Dự thảo tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu phát triển vector nhị thể mới ứng dụng trong cải biến di truyền một số loài nấm sợi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
_______________________

VŨ XUÂN TẠO

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VECTOR NHỊ THỂ MỚI
ỨNG DỤNG TRONG CẢI BIẾN DI TRUYỀN
MỘT SỐ LOÀI NẤM SỢI

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 9420101.07

DỰ THẢO
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2019


Cơng trình đƣợc hồn thành tại:
Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:

1. TS. Trần Văn Tuấn
2. PGS.TS Nguyễn Quang Huy

Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Luận án sẽ đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng cấp Đại học Quốc
gia chấm luận án tiến sĩ họp tại Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên ĐHQGHN vào hồi….giờ….ngày… tháng… năm 20...

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thƣ viện Quốc gia Việt Nam
- Trung tâm Thông tin - Thƣ viện, Đại học Quốc gia Hà Nội


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Nấm sợi là những lồi mang lại nhiều lợi ích thiết thực cho
con ngƣời nhƣng chúng cũng có thể gây ra những thiệt hại khôn
lƣờng cho sản xuất nông nghiệp. Nấm sợi Aspergillus niger đƣợc sử
dụng rộng rãi trong sản xuất công nghiệp nhiều loại enzyme và axit
hữu cơ, trong khi đó nấm Penicillium chrysogenum lại là loài nổi
tiếng trong sinh tổng hợp kháng sinh penicillin, kháng sinh β-lactam
đầu tiên đƣợc phát hiện và sản xuất ở quy mô công nghiệp. Việc khai
thác các lồi nấm sợi sẵn có trong tự nhiên để sản xuất enzyme, axit
hữu cơ và các chất có hoạt tính sinh học là có giới hạn. Mặc dù nhiều
chủng đột biến của A. niger và P. chrysogenum có khả năng sinh
tổng hợp hàm lƣợng cao sản phẩm đã đƣợc tạo ra nhờ phƣơng pháp
vật lý và hóa học. Tuy nhiên các phƣơng pháp này tạo ra các thể đột
biến ngẫu nhiên và khó xác định đƣợc gen đích đã bị gây hỏng. Do
đó nghiên cứu cải tiến, nâng cấp năng lực cho các chủng tự nhiên
bằng cách can thiệp trực tiếp, có định hƣớng vào hệ gen nấm là việc
làm cần thiết, mang tính ứng dụng cao. Bên cạnh đó, đối sản xuất
nơng nghiệp, vi nấm liên quan mật thiết đến năng suất cây trồng và
bảo quản sản phẩm sau thu hoạch. Nấm Penicillium digitatum đƣợc
coi là tác nhân gây hỏng nghiêm trọng đối với các loại quả có múi ở
giai đoạn sau thu hoạch. Việc nghiên cứu làm sáng tỏ vai trò của các

gen gây bệnh ở P. digitatum sẽ góp phần trong việc định hƣớng phát
triển các giải pháp “xanh” hiệu quả trong bảo quản nông sản sau thu
hoạch.
Nghiên cứu này hƣớng đến phát triển giải pháp chuyển gen
nhờ vi khuẩn A. tumefaciens có thể sử dụng chung cho nhiều loài
nấm sợi khác nhau. Việc phối hợp giữa tối ƣu hóa phƣơng pháp


chuyển gen và xây dựng đƣợc hệ thống các vector nhị thể mới sẽ là
nền tảng để triển khai các nghiên cứu chuyên sâu về điều tra chức
năng của các gen ở vi nấm.
2. Mục tiêu của đề tài
- Tạo đƣợc các vector nhị thể mới và thiết lập đƣợc hệ thống
chuyển gen tối ƣu sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho
ba loài nấm sợi là Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum và
Penicillium digitatum.
- Điều tra đƣợc vai trò của gen laeA ở cả ba loài nấm sợi
nghiên cứu nhờ áp dụng hệ thống chuyển gen tối ƣu đã thiết lập.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Đây là cơng trình nghiên cứu đầu tiên đƣợc thực hiện một
cách có hệ thống tại Việt Nam và trên thế giới về phát triển các
vector nhị thể mới ứng dụng trong cải biến di truyền ba loài nấm sợi
sử dụng phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens. Đề tài đã chứng minh hiệu quả của hệ vector tạo đƣợc
bằng cách áp dụng trực tiếp vào việc biểu hiện gen, xóa gen ở cả ba
lồi nấm sợi khác nhau.
4. Những đóng góp mới của luận án
* Đã tạo thành cơng các vector nhị thể mới dùng cho biểu
hiện gen, xóa gen và bổ trợ gen ở ba loài nấm sợi gồm A. niger, P.
chrysogenum và P. digitatum.

