Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của cây côm (elaeocarpus griffithi)

Luận văn Thạc sĩ 2013

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------------O0O--------------

TRẦN THU TRANG

NGHIÊN CỨU CÁC THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH
GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÂY CÔM (ELAEOCARPUS GRIFFITHI)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TSKH. Phạm Văn Cường

Hà Nội, Năm 2013

1


Luận văn Thạc sĩ 2013
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc
đến TSKH. Phạm Văn Cường người đã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành bản
luận văn này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn toàn thể cán bộ tại phòng Tổng hợp Hữu
cơ -Viện Hóa sinh biển và ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển đã động viên và giúp
đỡ tôi rất nhiều trong việc hoàn thành bản luận văn này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới dự án Pháp – Việt, đặc biệt là Viện Hóa học các
Hợp chất Tự nhiên tại Gif-sur-Yvette (Cộng hòa Pháp) đã đo mẫu và thử hoạt tính
gây độc tế bào các cặn chiết và các chất phân lập được để tôi có thể hoàn thành
bản luận văn này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học và các
thầy cô giáo Khoa Sinh học-Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên-ĐHQG Hà Nội
đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn đến gia đình và bạn bè luôn động viên và ở
bên cạnh giúp đỡ tôi những lúc khó khăn trong cuộc sống để tôi có thể làm việc
tốt và hoàn thành tốt luận văn này.
Hà Nội, ngày 10 tháng 12 năm 2013
Trần Thu Trang

2


Luận văn Thạc sĩ 2013
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
AMEM

Advanced Minimum Essential Medium

ATCC

Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ

CC

Column Chromatography (Sắc ký cột)

13

Carbon Magnetic Resonance Spectroscopy

C-NMR

(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon)
d

Dublet

dd

Dublet của dublet

dt

Dublet của triplet

dq

Dublet của quartet

DMSO

Dimethyl sulfoxyd

DEPT

Distortionless Enhancement By Polarization Transfer (Phổ DEPT)

ED50

Liều tác dụng tối đa trên 50% đối tượng thử.

ESI-MS

Electron Spray Impact Mas Spectroscopy
(Phổ khối va chạm phun mù điện tử)

HSQC

Heteronuclear Spectroscopy Quantum Coherence
(Phổ tương tác dị hạt nhân)

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Correlation (Phổ tương tác liên kết dị hạt
nhân)

1

H-NMR

Proton Magnetic Resonance Spectroscopy
(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton)

1

H-1H-COSY

1

H-1H Correlated Spectroscopy (Phổ tương tác proton-proton)

IR

Infrared Spectroscopy (Phổ hồng ngoại)

IC50

Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của cá thể nghiên cứu

KB

Tế bào ung thư biểu mô

MCF-7

Tế bào ung thư vú

m

Multiplet

MS

Mass spectrometry

3

Luận văn Thạc sĩ 2013
MTT

(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)

NMR

Thin Layer Chromatography (sắc ký lớp mỏng)

TMS

Tetramethylsilan

Trypsin EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)
t

Triplet

TLC

Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng)

SKC

Sắc ký cột

S

Singulet

q

Quartet

J(Hz)

Hằng số tương tác tính bằng Hz

δ (ppm)

Độ chuyển dịch hóa học tính bằng ppm

4


Luận văn Thạc sĩ 2013
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1: Cây Côm (Elaeocarpus griffithi) thuộc họ Côm (Elaeocarpaceae) ...........3
Hình 2. Một số hợp chất alkaloid từ loài Elaeocarpus grandis
Hình 3. Một số hợp chất alkaloid từ loài Elaeocarpus fuscoides..............................5
Hình 4. Một số hợp chất phân lập từ loài E. parvifolius và E. mastersi...................6
Hình 5: Một số hợp chất từ loài Elaeocarpus habbemensis......................................6
Hình 6: Chu kỳ tế bào................................................................................................8
Hình 7: Các tác nhân alkylants .................................................................................9
Hình 8: Những tác nhân chống lại quá trình trao đổi chất........................................10
Hình 9: Ức chế tổng hợp protein...............................................................................11
Hình 10: Các chất đan xen chuỗi ADN.....................................................................11
Hình11: Ức chế enzyme topoisonmerase I và II.......................................................12

Hình 12: Cấu trúc hóa học của hợp chất F1..............................................................13
Hình 13: Cấu trúc hóa học của chất F2......................................................................26
Hình 14: Cấu trúc hóa học của chất F3......................................................................27
Hình 15: Cấu trúc hóa học của chất F4......................................................................29
Hình 16: Khảo sát hoạt tính độc tế bào ung thư vú của chất F2...............................30
Hình 17: Minh họa ảnh hưởng của chất F2 trên dòng tế bào ung thư biểu mô KB...32
Hình 18: Minh họa ảnh hưởng của chất F2 trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7........32

