Nghiên cứu xây dựng phương pháp RT lamp (reverse transcription loop mediated isothermal amplification) để phát hiện virus dengue

LÂM TÚ QUỲNH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

CÔNG NGHÊ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
RT-LAMP (REVERSE TRANSCRIPTION
LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL
AMPLIFICATION) ĐỂ PHÁT HIỆN
VIRUS DENGUE

---------------------------------------

LÂM TÚ QUỲNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

2010 - 2012
Hà Nội
2013

NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2013


MỤC LỤC
MỤC LỤC .................................................................................................................. i
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. iii

DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................v
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................3
1.1 Tình hình sốt xuất huyết trên thế giới và Việt Nam ...................................3
1.1.1 Tình hình sốt xuất huyết trên thế giới ..................................................3
1.1.2 Tình hình sốt Dengue, sốt xuất huyết Dengue ở Việt Nam .................6
1.2 Đặc điểm của virus Dengue ..........................................................................8
1.2.1 Đặc điểm hình thái .................................................................................8
1.2.2 Đặc điểm di truyền ...............................................................................10
1.3 Chẩn đoán virus Dengue .............................................................................10
1.3.1 Chẩn đoán lâm sàng ............................................................................11
1.3.2 Chẩn đoán qua xét nghiệm huyết thanh .............................................11
1.3.2.1 Phương pháp ngăn ngưng kết hồng cầu ....................................11
1.3.2.2 Phương pháp miễn dịch enzyme phát hiện kháng thể IgM ...........12
1.3.2.3 Phương pháp phân lập virus .....................................................13
1.3.2.4 Phương pháp ELISA – NS1 .......................................................14
1.3.3 Chẩn đoán dựa trên nucleic acid .......................................................14
1.3.3.1 Phương pháp RT-PCR ............................................................14
1.2.3.2 Phương pháp Real-time RT-PCR ...........................................15
1.4 Phương pháp RT-LAMP ............................................................................16
1.4.1 Cơ chế hoạt động của RT-LAMP ......................................................16
1.4.2 Ứng dụng của phương pháp RT-LAMP ...........................................19
1.4.2.1 RT-LAMP trong chẩn đoán SD/SXHD ......................................19
1.4.2.2 Các ứng dụng khác của LAMP, RT-LAMP ...............................20
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....21
2.1 Nguyên vật liệu.............................................................................................21
2.1.1 Mẫu vật .................................................................................................21
2.1.2 Hóa chất ...............................................................................................21
2.1.3 Trang thiết bị ........................................................................................22

i


2.2 Phương pháp nghiên cứu .........................................................................22
2.2.1 Quy trình tách chiết RNA .................................................................22
2.2.2 Phương pháp RT-PCR ......................................................................23
2.2.2.1 Phương pháp tạo cDNA ..........................................................23
2.2.2.2 Phương pháp PCR ..................................................................24
2.2.2.3 Phương pháp Nested-PCR ......................................................25
2.2.3 Phương pháp RT-LAMP...................................................................25
2.2.3.1 Khảo sát điều kiện nhiệt độ: ...................................................27
2.2.3.2 Khảo sát điều kiện thời gian: ..................................................27
2.2.3.4 Khảo sát điều kiện nồng độ Mg2+: ..........................................27
2.2.3.5. Khảo sát điều kiện nồng độ Betaine: .....................................27
2.2.3.6. Khảo sát tính đặc hiệu của phương pháp: .............................27
2.2.3.7. Khảo sát khả năng phát hiện virus Dengue ..............................28
2.2.3.8 Khảo sát nồng độ khuôn của mẫu phát hiện virus Dengue: ..28
2.2.4 Phương pháp điện di trên Agarose: .................................................28
2.2.5 Phương pháp bổ sung MgSO 4 và Ethidium Bromide .....................29
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................30
3.1. Thiết lập phản ứng RT-LAMP ...............................................................30
3.2.1. Khảo sát điều kiện nhiệt độ..............................................................32
3.2.2. Khảo sát điều kiện thời gian ............................................................33
3.2.3. Khảo sát điều kiện nồng độ dNTPs .................................................34
3.2.4. Khảo sát điều kiện nồng độ Mg2+ ....................................................35
3.2.5. Khảo sát điều kiện nồng độ Betaine ................................................36
3.3. Phát triển phương pháp xác định sản phẩm phản ứng LAMP ...........37
3.4. Xác định độ đặc hiệu của phản ứng RT-LAMP ...................................38
3.5. Khả năng phát hiện virus Dengue bởi phương pháp RT- LAMP.......39
3.5.1. Phản ứng RT-PCR xác định virus Dengue từ huyết thanh ...........39

3.5.2. Phản ứng Nested-PCR .....................................................................40
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .........................................................45
KẾT LUẬN ..............................................................................................................45
KIẾN NGHỊ .............................................................................................................45
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................46