* Phát triển thành công hệ thống chuyển gen hiệu quả cao sử
dụng vi khuẩn A. tumefaciens ở ba loài nấm sợi nghiên cứu. Lần đầu
tiên, hệ thống chuyển gen hoàn toàn mới dựa trên cơ chế trợ dƣỡng
uridine/uracil đƣợc thiết lập ở nấm sợi A. niger và P. chrysogenum.
Đồng thời, hệ thống chuyển gen sử dụng marker kháng kháng sinh ở


P. chrysogenum và P. digitatum đƣợc tối ƣu và hiệu quả chuyển gen
đạt đƣơc cao hơn từ 10 đến 20 lần so với các nghiên cứu trƣớc đây.
* Đây là cơng trình nghiên cứu đầu tiên chứng minh việc
xóa, phục hồi và biểu hiện quá mức gen laeA đƣợc thực hiện thành
cơng ở ba lồi nấm sợi A. niger, P. chrysogenum và P. digitatum nhờ
sử dụng phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A.
tumefaciens. Đặc biệt nghiên cứu này đã phát hiện ra các vai trị hồn
tồn mới của gen laeA trong điều hịa biệt hóa hình thái tế bào nấm,
trao đổi chất và kiểm soát khả năng gây bệnh trên quả sau thu hoạch.
5. Bố cục của luận án
Bố cục của luận án gồm 163 trang, 2 bảng và 43 hình. Cụ
thể: Mở đầu 4 trang; Chƣơng 1 Tổng quan tài liệu 35 trang; Chƣơng
2 Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu 19 trang; Chƣơng 3 Kết quả
và thảo luận 70 trang; Kết luận và kiến nghị 3 trang; Danh mục các
cơng trình 2 trang; Tài liệu tham khảo 30 trang.
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NẤM A. niger, P. chrysogenum VÀ
P. digitatum
Aspergillus niger là một trong những loài phổ biến nhất
trong khoảng 250 loài thuộc chi Aspergillus. A. niger là một vi nấm
mơ hình quan trọng đối với một số lĩnh vực nghiên cứu, bao gồm
nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp protein, enzyme, cơ chế phân

tử và các cơ chế liên quan tới việc kiểm sốt đặc điểm hình thái nấm.
P. digitatum là nấm gây bệnh thực vật đầu tiên thuộc loài
Penicillium đƣợc giải mã toàn bộ hệ gen. Nhiều nghiên cứu về cơ
chế gây bệnh của nấm P. digitatum ở mức độ phân tử cho thấy một


