Đề tài nghiên cứu khoa học và công nghệ cấp trường: Nghiên cứu trích ly thành phần dược liệu từ hoa cúc La Mã Matricaria chamomilla

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA - VŨNG TÀU

BÁO CÁO
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU TRÍCH LY THÀNH PHẦN DƯỢC
LIỆU TỪ HOA CÚC LA MÃ (Matricaria chamomilla)

Chủ nhiệm đề tài: TS. Đặng Thu Thủy (chủ nhiệm)
KS. Nguyễn Văn Toàn

Bà Rịa-Vũng Tàu, tháng 11 năm 2020
i


THÔNG TIN CHUNG CỦA ĐỀ TÀI
Tên đề tài: “Nghiên cứu trích ly thành phần dược liệu từ hoa cúc La Mã
Matricaria chamomilla”
Chủ nhiệm đề tài: TS. Đặng Thu Thủy
Danh sách cán bộ tham gia chính: KS. Nguyễn Văn Tồn
Nội dung chính:
- Nghiên cứu phương pháp chiết tách thành phần dược liệu trong hoa cúc La
Mã;
- Xác định định tính và định lượng nhóm hợp chất hoạt động sinh học của hoa
cúc La Mã;
- Khảo sát hoạt tính sinh học của hợp chất trích ly được.
Kết quả đạt được:
- Đã xác định được thơng số tối ưu cho q trình trích ly thành phần dược liệu
từ hoa cúc La Mã;
- Đã xác định định tính thành phần dược liệu từ hoa cúc La Mã và định lượng

thành phần dược liệu chính trong hoa cúc La mã;
- Đã khảo sát hoạt tính sinh học của thành phần dược liệu trích ly được.
- Đã hướng dẫn luận văn tốt nghiệp 03 sinh viên.
Thời gian nghiên cứu: 10 tháng từ tháng 01/2020-10/2020
CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

TS. Đặng Thu Thủy

i


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.........................................................................4
1.1. Đặc điểm của hoa cúc La Mã...................................................................................4
1.2. Thành phần dược liệu của hoa cúc La Mã................................................................4
1.3. Tác dụng của hoa cúc La Mã....................................................................................8
1.4. Phương pháp chiết tách thành phần hoạt tính sinh học từ hoa cúc La Mã………...9
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............................11
2.1. Đối tượng nghiên cứu.............................................................................................11
2.2. Bố trí thí nghiệm.....................................................................................................11
2.3. Phương pháp nghiên cứu........................................................................................11
2.3.1. Nghiên cứu tối ưu hóa hiệu suất chiết cao cồn bằng phương pháp chưng
ninh.......................................................................................................................11

2.3.2 Chiết tách thành phần dược liệu bằng phương pháp chưng ninh.......13
2.3.3. Chiết cao cồn bằng phương pháp ngấm kiệt...............................................14
2.3.4. Chiết cao cồn bằng phương pháp Soxhlet.................................................14
2.3.5 Chiết tách thành phần dược liệu qua hai giai đoạn: Soxhlet và chưng
ninh.......................................................................................................................15

2.3.6. Phương pháp chiết tách cao etyl acetat và cao ete dầu hỏa từ cao cồn.......16
2.3.7. Phương pháp định tính các thành phần của dược liệu................................17
2.3.8. Định lượng thành phần dược liêu (flavonoid) tổng trong cao etyl acetat...18
2.3.9. Xác định thành phần dược liệu (flavonoid) bằng sắc ký lỏng cao áp ghép
khối phổ................................................................................................................18
2.3.10. Thử hoạt tính sinh học thành phần dược liệu (flavonoid) từ hoa cúc La
Mã……………………………………………………………………………….19
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................21
3.1. Nghiên cứu chiết tách cao cồn................................................................................21
3.1.1. Nghiên cứu tối ứu hoa hiệu suất tách chiết cao cồn bằng phương pháp
chưng ninh............................................................................................................21
3.1.2. So sánh hiệu suất chiết cao etanol bằng phương pháp chưng ninh, ngấm
kiệt, Soxhlet……………………………………………………………………..24
3.1.3. So sánh hiệu suất chiết tách cao etanol bằng phương pháp chưng ninh và
ii


Soxhlet-chưng ninh……………………………………………………………..25
3.2. So sánh hiệu suất chiết tách cao etyl acetat và cao ete dầu hỏa…………………25
3.3. Định tính thành phần dược liệu trong cao chiết thu được từ hoa cúc La Mã……26
3.3.1 Định tính thành phần dược liệu trong cao ete dầu hỏa……………………26
3.3.2. Định tính thành phần trong cao etyl acetate……………………………...27
3.4. Kết quả xác định hàm lượng, thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của thành
phần dược liệu (flavonoid) từ hoa cúc La Mã………………………………………...27
3.4.1. Định lượng thành phần flavonoid trong cao etyl acetat…………………..27
3.4.2. Thành phần các hợp chất flavonoid………………………………………28
3.4.3. Hoạt tính sinh học của flavonoid…………………………………………29
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................................................31
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................32
PHỤ LỤC

iii


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cây hoa Cúc La Mã.
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí nội dung thí nghiệm.
Hình 2.2. Quy trình chiết tách dược liệu bằng phương pháp chưng ninh.
Hình 2.3. Sơ đồ khảo sát chiết cao cồn bằng phương pháp chưng ninh.
Hình 2.4. Sơ đồ khảo sát chiết cao cồn bằng phương pháp ngấm kiệt.
Hình 2.5. Sơ đồ khảo sát tách chiết hợp chất trong hoa cúc La Mã bằng phương pháp
Soxhlet.
Hình 2.6. Sơ đồ khảo sát chiết tách thành phần dược liệu qua hai giai đoạn Soxhlet và
chưng ninh.
Hình 2.7. Sơ đồ chiết cao etyl acetat và ete dầu hỏa.
Hình 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ dung mơi lên mật độ quang.
Hình 3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên mật độ quang.
Hình 3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ dược liệu/dung mơi lên mật độ quang.
Hình 3.4. Ảnh hưởng của thời gian lên mật độ quang.
Hình 3.5. Đường chuẩn xác định flavonoid toàn phần theo Catechin.

iv


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các thành phần hợp chất chiếm tỷ lệ cao trong tinh dầu hoa cúc La Mã.
Bảng 1.2. Các thành phần hợp chất chiếm tỷ lệ cao trong flavonoid.
Bảng 1.3. Các thành phần hợp chất chiếm tỷ lệ cao trong coumarine.
Bảng 3.1. Sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ dung môi.
Bảng 3.2. Sự phụ thuộc của mật độ quang vào nhiệt độ.