5


Luận văn Thạc sĩ 2013

DANH MỤC CÁC BẢNG
1

Bảng 3.1: Số liệu phổ H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz)
trong DMSO
Bảng 3.2: Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz)
trong DMSO
Bảng 3.3: Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz)
trong DMSO
Bảng 3.4 Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz)
trong DMSO

6

của chất F1
của chất F2
của chất F3

của chất F4


Luận văn Thạc sĩ 2013

MỞ ĐẦU
Ngày nay, cùng với công cuộc phát triển kinh tế thì việc chăm sóc sức khỏe ban
đầu và bảo vệ sức khỏe cộng đồng trở nên cấp thiết đối với mọi quốc gia trên thế giới.
Do vậy, nhu cầu về sử dụng thuốc để phòng ngừa và chữa trị những căn bệnh nan y,
đặc biệt là ung thư ngày càng cao. Hiện nay, một trong những hướng chính để phòng
ngừa và chữa trị bệnh ung thư là nghiên cứu tìm các hợp chất có nguồn gốc từ thiên
nhiên. Theo đánh giá của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), 80% dân số trên toàn thế giới
vẫn tin dùng các loại thảo dược cho việc chăm sóc sức khỏe ban đầu và khoảng hơn
60% các tác nhân hóa trị liệu dùng trong điều trị ung thư có nguồn gốc từ các hợp chất
tự nhiên.[9,15,20].
Nước ta có thảm thực vật vô cùng phong phú và đa dạng. Theo các số liệu
thống kê của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Thế giới (IUCN), thì thảm thực vật Việt
Nam có trên 12.000 loài, trong đó có khoảng 3.200 loài được sử dụng trong dân gian
làm thuốc mới có hoạt tính cao, đã được sử dụng rộng rãi trong việc điều trị bệnh [34].
Ví dụ nổi bật là việc phát hiện ra hai loại hoạt chất tự nhiên Vinblastine và Vincristine
từ cây Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don), họ Trúc đào (Apocynaceae) [19]
và Taxol từ cây thông đỏ (Taxus brevifolia), họ Thông (Pinaceae) [31], cùng với các
dẫn xuất bán tổng hợp như Taxotere từ 10-deacetyl bacatin III hay gần đây hoạt chất
Vinflunine từ Vinorelbine cũng đã chính thức được sử dụng để điều trị cho bệnh nhân
ung thư. Tuy nhiên, còn phần lớn các cây thuốc dân gian vẫn chưa được nghiên cứu
một cách hệ thống. Việc nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học
không những giúp sử dụng các cây thuốc một cách hiệu quả mà trên cơ sở đó còn phân
lập được các hoạt chất để từ đó tiến hành tổng hợp hoặc bán tổng hợp ra các hoạt chất
mới có hoạt tính cao hơn và ít tác dụng phụ hơn trong điều trị.
Mô hình nghiên cứu “Sinh học dẫn đường” nhằm tìm kiếm những chất có hoạt

tính sinh học là mô hình nghiên cứu tiên tiến, có định hướng cao, nhằm làm sáng tỏ
bản chất khoa học của nguồn tài nguyên thiên nhiên, góp phần đưa nhanh các kết quả
nghiên cứu vào áp dụng thực tiễn. Việc nghiên cứu kế thừa và phát huy vốn quí của
dân tộc đặt ra trong lúc này vừa là vận hội và cũng là thách thức đối với những nhà

7


Luận văn Thạc sĩ 2013
khoa học nói chung và cho những nhà nghiên cứu phát triển công nghiệp được nói
riêng. Với mong muốn đóng góp vào việc nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính
sinh học của các thảo dược dân tộc, chúng tôi tiến hành đề tài : “Nghiên cứu thành
phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của cây Côm (Elaeocarpus griffithi).
với nội dung nghiên cứu như sau:
Nội dung
-

Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất trong dịch chiết etylaxetat

-

của cây Côm (Elaeocarpus griffithi), thuộc họ Côm (Elaeocarpaceae).
Khảo sát hoạt tính độc tế bào của dịch chiết etylaxetat tổng cũng như các chất phân
lập được.

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu chung về cây Côm
1.1.1 Mô tả về thực vật

8


Luận văn Thạc sĩ 2013
Côm (Elaeocarpus griffithii) là loại cây đại mộc cao khoảng 10-25m, thân
thẳng, gốc có bạnh bè thấp, cành non màu nâu nhạt, nhánh non có lông mịn. Lá có
phiến mỏng hình mác dài 7-10 cm, rộng 2,5-3,5 cm, đầu có mũi nhọn, mép lượn
sóng, có răng cưa mềm, hoa mọc thành từng chùm ở nách hay đầu cành, đài hoa có
năm lá đài hình tam giác, nhị nhiều. Quả hình thận dài 1,5 cm, đường kính 0,8 – 1cm,
khi chín có màu đen. Gỗ cây màu trắng vàng có thể dựng làm nhà, đóng đồ mộc
thông thường xẻ ván. Nhân dân nhiều nơi thường chặt hạ cây này để mục trong rừng
để gây trồng nấm hương [1,2].