ii


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Các quốc gia và khu vực có nguy cơ lây truyền Dengue, 2012 .................4
Hình 1.2. Số mắc Dengue và Dengue nặng được báo cáo hàng năm cho WHO giai
đoạn 1995 -2007 và một số ca được báo cáo trong giai đoạn 2008-2010. ..5
Hình 1.3. Số ca mắc SD/SXHD của 30 quốc gia có SD/SXHD cao nhất. ..................5
Hình 1.4. Số quốc gia có SD/SXHD cùng với số ca mắc giai đoạn 1955- 2008 ........6
Hình 1.5. Cấu trúc và tổ chức bộ gen của virus Dengue [20]. ..................................8
Hình 1.6. Sơ đồ cơ chế hoạt động của phản ứng Mac-ELISA ..................................13
Hình 3.1. Phổ điện di sản phẩm LAMP (giếng + ), đối chứng (giếng - ), thang DNA
chuẩn 100 bp Fermentas (giếng M) ............................................................31
Hình 3.2. Phản ứng LAMP tại các nhiệt độ khác nhau 59, 61, 63, và 65oC; thang
DNA chuẩn 100 bp Fermentas (M) .............................................................32
Hình 3.3. Phản ứng RT-LAMP được thực hiện trong các khoảng thời gian khác
nhau 15, 30, 45, và 60 phút ở nhiệt độ tối ưu là 61oC; thang DNA chuẩn
100 bp Fermentas (M) .................................................................................33
Hình 3.4. Phản ứng LAMP được thực hiện ở các nồng độ dNTPs khác nhau 0,2;
0,4; 0,6; 0,8; 1,0 mM; thang DNA chuẩn 100 bp Fermentas (M) ..............34
Hình 3.5. Phản ứng LAMP thực hiện với các nồng độ Mg2+ khác nhau 2, 4, 6, 8, 10
mM; thang DNA chuẩn 100 bp Fermentas (M) ..........................................36
Hình 3.6. Phản ứng LAMP thực hiện với các nồng độ Betaine khác nhau ..............37
Hình 3.7. Phát hiện sản phẩm LAMP bằng điện di trên gel agarose 1,5% (A).......38

quan sát kết tủa bằng mắt thường (B), bổ sung MgSO 4 và ethidium bromide (C)
dưới đèn UV. ...............................................................................................38
Hình 3.8. Phản ứng RT-LAMP sử dụng khuôn RNA virus dengue (giếng 1), virus sởi
(giếng 2, 3) và virus rubella (giếng 4, 5); thang DNA 100 bp Fermentas
(giếng M) .....................................................................................................39
Hình 3.9: Phổ điện di sản phẩm PCR giếng 1 – đối chứng, giếng 2, 3, 4, 5 tương
ứng cho sản phẩm PCR từ các mẫu bệnh; giếng M - DNA chuẩn 100 bp
Fermentas ....................................................................................................40

iii


Hình 3.10: Phổ điện di sản phẩm PCR giếng1, 2, 3, 4, tương ứng cho mẫu dương
tính Dengue; giếng 5 – đối chứng âm, giếng M - DNA chuẩn 100bp
Fermentas ....................................................................................................41
Hình 3.11. Khả năng phát hiện virus Dengue của phản ứng RT-LAMP với RNA typ
1 (giếng 1), typ 2 (giếng 2), typ 3 (giếng 3) và typ 4 (giếng 4) tách từ huyết
thanh ............................................................................................................42
Hình 3.12. Ảnh hưởng của lượng mẫu RNA tách từ huyết thanh đến phản ứng
LAMP. 0,1 µl mẫu (giếng 1-4) và 3 µl mẫu (giếng 5-8) của 4 bệnh nhân với
4 typ (1-4) tương ứng. .................................................................................43

iv


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1 So sánh hai phương pháp phát hiện virus Dengue (chưa phân typ) ..................... 43
Bảng 3.2 So sánh phương pháp phát hiện virus Dengue của Parida và cộng sự với phương
pháp của đề tài ...................................................................................................... 44

v


MỞ ĐẦU
Sốt Dengue (SD), sốt xuất huyết Dengue (SXHD) và hội chứng sốc
Dengue là do virus Dengue gây ra và do muỗi lây truyền, chủ yếu xảy ra ở vùng
nhiệt đới và cận nhiệt đới. Nước ta là một trong những quốc gia có tỉ lệ mắc
SD/SXHD cao trên thế giới. Cũng như các nước khác, SD/SXHD ở Việt Nam
hiện là một trong những bệnh gây tử vong hàng đầu cho trẻ em, tập trung chủ
yếu ở trẻ dưới 15 tuổi [7].
Các phương pháp xét nghiệm chẩn đoán SD/SXHD phổ biến hiện nay
bao gồm: phương pháp huyết thanh học (phân lập virus, Mac-ELISA) thường
cho kết quả chậm, không phù hợp trong chẩn đoán và điều trị, chủ yếu phục vụ
cho công tác giám sát dịch tễ. Kỹ thuật sinh học phân tử Nested RT-PCR, realtime RT-PCR đã được phát triển và ứng dụng trong chẩn đoán, tuy nhiên các
phương pháp này vẫn còn chưa được áp dụng phổ biến và ứng dụng thực tiễn do
chi phí cao, trang thiết bị phức tạp, nhân viên phải được đào tạo tốt. Gần đây, kỹ
thuật ELISA kháng nguyên NS1 đã được sử dụng để phát hiện protein NS1 của
virus Dengue, tuy nhiên phương pháp này không thể xác định typ và giá cả sinh
phẩm còn đắt.
LAMP là một phương pháp mới cho phép khuếch đại acid nucleic chỉ tại
một điều kiện nhiệt độ và trong thời gian ngắn. Kỹ thuật LAMP sử dụng 4 mồi
bắt cặp tại 6 vị trí khác nhau, do đó tính đặc hiệu là rất cao và vượt trội so với kỹ
thuật PCR thông thường. Hơn nữa, kỹ thuật LAMP chỉ yêu cầu một thiết bị ổn
nhiệt thông thường và sản phẩm LAMP có thể quan sát được bằng mắt (không
cần thực hiện điện di). Kỹ thuật đã được phát triển thành kit sử dụng cho phát
hiện nhiều loại virus, vi khuẩn, ký sinh trùng [7] [8] [24]. Phương pháp RTLAMP cũng đã được nghiên cứu để phát hiện virus Dengue tại Nhật Bản. Tuy
nhiên đặc điểm miễn dịch học phân tử của virus Dengue tại mỗi vùng địa lý khác
nhau có thể khác nhau. Xuất phát từ tình hình đó, chúng tơi đã thực hiện đề tài

1

“Nghiên cứu xây dựng phương pháp RT-LAMP (Reverse Transcription Loopmediated isothermal amplification) để phát hiện virus Dengue” phục vụ phát triển
bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh virus Dengue phù hợp điều kiện tại Việt Nam.
Mục tiêu của đề tài:
-

Thiết lập và ứng dụng phương pháp RT-LAMP cho xác định nhanh
virus Dengue từ mẫu huyết thanh.