Bảng 3.3. Sự phụ thuộc của mật độ quang vào tỷ lệ dược liệu/dung môi.
Bảng 3.4. Sự phụ thuộc của mật độ quang vào thời gian.
Bảng 3.5. Hiệu suất chiết cao cồn theo 3 phương pháp chưng ninh, ngấm kiệt, Soxhlet.
Bảng 3.6. Hiệu suất chiết cao cồn bằng phương pháp chưng ninh và Soxhlet-chưng
ninh.
Bảng 3.7. Hiệu suất chiết cao etyl acetat và cao ete dầu hỏa.
Bảng 3.8. Kết quả định tính thành phần dược liệu trong cao ete.
Bảng 3.9. Kết quả định tính thành phần dược liệu trong cao etyl acetate.
Bảng 3.10. Kết quả xây dựng đường chuẩn theo chất đối chiếu là catechin.
Bảng 3.11. Hiệu suất flanovoid tồn phần.
Bảng 3.12. Cơng thức cấu tạo và định danh một số chất.
Bảng 3.13. Khả năng kháng khuẩn của flanonoid với vi khuẩn.

v


vi


ĐẶT VẤN ĐỀ
Chamomile (Cúc La Mã) hay ở nước ta cịn gọi là Cúc Hoạ Mi là một trong
những lồi thực vật thuộc họ Hoa Cúc có nguồn gốc từ Nam và Đông Âu. Loại thảo
dược này cũng được trồng ở Đức, Hungary, Pháp, Nga, Croatia, và Brazil. Chamomile
được biết đến ở Ấn Độ trong thời kỳ Mughal, bây giờ nó được trồng ở Punjab, Uttar
Pradesh, Maharashtra, Jammu và Kashmir. Các lồi thực vật có thể được tìm thấy ở
Bắc Phi, châu Á, Bắc và Nam Mỹ, Australia, và New Zealand. Hungary là nơi trồng
chính của loại thực vật này. Tại Hungary, Chamomile cũng mọc nhiều ở vùng đất
nghèo và nó là một nguồn thu nhập cho người dân nghèo của khu vực này. Hoa được
xuất khẩu sang Đức với số lượng lớn để chưng cất tinh dầu. Tại Ấn Độ, cây đã được
trồng ở Lucknow khoảng 200 năm trước, và được đưa đến Punjab khoảng 300 năm

trước trong thời kỳ Mughal [6].
Các tác dụng chữa bệnh của Chamomile được loài người phát hiện ra cách đây
hàng ngàn năm từ thời La Mã cổ đại, và cũng đã được ghi nhận trong y văn của
Hippocrate. Người Hy lạp và La Mã cổ đại đã biết dùng Chamomile để chữa bệnh
bằng cách: giã nhỏ đắp hoặc chườm lên các vết thương, vết lt ngồi da giúp phịng
nhiễm khuẩn, giảm đau, nhanh liền sẹo; hoặc hãm hay sắc lấy nước uống chữa viêm
loét miệng, sưng lợi , đau răng, đau bụng (do tiêu hoá, do kinh nguyệt, …), đau đầu,
mất ngủ, căng thẳng, … Hoa cúc La Mã từ lâu đã được người Ai Cập cổ xem là một
phương thuốc trị bách bệnh. Trà của loại dược thảo quý này đã được sử dụng hàng
trăm năm qua với nhiều lợi ích tuyệt vời đối với sức khỏe. Nó có tác dụng thanh nhiệt,
giải độc, tán phong thấp, giáng hỏa,được dùng làm thuốc chữa nhức đầu, chóng mặt,
đau mắt, tăng huyết áp (có thể dùng xoa bóp lên thái dương, vùng trán, gáy, hay cho
thêm vào nước uống hàng ngày) [18].
Trong y học khoa học hiện đại, hoa cúc được hãm hoặc đun sôi lấy nước, và
tinh dầu. Hoa cúc La Mã được sử dụng trong thuốc điều điều trị nội và ngoại khoa.
Nước hãm từ hoa cúc có tác dụng chống viêm, cầm máu, sát trùng, làm se, giảm đau,
an thần, chống co thắt, ra mồ hôi, điều tiết tác động của mật. Số lượng của các hợp
chất phenolic được tìm thấy trong hoa cúc được chứng minh hiệu quả lâm sàng trong
điều trị sưng phổi, có tác dụng bảo vệ màng tế bào mạch máu.
Các chế phẩm hoa cúc được sử dụng trong điều trị nội khoa như đổ mồ hôi, rối
loạn co thắt kinh nguyệt, đau bụng, đầy hơi, tiêu chảy, viêm dạ dày, viêm đại tràng;
điều trị ngoại khoa như - nước súc miệng, họng và cổ họng. Thuốc sắc từ hoa cúc cũng
được sử dụng để rửa vết thương mưng mủ và mắt. Chamazulene trong hoa cúc được
sử dụng để điều trị bệnh hen suyễn, thấp khớp, viêm dạ dày dị ứng và viêm đại tràng,
eczema, bỏng bởi X-quang. Chamazulene thúc đẩy quá trình tái tạo da, làm giảm các
phản ứng dị ứng [18].
Tinh dầu hoa cúc được sử dụng trong hương trị liệu cho chứng mất ngủ, đau
nửa đầu, viêm da, cũng như bỏng và eczema. Tinh dầu cũng hoa cúc được khuyến
1