Hình 1: Cây Côm (Elaeocarpus griffithi) thuộc họ Côm (Elaeocarpaceae)
1.1.2. Phân bố sinh thái

Côm (Elaeocarpus griffithii) là loại cây nhiệt đới và cận nhiệt đới, với một
ít là cây ôn đới. Phần lớn các loài cây thường xanh. Cây mọc rải rác trong rừng
thứ sinh ở độ cao từ 400 m trở xuống. Cây ưa sáng, mọc nhanh, thích hợp với đất
sét pha. Tái sinh hạt tốt, ra hoa vào tháng 8-9, có quả chín tháng 12 đến tháng 1
năm sau. [1,2]

9


Luận văn Thạc sĩ 2013
Chúng được tìm thấy ở Madagascar, Đông Nam Á, Malaysia, miền đông
Australia, New Zealand, Tây Ấn và Chile. Họ này chứa khoảng 605 loài cây thân gỗ và
cây bụi trong 12 chi. Ở Việt Nam có 38 loài phân bố từ Tuyên Quang đến Phú Quốc.
Các loài trong họ Elaeocarpaceae phần lớn loài cây này có hoa lưỡng tính hoặc

khác gốc và chúng mọc thành cụm [1,2].
1.2 Những nghiên cứu trước đây về cây Côm (Elaeocarpus griffithii)

Cho đến nay, chưa có công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính
sinh học nào được công bố về loài thực vật này.
Các nghiên cứu về các loài khác thuộc chi này cho thấy thành phần hóa học của
các hợp chất của chi Elaeocarpus rất đa dạng. Nổi bật về thành phần hóa học của các
loài trong chi này là các hợp chất alkaloid. Các chất đã được phân lập từ loài
Elaeocarpus grandis là rudrakine (1), grandisines A (2), Isoelaeocarpiline (3),
grandisines C, D, E, F, and G (4-8) cho thấy khả năng liên kết mạnh với cơ
quan thụ cảm δ-opioid của người với giá trị IC50 nằm trong khoảng 9,9 - 75,4 µg/ml.
Các nhà khoa học đã chứng minh rằng cơ quan thụ cảm δ-opioid có liên quan chặt
chẽ tới các triệu chứng đau kinh niên [6,23].

Hình 2. Một số hợp chất alkaloid từ loài Elaeocarpus grandis

10


Luận văn Thạc sĩ 2013
Trong một nghiên cứu khác về loài Elaeocarpus fuscoides, Anthony R.
Carroll và cộng sự cũng đó phân lập được các alkaloid là elaeocarpenine (9),
isoelaeocarpicine (10), isoelaeocarpine (11) và elaeocarpine (12). Kết quả khảo sát
hoạt tính sinh học cho thấy các hợp chất này có khả năng liên kết mạnh với cơ quan
thụ cảm δ-opioid. Đặc biệt hợp chất 9 cho thấy khả năng liên kết mạnh với cơ quan
thụ cảm δ-opioid với IC50 là 2,7 g/ml [22].

Hình 3. Một số hợp chất alkaloid từ loài Elaeocarpus fuscoides

Ngoài ra, các dẫn xuất của axit ellagic cũng được tìm thấy trong một số loài

của chi Elaeocarpus. Khi nghiên cứu về loài Elaeocarpus parvifolius, K. Nabeta và
cộng sự đã phân lập được các hợp chất là 4-O-methylellagic acid 3 0-(200,300 -diO-acetyl)-a-rhamnoside(13), 4-O-methylellagic acid 3 0 -a-rhamnoside (14), 4-Omethylellagic acid 3 0 -(300 -O-acetyl)-a-rhamnoside (15), and 4-O-methylellagic
acid 3 0 -(400 -O-acetyl)-a-rhamnoside (16)[10]. Trong đó, hợp chất 13 và 15 cho
hoạt tính kháng ký sinh trùng babesia rất đáng quan tâm. Các dẫn xuất của axit
ellagic cũng được tìm thấy trong loài Elaeocarpus mastersii như hợp chất 4,40-Odimethylellagic acid 3-(200,300-di-O-acetyl)-a-l-rhamnoside (17).
Mặt khác, cũng từ loài này, các nhà khoa học đã phân lập được hai hợp chất
triterpen cucurbitacin D (18) và cucurbitacin F (19) có hoạt tính gây độc tế bào rất