Nội dung nghiên cứu:
-

Tách chiết RNA từ mẫu huyết thanh

-

Thiết lập phản ứng RT-LAMP

-

Khảo sát điều kiện phản ứng RT-LAMP

-

Ứng dụng phương pháp RT-LAMP để xác định virus Dengue từ mẫu
huyết thanh

2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tình hình sốt xuất huyết trên thế giới và Việt Nam
1.1.1 Tình hình sốt xuất huyết trên thế giới
Sốt Dengue (SD), sốt xuất huyết Dengue (SXHD) và hội chứng sốc
Dengue (HCSD) là bệnh do virus Dengue có ở muỗi Aedes aegypti truyền.
Trong suốt nhiều thập kỷ qua, mức độ xuất hiện của SD, SXHD và HCSD cùng
với các vụ dịch tăng lên đáng lo ngại trên toàn cầu, đồng thời tỷ lệ mắc bệnh
cũng tăng lên, hiện nay chưa có vắc xin phịng ngừa cũng như chưa có thuốc đặc
trị. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG) hiện tại có khoảng 2,5- 3 tỷ người có
nguy cơ mắc SD, ước tính có tới 50-100 triệu trường hợp mắc SD mỗi năm.
Hằng năm, 500.000 trường hợp SD phải nhập viện, trong đó 90% là trẻ em dưới
15 tuổi. Tỷ lệ tử vong trung bình của các trường hợp mắc SD/SXHD là 2,5%.
Dịch có tính chất chu kỳ [31].
Dịch SXHD được ghi nhận đầu tiên vào những năm 1950 tại Philippines
và Thái Lan. Ngày nay, SXHD ảnh hưởng hầu hết các nước châu Á và châu Mỹ
la tinh, nó trở thành nguyên nhân hàng đầu của tỷ lệ trẻ em nhập viện và tử vong
ở các quốc gia thuộc khu vực này [31].
Trước năm 1970, SD/SXHD chỉ xuất hiện trên chín quốc gia. Hiện tại,
SD/SXHD đã lan rộng trên 100 quốc gia, trong đó có 20 nước châu Phi, 42 nước
Châu Mỹ, 7 nước Đông Nam Á, 4 nước phía đơng Địa Trung Hải và 29 nước
thuộc khu vực Tây Thái Bình Dương. Hiện nay, những khu vực có khí hậu nhiệt
đới đều là những vùng có nguy cơ bị dịch cao với tất cả bốn typ virus lưu hành
đồng thời, đó là khu vực châu Mỹ, châu Á Thái Bình Dương và châu Phi [31].
Năm 2008 số ca mắc SD/SXHD được ghi nhận tại Châu Mỹ, Đơng Nam
Á, Tây Thái Bình Dương đã vượt quá 1,2 triệu và con số này là 2,3 triệu vào
năm 2010. Gần đây, số ca mắc SD/SXHD được báo cáo ngày càng gia tăng.

3

Riêng tại châu Mỹ năm 2010 đã ghi nhận 1,6 triệu trường hợp sốt Dengue trong
đó 49000 trường hợp là sốt Dengue nặng [31].
Không những số ca mắc SD tăng lên hàng năm ở các khu vực đã có SD,
mà ngày càng có nhiều khu vực mới có bệnh nhân mắc SD, và con số gia tăng ở
tốc độ bùng nổ. Năm 2010 những ca SD đầu tiên được ghi nhận đầu tiên tại Pháp
và Croatia. Năm 2012 trên đảo Madeira của Bồ Đào Nha dịch SXH đã bùng phát
với 1800 ca được ghi nhận và thêm năm quốc gia khác của châu Âu cũng ghi
nhận những trường hợp SD du nhập. Năm 2012 SD được xem là dịch bệnh dịch
virus lây truyền qua muỗi nguy hiểm nhất trên thế giới [31].

Vùng thích hợp lây truyền Dengue
Nguy cơ cao
Nguy cơ thấp
Khơng có dịch/ Khơng
thích hợp

Hình 1.1: Các quốc gia và khu vực có nguy cơ lây truyền Dengue, 2012
Nguồn: WHO - Global strategy dengue prevention and control 2012-2020 [22]

4


Số ca mắc Dengue và

Năm

Hình 1.2: Số mắc Dengue và Dengue nặng được báo cáo hàng năm cho WHO
giai đoạn 1995 -2007 và một số ca được báo cáo trong giai đoạn 2008-2010.
Nguồn: WHO - Global Strategy Dengue Prevention And Control 2012-2020 [22]

Hình 1.3: Số ca mắc SD/SXHD của 30 quốc gia có SD/SXHD cao nhất.
Nguồn: WHO - Global strategy dengue prevention and control 2012-2020 [22]

5


Mỗi mười năm, con số mắc SD/SXHD được báo cáo cho Tổ chức Y tế thế
giới tiếp tục tăng theo cấp số nhân. Từ năm 2000 đến năm 2008, số ca mắc
SD/SXHD được báo cáo là 1 656 870, gấp 3,5 lần giai đoạn 1990-1999 (479 848
ca) (hình 1.4). Trong năm 2008, có 69 quốc gia có sự hiện diện của SD/SXHD
tập trung ở Đơng Nam Á, Tây Thái Bình Dương và châu Mỹ.