số gen đóng vai trị quy định độc lực của nấm P. digitatum. Tuy
nhiên cho tới hiện nay, việc điều tra vai trò của các gen quy định độc
lực gây bệnh của nấm P. digitatum vẫn đang tiếp tục đƣợc thực hiện.
Nấm P. chrysogenum đƣợc nghiên cứu từ rất lâu, tuy nhiên
tới năm 2008 hệ gen của loài nấm này mới đƣợc giải trình tự tồn bộ.
Ứng dụng nổi bật nhất của nấm mốc P. chrysogenum là khả năng
sinh kháng sinh penicillin với nhiều chủng cho hiệu suất sinh tổng
hợp cao, đặc biệt sau khi đã đƣợc xử lý đột biến.
1.2. PHƢƠNG PHÁP CHUYỂN GEN VÀO NẤM SỢI THÔNG
QUA VI KHUẨN A. tumefaciens (ATMT)
Để thực hiện các nghiên cứu về cải biến di truyền nấm sợi
thì phƣơng pháp chuyển gen là một công cụ không thể thiếu. Hiện
nay, một số phƣơng pháp chuyển gen đƣợc sử dụng phổ biến ở nấm
sợi là chuyển gen qua tế bào trần (protoplast) và chuyển gen trung
gian qua vi khuẩn A.tumefaciens. Với phƣơng pháp chuyển gen
thông qua tế bào trần, các đoạn DNA hoặc các vector mang gen
mong muốn đƣợc chuyển trực tiếp vào tế bào. Tuy nhiên, quá trình
chuẩn bị tế bào trần cũng nhƣ các bƣớc chuyển gen khá phức tạp, tốn
nhiều cơng sức, chi phí cao và khơng ổn định, địi hỏi ngƣời thực
hiện phải có nhiều kinh nghiệm, khơng thể áp dụng rộng rãi tại các
phịng thí nghiệm vừa và nhỏ. Phƣơng pháp chuyển gen vào nấm
gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens kể từ khi công bố đến
nay đã đƣợc áp dụng thành cơng trên nhiều lồi nấm khác nhau, bởi
đây thực sự là phƣơng pháp đơn giản, tiện dụng mà hiệu quả đạt

đƣợc cao.
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ GEN laeA Ở NẤM SỢI
LaeA (loss of aflR-expression A) là một protein có vai trị đa
năng ở nấm sợi nói chung. LaeA đƣợc xem nhƣ một protein điều hòa


quan trọng bởi nó tƣơng tác với nhiều protein khác, trong đó có phức
hệ velvet nổi tiếng. Xét về khía cạnh protein, LaeA sở hữu vùng
chuyển nhóm methyl và tham gia vào việc điều hịa các q trình
trao đổi chất và phát triển của nấm. Trong cấu trúc protein, một vùng
cấu trúc phụ thuộc S-adenosylmethione (SAM) có hoạt tính chuyển
nhóm methyl khá tƣơng đồng với các enzyme chuyển nhóm methyl
cho axit amin arginin.
Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng LaeA và các protein
velvet gồm VeA, VelB, VelC và VosA hoạt động nhƣ những protein
điều hòa chủ chốt của quá trình phát triển và trao đổi chất bậc hai ở
nấm thơng qua việc hình thành các phức hệ nhƣ LaeA/VeA/VelB,
VeA/VelB, VelB/VosA, VelB/VelB, VelC/VosA, VelC/VeA.
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
Các chủng vi sinh vật đƣợc sử dụng trong nghiên cứu gồm:
DH5α,

Escherichia

coli

Penicillium

digitatum

Agrobacterium

PdVN1,

tumefaciens

Penicillium

digitatum

AGL1,
N11,

Penicillium chrysogenum VTCC-F1170, Penicillium chrysogenum
VTCC-F1172, Aspergillus niger N402, Aspergillus niger CBS
113.46 và Staphylococcus aureus ATCC25923.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phân lập, định danh chủng nấm mốc gây hỏng cam
2.2.2. Thu bào tử và hệ sợi nấm


2.2.3. Đánh giá khả năng mẫn cảm kháng sinh
2.2.4. Tách chiết DNA
2.2.5. Tạo các vector nhị thể dùng cho chuyển gen
2.2.6. Tối ƣu quy trình chuyển gen ở nấm A. niger, P.
digitatum và P. chrysogenum và thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
2.2.7. Xóa và phục hồi gen laeA ở các nấm sợi nghiên cứu
2.2.8. Sàng lọc và xác nhận các thể chuyển gen

2.2.9. Điều tra vai trò của gen laeA ở các loài nấm sợi nghiên
cứu
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN GEN HIỆU QUẢ CAO
SỬ DỤNG MARKER KHÁNG KHÁNG SINH
3.1.1. Nghiên cứu chuyển gen vào nấm A. niger sử dụng
phƣơng pháp ATMT và marker là gen kháng kháng sinh
Đây là nghiên cứu đầu tiên chỉ ra tỷ lệ dƣơng tính giả khi
chuyển gen vào A. niger với marker chọn lọc là gen kháng kháng
sinh. Đồng thời, nhận thấy nồng độ kháng sinh hygromycin dùng
trong chuyển gen khá cao. Nhƣ vậy, việc chuyển gen thông qua vi
khuẩn A. tumefaciens sử dụng marker chọn lọc là gen kháng
hygromycin tỏ ra không hiệu quả với chủng A. niger.