11


Luận văn Thạc sĩ 2013
khả quan trên các dạng tế bào ung thư khác nhau với các giá trị ED 50 trong khoảng
0,01 – 1,9 g/ml [5]

Hình 4. Một số hợp chất phân lập từ loài E. parvifolius và E. mastersi
Từ dịch chiết vỏ cây của loài Elaeocarpus habbemensis, thu thập ở phía
nam tỉnh Papua New Guinea, tháng 01 năm 1999. Peter L. Katavic và các cộng sự
đã phân lập được hai hợp chất alkaloid pyrrolidine mới đó là habbemines A (20)
and B (21) như là một đồng phân quang học của nhau. hỗn hợp đồng phân
habbemines A and B cho thấy khả năng liên kết mạnh với cơ quan thụ cảm δopioid của người với IC50 là 32,1 M. [24]

12


Luận văn Thạc sĩ 2013

Hình 5: Một số hợp chất từ loài Elaeocarpus habbemensis

1.3 Tổng quan về bệnh ung thư

1.3.1 Cơ sở khoa học của bệnh ung thư
Ung thư là một tên chung dùng để gọi một nhóm bệnh trên 200 loại khác
nhau về nguồn gốc của tế bào, căn nguyên, tiên lượng và cách thức điều trị nhưng
có những đặc điểm chung, đó là sự phân chia không kiểm soát được của tế bào, khả
năng tồn tại và phát triển của các cơ quan và tổ chức lạ.
Các khối u thường được sinh ra từ một tế bào ban đầu và phải mất nhiều năm
cho tới khi có một kích thước đủ lớn để có thể nhận thấy được. Quá trình phát triển
từ một tế bào duy nhất thành một khối u trải qua nhiều giai đoạn. Thông thường,
các tế bào lành có một tuổi nhất định và tuân thủ theo một quy luật chung là “ phát
triển – già – chết”. Các tế bào chết đi lại được thay thế bằng các tế bào mới. Cơ thể
có một cơ chế kiểm soát quy luật này một cách chặt chẽ và duy trì số lượng tế bào ở
mỗi cơ quan, tổ chức ở mức ổn định.
Bệnh ung thư bắt đầu khi có một tế bào vượt qua cơ chế kiểm soát này của
cơ thể, phát triển và sinh sôi không ngừng, hình thành một đám tế bào có chung một
đặc điểm là phát triển vô tổ chức, xâm lấn và chèn ép vào các cơ quan và tổ chức

13


Luận văn Thạc sĩ 2013
xung quanh. Các tế bào ung thư có liên kết lỏng lẻo, dễ dàng bứt ra khỏi khối u mẹ,
theo mạch máu và mạch bạch huyết di cư đến các tổ chức và các cơ quan mới, bám
lại và tiếp tục sinh sôi nảy nở (quá trình này gọi là di căn). Các ung thư chèn ép
hoặc di căn vào các cơ quan giữ chức năng sống của cơ thể bệnh nhân như não,
phổi, tim, gan... và dẫn đến tử vong.
Ung thư thường gặp nhất là ung thư phổi, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư
ngực và ung thư ruột. Theo thống kê của cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế
(International Agency for Research on Cancer, IARC) thì năm 2002, trên toàn thế
giới ước tính có khoảng 10,9 triệu người mới mắc bệnh ung thư. Nhìn chung số

bệnh nhân ung thư ngày càng tăng.
1.3 .2 Chu kỳ tế bào

Các tế bào của sinh vật Eukaryotae trải qua nhiều giai đoạn nối tiếp nhau và
kết thúc bằng sự phân chia tạo ra tế bào mới. Toàn bộ quá trình tế bào đến tế bào
thế hệ kế tiếp được gọi là chu trình tế bào, gồm 4 giai đoạn: M, G 1, S và G2. Nếu tế
bào có chu kỳ bị tạm thời ngưng trệ hay bị đảo ngược thì được xem như lâm vào
một trạng thái tĩnh lặng gọi là pha G0. [3]

Hình 6: Chu kỳ tế bào
Pha G0 (hay là thời kỳ sau nguyên phân) trong pha này tế bào không tham gia vào
chu kỳ và ngừng phân chia.
Pha G1: Kéo dài từ sau khi tế bào phân chia đến bắt đầu sao chép vật chất di
truyền. Sự tích lũy vật chất nội bào đến một điểm nào đó đạt điểm tới hạn thì tế bào
bắt đầu tổng hợp ADN.
Pha S: là giai đoạn tổng hợp ADN