Số
ca

Số ca
Số quốc gia

Số
quốc
gia

Hình 1.4: Số quốc gia có SD/SXHD cùng với số ca mắc giai đoạn 1955- 2008
Nguồn: WHO (2011), Region Office for South East Asia Comprehensive Guidelines
for Prevention and Control of Dengue and Dengue Haemorrhagic Fever [23]

1.1.2 Tình hình sốt Dengue, sốt xuất huyết Dengue ở Việt Nam
Việt Nam là một trong những quốc gia nằm trong vùng dịch tễ lan truyền
của virus Dengue, SD/SXHD xuất hiện tại Việt Nam từ hơn 50 năm qua đã gây

nhiều tử vong, đặc biệt ở trẻ em tại miền Nam Việt Nam. Những năm đầu
SD/SXHD chỉ xuất hiện ở một vài địa phương với các ổ dịch nhỏ, số người mắc
bệnh ít, tỷ lệ tử vong cao. Những năm sau, SXHD lan rộng trên nhiều tỉnh thành
với số ca bệnh ngày càng gia tăng. Đỉnh cao là các năm 1983, 1987 với qui mơ
tồn quốc. Tỷ lệ mắc chung cho cả nước từ 41,02 (1981) đến 462,24/100.000
dân (1987). Những năm tiếp theo, nhờ công tác điều trị đạt được nhiều tiến bộ

6


nên tỷ lệ tử vong giảm từ 2,7 (1983) xuống còn 0,16 (1994)/100.000 dân. Tỷ lệ
mắc ở miền Nam và miền Trung thường cao hơn nhiều lần so với miền Bắc [22].
Năm 1996, SD/SXHD được ghi nhận trong 44 trên 53 tỉnh thành trong cả
nước. Năm 1998, dịch SXH bùng phát ở 19 tỉnh thành phía Nam với 119429 ca
mắc (438,9/100000 dân) và 342 ca chết (1,26/100000 dân) [8].
Từ năm 1998, chương trình quốc gia phịng chống sốt xuất huyết đã được
thành lập giúp cải thiện nhiều trong vấn đề kiểm soát, chẩn đoán và điều trị bệnh.
Tuy nhiên, SD/SXHD chưa có chiều hướng giảm trong những năm gần đây.
Theo báo cáo của Cục Y tế dự phòng tại hội nghị tăng cường cơng tác
phịng, chống sốt xuất huyết cho các tỉnh/TP khu vực phía nam ngày 15/08/2012,
tính từ đầu năm 2012 đến 15/08/2012, cả nước ghi nhận hơn 39.987 trường hợp
mắc SXH tại 52 tỉnh/TP, tăng 35,3% so với cùng kỳ năm 2011, trong đó có 26
trường hợp tử vong. Các tỉnh có trên 3000 ca mắc là TP Hồ Chí Minh, Đồng
Nai, Bình Dương, Bình Phước, An Giang. Đáng quan tâm, năm nay dịch SXH
tăng mạnh ở các tỉnh khu vực miền Trung và Tây Nguyên. Tích lũy số ca mắc
SXH ở các tỉnh miền Trung là 3.593 ca (tăng 130%), Tây Nguyên: 339 ca (tăng
73%) và các tỉnh phía Nam: 35.374 ca (tăng 14%).
Theo kết quả giám sát của Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh được báo cáo tại
hội nghị, trong 7 tháng đầu năm 2012, tại khu vực phía Nam tình hình bệnh SXH
diễn biến khá phức tạp. Các chuyên gia dịch tễ nhận định nguyên nhân của dịch

SXH gia tăng trên diện rộng là do bệnh chưa có vắc-xin phịng ngừa, chưa có
thuốc đặc trị và một trong những nguyên nhân quan trọng dẫn đến tình trạng
bùng phát dịch trên diện rộng do sự chủ quan, lơ là, thiếu ý thức của người dân
trong phòng, chống dịch bệnh dù bệnh SXH khơng q khó để phòng tránh. Ở
nước ta hiện đang lưu hành đồng thời cả bốn typ virus Dengue gây bệnh SXH là:
D1 (30%), D2 (26%), D3 (20,3%) và D4 (23,6%), đặc biệt typ D4 đã xuất hiện ở
cả khu vực miền Nam và miền Trung.

7


1.2 Đặc điểm của virus Dengue
1.2.1 Đặc điểm hình thái

Hình 1.5: Cấu trúc và tổ chức bộ gen của virus Dengue [20].
Virus Dengue thuộc giống Flavivirus, thuộc họ Flaviviridae. Virus Dengue
gồm 4 typ huyết thanh:
-

Virus Dengue typ I: được biết từ năm 1907

-

Virus Dengue typ II: phân lập từ năm 1952

-

Virus Dengue typ III: lần đầu tiên phát hiện năm 1955

-

Virus Dengue typ IV: phân lập năm 1957

Nếu nhiễm một trong bốn typ virus này, sẽ tạo được miễn dịch suốt đời với
virus có typ huyết thanh đó. Mặc dù cả bốn typ đều tương tự nhau về mặt kháng
nguyên, nhưng sự khác nhau giữa bốn typ này vẫn đủ để tạo ra khả năng miễn
dịch chéo, và khả năng miễn dịch chéo này chỉ kéo dài một vài tháng sau khi
nhiễm một trong bốn typ. Dengue 1 và Dengue 3 có vài thành phần kháng
nguyên giống nhau; Dengue 1 và Dengue 4 có 70% trình tự cấu trúc gen giống