khích sử dụng để điều trị cho bệnh hen suyễn, viêm phế quản, ho, cảm cúm, viêm bàng
quang. Mùi tinh dầu hoa cúc có đặc điểm như sau: hơi đắng, ấm và nặng mùi. Mùi tinh
dầu hoa cúc có tác dụng an thần. Mùi tinh dầu cịn có tác dụng làm giảm đau đầu, cơ
bắp, cải thiện hoạt động của não với tinh thần mệt mỏi, làm giảm kích ứng và làm dịu
những cơn bộc phát. Trong lĩnh vực hương trị liệu, tinh dầu hoa cúc được khuyên
dùng pha loãng trong nước dùng cho bệnh đau trong ruột; pha trong trà khác khi bị co
giật; pha trong nước với mật ong khi bị kích thích thần kinh. Khi trầm cảm nhà hương
trị liệu chuyên nghiệp Joan Redford khuyến cáo rằng, nên sử dụng dầu hoa cúc trong
xông hơi hoặc nhỏ vào trong bồn tắm. Hoa cúc sấy khô được bỏ chiếc gối thảo dược
thơm, thúc đẩy thư giãn cơ bắp. Tinh dầu hoa cúc có thể giúp ngăn ngừa các phản ứng
dị ứng sau khi bị côn trùng cắn, hay làm giảm vết bầm tím. Dưỡng thể với tinh dầu hoa
cúc được sử dụng đối với vết bỏng, bong gân, và da bị cháy nắng. Nếu bị kích ứng da
ở trẻ sơ sinh có thể áp dụng mát xa, hoặc tắm với tinh dầu hoa cúc [18].
Chiết xuất hoa cúc đối với da có tác dụng chống viêm, chống dị ứng, làm dịu,
giảm đau, giữ ẩm, tái tạo, làm dịu và chữa lành. Chính vì thế nó là một phần của các
sản phẩm mỹ phẩm cho da nhạy cảm.
Cúc La Mã - một trong những dược liệu được tiêu thụ nhiều nhất trong y học.
Vào năm 1986, cúc La Mã là nguyên liệu được khuyên dùng làm thuốc tại 26 quốc
gia. Tổng sản lượng hoa cúc khơ trên tồn thế giới năm 2007 lên đến 65000 tấn.
Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm nên có nguồn
tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng. Tuy nhiên hiện nay nguồn tài nguyên cây
thuốc không còn nguyên vẹn nữa. Hiện nay, theo thống kê mới nhất của Viện Dược
liệu (2007), có 144 lồi cây thuốc thuộc diện quý hiếm có nguy cơ bị tuyệt chủng cần
được bảo tồn. Trong số đó có rất nhiều lồi cây thuốc quí như Sâm ngọc linh (Panax
vietnamensis), Sâm vũ diệp (P. bipinnatifidus), Tam thất hoang (P. stipuleanatus), các
loài Hoàng liên (Berberis spp.), Bách hợp (Lilium brownii), Biến hóa núi cao (Asarum
balansae), Thanh mộc hương (Aristolochia tuberosa), Ba kích (Morinda officinalis),
Đảng sâm (Codonopsis javanica)…
Chính vì vậy, việc tìm kiếm các hoạt chất tự nhiên “mới” có hoạt tính sinh học

cao, có khả năng nhân rộng ở quy mơ cơng nghiệp để làm thuốc là một xu thế được
rất nhiều các nhà khoa học quan tâm.
Hoa cúc La Mã được du nhập vào Việt Nam ở thời gian gần đây chủ yếu qua
đường tiểu ngạch và được bán rải rác ở những hiệu thuốc, cửa hàng mỹ phẩm. Sản
phẩm chính của hoa cúc được một số nhà phân phối cung cấp là tinh dầu và trà hoa
cúc với giá cao. Ngoài ra cúc La Mã mọc ở rất nhiều nơi ở Việt Nam, đặc biệt là ở
những vùng khí hậu mát mẻ như Tây Nguyên và Đà Lạt. Tuy nhiên việc sự dụng loại
dược liệu này còn rất nhiều e ngại trong tâm lý người tiêu dùng do chưa có một nghiên
cứu chính thức một cách khoa học và có hệ thống được cơng bố trong nước về thành
phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của loại hoa này.
Chính vì vậy việc “Nghiên cứu trích ly thành phần dược liệu từ hoa cúc La Mã
2


Matricaria chamomile” để phổ biến rộng rãi loại dược liệu này trong nước là cấp thiết.
Để đạt được mục tiêu trên, nghiên cứu cần thực hiện những nội dung như sau:
- Thu thập, nghiên cứu tài liệu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của
hoa cúc La Mã, cũng như tình hình sử dụng loại dược liệu này trên thế giới và trong
nước;
- Nghiên cứu phương pháp chiết tách thành phần dược liệu trong hoa cúc La
Mã;
- Xác định định tính và định lượng nhóm hợp chất hoạt động sinh học của hoa
cúc La Mã;
- Khảo sát hoạt tính sinh học của hợp chất trích ly được.

3


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm của hoa cúc La Mã

Hoa cúc La Mã (Matricaria chamomile hay còn gọi là Roman Chamomile) là
cây thảo dược lâu năm với rễ chùm, phát triển theo chiều ngang, số lượng rễ lớn do
vậy khả năng hút nước và dinh dưỡng mạnh. Thân mọc đứng gần mặt đất và phân
nhánh, lá kép dài và hẹp với các đoạn hình dải nhọn như gai, cụm hoa hình đầu nằm ở
ngọn các cuống mảnh, đường kính của đầu hoa là 10-30 mm,với một vịng đơn các
cánh hoa hình lưỡi trắng và ở giữa rất nhiều hoa con hình ống màu vàng xếp trên mặt
đế hoa phồng lên tạo dạng nón sau khi hoa nở [4], [5]. Đặc điểm hình thái của hoa cúc
La Mã được thể hiện ở hình 1.1.

Hình 1.1. Cây hoa Cúc La Mã
1.2. Thành phần dược liệu của hoa cúc La Mã
Theo kết quả nghiên cứu trước đây( [6], [7], [8], [15]) thì thành phần các hợp
chất có trong hoa cúc La Mã rất đa dạng. Tùy thuộc vào điều kiện sinh trưởng và phát
triển mà tỷ lệ các hợp chất trong hoa cúc La Mã ở mỗi vùng miền khác nhau. Qua các
nghiên cứu cho thấy phần lớn các hợp chất có trong hoa cúc La Mã chủ yếu bao gồm
các tinh dầu dễ bay hơi, các flanovoid, coumarin, các polyphenol khác, đường,….
a) Tinh dầu dễ bay hơi
Về thành phần tinh dầu dễ bay hơi, hoa cúc La Mã có chứa khoảng 0,6-2,4 %
tinh dầu dễ bay hơi. Thành phần hợp chất của tinh dầu khá phức tạp và cho đến nay có
hơn 140 hợp chất đã được xác định chủ yếu là các dẫn chất của monoterpen,
4


sesquiterpen, các chất có nhân thơm, dẫn chất có chứa N, S.
Các thành phần chính của hợp chất có trong tinh dầu dễ bay hơi của hoa cúc La
Mã là: 25,85-36 % iso-butyl angelate; 10,9-23,7 % iso-amyl iso-butyrate; 11,7-19,9 %
iso-amyl tigliate; 12 % propyl tigliate; 5,3-17,9 % iso-amyl angelate và 3,7-5,3 % isobutyl iso-butyrate.Hơn nữa, tinh dầu có chứa đến 4% monoterpene: như α- và β-pinen,
β-myrcene, limonene, γ-terpinene, p-xymen, camphene, (-) - pinocarvone và (-) trans-pinocarveol; và 1,54 % dẫn xuất của sesquiterepene bao gồm:β-selinene, α- và βcubene, α- và β-caryophyllene, chamazulene, farnesene, cadinen, bisabolane [16].
Một nghiên cứu khác nữa cho thấy trong tinh dầu hoa Cúc La Mã chứa các
sesquiterpene chính là Chamazulene (19,9 %), α-Bisabolol (20,9 %), A và B