14


Luận văn Thạc sĩ 2013
Pha G2: Trong suốt giai đoạn này số lượng ADN tăng gấp đôi cho đến khi tế bào
phân chia.
Pha M: là giai đoạn nguyên phân
Các thuốc chống ung thư thường được phân loại theo phương thức hoạt động
của chúng. Nhiều tác nhân chống ung thư hoạt động theo cách thức phụ thuộc vào
chu kỳ tế bào.
• Tác nhân alkyl hóa (alkylants)
• Tác nhân chống lại quá trình trao đổi chất
• Tác nhân ức chế tổng hợp protein ở tiểu đơn vị ribosome

• Các chất tương tác với ADN và phức hệ enzyme ADN
• Gây độc trong quá trình phân bào
• Vacxin và kháng thể
1.3.2.1 Các tác nhân alkyl hóa (alkylants)
Electrophiles là những chất có khả năng liên kết cộng hóa trị với ADN tại một
điểm. Chúng tạo ra liên kết giữa hai điểm trên cùng một sợi ADN (cầu nối sợi đơn)
hoặc trên sợi đôi ADN (cầu nối liên sợi) gây phá vỡ ADN. Trong nhóm này, các ví
dụ điển hình là cyclophosphamide (Endoxan), carmustine, cis-plantin (Neoplatine),
melphalan (Alkeran) và chlorambucil (Leukeran). Các chất trong lớp này hoạt động
trên pha sinh trưởng (G1) của chu kỳ tế bào.

15


Luận văn Thạc sĩ 2013
Hình 7: Các tác nhân alkylants
1.3.2.2 Những tác nhân chống lại quá trình trao đổi chất (ức chế quá trình tổng
hợp acid nucleic).
Cytosine arabinoside là chất can thiệp vào quá trình tổng hợp ADN và chuyển đổi
nhanh chóng vào triphosphate arabinoside cytosine gây tổn thương ADN trong
pha S. Cytosine arabinoside ức chế enzyme ADN, ARN polymerase và enzyme
nucleotide reductase cần thiết để tổng hợp ADN. Khi được sử dụng như là một chức
năng kháng virus thì cytarabine sẽ ức chế deoxycytidine [16].
Methotrexate có khả năng ức chế dihydrofolate reductase (DHFR), một loại enzyme
tham gia vào quá trình sinh tổng hợp axit fonic.[25] Ái lực của methotrexate với
DHFR gấp 1000 lần so với folate. DHFR xúc tác chuyển đổi dihydrofolate đến
hoạt động tetrahydrofolate. Axit folic là cần thiết cho tái tổng hợp nucleoside
thymidine và tổng hợp ADN. Ngoài ra, folate là cần thiết để tổng hợp purine. Do
đó, tất cả tổng hợp purine sẽ bị ức chế. Methotrexate ức chế sự tổng hợp của DNA,
RNAs, và proteins.

5-flourouracile là một trong những chất điển hình của lớp chất chống ung thư loại
này. Hoạt tính chống ung thư của 5-fluorouracile nhờ chuyển hóa thành 5fluorodesoxyuridine monophosphate. Hợp chất này chính là chất ức chế đặc hiệu
đối với thymidilate-synthetase – chất chịu trách nhiệm xúc tác quá trình methyl hóa
axit desoxyuridilique thành axit thymidilic.

16


Luận văn Thạc sĩ 2013

Hình 8: Những tác nhân chống lại quá trình trao đổi chất
1.3.2.3 Tác nhân ức chế tổng hợp protein ở tiểu đơn vị ribosome
Girolline là một dẫn xuất 2-aminoimidazole. Nghiên cứu in vitro cho thấy rằng
girolline có tác dụng ức chế tổng hợp protein và làm ngừng chu kỳ tế bào ở giai
đoạn G2.
Homoharringtonine là một alkaloid được phân lập từ cây Cephalotaxus
harringtonia, thuộc họ (Cephalotaxaceae). Hợp chất này có khả năng ức chế tổng
hợp protein bằng cách tác động sớm vào giai đoạn kéo dài peptide [30].

Hình 9: Ức chế tổng hợp protein
1.3.2.4 Các chất tương tác với ADN và phức hệ enzyme topoisomerase I và II

17


Luận văn Thạc sĩ 2013
Tác nhân đan xen vào chuỗi AND
Doxorubicin tương tác với ADN bằng cách đan xen và ức chế sinh tổng hợp đại
phân tử. [11] [18] Nhờ vào cấu trúc phẳng, doxorubicine có khả năng xen vào giữa
các vòng xoắn được tạo thành giữa các bazơ của chuỗi ADN và như vậy ngăn chặn

quá trình sao mã.
Với cơ chế hoạt động tương tự, trong lớp chất này còn có actinomycin D. [27] Đây
là một cyclopeptid có chứa phần cấu trúc phẳng được hình thành từ các vòng thơm.
ơ