3.1.2. Phát triển hệ thống chuyển gen hiệu quả cao ở nấm
P. chrysogenum và P. digitatum sử dụng marker kháng kháng
sinh

Hình 3.6. Quy trình chuyển gen tối ƣu vào nấm P. chrysogenum
và P. digitatum
Chúng tôi đã thiết lập thành công quy trình chuyển gen hiệu
quả cao cho chủng P. digitatum PdVN1 và chủng P. chrysogenum
VTCC-F1172 (Hình 3.6). Với quy trình này, ở P. digitatum PdVN1,
hiệu suất chuyển gen đạt 1240 ± 165 thể chuyển gen, cao hơn 20 lần
so với công bố trƣớc đây trên chủng Pd01. Với P. chrysogenum
VTCC-F1172, hiệu suất chuyển gen đạt 5090 ± 96 thể chuyển
gen/106 bào tử, cao gấp 10 lần so với công bố trƣớc đây trên chủng
DS17690. Tính tới thời điểm hiện tại, đây đƣợc coi là quy trình

chuyển gen hiệu quả nhất đối với loài nấm P. digitatum và P.
chrysogenum.
Đồng thời, đây là báo cáo đầu tiên về việc biểu hiện thành
công gen mã hóa protein huỳnh quang đỏ DsRed ở P. digitatum và


huỳnh quang xanh GFP ở nấm P. chrysogenum bằng phƣơng pháp
chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens.
Đặc biệt trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chứng minh gen
kháng phleomycin là một marker mới hiệu quả cho chuyển gen và
biểu hiện gen ở cả nấm P. chrysogenum và P. digitatum.
3.2. PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN GEN SỬ DỤNG
MARKER TRỢ DƢỠNG pyrG Ở A. niger VÀ P. chrysogenum
Lần đầu tiên việc xóa gen pyrG tạo thể đột biến trợ dƣỡng
uridine/uracil đƣợc thực hiện thành cơng trên hai lồi nấm là A. niger
và P. chrysogenum bằng phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A.
tumefaciens.
Nghiên cứu của chúng tôi đã xây dựng đƣợc hệ thống
chuyển gen mới với hiệu quả cao dựa trên gen trợ dƣỡng pyrG sinh
tổng hợp uridine/uracil (marker trợ dƣỡng pyrG) ở hai loài nấm A.
niger và P. chrysogenum. Các thông số tối ƣu cho hệ thống chuyển
gen này là nồng độ bào tử cho chuyển gen là 106 bào tử/ml, đồng
nuôi cấy ở 22°C trên môi trƣờng cảm ứng (induction medium, IM)
bổ sung 0,02% uridine và 0,02 % uracil, IM của cả 2 giai đoạn cảm
ứng đều bổ sung 200 µM acetosyringone (AS), thời gian đồng ni
cấy là 60 giờ. Đây là nghiên cứu đầu tiên thiết lập thành công hệ
thống chuyển gen trợ dƣỡng uridine/uracil mà không cần sử dụng
đến gen kháng kháng sinh ở hai loài nấm này. Đây là một bƣớc tiến
vƣợt trội và hệ thống chuyển gen thiết lập đƣợc có thể đƣợc sử dụng
cho các nghiên cứu tái tổ hợp mang tính ứng dụng trong tƣơng lai.

Hình 3.15. Quy trình chuyển gen hiệu quả cao cho nấm A. niger
và P. chrysogenum trợ dƣỡng uridine/uracil
(A) Quy trình chuyển gen tối ƣu. (B) Kết quả chuyển gen trên chủng
A. niger N402, CBS 113.46 và P. chrysogenum VTCC-F1172 trợ
dƣỡng uridine/uracil.
Với quy trình chuyển gen tối ƣu vào A. niger trợ dƣỡng
uridine/uracil đã biểu hiện thành công gen huỳnh quang DsRed. Điều
này đã mở ra triển vọng mới cho nghiên cứu biểu hiện enzyme và
protein tái tổ hợp ở loài nấm sợi tiềm năng này.


