Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng oxy hóa của cao chiết ethanol 70% từ cây bồ công anh lactuaca indica

ĐỒN THANH NIÊN CỘNG SẢN HỒ CHÍ MINH
BAN CHẤP HÀNH TP. HỒ CHÍ MINH
----------------------

CƠNG TRÌNH DỰ THI
GIẢI THƯỞNG SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC EURÉKA
LẦN THỨ XIX NĂM 2017

TÊN CÔNG TRÌNH:

ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG
OXY HỐ CỦA CAO CHIẾT ETHANOL 70% TỪ
CÂY BỒ CÔNG ANH (Lactuca indica L.)

LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU: CƠNG NGHỆ HỐ – DƯỢC
CHUN NGÀNH: DƯỢC LIỆU

Mã số cơng trình: …………………………….
(Phần này do BTC Giải thưởng ghi)


i

MỤC LỤC
Trang
MỤC LỤC .................................................................................................................. i
DANH MỤC HÌNH ẢNH ....................................................................................... iv
DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. vi
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .....................................................................................3
1.1. Giới thiệu về cây bồ công anh (Lactuca indica L) ............................................3

1.1.1. Nguồn gốc và phân bố.....................................................................................3
1.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây bồ công anh ..................................................3
1.1.3. Công dụng........................................................................................................4
1.2. Tổng quan cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất có nguồn gốc thực vật............5
1.2.1.

Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật .................5

1.3. Hoạt tính chống oxi hóa........................................................................................7
1.3.1.

Khái niệm về gốc tự do ..................................................................................7

1.3.2. Lợi ích của gốc tự do đối với cơ thể ...............................................................7
1.3.3. Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể ...............................................................7
1.3.4. Chất chống oxy hóa trong thực vật ................................................................9
CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................10
2.1. Địa điểm và thời gian .......................................................................................10
2.1.1. Địa điểm nghiên cứu ......................................................................................10
2.1.2. Thời gian nghiên cứu.....................................................................................10
2.2. Vật liệu ...............................................................................................................10
2.2.1. Nguồn mẫu ......................................................................................................10
2.2.2. Vi khuẩn chỉ thị ..............................................................................................10
2.2.3. Hóa chất, dung môi ........................................................................................10
2.2.4. Thiết bị và dụng cụ .........................................................................................11
2.3. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................12
2.3.1. Phương pháp thu và xử lý nguồn mẫu .........................................................12


ii

2.3.2. Phương pháp tách chiết và thu nhận cao thực vật .......................................12
2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật ..........................................12
2.3.4. Phương pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi sinh vật chỉ thị.............13
2.3.5. Phương pháp pha lỗng mẫu ........................................................................14
2.3.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn ...........................................14
2.3.7. Phương pháp xác định khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết. ..............15
2.3.8. Phương pháp xác định thành phần hóa học có trong cao chiết .................17
2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu .............................................................................20
2.4. Bố trí thí nghiệm ................................................................................................21
2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hiệu suất
thu hồi cao chiết từ bồ cơng anh. ............................................................................22
2.4.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của LiEE.........................24
2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng oxy của LiEE .........................................25
2.4.4. Thí nghiệm 4: Định tính một số thành phần hóa học cơ bản của LiEE.....27
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................29
3.1. Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi cao chiết EtOH 70% (LiEE) ......................29
3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của LiEE đối với vi khuẩn chỉ thị .....30
3.2.1. Kết quả hoạt tính kháng nhóm E.coli của LiEE ..........................................30
3.2.2. Kết quả hoạt tính kháng nhóm Salmonella của LiEE .................................31
3.2.3. Kết quả hoạt tính kháng nhóm Shigella của LiEE ......................................32
3.2.4. Kết quả hoạt tính kháng nhóm Vibrio spp. của LiEE .................................34
3.2.5. Kết quả hoạt tính kháng nhóm vi khuẩn khác của LiEE ............................35
3.2.6. Tổng hợp kết quả kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ Bồ Công anh đối
với vi khuẩn chỉ thị ...................................................................................................37
3.3. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hố của cao chiết ethanol từ Bồ Cơng
anh. ............................................................................................................................38
3.3.1. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hố dựa trên sự loại bỏ gốc tự do
DPPH của vitamin C ................................................................................................38
3.3.2. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hố của LiEE...................................40

iii

3.4. Kết quả xác định sơ bộ thành phần hoá học của LiEE.......................................42
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................45
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................46


iv

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Trang
Hình 1.1: Thân và hoa của cây bồ cơng anh ...........................................................4
Hình 1.2: Vị trí các hợp chất trong tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn tác động
lên vi khuẩn ................................................................................................................6
Hình 2.2: Phản ứng trung hịa gốc DPPH .............................................................16
Hình 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng qt .........................................................21
Hình 2.4: Quy trình tách chiết và thu hồi cao từ cây Lactuca indica L .............22
Hình 2.5: Mẫu lá bồ cơng anh ................................................................................23
Hình 2.8: Quy trình định tính một số thành phần hóa học của LiEE................27
Hình 3.1: Mẫu cao chiết ethanol từ Bồ Cơng Anh (LiEE) ..................................29
Hình 3.2: Đường kính vòng ức chế của LiEE ở các nồng độ khác nhau đối với
nhóm E.coli. .............................................................................................................30
Hình 3.3: Đường kính vịng ức chế của LiEE ở các nồng độ khác nhau đối với
Salmonella. ...............................................................................................................32
Hình 3.4: Đường kính vịng ức chế của LiEE ở các nồng độ khác nhau đối với
Shigella. ....................................................................................................................33

v

DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 3.1. Kết quả đường kính vịng ức chế (mm) của LiEE từ các nồng độ
khác nhau trên 20 chủng vi khuẩn gây bệnh ........................................................37
Bảng 3.2: Hàm lượng chất kháng oxy hoá tương đương g/ml vitamin C ở các
nồng độ cao chiết khảo sát ......................................................................................41
Bảng 3.3: Hiệu quả loại bỏ 50% gốc tự do của LiEE và vitamin C ...................42
Bảng 3.4: Kết quả định tính một số thành phần hóa học trong LiEE ...............43


vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
TSB:

Trypticase Soya Broth

TSA:

Trypticase Soya Agar

DMSO:

Dimethyl sulfoxide

LiEE:

Lactuca indica L ethanolic extract

NA:

Non Activity

DPPH:

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

RNA:

Ribonucleic Acid

DNA:

Deoxyribonucleic Acid


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng các loại cây cỏ thiên nhiên nhằm mục
đích trị bệnh, vì đây là một liệu pháp an tồn, dễ tìm, đồng thời mang đến hiệu quả
cao. Khi xã hội ngày càng phát triển cùng với những tiến bộ của khoa học kỹ thuật
thì các nhà khoa học đã không ngừng nghiên cứu tạo ra các loại thuốc tây y giúp hỗ
trợ điều trị bệnh tốt hơn, trong đó, phần lớn là các loại thuốc kháng sinh. Mặc dù
kháng sinh giải quyết rất nhiều vấn đề liên quan đến trị bệnh và mang lại lợi ích rất
lớn cho con người, nhưng cũng chính việc sử dụng kháng sinh cũng dẫn đến hiện
tượng kháng thuốc xảy ra nhiều hơn. Nguyên nhân chủ yếu là do việc lạm dụng, sử

dụng thuốc kháng sinh tùy tiện, tràn lan của con người. Dẫn đến hiện tượng xuất
hiện ngày càng nhiều chủng vi khuẩn kháng kháng sinh, kể cả những loại kháng
sinh thế hệ mới. Để giải quyết vấn đề này là sử dụng các nhóm chất kháng khuẩn có
nguồn gốc từ thực vật kết hợp với y học hiện đại để thay thế dần các loại kháng sinh
hiện nay vì vừa có thể mang lại hiệu quả điều trị bệnh vừa đảm bảo an tồn đồng
thời phịng ngừa hiện tượng kháng thuốc của vi sinh vật gây bệnh.
Đất nước ta vốn nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới có nền thực vật vô cùng
phong phú, nguồn dược liệu cùng với nền y học lâu đời. Chính vì điều đó nên việc
ứng dụng các loại thực vật vào trong thuốc chữa bệnh là một thành phần không thể
thiếu trong cuộc sống. Theo số liệu thống kê gần đây, hệ thực vật Việt Nam có trên
10000 lồi và theo tác giả Võ Văn Chi nước ta có khoảng 3200 lồi cây thảo dược.
Không chỉ riêng ở Việt Nam mà cả trên thế giới, việc nghiên cứu về hoạt tính sinh
học và thành phần hóa học của các lồi thực vật đã giúp các nhà khoa học tìm hiểu
sâu hơn và sử dụng hiệu quả hơn nguồn dược liệu sẵn có, đồng thời phát hiện thêm
các loại thảo dược mới, quý hiếm, có khả năng kháng được nhiều chủng vi khuẩn
gây bệnh hơn. Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ hiện đại việc nghiên
cứu các loại thảo dược ở nước ta những năm gần đây đã có nhiều bước phát triển.
Hoạt tính kháng khuẩn của các loại thảo dược đã được nghiên cứu song song cùng
việc xác định những thành phần các hoạt chất có trong thực vật. Các loại thảo dược


2

điển hình như trầu khơng (Piper betle L.), sống đời (Kalanchoe pinnata), lô hội
(Aloe barbadensis), dâu tằm (Morus acidosa Griff), khổ qua (Momordica charantia
L.) … đã được xác định là có hoạt tính kháng khuẩn rất mạnh đối với nhiều loại vi
khuẩn gây bệnh như Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp.
Cây bồ công anh (Lactuca indica L.) là một cây thuốc mọc hoang ở khắp nước
ta, dược liệu này rất dễ trồng trọt, thu hái, chế biến. Mặc dù bồ công anh đã được sử
dụng từ lâu đời nhưng những cơng trình nghiên cứu về cây vẫn cịn hạn chế. Việc

đánh giá hoạt tính sinh học của bồ cơng anh là điều hết sức cần thiết, góp phần hồn
thiện một phương thuốc dân gian có tiềm năng sử dụng trong điều trị bệnh. Với cơ
sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Đánh
giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng oxy hóa của cao chiết ethanol 70% từ cây bồ
công anh (Lactuca indica L)”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
-

Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng oxy hoá từ cao chiết từ ethanol

70% của bồ công anh (Lactuca indica L).
-

Xác định sơ bộ thành phần hóa học của cao chiết ethanol từ bồ công anh.

3. Nội dung nghiên cứu
-

Tách chiết cao từ lá bồ cơng anh bằng ethanol 70%.

-

Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết.

-

Xác định sơ bộ thành phần hóa học của cao chiết.

4. Phạm vi nghiên cứu
-

Chỉ khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết ethanol 70% từ lá bồ công anh.

-

Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn trên một số chủng vi khuẩn chỉ thị

Escherichia Coli, Samonella spp., Vibrio spp., Shigella spp.,

Listeria spp.,

Pseudomonas spp..
-

Bước đầu định tính và định lượng thành phần hóa học của cao chiết.


3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.

