kỹ thuật, thiết bị hiện đại vào việc tách

nay, xu hướng nghiên cứu khoa học một

các hợp chất có trong từng bộ phân của cây


một cách hiệu quả góp phần mang lại các

Nguyên... Diện tích trồng đu đủ của cả nước

ứng dụng thiết thực trong đời sống con

ước khoảng 10000 – 17000 hecta với sản

người. Ở mỗi loại thực vật khác nhau sẽ có

lượng khoảng 200 – 350 nghìn tấn quả. Cây

các cơng dụng, hoạt tính khác nhau và các

đu đủ có lợi thế là loại cây dễ trồng, ra quả

hợp chất trong cây cũng vậy, sẽ có những

sớm, năng suất cao đồng thời tồn bộ thân,

hợp chất có hoạt tính cao mang lại hiệu quả

lá, quả đều được sử dụng với nhiều mục đích

nâng cao giá trị sử dụng nhưng cũng có

khác nhau. Ngồi việc lấy quả tươi, dùng

những hợp chất khơng có các đặc tính có thể

làm ngun liệu cho chế biến, đu đủ cịn

ứng dụng được. Do đó, việc đi sâu vào

được trồng để lấy nhựa, dùng làm thức ăn

nghiên cứu các loại cây và tìm ra các chất tạo

chăn ni.

lợi ích là việc làm của các nhà khoa học.

Đu đủ đã được ông cha ta sử dụng với

Đu đủ (Carica papaya L.) là một loại

rất nhiều mục đích khác khác, một trong các

trái cây giàu dinh dưỡng và đang có giá trị

công dụng tốt nhất là các bộ phận của đu đủ

kinh tế hiện nay.

như lá, thân có tác dụng điều trị bệnh sốt rét,

Đu đủ chín có hàm lượng dinh dưỡng

kháng nấm, kháng viêm và còn dùng để sát

cao, theo phân tích thành phần hóa học,

khuẩn... Đã có rất nhiều cơng trình nghiên

trong 100g thịt trái chín có chứa 86,6%

cứu về hoạt tính sinh học của lá đu đủ và đã

nước; 12,1% tinh bột; 0,6% protein; 0,3%

được chứng minh rằng lá đu đủ có khả năng

lipid; năng lượng là 50 calo; 0,7% xơ; 0,5%

chống oxy hóa rất mạnh. Hoạt tính chống

tro; và có khá nhiều khống như: Kali

oxy hóa này chính là do các hợp chất phenol

(204mg); Ca (34mg); P (11mg). Đặt biệt đu

gây ra. Lá đu đủ có hoạt tính kháng khuẩn

đủ cung cấp lượng vitamin rất phong phú:

tốt, có khả năng kháng nhiều loại vi khuẩn

vitamin A (450mg); vitamin C (74mg);

gram âm, gram dương, các loại nấm...

vitamin B1 (0,03mg); vitamin B2 (0,04mg);
P (0,5mg) [1].

Ở nước ta, cao chiết với cồn từ lá đu
đủ được nghiên cứu trong một số mơ hình

Ở Việt Nam, dù chưa xác định được

ung thư thực nghiệm và được chứng minh có

nguồn gốc, xuất sứ nhưng đến nay đu đủ

tác dụng ức chế sự phát triển của khối u gây

được trồng hầu hết ở các tình miền Bắc,

bởi tế bào ung thư Sarcoma TG-180 ở chuột

Trung và Nam. Chúng được trồng chủ yếu ở

nhắt trắng. Người dân đã dùng lá đu đủ chữa

các tỉnh đồng bằng như Hà Tây, Hà Nam,

trị bệnh ung thư. Đầu năm 2010, một nhóm

Hưng Yên, Tuyên Quang, Vĩnh Phúc, Bình

nghiên cứu Nhật Bản và Mỹ đã thơng báo

Dương, Tiền Giang, Sông bé và các tỉnh Tây

dịch chiết nước lá cây đu đủ có tác dụng ức


chế một số dòng tế bào ung thư người như

xác định thành phần hóa học và hoạt tính

ung thư dạ dày, ung thư phổi, ung thư

sinh học của đu đủ. Tuy nhiên, các bài

máu,… Ngoài ra, dịch chiết từ lá đu đủ còn

nghiên cứu về lá đu đủ là chủ yếu, vẫn có rất

có tác dụng hỗ trợ hệ miễn dịch để tấn cơng

ít bài nghiên cứu về bộ phận hoa của chúng.

