Phân lập và định dạng một số dòng nấm có khả năng kích thích tạo trầm hương từ thân cây dó bầu tại hà tĩnh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP
----------o0o----------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DẠNG MỘT SỐ DỊNG NẤM CĨ KHẢ
NĂNG KÍCH THÍCH TẠO TRẦM HƯƠNG TỪ THÂN CÂY DĨ
BẦU TẠI HÀ TĨNH
NGÀNH : CƠNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ

: 7420201

Giáo viên hướng dẫn

: TS. Nguyễn Thị Hồng Gấm

Sinh viên thực hiện

: Trần Thị Mai Hạnh

Lớp

: K61 – CNSH

Khóa học

: 2016 - 2020

Hà Nội, 2020

LỜI MỞ ĐẦU
Trong quá trình thực hiện chuyên đề nghiên cứu khoa học, để hoàn thành
đề tài, Em đã nhận đƣợc sự giúp đỡ tận tình từ các thầy cơ giáo thuộc Viện Công
nghệ sinh học Lâm nghiệp - trƣờng Đại học Lâm nghiệp.
Nhân dịp này, Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô TS. Nguyễn Thị
Hồng Gấm - ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn, giúp đỡ và đóng góp những ý kiến
quý báu để chúng em có thể hoàn thành đề tài này.
Đồng thời, Em cũng xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong
Viện nghệ sinh học Lâm nghiệp, các thầy cô thuộc bộ mơn Cơng nghệ Vi sinh Hóa sinh đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Thơng qua q trình thực hiện đề tài, Em đã học đƣợc nhiều điều và rút ra
đƣợc nhiều bài học kinh nghiệm quý báu. Vì kiến thức bản thân cịn hạn chế,
trong q trình thực hiện đề tài này cũng khơng tránh khỏi sai sót, Em kính
mong nhận đƣợc những ý kiến đóng góp quý báu của thầy cô.
Em xin trân thành cảm ơn !
Sinh viên thực hiện

Trần Thị Mai Hạnh

i


MỤC LỤC
LỜI MỞ ĐẦU ........................................................................................................ i
DANH MỤC HÌNH ẢNH ................................................................................... iv
DANH MỤC BẢNG BIỂU .................................................................................. v
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ................................. 2
1.1. Khái quát về cây Dó Bầu ........................................................................... 2

1.1.1.

Giới thiệu về cây Dó Bầu ................................................................ 2

1.1.2.

Đặc điểm sinh thái của cây Dó bầu ................................................. 2

1.1.3.

Đặc điểm về hình thái của cây Dó bầu ........................................... 3

1.1.4.

Đặc điểm sinh học của cây Dó bầu ................................................. 4

1.1.5.

Địa điểm phân bố của cây Dó bầu .................................................. 5

1.1.6.

Cơng dụng của lá cây Dó bầu ......................................................... 5

1.1.7.

Triển vọng và thách thức................................................................. 7

1.2. Khái quát về tinh dầu Trầm........................................................................ 7
1.2.1.

Khái quát chung về tinh dầu trầm ................................................... 7

1.2.2.

Tính chất hóa lý của tinh dầu trầm.................................................. 8

1.2.3.

Thành phần của tinh dầu trầm ......................................................... 8

1.3. Tổng quan nghiên cứu tạo trầm hƣơng .................................................... 10
1.3.1.

Tạo trầm hƣơng tại Việt Nam ....................................................... 10

1.3.2.

Trên thế giới .................................................................................. 11

1.4. Các phƣơng pháp kích thích tạo ra Trầm hƣơng ..................................... 12
1.4.1.

Phƣơng pháp tạo trầm truyền thống .............................................. 13

1.4.2.

Phƣơng pháp tạo trầm hiện đại ..................................................... 13

CHƢƠNG II. MỤC TIÊU - NỘI DUNG - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .. 17

2.1. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................. 17
2.1.1. Mục tiêu chung .................................................................................. 17
2.1.2. Mục tiêu cụ thể .................................................................................. 17
2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 17
2.3. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 17
ii


2.3.1. Hóa chất, thiết bị ............................................................................... 17
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................................... 18
2.4.1.

Phƣơng pháp phân lập nấm ........................................................... 18

2.4.2.

Phƣơng pháp nghiên cứu đặc tính sinh học .................................. 19

2.4.3.

Phƣơng pháp định tên nấm............................................................ 19

2.4.4.

Phƣơng pháp thu thập và xử lý số liệu .......................................... 21

PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................ 22
3.1. Kết quả phân lập một số chủng nấm trong thân cây Dó bầu ................... 22
3.2. Kết quả nghiên cứu đặc tính sinh học ...................................................... 24
3.2.1.

Nghiên cứu mơi trƣờng ni cấy thích hợp .................................. 24

3.2.2.

Nghiên cứu pH thích hợp .............................................................. 26

3.2.3.

Khả năng sinh enzym ngoại bào ................................................... 29

3.3. Kết quả định danh nấm ............................................................................ 32
3.3.1.

Kết quả định danh nấm thơng qua đặc điểm hình thái.................. 32

3.3.2.

Kết quả định danh nấm bằng kĩ thuật sinh học phân tử ................ 34

KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ .............................................................. 42
1. Kết luận ....................................................................................................... 42
2. Tồn tại.......................................................................................................... 42
3. Kiến nghị ..................................................................................................... 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 43

iii


DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Cây Dó bầu ............................................................................................ 3
Hình 1.2. Mặt cắt ngang thân cây Dó bầu tạo trầm .............................................. 4
Hình 1.3. Năm loại khung sesquiterpene cơ bản trong tinh dầu ........................... 9
Hình 3.1. Biểu đồ thể hiện đƣờng kính (cm) khuẩn lạc trên các mơi trƣờng khác
nhau ..................................................................................................................... 25
Hình 3.2. Chủng nấm GA1 trên mơi trƣờng PDA và Sabouround ..................... 25
Hình 3.3. Chủng nấm GA2 trên mơi trƣờng PDA và Sabouround .................... 26
Hình 3.4. Chủng nấm GA3 trên mơi trƣờng PDA và Sabouround ..................... 26
Hình 3.5. Biểu đồ thể hiện đƣờng kính khuẩn lạc (cm) ở các pH khác nhau .... 27
Hình 3.6. Đƣờng kính khuẩn lạc (cm) GA1 ở pH khác nhau ............................. 28
Hình 3.7. Đƣờng kính khuẩn lạc (cm) GA2 ở pH khác nhau ............................. 28
Hình 3.8. Đƣờng kính khuẩn lạc GA3 (cm) ở pH khác nhau ............................. 28
Hình 3.9. Biểu đồ thể hiện khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào.............. 30
Hình 3.10. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng nấm GA1 ................... 31
Hình 3. 11. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng nấm GA2 .................. 31
Hình 3. 12. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng nấm GA3 .................. 31
Hình 3. 13. Chủng nấm GA1, a: kính hiển vi, b: đĩa thạch................................. 32
Hình 3. 14. Chủng nấm GA2, c: kính hiển vi, d: đĩa thạch................................. 33
Hình 3. 15. Chủng nấm GA3, e: hệ sợi, f: đĩa thạch, g: bào tử........................... 34
Hình 3. 16. Kết quả so sánh trình tự gen chủng GA1 trên BLAST NCBI ......... 35
Hình 3. 17. Sơ đồ cây di truyền đối với chủng GA1 .......................................... 37
Hình 3. 18. Kết quả so sánh trình tự gen chủng GA2 trên BLAST NCBI ......... 38
Hình 3. 19. Sơ đồ cây di truyền đối với chủng GA2 .......................................... 39
Hình 3. 20. Kết quả so sánh trình tự gen chủng GA3 trên BLAST NCBI ......... 40
Hình 3.21. Sơ đồ cây di truyền đối với chủng GA3 ........................................... 41