Giới thiệu về cây bồ công anh (Lactuca indica L)

1.1.1. Nguồn gốc và phân bố
1.1.1.1. Nguồn gốc
Cây bồ cơng anh Việt Nam có tên khoa học là Lactuca indica L, thuộc họ Cúc
[3]. Hiện nay, Lactuca indica L được trồng phổ biến ở nhiều quốc gia trên thế giới,
ở Việt Nam bồ cơng anh cịn được biết đến với nhiều tên gọi khác nhau như diếp
dại; mót mét; rau mũi cày; rau chuôi; bồ công anh mũi mác theo Trung tâm dữ liệu

thực vật Việt Nam (2008) hay cây mũi mác, diếp trời, rau bồ cóc, rau mét, phắc
bao...[5]
1.1.1.2. Phân bố
Cây bồ công anh mọc hoang, phân bố chủ yếu ở các nước Châu Á như Nhật
Bản, Indonesia, Philippinnes, Trung Quốc... Tại Việt Nam bồ công anh phân bố rải
rác khắp mọi nơi. Từ miền núi như Đà Lạt, Sa Pa, Tam Đảo (thường ở độ cao dưới
1000m) trung du đến đồng bằng Bắc bộ [3,4,5,8,9].
1.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây bồ công anh
Bồ công anh là cây thân thảo, thân nhẵn, thẳng không lông, có tuổi thọ trung
bình từ 1 đến 2 năm, cao từ 60 cm đến 200 cm, thân thường đơn hoặc chẻ nhánh ở
phần trên, ít phân cành. Lá mọc so le, gần như không đều. Phiến lá thuôn dài hoặc
dạng hình mũi mác, kích thước phiến lá dài khoảng từ 13 – 25 cm, rộng từ 1,5 – 11
cm, đầu lá nhọn, đi lá hình nêm hoặc men cuống, cuống lá thường ngắn hoặc men
cuống tới tận nách lá. Mép lá ngun hoặc xẻ thùy hoặc có răng cưa thơ to. Mặt trên
phiến lá màu xanh lục, mặt dưới có màu xanh xám. Các lá mọc ở phía trên gần đỉnh
ngọn sinh hoa thường nhỏ hơn và thẳng. Hoa mọc ở đầu ngọn và đầu cành. Hoa tự
hình chùy, đầu cụm hoa rộng khoảng 2 cm; cuống dài 10 – 25 mm, mọc thẳng. Kích
thước chùm hoa thường cao 10 – 13 cm, rộng 5 – 6 mm, các lá ngồi hình trứng, dài
2 – 3 mm, các lá trong hình trứng – mũi mác. Hoa thường màu vàng, kích thước hoa
12 – 13 mm. Quả bế màu đen hình elip, phẳng, kích thước quả dài 4 – 4,5 mm, rộng


4

2,3 mm; mỏ quả dài 1 – 1,5 mm. Bồ cơng anh có số nhiễm sắc thể 2n = 18 (Peng &
Hsu, 1978). Mùa hoa vào khoảng tháng 6 – 7 và mùa quả vào tháng 8 – 9.

Hình 1.1: Thân và hoa của cây bồ công anh
1.1.3. Công dụng
1.1.3.1. Theo y học cổ truyền

Cây bồ cơng anh có vị cam khổ, tính hàn, quy vào các kinh can, tỳ, vị. Công
năng: giải độc, tiêu viêm, thanh nhiệt, lương huyết, tán ứ, trợ tiêu hố, lợi sữa. Có
khả năng trị tỳ vị có hoả uất, sưng vú, tràng nhạc, đinh độc nhiệt ung nhọt, ghẻ lở,
đầy bụng, khó tiêu. Kiêng kị dùng cho người có ung nhọt đã vỡ [2,7Error! Reference
ource not found.].

1.1.3.2. Theo y học hiện đại
Về độc tính, nước lá cây bồ công anh liều 200g/kg trọng lượng chuột không
gây ngộ độc [10]. Flavonoid của bồ công anh đã được chứng minh có khả năng ức
chế men oxy hóa khử peroxidase và catalase máu chuột cống trắng [3], kìm hãm
hoạt động của peroxydase và làm tăng lượng nhóm thiol tự do trong huyết thanh thỏ
[19, 20]. Cao lá với liều lg dược liệu/20g chuột có tác dụng giảm đau và tác dụng
này mạnh hơn là flavonoid toàn phần với liều 0,07g flavonoid /20g chuột (thử tác
dụng giảm đau nội tạng - theo phương pháp của Kosteng) [10]. Trên thế giới các
nhà khoa học sử dụng dịch chiết methanol và ethanol của cây bồ công anh để thử
tác dụng dược lý, kết quả cho thấy cả 2 dịch chiết có tác dụng làm giảm cholesterol
huyết thanh tương đương nhau [22]. Ngoài ra thành phần serquiterpen lacton là
lactucain c, lactucasid trong cây cịn có tác dụng chống đái tháo đường [25].


5

1.2.

Tổng quan cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất có nguồn gốc thực vật

1.2.1. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật
1.2.1.1. Khái niệm
Hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc thực vật (Kháng khuẩn thực vật) là tên
gọi chung chỉ các hợp chất hữu cơ có trong thực vật có khả năng tiêu diệt hay kìm