vào các tế bào ung thư. Bằng cách thúc đẩy

Việc sử dụng hoa đủ đực hiện nay vẫn chỉ

sự gia tăng các sản phẩm cytokine dạng Th1

theo phương thức dân gian, truyền miệng.

như là IL-12p40, IL-12p70, INF-γ và TNF-

Chính vì vậy, việc tìm hiểu thành phần hóa

α, các cytokine này có khả năng chống lại

học và cao hơn nữa là chứng minh được

khối u.

thành phần hoạt chất cụ thể của hoa đu đủ
Năm

1965,

Govindachari

Go,

đực là một việc vô cùng quan trọng và thiết

Nagarajan và Viswanathan đã xác định được

thực nhằm tạo cơ sở khoa học cho việc ứng

cấu trúc của carpaine và Pseudocarpaine là

dụng nguồn nguyên liệu dồi dào sẵn có ở

alkaloid được chiết xuất từ lá đu đủ [2]. Năm

Việt Nam làm thuốc điều trị các căn bệnh

1979, Chung – Shih Tang đã phân lập được

hiểm nghèo này, đặc biệt là ung thư.

2 alkaloid piperideine là dehydrocarpaine I
và dehydrocarpaine II từ lá đu đủ [3]. Ở Việt
Nam, năm 2007, Hà Thị Bích Ngọc đã sử
dụng kỹ thuật HPLC phân tích các chất
carotenoid trong lá đu đủ. Kết quả cho thấy
β – carotene, luteine chiếm tỉ lệ tương ứng là
57,05% và 11,864% so với tổng các chất
carotenoid nhưng không xác định được
lycopene [4]. Năm 2012, Trần Thanh Hà đã
phân lập được 4 chất từ phân đoạn chiết nhexan của lá đu đủ bao gồm β – sitosterol,
daucosterol,

cycloart-23-ene3β,25-diol

(sterculin A) và cycloart-25-ene-3β,24 (R/S)

diol. Trong đó sterculin A và cycloart-25ene-3β,24 (R/S) diol là 2 triecpen lần đầu
tiên phân lập từ lá đu đủ [5].
Công dụng của cây đu đủ rất đa dạng và
có rất nhiều đề tài nghiên cứu đã tập trung

2. Nguyên liệu và phương pháp.
2.1. Nguyên liệu.
Nguyên liệu hoa cây đu đủ đực được
thu hái tại Quảng Nam-Đà Nẵng vào tháng
01 năm 2017. Hoa đu đủ đực đã được định
danh, sau khi được thu hái sẽ được rửa sạch,
phơi, sấy khô và xay nhỏ thành bột để sử
dụng cho nghiên cứu.
2.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu.
Sắc ký lớp mỏng sử dụng bản mỏng
nhôm tráng sẵn silica gel 60GF254, độ dày
0,2mm. Phân lập các chất bằng phương pháp
sắc ký cột với chất hấp phụ là silicagel cỡ hạt
0,040 – 0,063mm Merck và silicagel pha đảo
RP-18. Thuốc thử phun lên bản mỏng chủ
yếu sử dụng dung dịch H2SO4 10%, sau đó
sấy ở nhiệt độ khoảng 110℃. Dung mơi
dùng để chạy cột và triển khai sắc kí lớp


mỏng bao gồm n-hexan, CH2Cl2, EtOAc,

dichloromethane và ethyl acetate bằng phễu

MeOH và BuOH loại tinh khiết đã được cất

chiết. Với mỗi loại dung môi thực hiện chiết

lại qua cột trước khi sử dụng để loại tạp

3 lần. Các dịch chiết được cất loại dung môi

chất…

sẽ thu được các cao chiết tương ứng (cao

Các thiết bị xác định cấu trúc chất: Phổ cộng

chiết n-hexan, chloroform, dichloromethane

hưởng từ hạt nhân 1H-NMR,

và EtOAc) để tiếp tục nghiên cứu.