iv


DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1. Các chỉ tiêu hóa lý của tinh dầu trầm .................................................. 8
Bảng 1.2. Các thành phần gây mùi của tinh dầu trầm/ trầm hƣơng .................. 10
Bảng 1. 3. Các nghiên cứu tạo trâm hƣơng bằng phƣơng pháp sinh học. .......... 14
Bảng 3. 1. Kết quả phân lập nấm từ các mẫu gỗ ban đầu ................................... 23
Bảng 3. 2. Đƣờng kính khuẩn lạc (cm) trên các mơi trƣờng khác nhau ............. 24
Bảng 3. 3. Đƣờng kính khuẩn lạc (cm) ở các pH khác nhau .............................. 27
Bảng 3.4. Đƣờng kính vịng phân giải (cm) cơ chất của các chủng nấm ........... 29
Bảng 3.5. Mức độ tƣơng đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng GA1 với các trình
tự tƣơng đồng ở GeneBank ................................................................................. 36
Bảng 3.6. Mức độ tƣơng đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng GA2 với các trình
tự tƣơng đồng ở GeneBank ................................................................................. 38
Bảng 3.7. Mức độ tƣơng đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng GA3 với các trình
tự tƣơng đồng ở GeneBank ................................................................................. 40

v


ĐẶT VẤN ĐỀ
Các lồi Dó có khả năng sinh trầm trong thân cây đƣợc gọi là cây Dó Bầu
(Aquilarria spp.) hay cây Trầm hƣơng, một số địa phƣơng gọi là cây Tóc, sản
phẩm thƣơng mại thì gọi là Agarwood, Agar wood oil hoặc Eaglewood. Trong
suốt vòng đời của chúng, Aquilaria phải mất nhiều năm để phát triển và hình
thành gỗ trầm hƣơng, xảy ra một cách ngẫu nhiên trong rừng tự nhiên.
Nhu cầu cao về trầm hƣơng trên thị trƣờng quốc tế đã ảnh hƣởng nghiêm
trọng đến tài nguyên thiên nhiên và đặt các lồi Aquilaria vào Cơng ƣớc quốc tế
về bn bán các lồi động vật và thực vật hoang dã có nguy cơ tuyệt chủng
(CITES, 2012).
Để khắc phục vấn đề trên và đáp ứng nhu cầu cao về gỗ trầm hƣơng, một
hệ thống sản xuất thay thế là không thể thiếu. Nuôi cấy mô thực vật là một kỹ
thuật đầy hứa hẹn, bao gồm sản xuất liên tục các chất chuyển hóa thứ cấp đặc

biệt là các hợp chất thơm (Shrivastava et al., 2006). Nhiều chiến lƣợc công nghệ
sinh học đã đƣợc thực hiện để tăng cƣờng sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp
trong cây trầm hƣơng. Đối với loài Aquilaria, việc cảm ứng bởi các yếu tố sinh
học hoặc phi sinh học là điều kiện cần thiết để hình thành gỗ trầm hƣơng, nhƣ
kết quả nghiên cứu của việc nuôi cấy các tế bào A. sinensis bằng chiết xuất từ
nấmMelanotus flavolivensđã kích thích tổng hợp 2-(2-phenylethyl)-chromone,
một thành phần chính trong gỗ trầm hƣơng có hoạt tính chống dị ứng (Shu et al.,
2005). Hơn nữa, theo một số nghiên cứu cho thấy một số loại nấm thƣờng đƣợc
xem là thành phần vi sinh vật chính kích thích hình thành trầm hƣơng đã đƣợc
phân lập và đƣợc xác định (Tamuli et al., 2000; Tabata et al., 2003; Mohamed et
al., 2010).
Vì vậy đƣợc sự nhất trí của ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm
nghiệp, cùng bộ môn Công nghệ tế bào, dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Nguyễn Thị
Hồng Gấm, em thực hiện đề tài:“Phân lập và định danh một số dịng nấm có
khả năng kích thích tạo trầm hương từ thân cây Dó Bầu tại Hà Tĩnh”.
1


CHƢƠNG I. TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Khái quát về cây Dó Bầu
1.1.1. Giới thiệu về cây Dó Bầu
Cây Dó bầu thuộc:
- Lớp: Magnoliopsida
- Bộ: Myrtales
- Họ: Thymelaeaceae
- Giống: Aquilaria
- Tên khoa học: Aquitarra crassna Pierre ex Lecomte, A. agallocha roxb
- Tên khác: Kỳ nam, trầm, Dó bầu, rà hƣơng
- Tên nƣớc ngoài: Tùy theo từng quốc gia có mỗi cách gọi tên khác nhau.
Chẳng hạn, ở Anh gọi là : Agarwood, malayan eaglewood, ở Pháp: bois d’aigle,

ở Trung quốc: tuchenxiang (tiếng phổ thông Ch’en Hsiang), ở Campuchia :
crassna, krassna, kresna, chan krassna, klampeok, ở Indonesia : gaharu,
tengkaras, mengkaras,…[1].
1.1.2. Đặc điểm sinh thái của cây Dó bầu
Dó bầu là cây trung tính, lúc cịn nhỏ ƣa bóng, khi lớn thiên về ánh sáng,
mọc rải rác trong các khu rừng thuộc kiểu ẩm nhiệt đới nguyên sinh hoặc thứ
sinh, xanh quanh năm, sống thích hợp trong rừng hỗn giao, cây lá rộng, cây Dó
bầu có thể tái sinh bằng chồi hoặc bằng hạt, sinh trƣởng, phát triển trong các
điểu kiện, nhiệt độ từ 15-36 0C vào ban ngày, 5-25oC vào ban đêm, tối thích hợp
22-29oC, lƣợng mƣa hàng năm trên 1200mm, độ ẩm >80%, độ cao từ 3001000m, tập trung ở độ cao 500-700m, độ dốc trên 25 độ. Cây Dó bầu có thể sinh
trƣởng trên nhiều loại đất núi, đất đỏ xám, đất vàng, đất feralit, thích hợp nhất là
đất nâu vàng, đất thịt pha cát cịn tính chất rừng, có tầng canh tác sau và nhiều
mùn. Lớp đất mặt trung bình hay mỏng, hơi ẩm, chua hoặc gần trung tính (pH
vào khoảng từ 4-6) [17].