3.3. NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA GEN laeA Ở A. niger, P.
chrysogenum VÀ P. digitatum
3.3.1. Nghiên cứu vai trò của gen laeA ở A. niger

Hình 3.18. Xác nhận xóa gen laeA ở A. niger
Với kết quả xác nhận bằng PCR với 3 cặp mồi đặc hiệu nhƣ
trên, chúng tôi đã xóa thành cơng gen laeA theo cơ chế tái tổ hợp
tƣơng đồng ở nấm A. niger. Đây là lần đầu tiên trên thế giới gen laeA
ở nấm A. niger đƣợc xóa thành cơng theo cơ chế tái tổ hợp tƣơng
đồng sử dụng phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens.
Đồng thời với phƣơng pháp này, gen laeA đã đƣợc phục hồi và quá
mức thành công. Sử dụng các chủng này, chúng tơi đã phát hiện một
loạt các vai trị mới của gen laeA ở A. niger.
* Gen laeA ảnh hưởng đến sự sinh trưởng trên các nguồn cacbon
của A. niger

Hình 3.23. Sự sinh trƣởng và hình thành bào tử của các chủng
A. niger trên các nguồn cacbon khác nhau
Trên mơi trƣờng có galactose, lactose, tinh bột và xylan,
chủng xóa gen laeA hình thành ít bào tử. Đặc biệt bào tử chủng xóa
gen trên nguồn cacbon là lactose giảm tới 93,75% và trên nguồn
cacbon là xylan giảm 70,55% so với chủng tự nhiên.
* Gen laeA ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng trên các nguồn nitơ

Hình 3.24. Sự sinh trƣởng và hình thành bào tử của các chủng
A. niger trên nguồn nitơ nitrat và ammonium
Đây là lần đầu tiên mối liên quan giữa gen laeA với các
nguồn nitơ đƣợc nghiên cứu ở nấm A. niger. Chúng tôi phát hiện một
điểm mới chƣa từng đƣợc công bố trƣớc đây về vai trị của gen laeA
trong biệt hóa hình thái và hình thành bào tử ở nấm A. niger trên
nguồn nitơ ammonium.


* Gen laeA ảnh hưởng đến khả năng phân giải cellulose của A.niger

Hình 3.25. Khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng A.
niger
Việc xóa gen laeA làm mất khả năng sinh tổng hợp enzyme
cellulase ở A. niger. Đây là phát hiện mới chƣa từng đƣợc cơng bố về
vai trị của gen laeA trong điều hịa kiểm sốt khả năng sinh enzyme
cellulase ở A. niger.
* Gen laeA ảnh hưởng tới khả năng gây hỏng quả của A. niger
Sau 10 ngày, thông qua xác định đƣờng kính vết lây nhiễm
nhận thấy khả năng gây hỏng táo của chủng xóa gen laeA giảm so
với chủng tự nhiên và chủng phục hồi trung bình khoảng 44,25%
(Hình 3.26A). Tƣơng tự, chủng xóa gen laeA cũng giảm khả năng

gây hỏng trên nho khoảng 53,33% (Hình 3.26B). Điều này chứng tỏ
gen laeA đóng vai trị nhất định trong việc gây hỏng quả sau thu
hoạch ở nấm A. niger. Phát hiện này chƣa từng đƣợc công bố trƣớc
đây.


Hình 3.26. Khả năng gây hỏng quả sau thu hoạch của các chủng
A. niger
(A) Gây hỏng trên táo. (B) Gây hỏng trên nho
3.3.2. Nghiên cứu vai trò của gen laeA ở P. chrysogenum
Đây là lần đầu tiên gen laeA đƣợc xóa bỏ khỏi hệ gen của P.
chrysogenum sử dụng phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn
A. tumefaciens.
Đồng thời, chủng phục hồi gen laeA cũng đã đƣợc tạo thành
công, giúp chúng tôi phát hiện một số điểm mới về vai trị của gen
laeA ở lồi nấm sợi này mà chƣa từng đƣợc công bố trƣớc đây.