13

C-NMR,

HSQC và HMBC đo trên máy Bruker

2.3.2. Phương pháp tách và tinh chế chất

Avance – 500 MHz, chất chuẩn nội là TMS

Các cao chiết trong các dung mơi

cho 1H-NMR và tín hiệu dung mơi (CDCl3)

khác nhau được tách và tinh chế bằng

Đèn

(UV

phương pháp sắc kí cột kết hợp với sắc kí lớp

BIOBLOCK) bước sóng λ = 254nm và

mỏng với các hệ dung mơi thích hợp. Sắc kí

365nm dùng để soi bản mỏng.

cột thường sử dụng silicagel pha thuận và

cho

13

C-NMR.

tử

ngoại

Ngồi ra cịn dùng một số trang thiết bị

pha đảo. Đối với các chất có khối lượng phân

khác như máy quay cất chân không, máy sấy,

tử khác nhau có thể sử dụng sắc kí cột

máy nung, máy siêu âm, cân phân tích, cốc

Sephadex LH–18. Trường hợp cần thiết có

thủy tinh, bình tam giác, các loại pipet, bình

thể chạy cột lặp lại nhiều lần hoặc dùng

định mức, giấy lọc, cột sắc ký…

phương pháp kết tinh phân đoạn, kết tinh lại

2.3. Phương pháp nghiên cứu

để tinh chế chất. Kiểm tra độ tinh khiết của

2.3.1. Phương pháp chiết mẫu thực vật:

các chất cũng như theo dõi q trình tách

Rót dung mơi tinh khiết (H2O, MeOH) vào

chất trên cột bằng sắc kí lớp mỏng với hệ

bình cho đến bề mặt của lớp bột cây. Chiết

dung mơi thích hợp.

mẫu ở nhiệt độ từ 800℃ – 900℃. Sau đó,

2.3.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa

dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ

học của các hợp chất

giấy lọc. Quá trình chiết được lặp lại nhiều

Việc xác định cấu trúc hóa học của

lần, mỗi lần chiết khoảng 24h. Gộp dịch

các chất sạch được thực hiện thông qua việc

chiết, cất loại dung môi dưới áp suất thấp

đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và

bằng máy quay cất chân không, thu được cao

hai chiều (1D và 2D-NMR) như 1H–NMR,

chiết tổng. Có thể gia tăng hiệu quả chiết

13

bằng cách thỉnh thoảng đảo lộn, xốc đều

2.4. Điều chế các cao chiết

hoăc sử dụng máy siêu âm. Cao chiết tổng

2.4.1. Điều chế cao tổng (cao methanol)

này được chế thêm nước và chiết phân lớp
lần

lượt

với

n-hexan,

chloroform,

C–NMR, HSQC, HMBC.


Nguyên liệu là hoa đu đủ đực sau khi thu
hái, rửa sạch, phơi, sấy khô, rồi đem xay nhỏ

loại dung mơi dưới áp suất thấp thu được 54g
cao n-hexane.

thì được 5 kg bột.

Phân lớp với chloroform, chiết 2 lần,

Lần 1: Cho 5kg bột nguyên liệu vào bình

mỗi lần khoảng 5 lít chloroform. Sau đó cất

cầu, cho 8 lít dung dịch methanol, ngâm

loại dung môi dưới áp suất thấp thu được 12g

khoảng 12 giờ. Cho vào máy siêu âm sử

cao chloroform.

dụng tần số 40kHz khoảng 2 giờ. Sau đó lấy

Phân lớp với dichloromethane, chiết

dịch chiết đem cất loại dung môi đến gần kiệt

2 lần, mỗi lần khoảng 5 lít dichloromethane.

thì tạo được dịch đặc.

Sau đó cất loại dung mơi dưới áp suất thấp

Lần 2: Cho 8 lít dung dịch methanol vào

thu được 52g cao dichloromethane.

bả nguyên liệu đã chiết lần 1, tiếp tục ngâm

Phân lớp với ethyl acetate, chiết 2 lần,

khoảng 12 giờ. Cho vào máy siêu âm sử

mỗi lần khoảng 5 lít ethyl acetate. Sau đó cất

dụng tần số 40kHz khoảng 2 giờ. Sau đó lọc

loại dung mơi dưới áp suất thấp thu được 20g

lấy dịch chiết đem cất loại dung môi đến gần

cao ethyl acetate.

kiệt, thu được dịch đặc.