hãm, ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Các chất kháng khuẩn thường có tác dụng
đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở một nồng độ thường rất nhỏ (Silva và
Fernandes, 2010).
1.2.1.2. Cơ chế kháng khuẩn
Cơ chế hoạt động khác nhau của các hợp chất kháng khuẩn có trong thực vật
đã được nghiên cứu. Chúng có thể ức chế các vi sinh vật, gây trở ngại cho một số
quá trình trao đổi chất hoặc có thể điều chỉnh biểu hiện gen và con đường truyền tín
hiệu (Etherton và ctv, 2002; Manson, 2003; Surh, 2003).
Ức chế quá trình tổng hợp vách của vi khuẩn (vỏ) của vi khuẩn. Gồm có
penicillin, bacitracin, vancomycin. Do tác động lên quá trình tổng hợp vách nên làm
cho vi khuẩn dễ bị các đại thực bào phá vỡ do thay đổi áp suất thẩm thấu.
Ức chế chức năng của màng tế bào. Gồm có: colistin, polymycin, gentamicin,
amphoterricin. Cơ chế làm mất chức năng của màng làm cho các phân tử có khối
lượng lớn và các ion bị thốt ra ngồi.
Ức chế q trình sinh tổng hợp protein: Nhóm aminoglycosid gắn với receptor
trên tiểu phân 30S của ribosome làm cho q trình dịch mã khơng chính xác. Nhóm
chloramphenicol gắn với tiểu phân 50S của ribosome ức chế enzyme
peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi polypeptide.
Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phân 50S của ribosome làm ngăn
cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide.
Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic: Nhóm refampin gắn với enzyme RNA
polymerase ngăn cản q trình sao mã tạo thành mRNA (RNA thơng tin). Nhóm
quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho hai mạch đơn của
DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản q trình nhân đơi của DNA. Nhóm


6

sulfamide có cấu trúc giống PABA (p aminobenzoic acid) có tác dụng cạnh tranh
PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp acid nucleotid. Nhóm trimethoprim tác động

vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân purin làm ức chế quá trình tạo acid
nucleic.
Khơng phải tất cả các cơ chế hoạt động đều làm việc trên các mục tiêu cụ thể,
và một số vùng khác của tế bào có thể bị ảnh hưởng bởi các cơ chế khác được thể
hiện ở hình 1.10.

Hình 1.2: Vị trí các hợp chất trong tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn tác động lên
vi khuẩn
Cao chiết từ các loại thực vật có thể biểu hiện hoạt tính kháng lại các chủng vi
khuẩn ở các mức độ khác nhau như sự can thiệp vào các lớp đôi phospholipid của
màng tế bào gây hậu quả làm gia tăng độ thấm, tổn hại các thành phần tế bào, phá
hủy các enzyme tham gia vào việc hình thành năng lượng tế bào, tổng hợp các
thành phần cấu trúc, và đồng thời phá hủy hoặc làm bất hoạt các vật liệu di truyền.
Nói chung, cơ chế tác động của hợp chất kháng khuẩn tự nhiên có liên quan đến sự
rối loạn, phá vỡ màng tế bào chất, làm gián đoạn mất ổn định lực chuyển động của
proton (PMF), dòng điện tử, sự vận chuyển tích cực, và đơng tụ các thành phần của
tế bào (Kotzekidou và ctv, 2008).


7

1.3.

Hoạt tính chống oxi hóa

1.3.1. Khái niệm về gốc tự do
Trong tự nhiên oxy được xem như một nguyên tố quan trọng giúp con người
duy trì q trình hơ hấp ở tế bào, sản sinh năng lượng cung cấp cho mọi hoạt động
sống. Ngày nay các nghiên cứu khoa học dần chứng tỏ rằng oxy vào cơ thể tham gia
nhiều q trình sinh hóa và trong các q trình đó oxy tạo ra những tiểu phân trung

gian gọi là các gốc tự do. Các gốc tự do có nguồn gốc oxy này có hoạt tính cao, kém
bền vững và được gọi chung là các gốc dạng oxy hoạt động (ROS: Reactive oxygen
species). Ban đầu oxygen nhận một điện tử tạo ra gốc superoxyde (O), đây là gốc tự
do quan trọng nhất của tế bào. Từ superoxyde nhiều gốc tự do và các phân tử khác
của oxy có khả năng phản ứng cao được tạo ra như hydroxyl, hydroperoxyl,
peroxyl, alkoxyl, lipoperoxyde, H2O2. Các dạng oxy hoạt động này do có năng
lượng cao, kém bền nên dễ dàng phản ứng với những đại phân tử như protein, lipid,
DNA, … gây rối loạn các q trình sinh hóa trong cơ thể. Đồng thời, khi một phân
tử sống bị các gốc tự do tấn cơng, nó sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự do mới,
tiếp tục phản ứng với những phân tử khác tạo thành một chuỗi phản ứng thường gọi
là phản ứng dây chuyền.
Gốc tự do được tạo ra bằng nhiều cách. Nó có thể là sản phẩm của những căng
thẳng tâm thần, bệnh hoạn thể xác, mệt mỏi, ô nhiễm mơi trường, thuốc lá, dược
phẩm, tia phóng xạ mặt trời, thực phẩm có chất màu tổng hợp, nước có nhiều
chlorine và ngay cả oxy.
1.3.2. Lợi ích của gốc tự do đối với cơ thể
Không phải là gốc tự do nào cũng có hại đối với cơ thể. Nếu được kiểm sốt,
nó là nguồn cung cấp năng lượng cho cơ thể, tạo ra chất màu melamine cần cho thị
giác, góp phần sản xuất prostaglandins có cơng dụng ngăn ngừa nhiễm trùng, tăng
cường hệ miễn dịch.
1.3.3. Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể
Ngay từ lúc con người mới sinh ra và mỗi tế bào chịu sự tấn công của cả chục
ngàn gốc tự do mỗi ngày. Nếu không được kiểm soát, kiềm chế, gốc tự do gây ra


8

các bệnh thối hóa như: ung thư, xơ vữa động mạch, làm suy yếu hệ thống miễn
dịch gây dễ bị nhiễm trùng, làm giảm trí tuệ, teo cơ quan bộ phận ở người cao niên,
phá rách màng tế bào khiến chất dinh dưỡng thất thốt, tế bào khơng tăng trưởng.