2


1.1.3. Đặc điểm về hình thái của cây Dó bầu
Đây là loại cây gỗ lớn, cao khoảng 30-40m. Tuy nhiên, độ cao trung bình
phổ biến nhất là 15-25m. Thân cây có đƣờng kính khoảng 60cm với màu xám,
vỏ nhẵn. Bên trong lớp vỏ đó là thịt gỗ màu vàng nhạt. Chúng là loại cây lá đơn.
Lá của chúng có hình bầu dục, hình trứng hoặc hình ngọn giáo. Mặt trên phiến
lá nhẵn bóng và có màu xanh đậm. Mặt dƣới lại có màu nhạt hơn và phần lơng
mềm. Nhìn chung loại cây này khá nhiều lông. Không chỉ ở phần lá, cành non
và phần cuống lá cũng có lơng mềm.

Hình 1.1. Cây Dó bầu
Về hoa, hoa mọc thành chùm ở nách lá. Chúng có hình chng và có lơng
ở miệng. Cây có tuổi từ 4-5 năm sẽ bắt đầu ra hoa kết trái. Ở Việt Nam, khoảng

tháng 2-3 sẽ có hoa và đến khoảng tháng 6-7 dƣơng lịch thì quả sẽ chín. Quả
nhìn hơi giống trái su su. Mỗi quả có từ 1-2 hạt. Hạt khi chín có màu nâu. Phần
ngồi cứng, bên trong mềm và có tinh dầu nên không lƣu trữ đƣợc lâu [17].

3


1.1.4. Đặc điểm sinh học của cây Dó bầu

Hình 1.2. Mặt cắt ngang thân cây Dó bầu tạo trầm
Cơ chế tạo ra trầm hƣơng trong cây Dó bầu đến nay vẫn là một điều nan
giải và chƣa đƣợc hiểu biết tƣờng tận. Ngƣời ta cho rằng các khối trầm đƣợc tạo
ra là kết quả của hoạt động chuyển hóa bệnh lý ở những nơi bị bệnh, bị
thƣơng,… Một số nghiên cứu cho rằng cây Dó bầu sinh ra trầm hƣơng là do “sự
biến đổi phân tử của gỗ dƣới ảnh hƣởng của một loại bệnh gây ra, trầm hƣơng là
những phần gỗ bệnh lý xuất hiện ở Aquilaria dƣới tác động của tác nhân gây
bệnh là một loại nấm thuộc nhóm bất tồn. Căn cứ vào sự hóa nhựa (sự tụ dầu)
nhiều hay ít có thể phân loại trầm hƣơng thành các loại khác nhau nhƣ:
- Tóc (có nguồn gốc tƣ chữ tok của ngƣời campuchia), nhựa(dầu) nhiễm
bên ngoài mạch gỗ.
- Trầm hƣơng: Do sự phân hóa khơng trọn vẹn của các phần tử gỗ, gỗ ít
tấm nhựa hơn, màu nâu hay có sọc đen, nhẹ nổi đƣợc trong nƣớc, dùng để chƣng
cất tinh dầu
- Kỳ nam (nghĩa là điều kỳ diệu của phƣơng nam): Do sự biến đổi hoàn
toàn của các phần tử gỗ (các phần tử gỗ thoái hóa, biến dạng, mất mộc tố chứa
một chất nhựa thơm) có màu nâu đậm hay đen, nặng chìm trong nƣớc, vị đắng,
thƣờng hình thành ở phần lõi gỗ (nhựa nhiễm cả bên trong và bên ngoài mạch
gỗ đậm đặc) [21].
4

1.1.5. Địa điểm phân bố của cây Dó bầu
Do phù hợp với khí hậu nhiệt đới nên loại cây này thƣờng phân bố ở
Đông Nam Á và đảo New Guinea. Việt Nam đƣợc cho là có trữ lƣợng và chất
lƣợng Trầm rất lớn. Ở nƣớc ta, Dó bầu phân bố tƣơng đối rộng từ Bắc vào Nam.
Trong đó, Khánh Hịa đƣợc xem là xứ sở Trầm Hƣơng. Bởi lẽ ở đây có số lƣợng
lớn cây Dó bầu có khả năng tạo ra Trầm. Cuộc sống của ngƣời dân ở đây trƣớc
kia gắn bó chủ yếu với Trầm Hƣơng.
Tại nƣớc ta có tất cả 4 lồi: Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte,
Aquilaria baillonii Pierre ex Lecomte, Aquilaria banaense Pham-hoang-Ho và
loài Aquilaria rugosa L.C.Kiệt & PJ.A Kessler. Chúng đƣợc đặt theo tên ngƣời
tìm ra.
Ở Việt Nam cây Dó bầu phân bố tại các địa bàn nhƣ:
Phía Bắc: Hồng Liên Sơn, Vĩnh Phú, Hịa Bình, Hà Tây, Quảng Ninh,
Bắc Hà, Cao Bằng, Lạng Sơn, Hà Bắc.
Miền Trung: Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tỉnh, Quảng Bình, Quảng Trị,
Thừa Thiên, Quảng Nam, Đà Nẵng, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú n, Khánh
Hịa.
Tây Ngun: Gia Lai, Kontum, Đắc Lắk.
Miền Nam: Bình Thuận, Lâm Đồng, Bình Phƣớc, Đồng Nai, Tây Ninh,
An Giang, Kiên Giang, Đảo Phú Quốc.
Trƣớc đây, cây Dó bầu phân bố tập trung ở dãy Trƣờng Sơn, song do sự
khai thác bừa bãi của dân, đến nay chỉ cịn thấy cây Dó Bầu ở những vùng xa
xơi, đầu nguồn rừng già [1].
1.1.6. Công dụng của lá cây Dó bầu
1.1.6.1. Lợi ích với sức khỏe
Cơng dụng nổi bật của loại lá này đó chính là đối với y học và sức khỏe.
Ngày nay, ngƣời ta điều chế ra các loại thực phẩm có chức năng hỗ trợ và tăng
cƣờng sức khỏe từ lá cây. Cụ thể, họ phơi khơ lá cây có tuổi đời từ 7 tháng trở