8


nhau; Dengue 2 có khoảng 28-36% trình tự cấu trúc gen giống các typ huyết
thanh khác.
Các typ virus có chung một số tính chất sinh học và giống nhau về hình ảnh
lâm sàng. Các typ virus khác nhau về cấu trúc kháng nguyên. Kích thước của
virus Dengue vào khoảng 50-70 nm, mang một chuỗi đơn RNA. Viron của virus
Dengue gồm một lõi nucleocapsid hình khối vng đối xứng nằm trong một vỏ
có cấu tạo là lipoprotein. Gen của virus Dengue có chiều dài gần 11.000 cặp base
và gồm ba gen có cấu trúc protein mã hóa cho nucleocapsid hay protein lõi (C),
một protein liên quan tới màng (M), một protein vỏ (E) và bảy gen khơng có cấu
trúc protein (NS). Glycoprotein vỏ có liên quan đến hoạt tính ngưng kết hồng
cầu và hoạt tính trung hịa của virus.
Bộ gen virus Dengue là một khung đọc mở đơn (ORF) liên tục gắn vào vùng
khơng mã hóa 5’ và 3’, gồm 4 vùng khác nhau : đầu 5’ – vùng cấu trúc (chứa gen
mã hóa protein lõi C, protein màng prM/M và protein vỏ E) ; vùng khơng cấu trúc
(mã hóa các protein NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5) –đầu 3’ .
Virus Dengue hình thành một phức hệ khác biệt so với các virus thuộc giống
Flavivirus do đặc điểm kháng nguyên và đặc điểm sinh học.

Protein capsid C : có trọng lương phân tử 13,5Kd. Vùng kỵ nước của protein
C là cấu trúc bảo tồn trong nhóm Flavivirus.
Protein màng M: có hai dạng protein màng M, prM trọng lượng phân tử là
22Kd, có mặt ở các hạt virus chưa trưởng thành trong tế bào. Protein M có trọng
lượng phân tử là 8 Kd, có ở các hạt virus trưởng thành ngồi tế bào. Protein prM
là tiền thân của protein M.
Protein vỏ E là glycoprotein vỏ lớn có trọng lượng phân tử 51-60 Kd gồm
494 – 501 acid amin, xuất hiện trên bề mặt của hạt virus trưởng thành. Protein E
được phân chia thành 3 vùng kháng nguyên khác nhau I, II, III. Vùng kháng
nguyên III là vùng chịu ảnh hưởng áp lực chọn lọc dương cao nhất vì vùng này

9


chứa thụ thể gắn kế và epitope trung hòa typ đặc hiệu. Protein vỏ là kháng
nguyên quan trọng nhất kích thích miễn dịch dịch thể và cơ thể bệnh nhân tạo
kháng thể trung hòa virus, kháng thể ngăn ngưng kết hồng cầu. Protein vỏ có
chức năng sinh học quan trọng trong quá trình gắn kết vào tế bào ký chủ và đóng
gói virus. Tầm quan trọng của protein này trong đáp ứng miễn dịch trung gian
cũng được xác nhận [5] [6] [19].
Các protein nhỏ không cấu trúc NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS5 chức năng
chưa được xác định trong quá trình nhân lên của virus.
1.2.2 Đặc điểm di truyền
Các kiểu gen đặc hiệu bên trong một typ huyết thanh của virus Dengue
được kết hợp với mức độ nặng hơn hoặc nhẹ hơn của bệnh. Đối với typ huyết
thanh 2 và 3 thì kiểu gen tương ứng có nguồn gốc từ Đơng Nam Á và từ tiểu lục
địa Ấn Độ, đã từng được phát hiện như là nguyên nhân của nhiều vụ dịch SXHD
hoặc kết hợp HCSD và nhiễm nguyên phát nhiều hơn có kèm theo bệnh nặng.
Trong một số khu vực như Peru các nghiên cứu dịch tễ học đã từng chỉ ra rằng
thậm chí nhiễm thứ phát thì bệnh nhân vẫn khơng phát triển SXHD hoặc HCSD

khi chỉ có sự lưu hành của virus mang kiểu gen ít sinh bệnh xảy ra. Các kiểu gen
virus độc hơn đã thay chỗ cho các kiểu gen bản địa châu Mỹ, dẫn đến những vụ
dịch nặng nề hơn trước. Các cơ chế này đưa đến sự tăng lên độc lực của virus
Dengue đang được nghiên cứu, nhưng chưa có bằng chứng về sự tăng lên các tỷ
lệ đột biến hoặc tái kết hợp trong việc tạo ra các biến thể mới hoặc các kiểu gen.
Sự thực chủng virus Đông Nam Á từng đang thay thế virus mang kiểu gen châu
Mỹ ít độc lực hơn (không biểu hiện SXHD hoặc HCSD nhưng vẫn gây ra SD) ở
tại nhiều quốc gia.
1.3 Chẩn đoán virus Dengue
Hiện nay chưa có thuốc đặc trị cho SD/SXHD, đối với SD/SXHD nặng thì
sự chăm sóc y tế rất quan trọng, có thể giảm thiểu tỷ lệ tử vong từ 20% xuống

10


dưới 1% nếu bệnh nhân được theo dõi chặt chẽ và chăm sóc kịp thời. Vì thế việc
chẩn đốn để đưa ra kết quả kịp thời của bệnh nhân nghi ngờ SD/SXHD vơ cùng
cần thiết [31].
1.3.1 Chẩn đốn lâm sàng
Dựa vào sự phân bố địa lý của virus Dengue ở vùng dịch tễ có thể chẩn
đốn lâm sàng, bên cạnh đó sinh hoạt của bệnh nhân trước khi khởi bệnh cũng
đóng góp thơng tin hữu ích cho việc chẩn đốn.
Chẩn đoán lâm sàng SD/SXHD cần phân biệt với các bệnh nhiễm siêu vi,
bệnh lý đường hô hấp và bệnh lý giả cúm khác, cũng như giai đoạn sớm của sốt
rét, thương hàn…Giai đoạn toàn phát của các bệnh này khác với biểu hiện của
giai đoạn sốt Dengue. Sốt Dengue khác biệt với các bệnh có triệu chứng giống
Dengue ở chỗ sốt Dengue có kèm phát ban đặc hiệu [2].
1.3.2 Chẩn đoán qua xét nghiệm huyết thanh
1.3.2.1 Phương pháp ngăn ngưng kết hồng cầu – HI
(HEMAGGLUTIANATION INHIBITION)