Bisabolol-oxide (tương ứng là 21,6 % và 1,2 %), β-farnesen (3,1 %), α- và βcaryophyllene, caryophyllene-oxide và spathulenol, một số monoterpene như βphellandrene (0,8 %), limonene (0,8 %), β-ocymene (0,4%) và γ-terpinen (0,2 %) [16].
Các thành phần chiếm tỉ lệ cao trong tinh dầu hoa cúc La Mã có công thức cấu
tạo như bảng 1.1.
Bảng 1.1. Các thành phần hợp chất chiếm tỷ lệ cao trong tinh dầu hoa cúc La
Mã.
Tên hợp chất

Công thức cấu tạo

n-butyl angelate

n- butyl tigliate

1,8- Cineole

β- Myrcene

α- Pinene
5


Limonene

Α- bisabolol

Chamazulene

Farnesene

Về tính chất, tinh dầu hoa cúc La Mã là chất lỏng trong suốt, nhẹ hơn nước,

không tan hoặc tan rất ít trong nước, tan nhiều trong cồn và các dung môi hữu cơ khác.
Tinh dầu hoa cúc La Mã có màu xanh nhạt do các hợp chất azulen. Dưới tác dụng của
oxy khơng khí, một phần tinh dầu chủ yếu là hợp chất khơng no bị oxy hóa và cho mùi
nhựa [16].
b) Flavonoids
Về thành phần các hợp chất flanvonoid có trong hoa cúc La Mã chiếm khoảng
0,5%, chủ yếu ở dạng glycosid: bao gồm flavone apigenin và luteolin, các quercetin và
flavonol glycosides họapigenin-7-apiosylglucoside, luteolin-7-glucoside và quercetin3-mtin [2]. Các thành phần flavonoid chiếm tỷ lệ cao trong hoa cúc La Mã được thể
hiện trong bảng 1.2.
Bảng 1.2. Các thành phần hợp chất chiếm tỷ lệ cao trong flavonoid.
Tên các hợp chất

Công thức cấu tạo

Apigenin

6


Luteolin

Quercetin

Về tính chất, các hợp chất flavonoid có màu vàng rất nhạt có khi khơng màu
(trường hợp các nhóm -OH đã methyl hố).Độ tan khơng giống nhau, thường
flavonoid glycosid và flavonoid sulfat là những hợp chất phân cực nên không tan hoặc
ít tan trong dung mơi khơng phân cực mà tan được trong nước. Các aglycon flavonoid
thì tan được trong dung môi hữu cơ như ete, aceton, cồn nhưng hầu như khơng tan
trong nước. Các dẫn chất flavonoid có nhóm 7-hydroxy thường dễ tan trong dung dịch
kiềm loãng [2].

c) Coumarin
Catechin là thành phần làm cho hoa có màu nâu khi khô. Coumarine Scopolin
(7-β-D-glucopyranosyl-scopoletin), umbelliferone, herniarin, scopoletin là các thành
phần cũng đã được xác định [17]. Các thành phần hợp chất coumarin chiếm tỉ lệ cao
trong hoa cúc La Mã được thể hiện trong bảng 1.3.
Bảng 1.3. Các thành phần hợp chất chiếm tỷ lệ cao trong coumarine.
Tên các hợp chất

Công thức cấu tạo

Scopolin

Umbelliferone

Herniarin

7


Về tính chất, Coumarin là những chất kết tinh khơng màu, một số lớn dễ thăng
hoa có mùi thơm. Ở dạng kết hợp glycosid thì có thể tan trong nước, ở dạng aglycon
thì dễ tan trong dung mơi kém phân cực. Coumarin có vịng lacton nên bị mở vịng bởi
kiềm tạo thành muối tan trong nướcnếu acid hóa thì sẽ đóng vịng trở lại [4].
d) Các thành phần cịn lại trong hoa cúc
Các hợp chất phenol dùng để chỉ chung các hợp chất mà trong cấu trúc có vịng
benzen mang một hoặc nhiều nhóm chức hydroxy –OH. Các hợp chất phenol trong tự
nhiên như: flavonoid, xanthon, coumarin, quinon, các polyphenol (lignin, tanin, …).
Tanin là hợp chất polyphenol, có vị chát, tanin hầu như không tan trong dung môi kém
phân cực, tan được trong cồn lỗng, tốt nhất là nước nóng.
Glycosid là dạng phổ biến của nhiều hợp chất tự nhiên, cấu trúc của các hợp