5


lên sau đó chiết xuất thành cao. Nó đƣợc sử dụng để tăng cƣờng sức khỏe,
phòng và hỗ trợ điều trị bệnh.
Đối với sản phẩm trà, ngƣời ta sẽ dùng lá của cây có tuổi đời từ 9 tháng
tuổi, các lá lấy từ cây Dó bầu có độ tuổi từ 9 tháng thì hàm lƣợng Mangiferin
cao hơn so với các lá lấy từ cây có độ tuổi 7 tháng. Mangiferin đã đƣợc nghiên
là một hợp chất có khả năng chống lại các gốc oxi hóa tự do, có tác dụng ổn
định đƣờng huyết và giảm cholesterol xấu, chống lại các gốc oxi hóa tự do, nên
Mangiferin có khả năng ngăn ngừa các căn bệnh nhƣ tim mạch, ung thƣ. Việc
sản xuất trà này đã và đang diễn ra không chỉ ở Việt Nam mà còn ở các nƣớc
châu Á khác nhƣ Lào, Thái Lan,…Đây là loại thức uống có lợi, rất tốt cho sức
khỏe. Sản phẩm này hiện đang rất phổ biến và đƣợc ƣa chuộng tại Lào [1].
1.1.6.2. Lợi ích kinh tế, xã hội
Toàn bộ thân, rễ, lá của cây Dó bầu đều đƣợc sử dụng để chƣng cất tinh
dầu Trầm. Ngồi ra, với những cây Dó tạo ra Trầm Hƣơng có thể có giá trị lên
đến hàng tỷ đồng. Trên thị trƣờng hiện nay, Trầm Hƣơng đƣợc ƣa chuộng và có
giá thành rất cao. Đặc biệt, Kỳ Nam cịn có giá lên đến hàng nghìn tỷ đồng cho
một khối. Bởi lẽ, Kỳ Nam là loại cao cấp nhất, có lƣợng tinh dầu rất lớn. Bên
cạnh đó, nó cũng chứa những hoạt chất tốt cho sức khỏe [17].
Các sản phẩm làm từ Trầm Hƣơng rất đa dạng và đƣợc sử dụng phổ biến
trong đời sống. Bột gỗ, vụn hay nhang để xông Trầm. Nhang trầm hƣơng dùng
trong nghi lễ cúng bái, văn hóa tâm linh.
Tùy thuộc vào độ đậm đặc của tinh dầu mà ngƣời ta chia nó thành Kỳ
nam, Trầm Hƣơng, Trầm tốc. Trong đó, Kỳ Nam là thứ cao cấp nhất, mang lại
hiệu quả kinh tế cao. Nhu cầu về Trầm trên thế giới rất cao. Bởi lẽ đó là nhờ vào
cơng dụng, giá trị tuyệt vời mà nó đem lại. Chính vì sự hiếm có của loại gỗ này,
trong khi đó nhu cầu thị trƣờng lại cao nên giá thành cũng không hề rẻ. Nếu gỗ
sƣa đƣợc ví đắt nhƣ vàng rịng thì Trầm cịn đắt hơn cả vàng rịng. Có những

khối Kỳ Nam dao động từ vài chục tỷ đến cả trăm nghìn tỷ. Đây là một mức giá
thành cao. Điều này cho thấy rằng hiệu quả kinh tế từ loài cây này là rất lớn.
6


Từ xƣa đến nay, Trầm Hƣơng đƣợc tạo ra nhờ những vết thƣơng trên cây
Dó bầu. Cây sẽ tiết ra nhựa và tinh dầu để làm lành vết thƣơng. Lâu dần, chúng
tích tụ lại tạo ra Trầm. Nhƣng có những cây khả năng tích tụ dầu thấp sẽ khơng
tạo ra đƣợc Trầm. Chính vì thế, khi cấy tạo Trầm, khả năng thành công cũng
không cao [1].
1.1.7. Triển vọng và thách thức
Cây Dó bầu đã và đang mang lại những hiệu quả kinh tế rất lớn, bởi lẽ
không chỉ nhu cầu sử dụng Trầm Hƣơng trong nƣớc đang cao mà còn ở những
quốc gia khác nhƣ Mỹ, châu Âu nhu cầu này đang ngày càng phát triển mạnh
mẽ hơn. Chính vì thế, tiềm năng cơ hội phát triển từ loại cây này là rất lớn.
Tuy nhiên, chúng ta cũng đang gặp một hạn chế nhất định. Thứ nhất là để
sử dụng đƣợc sản phẩm từ cây Dó bầu phải trải qua một khoảng thời gian khá
dài. Cụ thể là khoảng 10 năm. Bên cạnh đó, cơng nghệ sử dụng cịn hạn chế,
nhiều yếu kém. Vì thế cần khắc phục điều này để lợi ích kinh tế mà loại cây này
đem lại đƣợc sử dụng hiệu quả hơn [21].
1.2. Khái quát về tinh dầu Trầm
1.2.1. Khái quát chung về tinh dầu trầm
Tinh dầu trầm hƣơng đƣợc chiết xuất từ cây Dó bầu bằng phƣơng pháp
chƣng cất hơi nƣớc. Loại tinh dầu này có tên tiếng Anh là Agarwood essential
oil, có nguồn gốc từ Ấn Độ tuy nhiên hiện nay, có thể dễ dàng tìm thấy nó ở các
nƣớc châu Á khác nhƣ: Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia và cả Việt Nam.
Đây là một loại tinh dầu quý, đƣợc sử dụng từ thời cổ đại trong nhiều nền
văn hóa khác nhau. Nó nổi tiếng khơng chỉ bởi hƣơng thơm quyến rũ mà cịn
bởi những tác dụng tuyệt vời đối với sức khỏe.
Tuy nhiên cần phải phân biệt tinh dầu trầm hƣơng với tinh dầu nhũ hƣơng

(có tên tiếng Anh là Frankincense essential oil). Tinh dầu nhũ hƣơng đƣợc chiết
xuất từ nhựa của cây Boswellia carterii, Boswellia ferreana hoặc Boswellia
serrata chúng thƣờng đƣợc trồng ở Somalia và Pakistan. Nhìn chung khi xét về