Hình 10: Các chất đan xen chuỗi AND

Ức chế enzyme topoisomerase I và II
Topotecan là một dẫn xuất bán tổng hợp của camptothecin. Camptothecin là một
sản phẩm tự nhiên được chiết xuất từ vỏ cây của loài Camptotheca acuminata.
Topoisomerase-I là một enzyme có chức năng tháo xoắn một mạch. Khi
topoisomerase-I tháo xoắn sợi đơn, topotecan xen giữa các bazơ của ADN. Sự đan
xen này sẽ phá vỡ quá trình sao chép ADN và cuối cùng dẫn đến cái chết của tế
bào. Các tế bào động vật có vú không thể sửa chữa những sợi đôi bị phá vỡ này.[26]
Trong nhóm ức chế enzyme topoisomerase-I, Irinotecan cũng là một trong những
chất điển hình của nhóm này.

18


Luận văn Thạc sĩ 2013
Etoposide tạo thành một phức hợp với ADN và enzyme topoisomerase II, ngăn
ngừa sự co xoắn của sợi ADN và dẫn đến phá vỡ sợi ADN.[13,12].

Hình11: Ức chế enzyme topoisonmerase I và II
1.3.2.5 Gây độc trong quá trình phân bào
Colchicine ức chế vi ống trên thoi gián phân bằng cách liên kết với tubulin, một
trong những thành phần chính của vi ống. Tubulin là cần thiết để điều khiển quá
trình phân bào và do đó colchicine có chức năng như một “chất độc phân bào hoặc
chất độc của thoi” [36].

Vincristine và Vinblastine là alkaloid chiết xuất từ cây dừa cạn Catharanthus
roseus (L.)G.Don. Chúng ngăn chặn nhưng có thể phục hồi được sự phân chia gián
phân ở giai đoạn trung kỳ. Nhờ sự liên kết của thuốc với các vi cấu trúc hình ống
khi gián phân, vincristine ức chế được sự tạo thành thoi gián phân. Trong tế bào ung
thư, vincristine ức chế một cách chọn lọc cơ chế sửa đổi ADN ; và bằng cách ức chế
ARN-polymerase phụ thuộc ADN, vincristine ức chế được sự tổng hợp ARN. Ở
nồng độ cao vinblastine có thể hiện nhiều tác dụng phức tạp tổng hợp acid nucleic
và protein [37].

19


Luận văn Thạc sĩ 2013

Hình 12: Các tác nhân chống lại quá trình phân bào
1.3.2.6 Vacxin và kháng thể
Một cách tiếp cận trong cuộc chiến chống lại ung thư là nghiên cứu vaccin
hoặc các kháng thể đặc hiệu cho các thụ thể của tế bào ung thư. Phát triển trong lĩnh
vực sinh học và công nghệ sinh học để xác định các yếu tố chịu trách nhiệm cho sự
gia tăng của các tế bào khối u và sản xuất kháng thể đặc hiệu.
Vaccin CDX-110 phòng chống các bệnh u thần kinh đệm, một loại u não ác
tính và thường gặp nhất. Vaccin nhắm vào khối u, gây ra một phản ứng miễn dịch
đặc hiệu để chống lại một loại protein ở trên bề mặt của các tế bào ung thư não,
protein này là dạng thụ thể màng tế bào đột biến, có tên gọi là EGFRvIII, liên quan
đến sự tăng trưởng của ung thư.
Các nhà khoa học thuộc Trường Đại học Gorgia Mỹ vừa nghiên cứu một loại
vaccin mang tên Herceptin khả năng phòng ngừa tổng hợp lên tới khoảng 7 loại
ung thư có tỷ lệ tử vong cao như hiện nay: ung thư tiền liệt tuyến, ung thư tụy, ung
thư đường ruột và ung thư buồng trứng…Vaccin này có chứa một lượng nhỏ các
protein có tên là MUC1, có tác dụng luyện tập cho hệ miễn dịch cơ thể, từ đó hệ

miễn dịch có thể nhận biết sự xuất hiện của tế bào ung thư và hệ miễn dịch có thể
chủ động tấn công [38].
Cevac là một loại vắc-xin chống lại bệnh ung thư đại tràng, là một kháng
thể đơn dòng gây ra một phản ứng miễn dịch với CEA (Carcino Embryonic
Antigen). Kháng nguyên CEA này hiện diện trong ung thư ruột.