chất này gồm hai thành phần là phần đường và phần không đường. Phần đường của
glycosid gọi là glycon, phần không đường gọi là aglycon hoặc genin. Phần đường và
phần không đường liên kết với nhau bằng dây nối acetal vì vậy phân tử glycosid dễ bị
phân huỷ khi có nước dưới ảnh hưởng của các enzyme thực vật hoặc dung dịcd acid
hoặc kiềm. Phần đường trong glycosid chủ yếu là monosaccarid hoặc oligosaccaride,
thường là glucose, rhamnose, galactose… nói chung các glycoside có tính phân cực
khá mạnh, nên không tan trong été dầu hỏa, hexan, benzen nhưng tan được trong
cloroform, dietyl ether, tan tốt trong acol và nước.
Các acid béo là 1 nhóm hợp chất hữu cơ bao gồm những este của acid béo với
các alcol. Chất béo nhẹ hơn nước, tan trong dung môi hữu cơ kém phân cực như
benzen, ete, chloroform, ít tan trong cồn và không tan trong nước.
Sáp là este cùa các acid béo có mạch cacbon dài và rượu đơn hoặc đa chức,
nằm trên các mơ bì của thực vật. Sáp rất trơ hóa học, khơng tan trong nước nhưng tan
trong rượu.
1.3. Tác dụng của hoa cúc La Mã
Tại Ai Cập, Hy Lạp và La Mã, thảo dược này được sử dụng như một phương
thuốc thảo dược hàng ngàn năm nay.Ở các tài liệu [6], [9], [13],[15], [16], hoa cúc La
Mã có tác dụng làm dịu tinh thần, được sử dụng để trấn an giấc ngủ, giảm căng thẳng
thần kinh, giúp làm sạch và bảo vệ vết thương khỏi bị nhiễm trùng. Sử dụng như một
phương thuốc tự nhiên chữa các mẫn ngứa, kích ứng, giảm sưng do phát ban và các
bệnh nhiễm trùng khác. Giảm bớt các vấn đề đau lưng, thấp khớp, đau bụng kinh,
chống co thắt đường ruột, điều trị ho, sốt rét, nhiễm giun ký sinhvà các bệnh về tiêu
hóa. Cúc La Mã khơng chỉ là một loại thuốc trong dược điển của 26 quốc gia mà ngồi
ra nó cịn phục vụ đắc lực cho cơng cuộc làm đẹp của nữ giới. Theo những nghiên cứu
gần đây cho thấy hoa cúc La Mã chứa các thành phần có tác dụng chữa bệnh điển hình
như:
- Tác dụng chống co thắt: Đã được quy cho một sốthành phần hoạt tính của hoa
cúc, đặc biệt là các flavonoid (anthemidin, apigenin, luteolin), glycosid, coumarin
8

(herniarin và umbelliferone)và các loại dầu dễ bay hơi của nó (có chứa alpha và
Bisabolol matricine) [16].
- Tác dụng chống oxy hóa: Chamazulenelà một chất chống oxy hóa mạnh có
giá trị trong q trình chống viêm. Nó đã được chứng minh để ngăn chặn
cyclooxygenase enzyme trong quá trình tổng hợp prostaglandin. Tác dụng chống viêm
của nó có thể là do sự ức chế hình thành leukotriene B4. Ngồi ra tác dụng chống oxy
hóa cịn do thành phần apigenin của nó [14].
- Tác dụng chống viêm: Một số thành phần của hoa cúc bao gồm apigenin-7glucoside, luteoline, hợp chất terpene, herniarine, matricin, chamazulene, (-) alphabisabololoxides A và B, và (-) alpha-bisabolol, patuletin, umbelliferone, quercetin,
myricetin, rutin, và spiroethers đã được nghiên cứu trong các hoạt tính chống viêm.
Trong đó các bisabolol và các flavonoid có tác dụng chống viêm cao nhất so với các
thành phần còn lại. [6], [9], [17].Các thử nghiệm đã được tiến hành để kiểm tra với sự
phù nề trên chân của loài chuột Sprague-Dowley [13].
- Tác dụng kháng khuẩn: Hoạt tính kháng khuẩn của hoa cúc đã được các nhà
khoa học nghiên cứu trong ống nghiệm và kết quả rất đáng khích lệ. Thành phần
coumarin, hernearin có tính chất kháng khuẩn và kháng nấm trong sự hiện diện của
ánh sáng cực tím. Nó cũng đã được chứng minh hiệu quả như một thành phần chống
lại nấm Candida albicans. Chống lại một số chủng vi khuẩn gram dương
(Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis) và vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa). Ức chế sự tăng trưởng của B. anthracis, Micrococcus
glutamicus, B. sacchrolyticus, B. thuringiensis, Sarcina lutea, B. stearothermophilus,
Lactobacillus plantarum, và Lactobacillus casei [12],[13], [14].
- Tác dụng chống ung thư: Tác dụng chống ung thư của apigenin, một hợp chất
flavonoid trong hoa cúc, đã được nghiên cứu trên động vật, apigenin giảm số lượng
các ung thư biểu mô tế bào da UVB gây ra ở chuột, apigenin đã được tìm thấy để đàn
áp 12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate gây xúc tiến khối u ở da chuột và được
chứng minh là một thành phần chống nắng hữu ích. Sesquiterpenoids, nobilin, và dẫn
xuất của nó đã chứng minh kháng u chống lại các tế bào khối u của con người trong
ống nghiệm [18].
- Tác dụng chống Alzheimer:Các flavonoid như quercetin có tác dụng chống

Alzheimer thơng qua ức chế acetylcholinesterase và butyrylcholinesterase [2], [9].
- Tác dụng chống viêm loét dạ dày: Bisabolol đã được tìm thấy và nghiên cứu
là làm giảm lượng enzyme phân giải protein tiết ra pepsin của dạ dày mà không cần
bất kỳ sự thay đổi xảy ra trong lượng axit dạ dày, do đó nó đã được đề nghị để điều trị
bệnh đường ruột [13].
1.4. Phương pháp chiết tách thành phần hoạt tính sinh học từ hoa cúc La
Mã
9


Chiết xuất dược liệu là phương pháp sử dụng dung môi lấy các chất tan ra khỏi
mô thực vật. Nguyên liệu có nguồn gốc từ tự nhiên chứa các tinh chất quý giá. Nguyên
liệu thường ở dạng tươi hoặc đã qua sơ chế, hoặc sấy khô. Sản phẩm thu được sau quá
trình chiết xuất là dung dịch của các chất hịa tan trong dung mơi dung dịch này được
gọi là dịch chiết.
Chiết xuất dược liệu hướng đến mục đích: tạo ra các chế phẩm toàn phần, tách
chiết riêng các hoạt chất tinh khiết; thu nhận chúng dưới dạng tinh khiết nhất để làm
thuốc mới hoặc bán tổng hợp ra thuốc mới; làm cho dược liệu có tác dụng mạnh hơn;
giảm tác dụng phụ không mong muốn của thảo dược.
Chiết xuất là bước đầu tiên để tách các sản phẩm tự nhiên mong muốn khỏi các
nguyên liệu thô. Phương pháp chiết bao gồm chiết bằng dung môi, phương pháp
chưng cất, ép và thăng hoa theo nguyên tắc chiết. Chiết dung môi là phương pháp
được sử dụng rộng rãi nhất. Việc chiết xuất các sản phẩm tự nhiên tiến triển qua các
giai đoạn sau: (1) dung môi thâm nhập vào cấu trúc rắn; (2) chất tan hịa tan trong
dung mơi; (3) chất tan được khuếch tán ra khỏi chất rắn; (4) các chất hòa tan được thu
thập. Bất kỳ yếu tố nào tăng cường độ khuếch tán và độ hòa tan trong các bước trên sẽ
tạo điều kiện thuận lợi cho việc chiết xuất. Các tính chất của dung mơi chiết, kích
thước hạt của nguyên liệu thô, khẩu phần dung môi đến chất rắn, nhiệt độ chiết và thời
gian chiết sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất chiết.
Phương pháp chiết xuất dược liệu bằng siêu âm: Sóng siêu âm có tác dụng