Chúng tạo ra chất lipofuscin tích tụ dưới da khiến ta có những vết đồi mồi trên mặt,
trên mu bàn tay. Ngồi ra, chúng cịn tiêu hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp các phân
tử protein, đường bột, lipid, enzyme trong tế bào, gây đột biến ở gene, ở DNA,
RNA, làm chất collagen, và elastin mất đàn tính, dẻo dai khiến da nhăn nheo, cơ
khớp cứng nhắc. Trong tiến trình hóa già, gốc tự do cũng góp phần và có thể là
nguy cơ gây tử vong. Hóa già được coi như một tích tụ những đổi thay trong mơ và
tế bào
Theo bác sĩ Denham Harman, các gốc tự do là một trong nhiều nguyên nhân
gây ra sự hóa già và sự chết của các sinh vật. Ông cho là gốc tự do phản ứng lên ty
lạp thể, gây tổn thương các phân tử bằng cách làm thay đổi hình dạng, cấu trúc,
khiến chúng trở nên vô dụng và mất khả năng sản xuất năng lượng. Theo các nhà
khoa học thì gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra tới trên 60 bệnh, đáng kể nhất gồm
có: bệnh xơ vữa động mạch, ung thư, Alzheimer, Parkinson, đục thủy tinh thể, bệnh
tiểu đường, cao huyết áp không nguyên nhân, xơ gan. Các nghiên cứu cũng phát
hiện rằng các gốc dạng oxy hóa hoạt động (ROS) sẽ được loại bỏ bằng các chất
chống oxy hóa tự nhiên có sẵn trong cơ thể như enzyme superoxid dismutase
(SOD), enzyme glutathion peroxidase (GSP-Px), enzyme catalase (CAT)… để tạo
sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và các dạng chống oxy hóa trong cơ thể
con người. Đó là một trạng thái cơ bản của cân bằng nội mô (homeostasis).
Ngày nay, do ảnh hưởng của điều kiện sống như: ô nhiễm môi trường, tiếng
ồn, căng thẳng, lo lắng hay sử dụng các thực phẩm chứa nhiều chất oxy hóa đã tạo
điều kiện làm gia tăng gốc tự do, kéo theo sau đó là sự gia tăng các dạng oxy hoạt
động. Các dạng oxy hoạt động gia tăng, gây ra nhiều phản ứng bất lợi, tổn thương
cho cơ thể và là nguyên nhân của nhiều căn bệnh nan y. Do đó cần có những nghiên
cứu, tìm hiểu về các chất có khả năng chống oxy hóa mang lại những tác dụng tốt,
có lợi cho sức khỏe của con người. Bên cạnh đó, chúng ta cũng cần khảo sát thêm


9

những quy trình thử hoạt tính chống oxy hóa tối ưu và dễ thực hiện để phục vụ cho
việc nghiên cứu.
1.3.4. Chất chống oxy hóa trong thực vật
Chất kháng oxy hóa tự nhiên có trong ngũ cốc, rau, quả. Các chất kháng oxy
hóa có nguồn gốc thực vật như vitamin E, vitamin C, carotenoid, acid phenolic,
phytate và estrogen đã được chứng minh làm giảm nguy cơ mắc các bệnh liên quan
đến q trình lão hóa như ung thư, bệnh tim mạch và bệnh Alzheimer (Moskovitz
and Yim, 2002). Một nghiên cứu khác cũng cho thấy chất kháng oxy hóa có trong
trái cây, trà, rau quả và rượu vang làm giảm nguy cơ mắc các bệnh mãn tính
(Prakash et al., 2000). Ngày nay, nhu cầu sử dụng các loại thuốc chống lão hóa
ngày càng tăng cao nhưng các loại thuốc làm đảo ngược đồng hồ sinh học này chưa
có những bằng chứng đáng tin cậy về tác dụng của nó cũng như tác dụng phụ có thể
có. Các chất kháng oxy hóa có nguồn gốc từ thực vật có tác dụng ngăn chặn q
trình oxy hóa khơng mong muốn trong cơ thể như các chất carotenoid, flavonoid,
phenol, vitamin C, vitamin E,... đang trở thành mối quan tâm của nền khoa học hiện
đại (Đỗ Thị Túy Phượng, 2007).


10

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Địa điểm và thời gian
2.1.1. Địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện tại Phịng Thí Nghiệm.
2.1.2. Thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ 02/2017 đến 07/2017.
2.2. Vật liệu
2.2.1. Nguồn mẫu
Mẫu lá bồ công anh được thu tại hộ nơng dân xã Cộng Hịa, huyện Hưng Hà,
tỉnh Thái Bình

2.2.2. Vi khuẩn chỉ thị
Vi khuẩn chỉ thị được sử dụng trong nghiên cứu là 20 chủng vi khuẩn được
cung cấp bởi Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh và Viện Nghiên
cứu Ni trồng Thuỷ sản II, bao gồm:
- Nhóm vi khuẩn Escherichia coli: E. coli, ETEC, E.coli 0208, E.coli
O157:H7.
- Nhóm vi khuẩn Salmonella: S. enteritidis, S. typhii, S. typhimurium, S.
dublin.
- Nhóm vi khuẩn Shigella: S. sonnei, S. boydii, S. flexneri.
- Nhóm vi khuẩn Vibrio: V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. harveyi,
V.cholerae.
- Nhóm vi khuẩn Listeria: L. monocytogenes, L. innocua.
- Các vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da: E. feacalis, S. aureus, P. aeruginosa.
2.2.3. Hóa chất, dung mơi
a) Hóa chất:
- Mơi trường TSB (HiMedia - Ấn Độ).
- Môi trường TSA (HiMedia - Ấn Độ).
- NaCl tinh khiết


11

- Một số loại thuốc thử: Molisch, Fehling A, Fehling B, Barfoed, Mayer,
Dragendroff, Hager, Wagner, Ninhydrin, Natri nitro prusside.
- DPPH (Đức)
b) Dung môi:
- Methanol
- Ethanol 50%, 70%, 90% (Việt Nam)
- DMSO (Trung Quốc)
2.2.4. Thiết bị và dụng cụ

a) Dụng cụ
- Đĩa petri

- Dụng cụ đục lỗ (d = 6 mm)

- Ống nghiệm lớn, nhỏ.