Nguyên lý của kỹ thuật HI là virus Dengue kết hợp với kháng thể đặc
hiệu, hồng cầu ngỗng tự do trong dung dịch không kết hợp với kháng nguyên
gây hiện tượng không ngưng kết hồng cầu (hồng cầu lắng xuống đáy giếng) [1].
Phương pháp HI là không đặc hiệu cho typ virus gây bệnh và có phản ứng
chéo khơng chỉ trong các typ Dengue mà với cả các Flavivirus khác. Do vậy
không thể dùng phản ứng này để xác định typ huyết thanh được [3].
Phương pháp HI hiện nay không được áp dụng để xét nghiệm xác định
SD/SXHD nữa vì cần phải lấy máu kép nên khó thực hiện, và mẫu máu 2 phải
cách mẫu máu đầu tiên 7 ngày nên phương pháp này chỉ dùng để nghiên cứu hồi
cứu không phục vụ cho việc chẩn đoán để điều trị SD/SXHD.

11


1.3.2.2 Phương pháp miễn dịch enzyme phát hiện kháng thể IgM (MAC-ELISA)
Mac-ELISA hiện là xét nghiệm chủ yếu hiện nay trong xét nghiệm SXH.
Đây là một xét nghiệm đơn giản, cho kết quả sau 2 ngày và khơng địi hỏi thiết
bị phức tạp. Mac-ELISA dựa trên nguyên tắc phát hiện các kháng thể đặc hiệu
với virus Dengue trong mẫu huyết thanh xét nghiệm bằng cách tóm bắt chúng ra
khỏi dung dịch có sử dụng kháng IgM của người được gắn vào pha rắn. Nếu
kháng thể IgM trong huyết thanh bệnh nhân là kháng thể kháng virus Dengue,
thì nó sẽ gắn với kháng nguyên Dengue được cho thêm vào trong bước tiếp theo
và được phát hiện bằng cách bổ sung kháng thể đơn dòng kháng Dengue gắn
enzyme. Cơ chất của enzyme được cho vào để tạo phản ứng màu.
Kháng thể IgM xuất hiện trước kháng thể IgG và có thể được phát hiện từ
ngày thứ 5 của bệnh. Tuy nhiên, mức độ hình thành IgM nhanh hay chậm khác
nhau giữa các bệnh nhân. Hiệu giá kháng thể IgM trong nhiễm virus tiên phát
cao hơn khá nhiều so với nhiễm virus thứ phát.
Trong chẩn đốn nhiễm Dengue, xét nghiệm Mac-ELISA có độ nhạy thấp
hơn so với HI. Tuy nhiên, so với xét nghiệm HI, xét nghiệm Mac- ELISA có ưu

điểm là thường chỉ cần lấy máu một lần và đúng thời điểm, vì thế sai số của
Mac- ELISA là chấp nhận được. Tuy nhiên, kháng thể IgM có thể tồn tại trong
huyết thanh bệnh nhân hơn 90 ngày, nên kết quả Mac- ELISA dương tính với
các mẫu huyết thanh đơn khơng có nghĩa chắc chắn là bệnh nhân đang nhiễm
Dengue. Kết quả dương tính này khẳng định rằng bệnh nhân đã từng nhiễm virus
Dengue trong khoảng từ 2 đến 3 tháng trước. Vì vậy, xét nghiệm Mac- ELISA
rất có giá trị trong giám sát tình hình SXH, và vẫn đang áp dụng cho chương
trình quốc gia giám sát trọng điểm SXH hiện nay [3].

12


Quang phổ
Cơ chất tạo màu
Cộng hợp có gắn enzyme
Kháng nguyên Dengue
Kháng thể người
Kháng với kháng thể người
Giá thể

Hình 1.6: Sơ đồ cơ chế hoạt động của phản ứng Mac-ELISA
Nguồn: Dengue Guidelines for Diagnosis, Treatment, Prevention and Control, New
edition, 2009, WHO Geneva. [21].

1.3.2.3 Phương pháp phân lập virus
Phương pháp nuôi cấy tế bào được coi là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán
SD/XHD. Phương pháp này dùng để định typ huyết thanh trong chẩn đoán
SD/SXHD, tuy nhiên phương pháp này mất nhiều thời gian, từ 2 đến 3 tuần.
Phương pháp nuôi cấy tế bào mất nhiều thời gian do phải nuôi cấy tế bào C6/36,
sau khi có được chai tế bào mọc dàn đều một lớp đẹp có thể dùng để cho ra tấm

plate. Tế bào đã cho ra tấm plate hai ngày được mọc đều đẹp có thể gây nhiễm
virus Dengue. Tấm plate đã được gây nhiễm virus Dengue được giữ trong tủ ấm
28oC một tuần, theo dõi sự hủy hoại tế bào của virus Dengue, sau đó cấy chuyển
sang tấm plate thêm một tuần nữa trước khi làm kỹ thuật miễn dịch huỳnh
quang. Kỹ thuật nuôi cấy và miễn dịch huỳnh quang cần có kính hiển vi đảo
ngược và kính hiển vi huỳnh quang. Định typ huyết thanh của virus Dengue
bằng kỹ thuật huỳnh quang gián tiếp. Phương pháp này có nhược điểm tốn nhiều
thời gian, nhân viên thực hiện phải được đào tạo tốt.