làm tăng sự hịa tan của các chất trong mơi trường dung mơi. Tăng q trình khuếch
tán, được áp dụng trong quy mô lớn. Đầu phát siêu âm được nhúng trực tiếp vào bình
chiết chứa dược liệu.
Phương pháp chiết xuất bằng vi sóng: Có tác dụng khuấy trộn, làm tăng tiếp
xúc pha. Làm cho hiệu suất phản ứng được lớn hơn.
Phương pháp chiết xuất bằng dung mơi: dịch chiết cịn được cơ đặc. Thêm
vào đó bằng dung mơi hữu có khơng phân cực.
Trong khuôn khổ của đề tài cao chiết từ hoa cúc La Mã bằng phương pháp
ngấm kiệt, chưng ninh, Sohxlet, và Sohxlet kết hợp chưng ninh.

10


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Để “Nghiên cứu trích ly thành phần dược liệu từ hoa cúc La Mã Matricaria
chamomile” trong khuôn khổ của đề tài sử dụng nguồn nguyên liệu là hoa cúc La Mã
khơ, sau đó ngun liệu được nghiền thành bột với độ ẩm 10 %.
2.2. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được tiến hành tại Phịng thí nghiệm, Khoa Kỹ thuật Công nghệ &
Nông nghiệp Công nghệ cao, Trường Đại học Bà Rịa-Vũng Tàu, Trung tâm phân tích
Trường đại học Khoa học tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh và Phịng thí nghiệm Vi
khuẩn-Khoa Vi sinh miễn dịch, Viện Pasteur TP.HCM. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ở hình
2.1.
Hoa cúc

Xử lý

Chiết cao cồn

Chiết cao etyl
acetate

Chiết cao ete
dầu hỏa

Định tính thành
phần dược liệu

Định lượng và xác định thành phần
thành phần hóa hoc, hoạt tính sinh
học flavonoid trong dược liệu

Hình 2.1. Sơ đồ bố trí nội dung thí nghiệm.
2.3. Phương pháp nghiên cứu [1]
2.3.1. Nghiên cứu tối ưu hóa hiệu suất chiết cao cồn bằng phương pháp chưng
ninh
11


Quy trình chiết tách theo phương pháp chưng ninh được thực hiện theo sơ đồ ở
hình 2.1.
Hoa cúc

Xử lý

Cồn

Chưng ninh

Lọc

Bã

Đo quang

Hình 2.2. Quy trình chiết tách dược liệu bằng phương pháp chưng ninh.
a) Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của nồng độ etanol tới hiệu suất chiết
Mục đích: khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung môi lên mật độ quang khi thực
hiện chiết bằng phương pháp ngâm ninh, nhằm tìm ra được nồng độ dung mơi tối ưu
để tối ưu hóa quy trình tách chiết.
Thực nghiệm: Cân 1,5 g hoa cúc cho vào bình cầu 2 cổ có lắp nhiệt kế để đo
nhiệt độ. Lắp hệ thống sinh hàn hồi lưu. Thực hiện chưng ninh trên bếp khuấy từ với 3
nồng độ cồn (96o, 70o, 50o) trong 3 giờ ở nhiệt độ 60 oC. Tỷ lệ “dung môi : nguyên
liệu” (20:1). Tháo hệ thống sinh hàn sau khi kết thúc thí nghiệm. Dịch chiết được làm
lạnh bằng nước đá sau đó đem đi lọc bằng máy lọc hút chân khơng. Pha lỗng mẫu và
đo quang ở bước sóng 390 nm. Lặp lại thí nghiệm 3 lần.
b) Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất chiết
Mục đích: khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên mật độ quang khi thực hiện chiết
bằng phương pháp ngâm ninh, nhằm tìm ra được nhiệt độ tối ưu để tối ưu hóa quy
trình tách chiết.
Thực nghiệm: Cân 1,5 g hoa cúc cho vào bình cầu 2 cổ có lắp nhiệt kế để đo
nhiệt độ. Lắp hệ thống sinh hàn hồi lưu. Thực hiện chưng ninh trên bếp khuấy từ ở các
nhiệt độ (50 oC, 60 oC, 70 oC, 78 oC) trong 3 giờ với nồng độ dung môi tối ưu như đã
khảo sát ở trên. Tỷ lệ “dung môi/nguyên liệu” (20:1). Tháo hệ thống sinh hàn sau khi
kết thúc thí nghiệm. Dịch chiết được làm lạnh bằng nước đá sau đó đem đi lọc bằng
máy lọc hút chân khơng. Pha lỗng mẫu và đo quang ở bước sóng 390 nm. Lặp lại thí
nghiệm 3 lần.
c) Nghiên cứu tỷ lệ ngun liệu/dung mơi ảnh hưởng tới hiệu suất chiết
12

Mục đích: khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi lên mật độ quang
khi thực hiện chiết bằng phương pháp ngâm ninh, nhằm tìm ra được tỷ lệ tối ưu để tối
ưu hóa quy trình tách chiết.
Thực nghiệm: Cân 1,5 g hoa cúc cho vào bình cầu 2 cổ có lắp nhiệt kế để đo
nhiệt độ. Lắp hệ thống sinh hàn hồi lưu. Thực hiện chưng ninh trên bếp khuấy từ ở các
tỷ lệ dung môi và nguyên liệu (1:10; 1:20; 1:30; 1:40; 1:50) trong 3 giờ ở nhiệt độ tối
ưu với nồng độ dung môi tối ưu như đã khảo sát ở trên. Tháo hệ thống sinh hàn sau khi
kết thúc thí nghiệm. Dịch chiết được làm lạnh bằng nước đá sau đó đem đi lọc bằng
máy lọc hút chân khơng. Pha lỗng mẫu và đo quang ở bước sóng 390 nm. Lặp lại thí
nghiệm 3 lần.
d) Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian tới hiệu suất chiết
Mục đích: khảo sát ảnh hưởng thời gian lên mật độ quang khi thực hiện chiết
bằng phương pháp ngâm ninh, nhằm tìm ra được thời gian tối ưu để tối ưu hóa quy
trình tách chiết.
Thực nghiệm: Cân 1,5 g hoa cúc cho vào bình cầu 2 cổ có lắp nhiệt kế để đo
nhiệt độ. Lắp hệ thống sinh hàn hồi lưu. Thực hiện chưng ninh trên bếp khuấy từ ở các
thời gian (1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ) ở nhiệt độ tối ưu với nồng độ dung môi tối ưu và
tỷ lệ tối ưu như đã khảo sát ở trên. Tháo hệ thống sinh hàn sau khi kết thúc thí nghiệm.
Dịch chiết được làm lạnh bằng nước đá sau đó đem đi lọc bằng máy lọc hút chân
khơng. Pha lỗng mẫu và đo quang ở bước sóng 390 nm. Lặp lại thí nghiệm 3 lần.
2.3.2 Chiết tách thành phần dược liệu bằng phương pháp chưng ninh
Quy trình chiết tách theo phương pháp Soxhlet được thực hiện theo sơ đồ ở
hình 2.2.
Hoa cúc