- Thước đo

- Becher 100 ml, 250 ml, 500 ml

- Bông thấm và bông không thấm nước

- Ống đong 100 ml, 250 ml, 500 ml

- Đũa thuỷ tinh

- Pipet 1 ml, 10 ml

- Các loại đầu típ

- Eppendoff 2 ml

- Micropipette 100 µL, 1000 µL, 5000

- Chai nắp xanh 250 ml, 500 ml,

µL

1000 ml

- Các loại dụng cụ khác như: bao chịu

- Que cấy trang

nhiệt, kéo, giấy giói, kẹp gấp, muỗng,

- Đèn cồn

dao, thun,...

b) Thiết bị
- Autoclave (Huxky Đài Loan)

- Máy đo UV – VIS (Hach)

-Tủ ấm 300C, 370C (Memmert

- Cân phân tích (Orbital Germany)

mermany)

- Bếp từ (Billy – England)

- Máy ly tâm (Tuttligen Germany)

- Máy nước cất (Branstead USA)

- Máy cô cách thủy

- Thiết bị cô quay chân không


12

2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp thu và xử lý nguồn mẫu
Mẫu thực vật được thu một lượng lớn toàn bộ các bộ phận thân, lá và cành
mang đi rửa sạch và sấy ở nhiệt độ 400C đến khi khối lượng không đổi.
Mẫu khô được tiến hành cắt nhỏ và xay nhuyễn thành dạng bột. Lượng bột
mẫu thu được sẽ được đóng gói trong túi nhựa và bảo quản ở nhiệt độ 40C để tách
chiết cao sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo.
2.3.2. Phương pháp tách chiết và thu nhận cao thực vật
Mẫu thực vật được tách chiết trong dung môi ethanol 70 % bằng phương pháp
ngấm kiệt ở nhiệt độ phòng và thu nhận cao chiết bằng cách cho bay hơi, loại bỏ
lượng dung môi của dịch chiết.
Nguyên tắc: Mẫu thực vật được ngấm kiệt trong lượng lớn dung môi (w/v)
trong khoảng thời gian nhất định để các chất tan trong mẫu hịa tan vào dung mơi,
đây là quá trình di chuyển vật chất trong hệ hai pha rắn – lỏng gồm 3 giai đoạn:
thâm nhập dung mơi vào dược liệu, hồ tan các chất trong mẫu, khuếch tán các chất
tan (khuếch tán nội bào, khuếch tán phân tử, khuếch tán đối lưu).
Tiến hành: Ngâm một lượng bột mẫu vào dung môi (tỷ lệ 1:20 (w/v)) trong
một bình kín để ở nhiệt độ phịng. Mẫu được ngâm trong thời gian xác định; thỉnh
thoảng có khuấy trộn hoặc lắc sau đó đem đi lọc hoặc ly tâm, thu nhận dịch chiết.
Phần dịch chiết được cô đặc, thu hồi cao bằng phương pháp cô quay chân không
(đối với dung môi methanol) và cô cách thủy (đối với dung môi ethanol, nước).
Tiếp tục cho thêm lượng dung môi mới vào phần bã bột thực vật và chiết thêm một
số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu. Sau khi thu hồi mẫu cao được bảo quản ở
nhiệt độ -40C.
2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật

2.3.3.1.

Phương pháp cấy chuyền vi sinh vật

Nguyên tắc: Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, dễ thực hiện, các chủng
vi sinh vật được cấy trên môi trường thạch nghiêng và ủ trong điều kiện thích hợp
cho vi sinh vật phát triển. Sau đó các chủng này được chuyển vào tủ mát (từ -30C


13

đến -50C) để bảo quản. Quá trình này được lặp đi lặp lại trong một thời gian nhất
định, đảm bảo vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và
chết. Tùy từng nhóm vi sinh vật khác nhau mà thời gian định kỳ cấy chuyền khác
nhau, tuy nhiên giới hạn tối đa là 3 tháng cấy chuyền một lần.
Cách tiến hành: Giống vi sinh vật thuần khiết, được bảo quản trong ống thạch
nghiêng và giữ ở nhiệt độ 40C. Sau 1 đến 3 tháng phải cấy truyền vi sinh vật qua
ống thạch nghiêng mới bằng cách dùng que cấy vòng lấy sinh khối vi sinh vật trong
ống thạch nghiêng cũ ria vào ống thạch nghiêng mới, sau đó đem ống thạch nghiêng
mới đi ủ, tùy từng loại vi sinh vật mà quyết định nhiệt độ ủ, nhiệt độ ủ dao động từ
48 – 72 giờ. Ống thạch nghiêng chứa vi sinh vật được bảo quản trong tủ lạnh ở 40C. (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007).
2.3.3.2.