Hình 3.30. Xác nhận chủng xóa gen laeA bằng PCR
(A) Sơ đồ trao đổi chéo và vị trí các cặp mồi dùng để kiểm tra. (B)
Sự sinh trƣởng của các chủng nấm trên môi trƣờng PDA và CD sau 3
và 6 ngày. (C) Kết quả PCR kiểm tra. M: 1 kb DNA marker, (-) Đối
chứng âm sử dụng nƣớc cất vô trùng.
* Gen laeA ảnh hưởng tới khả năng sinh kháng sinh penicillin
Việc phát hiện ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến q trình khơi
phục kiểu hình và khả năng sinh kháng sinh penicillin kháng vi
khuẩn S. aureus ở chủng P. chrysogenum xóa gen laeA chƣa từng
đƣợc nhắc đến, do vậy kết quả này góp phần bổ sung thêm sự hiểu
biết về vai trò điều hòa của gen laeA ở P. chrysogenum.

Hình 3.32. Sự sinh trƣởng và sinh kháng sinh penicillin của các
chủng P. chrysogenum trên nguồn nitơ là nitrat và ammonium
* Gen laeA ảnh hưởng tới khả năng hình thành bào tử ở nấm P.
chrysogenum
Sau 6 ngày nuôi cấy, ở nguồn nitơ nitrat, chủng xóa laeA
hình thành bào tử, tuy nhiên lƣợng bào tử hình thành chỉ bằng 45,6%
so với chủng tự nhiên. Trên môi trƣờng với nguồn nitơ là
ammonium, lƣợng bào tử của chủng xóa gen laeA tăng lên rất nhiều.
Cụ thể lƣợng bào tử hình thành bằng 87,3% so với chủng tự nhiên
(Hình 3.33B). Nhƣ vậy, nguồn nitơ ammonium thúc đẩy quá trình
phục phồi khả năng hình thành bào tử cho chủng P. chrysogenum
xóa laeA. Đây là nghiên cứu đầu tiên chỉ ra vai trò của nguồn nitơ
ảnh hƣởng tới hoạt động kiểm soát của gen laeA tới khả năng hình
thành bào tử ở nấm P. chrysogenum.


Hình 3.33. Sự hình thành bào tử của các chủng P. chrysogenum
trên nguồn nitơ nitrat và ammonium
* Gen laeA ảnh hưởng tới khả năng sinh enzyme α-amylase ở nấm P.
chrysogenum
Với nguồn nitơ nitrat, khả năng sinh enzyme α-amylase của
chủng P. chrysogenum xóa laeA giảm so với chủng tự nhiên và
chủng phục hồi. Trong khi đó, trên mơi trƣờng sử dụng nguồn nitơ
ammonium, khả năng sinh enzyme α-amylase của chủng xóa laeA
đƣợc phục hồi tƣơng đƣơng so với chủng tự nhiên và chủng phục


hồi. Nhƣ vậy, nguồn nitơ ảnh hƣởng tới hoạt động của gen laeA ở P.
chrysogenum trong điều hịa q trình sinh enzyme ngoại bào αamylase.

Hình 3.34. Khả năng sinh enzyme α-amylase của các chủng P.
chrysogenum trên nguồn nitơ nitrat và ammonium
3.3.3. Nghiên cứu vai trò của gen laeA ở P. digitatum
Hiện nay, đã có báo cáo về vai trị của một số gen trong hệ
gen của nấm P. digitatum nhƣ: PdMpkB, PdSNF1, PdSlt2,…. Tuy
nhiên, vai trò của gen laeA chƣa từng đƣợc đề cập ở nấm P.
digitatum. Trong nghiên cứu này, lần đầu tiên trên thế giới gen laeA
ở nấm P. digitatum đƣợc xóa thành cơng, việc điều tra đặc điểm của
chủng xóa gen laeA sẽ giúp làm sáng tỏ vai trò của gen này ở vi nấm
P. digitatum.
Đồng thời, trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến tạo thành
công chủng phục hồi và chủng biểu hiện quá mức gen laeA. Các
chủng phục hồi và biểu hiện quá mức gen laeA ở nấm P. digitatum sẽ
giúp cho việc điều tra vai trị của gen laeA đƣợc đầy đủ và chính xác.