7


mặt tác dụng cả 2 loại tinh dầu này đều có những tác dụng tƣơng tự nhau đối với
sức khỏe con ngƣời [1].
1.2.2. Tính chất hóa lý của tinh dầu trầm
Tinh dầu trầm là chất lỏng sánh màu vàng tím hoặc màu da cam đậm, mùi
thơm đặc biệt, rất dai. Các chỉ tiêu hóa lý của trầm đƣợc trình bày ở bảng 1.1
dƣới đây [10].
Bảng 1.1. Các chỉ tiêu hóa lý của tinh dầu trầm
Các chỉ tiêu

Thông số

Tỷ trọng

1,0086 - 1,0016

Góc quay cực

(-13o2’)-(-14o)

Khối lƣợng riêng (25oC)

0,89 - 1,08 (g/cm3)

Chỉ số acid

6,8 - 13,2

Chỉ số ester

18,3 - 27,1

Tính tan

Tan trong alcohol

Chiết xuất (25oC)

1,4920- 1,5001

1.2.3. Thành phần của tinh dầu trầm
1.2.3.1. Sesquiterpene
Từ lâu, các loại sesquiterpenoid trong tinh dầu trầm là một trong những đề
tài nghiên cứu đƣợc các nhà khoa học quan tâm đến, ngƣời ta cho rằng agarol
(đƣợc đặt tên bởi Jain và Bhattacharya năm 1959) là loại sesquiterpenoid trong
tinh dầu trầm đã đƣợc định danh từ những hợp chất sesquiterpene cơ bản,
agarosporane, nootkatane, selinane prczizane, và guaiane [24].

8


Hình 1.3. Năm loại khung sesquiterpene cơ bản trong tinh dầu
Chú thích: I: agarosirane, II: nootkatane, III: selinane, IV: prezizane, V: guaiane.
1.2.3.2. Dẫn xuất chromone

Những chromone có thể là agarotrtrol hay isoagaroterol chứa nhiều nhóm
hydroxy. Những chromone khác, phần lớn là những dẫn xuất của ethyl phenyl
chromone tìm ra trong A.agallocha và A.sinensis:

hydroxy, dihydroxy,

methoxy, dimethoxy, tetrahydroxy, tetrahydro; của ethyl phenyl pentahydroxy
chromone,… và ngƣời ta cũng tìm ra đƣợc những ethyl biphenyl chromone và
ethyl triphenyl chromone.
Một số dẫn xuất chromone trong loài A.sinensis: 2-(2-phenylethyl)
chromone;6-methoxy-2-(2-phenylethyl)chromone;

6,7-dimethoxy-2-(2-phenyl

ethyl) chromone; 6-methoxy-2-[2-(3’-methoxyphenyl)ethyl chromone,… [26]
1.2.3.3. Các thành phần khác
Ngồi sesquiterpene và chromone cịn có các chất khác nhƣ
benzylacetone, hydrocinamicacid, anisic acid, ρ-methoxyhydrocinamic acid, ρmethoxybenzylacetone,…
1.2.3.4. Thành phần của tinh dầu trầm chiết tách từ cây Dó bầu
Thành phần chính là 26% benzylacetone, 53% methoxybenzylacetone,
11% alcohol terpenic và cinnamic acid cùng các chất dẫn xuất, anisic acid,
agarospirol, agarol, agarofurane, agarotetrol, nor ketoagarofurane [1].

9


Năm 1993, trong một nghiên cứu của Ishihara và các cộng sự, khi so sánh
thành phần hóa học của bốn loại tinh dầu đƣợc trích ra từ 4 mẫu gỗ Dó thu từ
các nguồn khác nhau trên lãnh thổ Việt Nam (trong đó có 3 mẫu là lồi
A.agallocha và 1 mẫu là A.sinensis), tất cả các mẫu tinh dầu thu đƣợc phân tích

bằng phổ GC/MS đều cho thấy chúng có rất nhiều các sesquiterpene và
chromone.
Trong nghiên cứu này, Ishihara và các cộng sự đã tìm ra các thành phần
gây mùi trong tinh dầu trầm hƣơng (bảng 1.2).
Bảng 1.2. Các thành phần gây mùi của tinh dầu trầm/ trầm hương [21]
Thành phần

Mùi
Mùi gỗ giống nhƣ mùi khói khi đốt

Selina-3,11-diene-14-al

gỗ đàn hƣơng

Selina-4,11-diene-14-oic acid

Mùi bạc hà

Dehydrojnkoh-eremol

Mùi gỗ

(+)-dihydrokaranone

Mùi gỗ

Neopetasane

Mùi gỗ

1.3. Tổng quan nghiên cứu tạo trầm hƣơng
1.3.1. Tạo trầm hương tại Việt Nam
Trƣớc nhu cầu trên thế giới Trầm hƣơng nguyên liệu cộng với giá cả ngày
càng tăng, thiên nhiên ƣu đãi, hiện nay đã có nhiều dự án các cơ quan tổ chức
trong và ngồi nƣớc đầu tƣ trồng cây Dó bầu để tạo Trầm hƣơng.Nhƣ ơng
Nguyễn Ngọc Tồn chủ tịch hội đồng quảng trị công ty Fong San đã đầu tƣ
trồng 60 hecta Dó bầu tại xã An Khƣơng huyện Bình Long tỉnh Bình Phƣớc đến
nay đã bƣớc đầu gây tạo Trầm thành cơng và bƣớc đầu cho thu hoạch, chính vì
thế mà cơng ty đã nhân rộng mơ hình này tại nhiều tỉnh thành trong cả nƣớc nhƣ
: Quảng Nam, Đà Nẵng, Phú Yên, Lâm Đồng , Gia Lai …(theo tài liệu sở Lâm
Nghiệp tỉnh Gia Lai).
Ngoài ra nhiều tỉnh thành trên cả nƣớc bà con cũng phát triển cây Dầu Dó
ngay tại nhà mình theo kinh nghiệm dân gian họ truyền nhau và mày mò cách
10


tạo Trầm sao cho hiệu quả nhƣ đốt cháy sắt vào, cấy mảnh bom đạn vào các vết
thƣơng để dẫn dụ kiến khi kiến lên ăn dầu vơ tình sẽ tổn thƣơng cây và tạo ra
Trầm mắt kiến.
Đề tài điều tra số liệu khai thác Trầm ngoài tự nhiên của 59 cây Dó bầu
của Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, trong đó có 13 cây có khả năng xuất
khẩu chiếm 21%, 21 cây có dấu hiệu hình thành Trầm hƣơng ở các vị trí khác
nhau cây chiếm 35,6% cịn lại 25 cây khơng có Trầm hƣơng.
Đề tài gây tạo Trầm hƣơng bằng tác động cơ giới của kỹ sƣ Nguyễn Hồng
Lam (trung tâm Nghiên cứu Lâm đặc sản). Đề tài đã thực trên 54 cây Dó bầu ở độ
tuổi 6-18 tuổi. Kết quả đối với 27 cây chỉ tác động cơ giớ làm tổn thƣơng cây mà
không gây tác động gì thêm và theo định kỳ 2 năm quan sát một lần. Đối với 27
cây còn lại sau khi tác động cơ giới làm tổn thƣơng mà không phun Benlat thì sau
2 năm khơng có dấu hiệu gì, sau 4 năm 6 năm 8 năm mới thấy có tạo trầm , cịn
27 cây sau khi chấn thƣơng có sử dụng Benlat để phun thì khơng cho kết quả tạo