13


1.3.2.4 Phương pháp ELISA – NS1
Kháng nguyên NS1 là protein không tham gia cấu trúc vỏ virus được phát
hiện trong huyết thanh bệnh nhân ngay sau khi sốt và có thể kéo dài cho đến
ngày thứ 9, ở cả trên bệnh nhân nhiễm tiên phát và nhiễm thứ phát [17]. Phương
pháp ELISA-NS1 là một phương pháp xét nghiệm SD/SXHD được sử dụng
trong vài năm gần đây. Tuy nhiên, glycoprotein NS1 có mặt trong tất cả các
Flavivirus nên phương pháp ELISA – NS1 còn hạn chế trong việc phân biệt
virus Dengue và virus khác trong họ Flaviviridae.
1.3.3 Chẩn đoán dựa trên nucleic acid
1.3.3.1 Phương pháp RT-PCR
Từ những năm 1990, phương pháp RT-PCR đã được phát triển. Phương
pháp này có độ nhạy cao hơn phương pháp nuôi cấy virus và tiết kiệm thời gian.
Tất cả các xét nghiệm trên phân tử nucleic acid dựa trên 3 bước cơ bản: tách
chiết acid nucleic, tinh sạch và khuếch đại acid nucleic. Chiết tách và tinh sạch
có thể bằng nhiều phương pháp, bằng cloroform, phenol hoặc bằng bộ kit thương
mại hóa. Nhiều phịng thí nghiệm đã sử dụng phương pháp RT-PCR với bộ mồi
đặc hiệu nhóm virus Dengue chung khuếch đại vùng gen lõi tiền màng (C-prM)
để phát hiện virus Dengue và sau đó là kỹ thuật nested PCR để định typ huyết

thanh của virus Dengue. Sản phẩm được chạy điện di trên gel agarose có sử dụng
thuốc nhuộm ethidium promide và so sánh với thang chuẩn. Các typ khác nhau
của virus Dengue sẽ có khối lượng khác nhau vì vậy các typ sẽ được định dựa
vào độ dài của băng sản phẩm. Kích thước của các dải băng DNA xác định bằng
cách so sánh với trọng lương phân tử chuẩn bp (base pair), cho phép định danh
typ virus Dengue tương ứng như sau: dải băng DNA đặc hiệu nhóm virus
Dengue là 511 bp và đặc hiệu typ virus Dengue 1 là 482 bp, virus Dengue 2 là
119 bp, virus Dengue 3 là 290 bp và virus Dengue 4 là 392 bp [25].

14


So với nuôi cấy virus, độ nhạy của phương pháp RT-PCR khoảng từ 80100% và phụ thuộc vào mồi của gen đích. Gen đích rất quan trọng trong việc xác
định virus Dengue, cần phải đặc hiệu với virus Dengue, khác biệt với virus cùng
họ Flaviviridae để tránh dương tính giả [17]. Để phát hiện virus Dengue trong
huyết thanh bệnh nhân nghi SD/SXHD cần có mẫu huyết thanh được thu thập từ
1-5 ngày sau khởi sốt.
Phương pháp RT-PCR được thực hiện qua hai giai đoạn bao gồm phản ứng
phiên mã ngược (reverse transcriptation) để tạo cDNA từ khuôn RNA và phản
ứng Nested PCR với các mồi đặc hiệu typ. Phương pháp cần thực hiện trong các
phịng thí nghiệm xét nghiệm được trang bị các thiết chị chuyên dụng như PCR,
điện di, máy soi gel,…
1.2.3.2 Phương pháp Real-time RT-PCR
Phương pháp real-time RT-PCR là phương pháp được sử dụng để định
lượng RNA và sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho mỗi typ của virus Dengue. Cơng
dụng của đầu dị huỳnh quang có thể phát hiện các sản phẩm của phản ứng bởi
một máy PCR đặc biệt mà không cần thực hiện điện di. Nhiều phương pháp realtime PCR đã được phát triển dựa trên kỹ thuật TaqMan hoặc SYBR Green.
TaqMan real-time PCR có tính đặc hiệu cao để có thể lai tạo các đầu dị. Hơn
nữa, mồi và đầu dị đã được cơng bố có thể phát hiện được tất cả các chuỗi của
virus Dengue, sự nhạy cảm của mồi và đầu dò dựa trên sự tương đồng của chúng

với trình tự của gen đích của virus được phân tích. SYBR Green real-time PCR
lại có nhiều ưu điểm hơn ở sự đơn giản của thiết kế mồi cũng như quy trình
nhưng lại kém đặc hiệu.
Phương pháp real-time RT-PCR “singleplex” có thể phát hiện được một
loại typ huyết thanh mỗi lần thực hiện xét nghiệm, hoặc “multiplex” có thể phát
hiện được một lúc nhiều typ huyết thanh. Tuy nhiên độ nhạy của multiplex real-