20


Luận văn Thạc sĩ 2013
Mặt khác, việc điều trị kết hợp các loại vaccin với thuốc hóa trị liệu làm tăng
tỷ lệ sống sót: Herceptin thường gắn liền với taxol và ceavac được dùng cho bệnh
nhân kết hợp với fluorouracil-5 và leucovorin.
Đề kháng với các chất chống ung thư là một trong những thách thức lớn của
hóa trị liệu. Sự đề kháng này được gây ra bởi nhiều yếu tố và cơ chế vẫn chưa được
hiểu rõ. Yếu tố có thể là do:
- Gây ra từ sự sửa chữa ADN giống như polymerase-β.
- Giảm sự xâm nhập của thuốc vào trong tế bào (làm giảm nồng độ của thuốc trong
các tế bào).
- Sự gia tăng từ trong ra ngoài của các khối u tế bào đa kháng .
- Hấp thụ thuốc trong tế bào ngăn, ngăn cản tiếp xúc của thuốc với tế bào mang
bệnh.
- Sự biến đổi hoặc thay đổi enzyme đích.
Điều trị ung thư bằng vaccin cũng có nhiều tác dụng phụ và đôi khi còn gây
chết người. Với những thách thức này, việc tìm kiếm các loại thuốc mới chống ung
thư là cần thiết và các phân tử từ tự nhiên luôn là nguồn tài nguyên quý giá.
1.3.3 Ứng dụng của các hợp chất tự nhiênt trong điều trị ung thư
Hiện nay, ung thư vẫn là bài toán khó đối với y học và là căn bệnh đáng sợ nhất
của con người do chưa có thuốc đặc trị. Vì thế, các nhà khoa học vẫn không ngừng
kiếm tìm các hợp chất mới để tiêu diệt căn bệnh của thời đại, nhất là khi các phương

pháp điều trị hiện nay như hóa trị, xạ trị, phẫu thuật...đều để lại tác dụng xấu, nhiều
bệnh nhân Ung thư chết do suy kiệt trước khi chết vì ung thư
Trong hành trình đó, các nhà nghiên cứu đã tách chiết các hợp chất hóa học
và trên cơ sở đã bán tổng hợp và tổng hợp ra rất nhiều hợp chất có khả năng ức chế
sự phát triển và diệt tế bào ung thư như
Các nhà nghiên cứu tại Viện nghiên cứu Y khoa Sanford-Burnham, đứng đầu
là Kristiina Vuori, MD, Ph.D., đã phát hiện ra một hợp chất tự nhiên là sceptrin

21


Luận văn Thạc sĩ 2013
được tìm thấy trong các loài bọt biển, làm giảm sự di chuyển của các tế bào ung thư
và có độc tính rất thấp.
Những nghiên cứu lâm sàng bước đầu đã chỉ ra rằng Curcumin có tác dụng
tốt với một số bệnh ung thư như: ung thư tuyến tụy, ung thư vú, ung thư da, ung thư
trực tràng…
Một nghiên cứu của Đại học Missouri, Mỹ cho thấy, resveratrol-một hợp
chất được tìm thấy trong quả nho và rượu vang đỏ có thể khiến một số tế bào ung
thư như nhạy cảm hơn với xạ trị.
Ngày nay, các nhà khoa học vẫn đang miệt mài nghiên cứu nhằm tìm được
những hợp chất có hoạt tính cao trong điều trị ung thư
1.4 Các phương pháp nghiên cứu độ độc tế bào
Một vài phép so màu nhanh đã được miêu tả trong thử nghiệm trên các dòng tế bào
ung thư ở mức độ in vitro, trong đó hiện nay người ta thường sử dụng hai phương
pháp là: phương pháp MTT và phương pháp SRB.
1.4.1 Phương pháp MTT
Trong những năm gần đây, phương pháp tetrazolium (MTT) được sử dụng phổ
biến. Phương pháp này lần đầu tiên được miêu tả bởi Tim Mosmann trên tạp chí
Immunological Methods năm 1983 [1]. Theo tác giả, muối tetrazolium được dùng

để triển khai phép thử so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng phát
triển của tế bào động vật. Nguyên lý của phép thử là vòng tetrazolium bám chặt vào
ti thể của tế bào hoạt động, dưới tác dụng của enzym dehydrogenase, màu vàng của
MTT biến đổi thành màu tím formazan. Kết quả đọc trên máy quang phổ và có độ
chính xác cao. Phương pháp được dùng để đo độ độc của chất nghiên cứu, khả năng
phát triển và hoạt động của tế bào.