Xử lý

Cồn

Chưng ninh

Lọc

Cơ quay

Bã

Dung mơi

Cao cồn

Hình 2.3. Sơ đồ khảo sát chiết cao cồn bằng phương pháp chưng ninh.
13


Cân hoa cúc cho vào bình cầu 2 cổ có lắp nhiệt kế để đo nhiệt độ. Lắp hệ thống
sinh hàn hồi lưu. Thực hiện chưng ninh trên bếp khuấy từ ở các thời gian, nhiệt độ với
nồng độ dung và tỷ lệ tối ưu như đã khảo sát ở trên. Tháo hệ thống sinh hàn khi kết
thúc thì nghiệm, dịch chiết được làm lạnh bằng nước đá sau đó đem đi lọc bằng máy
lọc hút chân không và tiếp tục đưa đi cô quay chân không để loại dung môi thu được
cao cồn chứa các thành phần của dược liệu.
2.3.3. Chiết cao cồn bằng phương pháp ngấm kiệt
Quy trình chiết tách theo phương pháp Soxhlet được thực hiện theo sơ đồ ở
hình 2.4.
Hoa cúc

Xử lý

Cồn

Chiết ngấm kiệt

Lọc

Cơ quay

Bã

Dung mơi

Cao cồn

Hình 2.4. Sơ đồ khảo sát chiết cao cồn bằng phương pháp ngấm kiệt.
Cân 100 g hoa cúc, xay nhỏ đến độ mịn thích hợp và cho vào bình chiết, đổ
dung môi vào ngập dược liệu khoảng 2-3 cm và để ngâm trong 24 giờ. Sau đó tiến
hành mở van rút dịch chiết cho sản phẩm ra đồng thời bổ sung thêm dung mơi từ bình
lóng vào bình chiết. Điều chỉnh sao cho vận tốc dung môi tinh khiết chảy vào bình
chiết bằng vận tốc dung dịch chiết chảy ra khỏi bình này. Kiểm tra sự chiết kiệt bằng
cách nhỏ một giọt dịch chiết từ bình hứng vào một tấm kiếng và cho bốc hơi hồn
tồn, nếu khơng thấy vết gì nghĩa là chiết kiệt. Dịch chiết cồn sau khi lọc đưa đi cô
quay để tách cồn và thu được cao cồn.
2.3.4. Chiết cao cồn bằng phương pháp Soxhlet
Quy trình chiết tách theo phương pháp Soxhlet được thực hiện theo sơ đồ ở
hình 2.5.

14

Hoa cúc

Xử lý

Cồn

Chiết Soxhlet

Lọc

Cơ quay

Bã

Dung mơi

Cao cồn

Hình 2.5. Sơ đồ khảo sát tách chiết hợp chất trong hoa cúc La Mã bằng phương
pháp Soxhlet.
Cân 100 g hoa cúc cho vào túi lọc và đặt vào bình chiết, thêm dung mơi vào
bình cầu sao cho dung mơi trong bình cầu khơng được nhiều hơn hai phần ba thể tích
bình cầu. Lắp hệ thống Soxhlet và kiểm tra hệ thống, mở nước chảy hoàn lưu trong
ống ngưng, cắm bếp điện và điều chỉnh nhiệt cho dung mơi trong bình cầu sơi đều.
Quan sát dịch hút ra trong ống thông nhau và kiểm tra sự chiết kiệt bằng cách tắt máy
để nguội, mở hệ thống và rút lấy một giọt dung môi thử trên mặt kiếng, nếu khơng cịn
dấu vết gì là đã chiết kiệt. Tháo hệ thống Soxhlet, tiến hành lọc dịch chiết bằng máy
lọc hút chân khơng, sau đó đưa đi cô quay loại dung môi thu được cao cồn.
2.3.5 Chiết tách thành phần dược liệu qua hai giai đoạn: Soxhlet và chưng ninh
Quy trình chiết tách theo phương pháp Soxhlet được thực hiện theo sơ đồ ở

hình 2.6. Cân hoa cúc cho vào túi lọc và đặt vào bình chiết, thêm dung mơi là ete dầu
hỏa vào bình cầu sao cho dung mơi trong bình cầu khơng được nhiều hơn hai phần ba
thể tích bình cầu. Lắp hệ thống Soxhlet và kiểm tra hệ thống, mở nước chảy hoàn lưu
trong ống ngưng, cắm bếp điện và điều chỉnh nhiệt cho dung mơi trong bình cầu sơi
đều. Quan sát dịch hút ra trong ống thông nhau và kiểm tra sự chiết kiệt bằng cách tắt
máy để nguội, mở hệ thống và rút lấy một giọt dung môi thử trên mặt kiếng, nếu
khơng cịn dấu vết gì là đã chiết kiệt.
Dịch chiết ete được đưa đi cô quay để tách dung môi thu được cao ete dầu hỏa.
Cân lượng cao ete dầu hỏa thu được. Phần bã sau khi tháo ra khỏi máy được đưa đi
chưng ninh bằng cồn với hệ thống ống sinh hàn hồi lưu trên bếp khuấy từ gia nhiệt với
các thông số về nồng độ dung môi, nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ nguyên liệu- dung môi tối
ưu như đã khảo sát ở trên. Dịch chiết cồn sau khi lọc và đưa đi cô quay để tách cồn
15