15


time RT-PCR lại kém hơn độ nhạy của phương pháp Nested RT-PCR [21].
Phương pháp đòi hỏi thực hiện trên máy Real time PCR chuyên dụng.
1.4 Phương pháp RT-LAMP
LAMP là viết tắt của Loop-mediated Isothermal Amplification, một
phương pháp khuếch đại acid nucleic đơn giản, nhanh chóng và giá thành hợp lý.
Phương pháp này đầu tiên được Notomi và cộng sự phát minh năm 2000, về sau
được công ty Eiken phát triển. Phương pháp LAMP là phương pháp khuếch đại
acid nucleic xảy ra ở một điều kiện nhiệt độ duy nhất và trong thời gian ngắn.
LAMP đặc trưng bởi việc sử dụng 4 mồi khác nhau được thiết kế đặc biệt để
nhận ra 6 vùng gen mục tiêu. Trong phương pháp này sự khuếch đại và phát
hiện gen có thể diễn ra bởi một bước đơn giản khi cho hỗn hợp mẫu, mồi, DNA
polymerase và cơ chất được ủ đẳng nhiệt khoảng 65oC, trong khoảng từ 15 đến
60 phút. Tuy nhiên, sản phẩm DNA khuếch đại thu được lại rất lớn, có thể gấp
10 lần sản phẩm của các phương pháp khuếch đại thông thường. RT-LAMP là
phương pháp dựa trên nguyên lý của phương pháp LAMP, tuy nhiên phải dùng
enzyme reverse transcriptase vì khn là RNA [29].
1.4.1 Cơ chế hoạt động của RT-LAMP
• Bước 1:
Chiết tách RNA từ mẫu, sau đó chuẩn bị dung dịch mẫu. Chuẩn bị hỗn
hợp trộn (mix) gồm dung dịch mẫu và các thành phần cần thiết của phản ứng rồi

ủ tất cả ở nhiệt độ đẳng nhiệt trong khoản 60-65oC. Mồi BIP gắn vào khuôn
RNA, phiên mã ngược tạo sợi cDNA có gắn mồi BIP.

16


• Bước 2:
Mồi B3 gắn vào khuôn, tổng hợp sợi cDNA mới, đẩy sợi cDNA gắn mồi BIP
ra mơi trường.

• Bước 3:
Từ bước 2, sợi cDNA đơn được tổng hợp bởi mồi BIP đã rớt ra mơi trường,
sau đó mồi FIP gắn vào sợi cDNA đơn.

• Bước 4:
Từ bước phiên mã ngược (reverse transcription) của bước 3, thông qua các
hoạt động của DNA polymerase với các hoạt động chuyển sợi, đầu 3’ cuối của
vùng F2 của mồi FIP trở thành điểm khởi đầu để tổng hợp sợi DNA.

• Bước 5:
Mồi F3 gắn vào vùng ngoài của FIP và đầu 3’ của nó trở thành điểm bắt
đầu để tổng hợp sợi mới, đồng thời đẩy sợi DNA vừa được tổng hợp bởi FIP ra
môi trường.

17


• Bước 6:
Sợi DNA mạch đôi vừa được tổng hợp bởi một sợi của mồi F3 và sợi của
DNA mạch khn.

• Bước 7:
Sợi DNA đã được tổng hợp bởi FIP ở bước 5, có mang trình tự bổ sung,
sẽ tự nối và tạo thành vòng ở 2 đầu để tham gia vào sự khuếch đại vịng.

• Bước 8:
Sợi DNA có cấu trúc hình quả tạ của bước 7 được chuyển đổi sang cấu trúc
DNA vòng lặp nhờ mồi tự tổng hợp, cấu trúc mà có vịng lặp nhơ ra tại đầu 5’ và
tổng hợp DNA từ đầu 5’. Mồi BIP sẽ bám vào sợi DNA đơn trong cấu trúc vòng
lặp để bắt đầu tổng hợp DNA của bước 8 đồng thời giải phóng sợi vừa tổng hợp
được ra mơi trường.
• Bước 9:
Sự giải phóng sợi đơn có cấu trúc vịng lặp ở đầu 3’ thực hiện được vì có sự
bổ sung của vùng F1c và F1. Sau đó đầu 3’ có vùng F1 sẽ bắt đầu tổng hợp

18


DNA, sử dụng cấu trúc sẵn có để làm khn, và giải phóng sợi bổ sung có gắn
BIP (cấu trúc của bước 9).
• Bước 10:
Sau khi sợi đơn có gắn BIP được giải phóng, cấu trúc hình quả tạ ở cả 2 đầu
có sự bổ sung lần lượt F1-F1c và B1c-B1 tương ứng. Cấu trúc này sẽ quay lại
cấu trúc của cấu trúc bước 7.
• Bước 11:
Tương tự bước 7, cấu trúc của 10 được diễn ra bởi sự tự tổng hợp DNA bắt
đầu ở đầu 3’ có vùng F1. Hơn nữa, FIP gắn vào vùng F2 và bắt đầu tổng hợp sợi
DNA. Liên kết FIP của sợi DNA được giải phóng bởi sợi thay thế của sợi DNA
tự tổng hợp. Theo đó, tương tự tiến trình của 7, 8, 10 và 11, cấu trúc của bước 7
lại được lặp lại một lần nữa.

• Bước 12:
Với cấu trúc đã được tạo ra ở bước 9 (hoặc bước 12). FIP (hoặc BIP) kết nối
với sợi đơn có vùng F2c (hoặc B2c), và DNA tiếp tục được tổng hợp bởi sự giải
phóng sợi DNA mạch đơi. Kết quả của tiến trình này là các cấu trúc có kích
thước khác nhau bao gồm sự lặp đi lặp lại của trình tự đích trên cùng một sợi
được hình thành.
1.4.2 Ứng dụng của phương pháp RT-LAMP
1.4.2.1 RT-LAMP trong chẩn đốn SD/SXHD
Nghiên cứu của nhóm Manmohan Parida và cộng sự tại trường đại học
Nagasaki, Nhật Bản được giới thiệu tại hội thảo về SXH ở Geneva, Thụy Sĩ vào
tháng 10 năm 2004 đã giới thiệu về việc áp dụng phương pháp RT-LAMP trong
chẩn đốn SD/SXHD. Nhóm nghiên cứu đã thiết kế một bộ gồm 6 mồi đặc hiệu
cho mỗi typ huyết thanh của virus Dengue. Sản phẩm thu được sau quá trình ủ ở
63oC trong 60 phút. Độ nhạy của RT-LAMP được chứng minh cao gấp 10 đến

19