Hình 3.39. Xác nhận xóa và phục hồi gen laeA ở P. digitatum
(A) Sơ đồ xóa và phục hồi; (B) PCR sử dụng ba cặp mồi PdlaeAP5/PdlaeA-P6, PdlaeA-ORF-F/PdlaeA-ORF-R và NAT-F/NAT-R;
(C) PCR sử dụng ba cặp mồi PdlaeA-P5/PdlaeA-P6, PdlaeA-ORFF/PdlaeA-ORF-R và PgpdA-F/HPH-R


* Gen laeA ảnh hưởng tới khả năng sử dụng nguồn cacbon ở nấm P.
digitatum

Hình 3.40. Gen laeA ảnh hƣởng tới khả năng sử dụng nguồn
cacbon ở nấm P. digitatum
(A) Sự sinh trƣởng của các chủng nấm trên các nguồn cacbon sau 7
ngày. (B) Đƣờng kính sinh trƣởng của các chủng nấm trên các nguồn
cacbon sau 7 ngày

Kết quả thu đƣợc cho thấy, trên tất cả các nguồn cacbon
nghiên cứu, chủng P. digitatum xóa gen laeA sinh trƣởng kém so với
chủng tự nhiên và chủng phục hồi. Đặc biệt trên mơi trƣờng với
nguồn cacbon là pectin chủng xóa gen laeA sinh trƣởng kém hơn rõ


ràng. Đây có thể là một đặc điểm quan trọng liên quan tới khả năng
gây hỏng quả của chủng nấm P. digitatum xóa gen laeA. Bởi pectin
là một thành phần quan trọng trong vỏ quả có múi
* Gen laeA ảnh hưởng tới khả năng sinh axit hữu cơ ở nấm P.

digitatum
Hình 3.41. pH dịch ni cấy các chủng nấm
Kết quả nghiên cứu cho thấy, pH của dịch ni cấy chủng
xóa laeA cao nhất (pH trung bình là 5,15) trong khi pH của chủng tự
nhiên trung bình là 4,02, chứng tỏ việc xóa gen laeA làm giảm khả
năng sinh axit hữu cơ ở nấm P. digitatum. Hơn nữa, ở chủng quá
mức gen laeA, pH dịch ni đạt trung bình là 3,61, điều này đồng
nghĩa với việc khi biểu hiện quá mức gen laeA lƣợng axit hữu cơ đã
sinh ra nhiều hơn làm giảm pH mơi trƣờng (Hình 3.41). Kết quả này
làm sáng tỏ một phần về vai trị kiểm sốt khả năng sinh axit hữu cơ
của gen laeA ở nấm sợi nấm P. digitatum. Vai trị này chƣa từng
đƣợc cơng bố trƣớc đây ở nấm P. digitatum. Việc giảm khả năng axit
hữu cơ hóa mơi trƣờng có thể liên quan trực tiếp tới độc lực gây
hỏng quả có múi của nấm P. digitatum.


* Gen laeA quy định khả năng gây bệnh và hình thành bào tử ở nấm
P. digitatum

Hình 3.42. Gen laeA kiểm sốt khả năng gây hỏng cam và hình
thành bào tử ở nấm P. digitatum
(A) Các chủng nấm P. digitatum trên môi trƣờng PDA và PDA bổ
sung 1,5M D-sorbitol; (B) Nồng độ bào tử của các chủng nấm P.
digitatum trên môi trƣờng PDA và PDA bổ sung 1,5M D-sorbitol;
(C) Sự gây bệnh của các chủng nấm trên
Với tác nhân gây ảnh hƣởng lên thành tế bào nấm là Dsorbitol, sẽ dẫn tới sự giảm hình thành bào tử trên các chủng nấm P.
digitatum xóa gen laeA. Đây là một điểm mới về vai trò của gen laeA
ở nấm P. digitatum chƣa từng đƣợc công bố trƣớc đây.
Khả năng gây hỏng quả có múi sau thu hoạch là đặc tính
quan trọng ở nấm P. digitatum. Vì vậy, trong nghiên cứu này chúng
tơi tập trung nghiên cứu vai trị của gen laeA liên quan tới kiểm soát
độc lực gây bệnh của nấm P. digitatum. Kết quả nghiên cứu của