được cao cồn. Cân khối lượng cao cồn thu được.
Hoa cúc

Xử lý

Ete dầu hỏa

Chiết Soxhlet

Dịch ete

Bã

Cơ quay

Chưng ninh bằng
cồn

Lọc
Cao
ete
Cơ quay

Cao
cồn

Hình 2.6. Sơ đồ khảo sát chiết tách thành phần dược liệu qua hai giai đoạn Soxhlet và
chưng ninh.
2.3.6. Phương pháp chiết tách cao etyl acetat và cao ete dầu hỏa từ cao cồn
Quy trình chiết tách theo phương pháp Soxhlet được thực hiện theo sơ đồ ở
hình 2.7.
Cao cồn sau khi đã đuổi hết dung mơi được kiềm hóa bằng dung dịch KOH đến
pH=10-12. Lắc nhiều lần với 500 ml dung môi ete dầu hỏa (lần thứ nhất 200 ml dung
môi, 100 ml cho những lần tiếp theo). Kiểm tra sự chiết kiệt bằng cách nhỏ dịch ete
lên một tấm kiếng sạch và để bay hơi hết, nếu khơng cịn dầu vết gì là chiết kiệt. Gộp
các dịch chiết ete lại và tiến hành cô quay để thu dung môi. Cân khối lượng cao ete thu
được.
Dung dịch kiềm sau khi đã chiết lấy dịch ete được acid hóa bằng HCl (10 %)
đưa về pH=2. Lắc nhiều lần với 500 ml dung môi etyl acetat (lần thứ nhất 200 ml dung
môi, 100 ml cho những lần tiếp theo). Kiểm tra sự chiết kiệt bằng cách nhỏ dịch etyl
acetat lên một tấm kiếng sạch và để bay hơi hết, nếu khơng cịn dầu vết gì là chiết kiệt.
16


Gộp các dịch chiết etyl lại và đem đi cô quay để thu hồi dung môi. Cân khối lượng cao

etyl acetat thu được.
Cao cồn

KOH (pH=10-12)

Kiềm hóa

Lắc với ete dầu hỏa

Dịch ete

Dịch kiềm

Cơ quay

Acid hóa

Dịch etyl acetate
Cao
ete
Cơ quay

Cao
cồn

Hình 2.7. Sơ đồ chiết cao etyl acetat và ete dầu hỏa.
2.3.7. Phương pháp định tính các thành phần của dược liệu
a) Định tính thành phần trong cao ete dầu hỏa
- Phản ứng Liebermann-Burchard để nhận biết terpenoid
Cho mẫu vào ống nghiệm, thêm 1 ml Anhidric acetic, 1ml cloroform, làm lạnh

ống nghiệm rồi thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc. Quan sát sau 1 đến 2 phút và nhận xét
màu sắc trong ống ngiệm.
- Phản ứng Salkowski để nhận biết terpenoid
Cho 1-2 mg mẫu vào ống nghiệm, thêm 1ml cloroform sau đó nhỏ thêm 1ml
H2SO4 đậm đặc. Quan sát sau 1 đến 2 phút và nhận xét màu sắc trong ống nghiệm.
- Với thuốc thử FeCl3 để nhận biết flavonoid và coumarine
Cho 1-2 mg mẫu vào ống ngiệm, thêm FeCl3 hòa tan trong ethanol để hóa tan
mẫu. Quan sát sau 1 đến 2 phút và nhận xét màu sắc trong ống nghiệm.
b) Định tính thành phần trong cao etyl acetat
17


- Phản ứng Liebermann-Burchard để nhận biết terpenoid
Cho mẫu vào ống nghiệm, thêm 1ml Anhidric acetic, 1ml cloroform, làm lạnh
ống nghiệm rồi thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc. Quan sát sau 1 đến 2 phút và nhận xét
màu sắc trong ống ngiệm.
- Tác dụng của FeCl3 để nhận biết flavonoid và coumarin
Cho 1-2 mg mẫu vào ống ngiệm, thêm FeCl3 hịa tan trong ethanol để hóa tan
mẫu. Quan sát sau 1 đến 2 phút và nhận xét màu sắc trong ống nghiệm.
- Tác dụng với H2SO4 đậm đặc để nhận biết flavonoid
Cho 1-2 mg mẫu vào ống nghiệm, thêm H2SO4 đậm đặc để hòa tan mẫu. Quan
sát sau 1 đến 2 phút và nhận xét màu sắc trong ống nghiệm.
2.3.8. Định lượng thành phần dược liệu (flavonoid) tổng trong cao etyl acetat
a. Xây dựng đường chuẩn bằng chất chuẩn Catechin:
Hòa tan Catechin vào bình định mức lần lược với các nồng độ 85 mg; 42,5 mg;
21,25 mg; 10,626 mg; 5,3125 mg; 2,65625 mg vào bình định mức 100 ml với dung
mơi là etanol 70o. Ta lấy 20 µl mẫu catechin đã hịa tan + 6 ml H2O + 200 µl thuốc thử
Folin Ciocalteau để sau 5 phút, thêm 600 µl Na2CO3 bảo hịa lắc đều để trong chỗ kín
trong 2 giờ sẽ tạo phức màu xanh. Tiến hành đo quang với bước song 425 nm và xây
dựng đường chuẩn.

b. Định lượng flavonoid toàn phần trong cao etyl acetat:
Cân 100 mg cao etyl acetat cho vào bình định mức 100 ml, cho thêm etanol 70o
vào bình cho đủ 100 ml. Tương tự sau khi lắc cho cao etanol tan hết, ta lấy Ta lấy 20
µl mẫu cao etyacetat đã hịa tan + 6 ml H2O + 200 µl thuốc thử Folin Ciocalteau để
sau 5 phút, thêm 600 µl Na2CO3 bảo hịa lắc đều để trong chỗ kín trong 2 giờ sẽ tạo
phức màu xanh. Tiến hành đo quang và xác định nồng độ catecin thơng qua phương
trình đường chuẩn. Hiệu suất flavonoid được tính theo cơng thức sau:
F(%) =

&.()
(*

× 100,

(2.1);

Trong đó:
- A: nồng độ catechin tính từ đường chuẩn (mg);
- m1: khối lượng cao etyl acetat (mg);
- m2: khối lượng mẫu khô (mg).
2.3.9. Xác định thành phần dược liệu (flavonoid) bằng sắc ký lỏng cao áp ghép
khối phổ
Mục đích: xác định thành phần hóa học trong flavonoid các dịch chiết từ cây
hoa cúc La Mã bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp ghép phối phổ (HPLC-MS).
Nguyên lý: phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác
khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion
phân tử trong một điện trường hoặc từ trường nhất định. Tỉ số giữa khối lượng và điện
18