Trầm hƣơng. Nhƣ vậy việc tạo Trầm có liên quan đến bệnh lý của cây.
Đề tài nghiên cứu khả năng tạo Trầm bằng chế phẩm sinh học (Lt ) của
trung tâm Nghiên cứu Lâm đặc sản - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam cho
thấy: Sau khi gây chấn thƣơng bằng tác động cơ giới nhƣ đục khoan vào thân
cây 0,8m; 1,2m; 1,5m so với mặt đất sau đó đƣa chế phẩm sinh học vào vết
thƣơng. Đề tài tiến hành trên 3 nhóm tuổi khác nhau của cây Dó bầu (Nhóm 1:
từ 4 - 8 tuổi; Nhóm 2 : từ 10 - 14 tuổi và Nhóm 3 : từ 16 - 20 tuổi). Ngồi ra,
phạm vi đề tài cịn đánh giá sự tạo Trầm ở rừng trồng tập trung và phân tán. Kết
quả sự hình thành Trầm ở các lứa tuổi của cây là nhƣ nhau.Nhƣ vậy, sự tạo
Trầm bằng chế phẩm sinh học không phụ thuộc vào lứa tuổi của cây, tuy nhiên ở
những cây có độ tuổi cao hơn có đƣờng kính to hơn cho Trầm nhiều hơn.
1.3.2. Trên thế giới
Ở Ấn độ TS. Shiva thì cho rằng kết quả hình thành Trầm trong tự nhiên có
liên quan đến bện lý của cây nhƣng nguồn gốc gây bệnh thì tác giả chƣa kết
luận.Ở Malysia sau khi tìm hiểu về vấn đề tạo Trầm hƣơng ngồi tự nhiên thìtiến
11


sĩ khoa học Julajudin đã đi đến kết luận. Quá trình hình thành Trầm trong tự nhiên
có liên quan đến bệnh lý của cây nguồn gốc hình thành Trầm là do sự cộng sinh
của các loài nấm Criptophoerica mangifera với thân gỗ mà thành (1996).
Năm 1989, tiến sĩ Naiyna Thpongijem và cộng sự (Thái Lan) nghiên về
vấn đề tạo Trầm quá trình hình thành Trầm cho rằng kết quả hình thành Trầm
hƣơng trên cây Dó bầu là kết quả cộng sinh của các loại nấm Cephalosoptrium,
Botriodiplodia, Chactomium.
1.4. Các phƣơng pháp kích thích tạo ra Trầm hƣơng
Với số lƣợng rừng trồng Aquilaria tăng lên, cùng với những nỗ lực đã
đƣợc thực hiện để phát triển các phƣơng pháp cảm ứng nhân tạo để kích thích sự
hình thành Trầm hƣơng. Mục đích là để tăng sản lƣợng Trầm hƣơng đƣợc trồng
lên có chất lƣợng cao cho các mục đích của ngƣời sử dụng. Các phƣơng pháp

này phải thiết thực cho các đồn điền, cơng ty, xí nghiệp có quy mơ lớn, với mục
tiêu chính là mang lại nguồn cung gỗ trầm hƣơng tối đa trong thời gian ngắn
nhất có thể. Cùng với các thực hành nông nghiệp tốt, phƣơng pháp nhân tạo
đƣợc dự đoán sẽ mang lại sản lƣợng gỗ trầm hƣơng cao hơn so với quy trình tự
nhiên, trong đó lý tƣởng nhất là chất lƣợng của nó phải gần nhƣ giống với gỗ
Trầm hƣơng tự nhiên đến 98%, hoặc có thể chất lƣợng Trầm tạo ra cao hơn
Trầm tự nhiên.
Trầm hƣơng là một hợp chất nhựa đƣợc sản xuất bởiAquilaria spp, nhƣ là
một phản ứng đối với tổn thƣơng phi sinh học và sinh học. Quá trình hình thành
trầm hƣơng diễn ra trong các tế bào nhu mô, bao gồm cả phloem và mạch
(Nobuchi và Sahri 2008; Mohamed et al. 2013). Cây phản ứng mạnh mẽ và sự
xâm nhập của các tác nhân bên ngồi bằng cách kích hoạt bộ máy tế bào của nó
để tổng hợp các chất hoạt động nhƣ một lớp bảo vệ sinh hóa chống lại các tác
nhân vật lý hoặc sinh học (Rasool và Mohamed 2016). Các cấu trúc giải phẫu
này chịu trách nhiệm sản xuất, lƣu trữ và phân phối các thành phần gỗ vào khu
vực bị thƣơng, lấp đầy các ngăn, trở nên rắn chắc và tẩm gỗ. Quá trình này là
nền tảng để phát triển các phƣơng pháp nhân tạo để tạo ra gỗ trầm hƣơng. Hiện
12


nay, phƣơng pháp cảm ứng gỗ trầm hƣơng nhân tạo có thể đƣợc phân thành hai
nhóm: Phƣơng pháp truyền thống và phƣơng pháp hiện đại.
1.4.1. Phương pháp tạo trầm truyền thống
Phƣơng pháp truyền thống là các phƣơng pháp đƣợc hình thành dựa trên
các kinh nghiệm cá nhân, đƣợc truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác.
Trung Quốc là một trong những nƣớc đã sử dụng các sản phẩm từ cây
Trầm hƣơng từ rất lâu. Trƣớc thời nhà Tống(A.D.960), ngƣời Trung Quốc đã
sáng tạo ra các phƣơng pháp khác nhau để tạo ra trầm hƣơng (Liu và cộng sự
2013). Theo định nghĩa của Pojanagaroon và Kaewrak (2005), phƣơng pháp
kích thích tạo trầm hƣơng cơ bản nhất là làm tổn thƣơng cây. Điều này giải thích