chúng tơi cho thấy việc xóa gen laeA đã làm mất hoàn toàn khả năng
gây hỏng cam của nấm P. digitatum.

Hình 3.43. Khả năng gây hỏng cam của chủng quá mức gen laeA
so với chủng xóa và chủng tự nhiên
Để khẳng định chính xác hơn về việc gen laeA kiểm soát khả
năng gây hỏng cam hay gen laeA là một gen độc gây hỏng cam ở
nấm P. digitatum, chúng tôi tiến hành lây nhiễm các chủng biểu hiện
quá mức này trên cam và so sánh với chủng tự nhiên và chủng xóa.
Chúng tơi nhận thấy chủng biểu hiện q mức gen laeA gây hỏng
cam nhanh hơn so với chủng tự nhiên (Hình 3.43). Nhƣ vậy cho thấy
gen laeA là một gen quan trọng kiểm soát khả năng gây hỏng cam ở
nấm P. digitatum. Đây là phát hiện mới đầu tiên trên thế giới về vai
trò của gen laeA đối với việc gây hỏng quả.

KẾT LUẬN
1. Đã tạo thành công các vector nhị thể mới dùng cho cải biến di
truyền ở ba loài nấm sợi A. niger, P. chrysogenum và P. digitatum
- Tạo thành công 4 vector nhị thể mang cấu trúc biểu hiện
gen huỳnh quang (DsRed hoặc GFP) với marker chọn lọc là gen trợ
dƣỡng pyrG (pEX2A), gen kháng kháng sinh hygromycin (pPK2Red), gen kháng kháng sinh nourseothricin (pGreen3), và gen kháng
kháng sinh phleomycin (pPK2-Red2).
- Tạo thành cơng 2 vector xóa gen sinh tổng hợp
uridine/uracil (gen pyrG) ở nấm sợi A. niger (pKO2AnpyrG) và P.
chrysogenum (pKO2ΔPcpyrG).
- Tạo thành công 9 vector nhị thể mới dùng cho xóa gen,
phục hồi và biểu hiện quá mức gen laeA ở ba loài nấm sợi A. niger,
P. chrysogenum và P. digitatum. Trong đó, 4 vector dùng cho xóa
gen laeA (gồm: pKO2ΔAnlaeA, pEΔAnlaeA, pKO2ΔPdlaeA,
pKO2ΔPclaeA) và 5 vector dùng cho phục hồi và biểu hiện quá mức
gen laeA (gồm: pG-AnlaeA, pGB-AnlaeA, pPK2-PclaeA, pEX2BPclaeA, pG-PdlaeA).
2. Phát triển thành công hệ thống chuyển gen hiệu quả cao thông
qua vi khuẩn A. tumefaciens ở ba loài nấm sợi nghiên cứu.
- Đây là cơng trình đầu tiên xây dựng thành cơng hệ thống
chuyển gen hiệu quả cao sử dụng marker trợ dƣỡng pyrG ở nấm sợi
công nghiệp A. niger và P. chrysogenum với hiệu quả chuyển gen
tƣơng ứng đạt 2212 ± 336 và 1750 ± 281 thể chuyển gen/106 bào tử.
- Đã xây dựng đƣợc hệ thống chuyển gen hiệu quả cao ở
nấm sợi P. chrysogenum và nấm gây hỏng quả có múi P. digitatum
sử dụng marker là gen kháng kháng sinh. Hiệu quả chuyển gen tƣơng
ứng đạt 1240 ± 165 và 5090 ± 96 thể chuyển gen/106 bào tử.