22


Luận văn Thạc sĩ 2013

1.4.2 Phương pháp SRB
Phép thử SRB được phát triển bởi Philip Skehan và cộng sự năm 1990 để đánh giá
độc tính của chất nghiên cứu và khả năng phát triển của tế bào trong ứng dụng sàng
lọc thuốc ở qui mô lớn. Nguyên tắc của phép thử là khả năng nhuộm màu của SRB
lên protein¸ SRB nhuộm bằng cách phá vỡ màng tế bào, những mảnh vỡ tế bào
không bị nhuộm, do đó không ảnh hưởng đến số liệu thực nghiệm. Phương pháp
SRB dựa trên khả năng liên kết tĩnh điện và sự phụ thuộc vào pH của các dư lượng
amino acid của các protein. Dưới các điều kiện môi trường axit nhẹ, SRB liên kết
với các dư lượng amino acid trên các protein của các tế bào đã được cố định bằng
trichloroacetic acid (TCA) và sử dụng bazơ yếu như Tris-base để hòa tan và đo mật
độ quang của dịch chiết từ tế bào một cách định lượng.
1.5 Phân loại các hợp chất thứ cấp trong thực v t
Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất dùng làm dược liệu hoặc phụ gia
thực phẩm có giá trị. Nhữn sản phẩm này được biết như là các chất trao đổi thứ cấp,
thường được hình thành với một lượng rất nhỏ trong cây và chức năng trao đổi chất
chưa được viết đầy đủ. Chúng dường như là sản phẩm của các phản ứng hóa học
của thực vật với môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động
vật. Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã phát triển

23


Luận văn Thạc sĩ 2013
từ cuối những năm 50 của thế kỷ 20. Các chất trao đổi thứ cấp có thể xếp trong ba
nhóm chính là alkaloid, tinh dầu và glycoside.
Các alkaloid có dạng tinh thể là các hợp chất chứa nitrogen, có hoạt tính sinh lý
trên tất cả động vật và được sử dụng trong công nghiệp dược. Họ alkaloid bao gồm:
codein, caffeine và morphine. Một số loài thực vật chứa nhiều alkaloid như: cây
thuốc phiện (họ Papaveraceate; cây canh kin a (họ Rubiaceae); cây cà độc dược,
thuốc lá và khoai tây. Người ta thường gặp trong một cây tập hợp alkaloid có cấu
trúc hóa học gần giống nhau. Đôi khi toàn cây chứa alkaloid, đôi khi chỉ tập trung
trong lá. Các alkaloid có hoạt tính sinh học rất khác biệt, một số tác dụng lên hệ
thần kinh (caffeine, atropine, strychnine…), một số tác dụng lên các cơ (veratrin,
atropine…), một số tác dụng lên mạch máu, một số khác tác dụng lên bộ máy hô
hấp. Alkaloid thường độc với liều lượng lớn nhưng với liều lượng nhỏ, chúng được
sử dụng làm thuốc chữa bệnh.
Các tinh dầu chứa hỗn hợp terpenoid, được sử dụng như chất mùi, chất thơm và
dung môi. Giống như những lipid khác, các terpenoid không tan trong nước. Terpên
được xây dựng từ những đơn vị 5 carbon và được thiết lập từ nhiều đơn vị isoprene,
ví dụ monoterpene chứa 2 đơn vị isoprene.
Các glycoside bao gồm các hợp chất phenol và flavonoid, saponin và các
cyanogenic glycoside, một số trong chúng được sử dụng làm thuốc nhuộm, chất
mùi thực phẩm và dược phẩm.

24


Luận văn Thạc sĩ 2013

CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu nghiên cứu
2.1.1 Mẫu thực vật
Cây Côm (E. griffithii) được thu hái vào ngày 5 tháng 2 năm 2004 tại Qùy
Châu, Nghệ An và được ThS. Nguyễn Quốc Bình (Bảo tàng thiên nhiên – Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) định tên. Mẫu tiêu bản số VN 1249 được
lưu trữ tại Viện Sinh thái Tài nguyên và Sinh vật – Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam.
Vỏ cây tươi sau khi sấy khô, xay nhỏ thu được 1,4 kg nguyên liệu.
2.1.2. Các dạng tế bào
Các dạng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm: KB (Human
epidermic carcinoma) – ung thư biểu mô, là dòng luôn luôn được sử dụng trong các
phép thử độ độc tế bào; và MCF-7 (Human breast carcinoma) – ung thư vú.
2.1.3 Thiết bị và hóa chất tách chiết mẫu thực vật
Sắc ký bản mỏng phân tích: sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel 60
F254 Merk, độ dày 0,2mm.
Sắc ký cột tổng sử dụng silica gel cỡ hạt 63- 100 mm
Sắc ký cột thường sử dụng silica gel cỡ hạt 40µm - 63 µm
Các loại cột sắc ký với kích cỡ khác nhau.
Bản mỏng được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254, 365nm sau đó
hiện màu bằng thuốc thử Ce(SO4); thuốc thử vanilin-H2SO4 (vanillin 1,2g; MeOH
200ml, CH3COOH 25ml; H2SO4 11ml)
Điểm nóng chảy đo trên máy BUCHI Melting Point B545 (Thụy Sĩ) của viện
Hóa học, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi trên máy Brucker Avance
500MHz viện Hóa học, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Các dung môi như n-hexan, etyl axetat, diclometan, metanol, aceton, etanol
đều được cất lại trước khi sử dụng để chạy sắc ký cột và sắc ký bản mỏng.

25