tại sao nơng dân sử dụng các phƣơng pháp nhƣ : khoan, đốt, cắt tỉa một phần
thân cây, dùng rìu hoặc dao rựa loại bỏ vỏ cây và đóng đinh trên cây để kích
thích cây tạo trầm hƣơng (Liu và cộng sự 2013; Rasool và Mohamed 2016).
Những phƣơng pháp này có thể có hiệu quả và chi phí thấp nhƣng ngƣợc
lại chúng rất tốn cơng, thời gian tạo ra Trầm lâu và có thể gây ảnh hƣởng tới
chất lƣợng gỗ Trầm. Hơn nữa, khi kích thích tạo Trầm hƣơng bằng phƣơng pháp
vật lí thì Trầm hƣơng chỉ hỉnh thành ở vùng bị tổn thƣơng nên năng suất thu
đƣợc không cao.
1.4.2. Phương pháp tạo trầm hiện đại
Sử dụng các phƣơng pháp phù hợp nhằm tạo ra các điều kiện gần sát với
điều kiện tự nhiên thích hợp cho sự tạo thành Trầm hƣơng đƣợc gọi là phƣơng
pháp hiện đại. Các phƣơng pháp này sử dụng chất xúc tác hoặc chất cảm ứng
vào cây kích thích sự hình thành trầm hƣơng. Hiện tại, chất cảm ứng có sẵn trên
thị trƣờng đƣợc phân thành 2 loại: (1) “inocula” sinh học, (2) cảm ứng hóa học.
Tóm tắt của các nghiên cứu liên quan đến tạo trầm hƣơng bằng các phƣơng pháp
hiện đại đƣợc thể hiện ở(Bảng 1.3).

13


Bảng 1. 3. Các nghiên cứu tạo trâm hương bằng phương pháp sinh học[25].
Năm

2015

Ngƣời thực
hiện

Đề tài
Agarwood constituents stimulated by crude extracts

of Trichoderma in cell suspension culture of A.
malaccensis.

Jayaraman
andMohamed

Fifteen different fungal isolates from Fusarium,
Acremonium, Alternaria, Nigrospora,
Scopulariopsis,Cladosporium, Scytalidium, and
Mucor species, identified from A. malaccensis preinoculated withFusarium.

Lisdayani et
al.

Patent of selected strains of Fomitopsis,L.
theobromae,Rigidoporus vinctus, Pestalotiopsis
virgatula andTrichoderma erinaceum.

Wei et al.

Four different F. solani strains (GSL1-GSL4)
introduced for commercial inoculation

Faizal et al

Acremonium and Fusarium species found effective on
Triadiati et al.
A. crassna
2016

2017

Patent of a chemical inducer
(glucohexaose,potassium dihydrogen phosphate,
magnesium chloride, calciumnitrate, ammonium
nitrate, potassium sulfate, copper sulfate, sodium
molybdate, boric acid, zinc sulfate,mangan sulfate
and ethylenediaminetetraacetic acid)

Tang and Liu

The fermentation liquid from L. theobromae and F.
solani induced agarwood formation in A. sinensis

Chen et al.

A chemical solution and fungal elicitor from L.
theobromae produced 2-(2-phenylethyl)chromones in
A.sinensis using transfusion method

Huang et al.

Arthrinium, Colletotrichum and Diaporthe species
associated to a broad spectrum of volatilecompounds
inagarwood oil.

Monggoot et
al.

14

1.4.2.1. Cảm ứng sinh học
Các chất cảm ứng sinh học thƣờng là các chế phẩm sinh học có nguồn gốc
từ vi sinh vật nhƣ nấm men, nấm mốc, …Chúng đƣợc gọi là “inoculum”. Kỹ
thuật này bao gồm việc nuôi cấy nấm vào cây để mơ phỏng tình trạng bệnh lý
của Aquilaria ở giai đoạn cịn non. Các lồi nấm này đƣợc phân lập từ tự nhiên
và nuôi cấy trong điều kiện có kiểm sốt nhƣ phịng thí nghiệm. Có thể nuôi cấy
trên môi trƣờng thạch trên các đĩa petri hoặc trong môi trƣờng lỏng để thu lấy
dịch bào tử.
“Inocula” đƣợc sản xuất bằng các thành phần có sẵn tại địa phƣơng nhƣ rỉ
đƣờng, nƣớc ép trái cây,… Chất cấy có thể chứa nhiều loại vi khuẩn và các sản
phẩm lên men do mơi trƣờng khơng đƣợc kiểm sốt trong đó chúng đƣợc điều
chế. Các chất cảm ứng sinh học có thể cần một thời gian ủ dài trƣớc khi khai
thác để tạo ra gỗ sẫm màu hơn và thu lấy trầm hƣơng với chất lƣợng tốt hơn
(Mohamedet al. 2014). Thời gian ủ lâu giúp cho vi sinh vật phát triển và tấn
công vào các thành phần cấu tạo nên cây, từ đó kích thích khả năng sản sinh ra
nhựa cây nhằm chống lại các tác nhân vi sinh vật(Rasool và Mohamed
2016).Các nhà nghiên cứu đã phân lập nấm từ gỗ trầm hƣơng tự nhiên để nghiên
cứu vai trò của nấm trong sự hình thành trầm hƣơng (bảng 1.3).
Chi nấm đã thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên cứu ở Indonesia là
Fusarium (Santoso và cộng sự 2011; Iskandar và Suhendra 2012). Các loại nấm
khác nhƣ: Paraconiothyrium variabile Riccioni, Botryosphaeria dothidea,
Aspergillus

niger

Tiegh,

Fomitopsis

spp,

Lasiodiplodia

theobromae,

Trichoderma spp, ... đƣợc phân lập từ cây trầm hƣơng đã và đang đƣợc nghiên
cứu. Mục đích của việc thử nghiệm nhiều loại nấm là để xác định các loài phù
hợp và có khả năng kích thích tạo ratrầm hƣơng chất lƣợng cao, tuy nhiên kết
quả có thể khác nhau khi áp dụng tại các địa điểm khác nhau.
1.4.2.2. Cảm ứng hóa học
Các chất cảm ứng hóa học có khả năng phản ứng nhanh và mang lại năng
suất tƣơng đối cao. Sử dụng hóa chất để tạo ra cơ chế bảo vệ cây đối với việc
15