Phương pháp bảo quản lạnh sâu

Nguyên tắc: Ngoài phương pháp giữ giống trên mơi trường thạch nghiêng, có
thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu. Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ
trong q trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là
việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước
trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn

chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol.
Cách tiến hành: Vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng thích
hợp rồi hút 1ml dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch và thu
cặn có chứa sinh khối vi khuẩn. Hút glycerol 40% cho vào và tiến hành giữ giống ở
nhiệt độ lạnh -150C (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007).
2.3.4. Phương pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi sinh vật chỉ thị
Mục đích: Hoạt hố các chủng vi khuẩn được giữ giống phát triển lại bình
thường vì trong quá trình bảo quản ở nhiệt độ thấp trong thời gian dài chúng có thể
bị suy yếu.
Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp ni cấy vi sinh vật trên mơi trường dinh
dưỡng thích hợp. Môi trường dinh dưỡng chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng (đa
lượng và vi lượng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật, đảm


14

bảo có đủ các điều kiện hố lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa vi sinh vật và
môi trường.
Đối với các giống vi khuẩn chỉ thị được giữ trong glycerol 40%, tiến hành
tăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 10 ml mơi trường
TSB trong điều kiện vơ trùng. Sau đó tiến hành lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong
24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sinh khối vi khuẩn tăng lên làm đục môi trường nuôi cấy
(Lê Ngọc Thuỳ Trang, 2013). Mật độ tế bào vi khuẩn được xác định bằng phương
pháp đo mật độ quang OD ở bước sóng 600nm.
Cơng thức tính tốn xác định mật độ tế bào (cơng thức McFahrland):
Mật độ = OD600nm x 1,02 x 109 (cfu/ml).
2.3.5. Phương pháp pha loãng mẫu
Nguyên tắc: Pha loãng mẫu là một trong những cơng đoạn cơ bản nhưng có
vai trị quan trọng trong q trình phân tích vi sinh vật. Việc pha lỗng mẫu ở các
nồng độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều cho quá trình định lượng cũng như phân tích

vi sinh vật. Phương pháp pha lỗng mẫu (mẫu lỏng và mẫu rắn) chỉ được sử dụng
trong trường hợp vi sinh vật phân bố trong mẫu nhiều và để định lượng vi sinh vật
trong mẫu.
Cách tiến hành: Dùng micropipette hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9
ml dung dịch pha lỗng, khi đó ta sẽ được nồng độ pha loãng là 10-1. Tiếp tục từ
ống nghiệm 10-1 hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha
loãng ta được nồng độ pha loãng 10-2. Tiếp tục tiến hành như vậy cho đến khi được
nồng độ cần thiết. (Phạm Minh Nhựt, 2013).
2.3.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn
Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết được đánh giá bằng phương pháp
khuếch tán trên giếng thạch dựa trên phương pháp của Anonymous (1996) và
Hadacek, ctv (2000) có sự điều chỉnh cho phù hợp với điều kiện của phịng thí
nghiệm .
Ngun tắc: Dịch cao chiết ở các giếng sẽ khuếch tán vào môi trường thạch và
tác động lên các chủng khuẩn chỉ thị. Nếu cao chiết có khả năng ức chế các chủng


15

vi khuẩn thì sẽ xuất hiện quầng trong bao quanh các giếng thạch (vịng ức chế). Từ
đó, đánh giá khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết bằng cách đo đường kính
vịng ức chế (mm).
Tiến hành:
- Các chủng vi khuẩn được hoạt hóa từ ống giống gốc trong mơi trường lỏng
TSB, lắc qua đêm. Cấy trang 100 µL dịch khuẩn (mật độ tế bào tương đương 106
cfu/ml) lên bề mặt đĩa petri có chứa mơi trường TSA và tiến hành đục giếng với
đường kính 6 mm. Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần.
- Đối chứng là dung dịch kháng sinh Ciprofloxacin.
2.3.7. Phương pháp xác định khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết.
2.3.7.1. Phương pháp DPPH

Nguyên tắc:
DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) là một gốc tự do bền, dung dịch có
màu tím, bước sóng cực đại hấp thu tại 517 nm. Các chất có khả năng kháng oxi
hóa sẽ trung hịa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu ánh sáng
của các gốc tự do tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần,
chuyển từ tím sang vàng nhạt [6]. Hoạt tính chống oxi hố được đánh giá thơng qua
giá trị hấp phụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy so
màu ở bước sóng 517nm (Pisoschi and Negulescu, 2012).

Hình 2.1: DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)


16

chất kháng oxy hóa

DPPH

DPPHH
Hình 2.2: Phản ứng trung hịa gốc DPPH

Khả năng kháng oxy hóa của một chất được biểu hiện bằng giá trị EC50, nồng
độ chất kháng oxy hóa để có thể ức chế 50% gốc tự do DPPH. Giá trị EC50 càng
nhỏ, hoạt tính kháng oxy hóa càng mạnh. EC50 là một giá trị dùng để đánh giá khả
năng ức chế mạnh hoặc yếu của mẫu khảo sát. EC50 (Effective Concentration of
50%) được định nghĩa là nồng độ (µg/mL) của chất kháng oxy hố mà tại đó nó có
thể loại bỏ 50% gốc tự do, tế bào hoặc enzyme, mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị
EC50 sẽ càng thấp. Giá trị EC50 được xác định bằng phương pháp lập phương trình
đường chuẩn y = ax + b. Với các giá trị x bao gồm nhiều nồng độ khác nhau. Khi
phần trăm (%) ức chế tuyến tính với nồng độ mẫu, cho y = 50% và thay vào phương

trình đã có, từ đó được giá trị x chính là EC50.
Tiến hành
Chuẩn bị mẫu chiết ở các nồng độ khác nhau trong DMSO. Mẫu đối chứng
được sử dụng là axit ascorbic. Sau đó, 1,0 ml DPPH với nồng độ thích hợp được
pha trong methanol vào 0,2 ml dung dịch của mẫu chiết và mẫu đối chứng. Để yên
và ủ ở nhiệt độ phòng trong buồng tối khoảng 30 phút. Sự thay đổi màu sắc từ màu
tím đậm sang vàng sau đó được đo ở 517 nm [18].