2.5. Phân lập các hợp chất CP9 từ cao

Lần 3: Tương tự như 2 lần trên. Tiếp túc

CPD

cho 8 lít dung dịch vào bã nguyên liệu

Cao chiết dichloromethane (CPD, 52g) được

methanol đã chiết lần 2, ngâm khoảng 12

hòa

giờ. Cho vào máy siêu âm sử dụng tần số

dichloromethane, sau đó tẩm với 150g silica

40kHz khoảng 2 giờ. Sau đó lọc lấy dịch

gel, cất quay cho đến khi bột tơi khô. Tiến

chiết đem cất loại dung môi sẽ thu được dịch

hành phân tách hỗn hợp này bằng cột silica

đặc cuối cùng.

gel pha thường, rửa giải gradient bằng hệ

2.4.2. Điều chế cao n-hexane (CPH),

dung môi dichloromethane/methanol với độ

chloroform

phân

(CPC),

dichloromethane

(CPD), ethyl acetate (CPET)

tan

với

một

cực

lượng

tối

tăng

(dichloromethane/methanol,

thiểu

dần
100:0

→

Dồn dịch đặc sau 3 lần chiết, cất loại

0:100,...) thu được 5 phân đoạn: CPD1

dung mơi và bổ sung 2 lít nước cất, sau đó

(20,6g), CPD2 (4,0g), CPD3 (2,5g), CPD4

phân lớp lần lượt với n-hexane, chloroform,

(3,5g), CPD5 (15,1g).

dichloromethane và ethyl acetate.
Phân lớp với n-hexane, chiết 2 lần,
mỗi lần khoảng 5 lít n-hexane. Sau đó cất

Phân đoạn CPD4 (3,5g) được phân
tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường
với

hệ

dung

môi

rửa

giải

dichloromethane/methanol (20/1, v/v) thu

được 3 phân đoạn: CPD4A (0,6g), CPD4B

DMSO-d6) của CP9 chỉ ra tín hiệu đặc trưng

(1,5g), CPD4C (1,1g).

của 2 proton olefinic methine tại H 6,62 (1H,

Phân đoạn CPD4A (0,6 g) được phân

m, H-3) và 5,86 (1H, dd, J = 11,0; 17,5 Hz,

tách bằng cột silica gel pha thường với hệ

H-7), 2 proton methylene vinylene tại H

dung môi rửa giải dichloromethane/ethyl

5,16 (1H, dd, J = 2,0; 17,5 Hz, H-8b) và 4,97

acetate (2/1, v/v) thu được 4 phân đoạn:

(1H, dd, J = 2,0; 11,0 Hz, H-8a), 4 proton

CPD4A1, CPD4A2, CPD4A3, CPD4A4.

methylene tại H 2,11 (2H, m, H-4) và 1,48

Tiếp tục phân tách phân đoạn

(2H, t, J = 8,0 Hz, H-5), 6 proton methyl tại

CPD4A4 bằng sắc ký cột silica gel pha

H 1,70 (3H, s, H-9) và 1,16 (3H, s, H-10).

thường

Phổ

với

hệ

dung

môi

rửa

giải

13

C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) của

dichloromethane/methanol (10/1, v/v) thu

CP9 chỉ ra tín hiệu của 10 carbon, trong đó

được

có 1 carbon carboxylic acid tại C 169,34

hợp

chất

CP9

(6-hydroxy-2,6-

dimethyl-2,7-octadienoic acid) (10 mg).

(C-1), 1 carbon oxymethine tại C 71,29 (C-

CP9

6), 2 carbon olefinic methine tại C 145,77

(6-hydroxy-2,6-dimethyl-2,7-

octadienoic acid): chất dầu, không màu,
công thức phân tử C10H16O3, M = 184. 1HNMR (500 MHz, DMSO-d6): δH 6,62 (1H,
m, H-3); 2,21 (2H, m, H-4); 1,48 (2H, t, J =
8,0 Hz, H-5); 5,86 (1H, dd, J = 11,0; 17,5 Hz,
H-7); 4,97 (1H, dd, J = 2,0; 11,0 Hz, Ha-8);
5,16 (1H, dd, J = 2,0; 17,5 Hz, Hb-8); 1,70

(C-7) và 141,52 (C-3), 1 carbon methylene
vinylene tại C 111,17 (C-8), 2 carbon
methylene tại C 40,61 (C-5) và 23,08 (C4), 2 carbon methyl tại C 27,67 (C-10) và
12,22 (C-9), 1 carbon bậc bốn tại C 127,83
(C-2). Phổ HMBC của CP9 thể hiện các

C-NMR

tương tác giữa H3-9 (H 1,70) và C-1/C-2/C-

(125 MHz, DMSO-d6): δC 169,34 (C-1);

3; H3-10 (H 1,16) và C-5/C-6/C-7 cho phép

127,83 (C-2); 141,52 (C-3); 23,08 (C-4);

định vị các methyl tại C-9, C-10. Tương tác

40,61 (C-5); 71,29 (C-6); 145,77 (C-7);

HMBC giữa H2-5 (H 1,48) và C-3/C-4/C-

111,17 (C-8); 12,22 (C-9) và 27,67 (C-10).