17

Khả năng ức chế gốc tự do DPPH được xác định thơng qua phần trăm ức chế
Q (%) được tính theo cơng thức sau
Q% = (𝟏 −

𝑶𝑫𝒎ẫ𝒖
𝑶𝑫𝒕𝒓ắ𝒏𝒈

) × 𝟏𝟎𝟎

Với ODtrắng: giá trị mật độ quang của mẫu trắng (control)
ODmẫu: giá trị mật độ quang của mẫu thử (sample).
2.3.8. Phương pháp xác định thành phần hóa học có trong cao chiết
Các nhóm hợp chất hữu cơ có trong mẫu cao chiết được định tính cơ bản bằng
phương pháp tiến hành một số thử nghiệm hóa học của chúng với các loại hóa chất,
thuốc thử đặc trưng (N.Raaman, 2006).
Ngun tắc: Định tính các nhóm chất hữu cơ trong thành phần cao chiết bằng
các phản ứng hóa học theo các phương pháp thơng dụng trong phịng thí nghiệm đã
được chuẩn hóa để sơ bộ hóa thành phần hoạt chất. (Lương Văn Tiến và ctv, 2015).
Cách tiến hành: Cao chiết được đem ngâm trong dung mơi thích hợp, tiến

hành lọc và thu dịch lọc. Sau đó dùng dịch cao chiết này tiến hành định tính các
thành phần hóa học với các loại hóa chất, thuốc thử đặc trưng.
2.3.8.1. Định tính thành phần carbohydrate
- Thử nghiệm Molisch: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm và thêm 5-6
giọt thuốc thử Molisch. Sau đó, nhỏ từ từ 1 ml H2SO4 đậm đặc trên thành ống
nghiệm và quan sát hiện tượng. Nếu hình thành vịng màu đỏ - tím ở lớp ngăn cách
cho thấy có sự hiện diện của carbohydrates.
- Thử nghiệm Fehling: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm sau đó thêm
lần lượt 1 ml thuốc thử Fehling A và 1 ml Fehling B. Ống nghiệm được đun cách
thủy trong 5 phút và đọc kết quả. Quan sát phần đáy ống nghiệm nếu xuất hiện kết
tủa màu đỏ của Cu2O chứng tỏ có sự hiện diện của carbohydrate.
- Thử nghiệm Barfoed: 2 ml dịch mẫu được cho vào ống nghiệm, tiến hành
thêm 2 ml thuốc thử Barfoed. Sau đó, đun cách thủy ống nghiệm chứa hỗn hợp
trong 5 phút, làm lạnh và quan sát kết quả. Thử nghiệm Barfoed dương tính (+) khi
đáy ống nghiệm có sự hình thành kết tủa màu đỏ gạch.


18

2.3.8.2. Định tính thành phần alkaloid
- Thử nghiệm Mayer: Cho vài giọt thuốc thử Meyer vào ống nghiệm có chứa 2
ml dịch mẫu, quan sát hiện tượng và đọc kết quả. Thử nghiệm Mayer dương tính (+)
khi kết tủa màu trắng hoặc trắng đục được tạo thành.
- Thử nghiệm Dragendorff: Hút 2 ml dịch lọc mẫu cho vào ống nghiệm sau đó
thêm 1 hoặc 2 ml thuốc thử Dragendorff và quan sát hiện tượng. Nếu hình thành kết
tủa màu vàng cam chứng tỏ có sự hiện diện của nhóm alkaloid trong mẫu cao, thử
nghiệm dương tính (+).
- Thử nghiệm Hager: Thêm 2 ml thuốc thử Hager vào ống nghiệm chứa 2 ml
dịch mẫu. Nếu kết tủa màu vàng được tạo thành dưới đáy ống nghiệm thì cho biết
thử nghiệm Hager dương tính (+).

- Thử nghiệm Wagner: Tiến hành hút 2 ml dịch cao mẫu cho vào ống nghiệm,
sau đó thêm 2ml thuốc thử Wagner và đọc kết quả.Thử nghiệm Wagner dương tính
(+) khi phần đáy ống nghiệm có sự hình thành kết tủa màu nâu đỏ.
2.3.8.3. Định tính thành phần saponin
- Thử nghiệm Foam (xà phòng): Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm và
lắc mạnh. Sau 10 - 15 phút, nếu lớp bọt hình thành sau khi lắc vẫn còn, cho thấy sự
hiện diện của saponin, thử nghiệm Foam (xà phịng) dương tính (+).
2.3.8.4. Định tính thành phần cardiac glycoside
- Thử nghiệm Legal: 2 ml dịch cao mẫu được cho vào ống nghiệm, sau đó
thêm lần lượt 1 ml pyridine và 1 ml Natri nitro prusside, và tiếp tục nhỏ 5 – 6 giọt
NaOH 10% vào ống nghiệm, sau đó quan sát và đọc kết quả. Nếu dung dịch trong
ống nghiệm xuất hiện màu hồng đến đỏ đậm thì chứng tỏ có sự hiện diện của
cardiac glycoside, thử nghiệm Legal dương tính (+).
- Thử nghiệm Keller Killiani: Thêm 2 ml acid acetic glacial vào ống nghiệm
chứa 2 ml dịch mẫu và tiếp tục thêm 1 ml dung dịch FeCl3. Sau đó cho từ từ 2 ml
H2SO4 đậm đặc vào ống nghiệm trên và quan sát hiện tượng. Thử nghiệm Keller
Killiani dương tính (+) khi ống nghiệm xuất hiện màu xanh trong lớp acid acetic.