6/C-7 thiết lập sự hiện diện của một nhóm

3. Kết quả

methylene tại C-5. Thêm vào đó, tương tác

3.1. Kết quả phân lập hợp chất hóa học

HMBC giữa H-8 (H 5,16; 4,97) và C-6/C-7

trong cao chiết dichloromethane.

xác nhận vị trí của nhóm methylene vinylene

Hợp chất CP9 được phân lập dưới dạng chất

tại C-8.

dầu, không màu. Công thức phân tử

Từ các dữ liệu phổ thu được kết hợp với dữ

C10H16O3, M = 184. Phổ 1H-NMR (500 MHz,

liệu phổ của hợp chất tham khảo ở tài liệu[6],

(3H, s, H-9); 1,16 (3H, s, H-10).

13


cho phép khẳng định hợp chất CP9 là 6-

chất CP9 đều thể hiện hoạt tính gây độc tế

hydroxy-2,6-dimethyl-2,7-octadienoic acid.

bào ung thư trên cả 3 dòng tế bào ung thư
khảo sát với các mức độ khác nhau.

4

8

HO

9

3

6

2

1. Trần Thế Tục, Đoàn Thế Lư (2004), Cây

10

HO

1

Tài liệu tham khảo

O

Công thức cấu tạo CP9

Đu đủ và kỹ thuật trồng, Nxb lao động xã
hội.

3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc

2. Govindachari T.R., Naga rajan K. and

tế bào ung thư của hợp chất CP9

Viswanathan N. (1965) “Carpaine and

Hợp chất CP9 có hoạt tính gây độc tế bào
ung thư trên cả 3 dòng tế bào ung thư ở người

pseudocarpaine”, Tetrahedron letters No
24, pp 1907-1916.
Tang

(1979)

“New

A549, MCF-7, Hep3B được thử ở các nồng

3. Chung-Shih

độ khác nhau, cụ thể: A549 với nồng độ IC50

macrocyclic Δ1–piperideine alkaloids from

78,98±4,64µg, Hep 3B với nồng độ IC50

papaya leaves: dehydrocarpaine I and

72,25±3,13µg và MCF-7 với nồng độ IC50

II”,Phytochemistry, 1979, vol 18, pp 651-

54,15±5,89µg.

652.

4. Kết luận
Từ nguyên liệu hoa đu đủ đực, bằng các
phương pháp khác nhau đã thu được các cao
chiết với các dung môi hữu cơ tương ứng: nhexane, chloroform, dichloromethane và

4. Hà Thị Bích Ngọc, Trần Thị Huyền Nga,
Nguyễn Văn Mùi (2007) ‘‘Điều tra hợp chất
carotenoid trong một số thực vật của Việt
Nam“, Tạp chí khoa học ĐHQGHN, khoa
học tự nhiên và công nghệ, (23), pp 130-134.

ethyl acetate.

5. Trần Thanh Hà, Trịnh Thị Điệp (2012)

Bằng phương pháp sắc ký cột, sắc ký bản

“Hai cycloratane triterpene lần đầu tiên

mỏng và các phương pháp phổ hiện đại (1H-

phân lập từ lá Đu đủ (carica papaya L.)“,

NMR, 13C-NMR,…) đã phân lập và xác định

Tạp chí hóa họctập 50 (4A), pp 166-169.

được cấu trúc hợp chất tinh khiết 6-hydroxy-

6. Robert L. Arslanian, Tara Anderson and

2,6-dimethyl-2,7-octadienoic acid (CP9).

Frank

Đã thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của

glucosides

hợp chất CP9 trên các dòng tế bào ung thư

Journal of Natural Products, 53(6), pp.

phổi (A549), ung thư gan (Hep 3B), ung thư

1485-1489.

vú (MCF-7). Kết quả thu được cho thấy hợp

R.

Stermitz
of

(1990),

Penstemon

“Iridoid

ambiguous”,