thúc đẩy sản xuất nhựa không chỉ đƣợc áp dụng cho Aquilaria spp., mà còn
đƣợc sử dụng rộng rãi với các loài khác, chẳng hạn nhƣ vân sam Na Uy [Picea
abies (L.) H. Karst.] (Martinet al. 2002). Loài Picea abies tƣơng tự nhƣ các loài
cây lá kim khác, tạo raoleoresin dựa trên terpenoid giúp chống lại sự xâm nhập
của côn trùng, mầm bệnh, … (Martin et al. 2002; Zeneli et al. 2006; Phillips et
al. 2007). Đối với Aquilaria, các nhà nghiên cứu đã tìm ra các hoạt chất nhƣ
methyl jasmonate, ethylene và axit salicylic giúp kích thích sản xuất gỗ trầm
hƣơng (Okudera và Ito 2009). Các chất cảm ứng hóa học kích thích tạo trầm
hƣơng khá phổ biến trên thị trƣờng chẳng hạn nhƣ methyl jasmonate, hydro
peroxide, natri methyl bisulfite, natri clorua, sắt clorua, axit formic, cellobiose,
axit salicylic và các chất có nguồn gốc sinh học nhƣ chitin (Blanchette và van
Beek 2005; Okudera và Ito 2009; Wijitphan 2009; Wei et al. 2010; Lan và Li
2013; Thanh et al. 2015; Fu và Xu 2016; Tan và Liu 2016). Tuy nhiên, việc sử

sụng các chất cảm ứng hóa học phải đƣợc nghiên cứu thực địa một cách chính
xác nhằm xác định nồng độ thích hợp tránh trƣờng hợp sử dụng nồng độ cao sẽ
gây chết.

16


CHƢƠNG II.
MỤC TIÊU - NỘI DUNG - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu nghiên cứu
2.1.1. Mục tiêu chung
Phân lập, nghiên cứu đặc tính sinh học và định danh đƣợc một số dịng
nấm trong thân cây Dó bầu có trầm hƣơng ở Hà Tỉnh.
2.1.2. Mục tiêu cụ thể
- Phân lập đƣợc ít nhất 2 chủng nấm từ thân cây Dó bầu có trầm hƣơng ở
Hà Tĩnh;
- Xác định đƣợc điều kiện ni cấy thích hợp cho từng chủng nấm;
- Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của từng chủng nấm đã phân lập.
- Định danh các chủng nấm đã phân lập đƣợc;
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập một số chủng nấm trong mẫu gỗ Dó bầu có trầm hƣơng ở Hà
Tĩnh;
- Nghiên cứu đặc tính sinh học của các chủng nấm đã phân lập:
 Mơi trƣờng thích hợp cho sự sinh trƣởng và phát triển;
 Điều kiện pH thích hợp cho sựu sinh trƣởng và phát triển;
 Khả năng sinhtổng hợp enzyme ngoại bào;
- Định danh các chủng nấm đã phân lập:
 Bƣớc đầu định danh các chủng nấm thơng qua đặc điểm hình thái;
 Định danh các chủng nấm bằng kĩ thuật sinh học phân tử.
2.3. Vật liệu nghiên cứu

Mẫu gỗ từ thân cây Dó bầu có trầm hƣơng lấy từ tỉnh Hà Tĩnh.
2.3.1. Hóa chất, thiết bị
2.3.1.1. Hóa chất
- Các loại đƣờng: glucose, saccharose.
17


- Các loại muối: K2HPO4, MgSO4.7H2O, NaH2PO4, Na2HPO4, CaCl2,
FeSO4.7H2O, MnSO4, ZnSO4, CuSO4, KI, CaCO3…
- Cao peptone, cao nấm men, agar, tinh bột tan, sodium carboxymethyl
cellulose (CMC), acid tanic và các hóa chất khác.
- Cơ chất bổ sung : khoai tây.
2.3.1.2. Dụng cụ và thiết bị
- Thiết bị: máy đo pH, nồi hấp khử trùng, tủ ấm vô trùng, tủ sấy, cân điện
tử, cân phân tích, tủ ni vi sinh vật, máy lắc, box cấy, máy ly tâm, tủ
lạnh, bếp điện.
- Dụng cụ: pipet, đĩa petri, ống đong, bình thủy tinh, ống falcon, ống
eppendorf… và các dụng cụ khác.
2.3.1.3. Môi trường
Các loại môi trƣờng và thành phần sử dụng trong nghiên cứu:
- PDA: 20g Dextrose; 20g khoai tây; 20g thạch; 1000ml nƣớc cất vừa đủ.
- Czapek: 3g NaNO3; 30g Saccarose; 1g KH2PO4; 0,5g MgSO4.7H2O; 20g
Agar; 1000ml nƣớc cất vừa đủ.
- Gause: 20g tinh bột tan; 1g KNO3; 0,5g KH2PO4; 0,5g MgSO4.7H2O; 0,5g
NaCl; 0,01g FeSO4; 20g thạch; 1000 ml nƣớc cất vừa đủ.
- Hansen: 50g glucose; 10g peptone; 3g KH2PO4; 2g MgSO4.7H20; 20g thạch,
1000ml nƣớc cất vừa đủ.
- Sabouroud: 20g peptone; 40g glucose; 20g thạch, 1000ml nƣớc cất vừa đủ.
- YEA: 4g cao nấm men; 20g glucose; 20g thạch, 1000ml nƣớc cất vừa đủ
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.4.1. Phương pháp phân lập nấm
Các mẫu gỗ đƣợc thu thập từ thân cây Dó bầu có trầm và đƣợc giữ trong
các túi nilon vơ trùng, ghi tên mẫu, ngày lấy mẫu, đánh số thứ tự và vị trí lấy
mẫu.
Các mẫu gỗ đƣợc cắt thành từng mảnh nhỏ khoảng 5mm, mỗi mẫu đƣợc
rửa bằng nƣớc vô trùng cho sạch hết các tạp chất bám trên bề mặt mẫu gỗ thu
18


thập đƣợc, lấy phanh gắp các mẫu vừa đƣợc rửa sạch xong, đặt trên môi trƣờng
PDA, nuôi cấy ở 28˚C trong 2-7 ngày.
Tiếp theo, để sàng lọc, tách đƣợc các chủng nấm đang phân lập cấy trên
môi trƣờng PDA ta liên tục cấy các khuẩn lạc ra môi trƣờng PDA vô trùng, cấy
chuyển liên tục nhiều lần (3-4 ngày cấy chuyền 1 lần) để thu đƣợc giống thuần
khiết [5].
2.4.2. Phương pháp nghiên cứu đặc tính sinh học
2.4.2.1. Mơi trường thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển
Khảo sát môi trƣờng thích hợp cho các chủng nấm đƣợc tiến hành trên
các loại môi trƣờng:PDA, Hansen, Gause, Czapek, Sabouroud, YEA. Nuôi cấy
ở nhiệt độ 28˚C sau 2-14 ngày, quan sát và đo đƣờng kính khuẩn lạc nấm.
2.4.2.3. Điều kiện pH thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển
Khả năng phát triển của các chủng nấm ở pH khác nhau đƣợc nghiên cứu
trên môi trƣờng PDA, sử dụng HCl và NaOH điều chỉnh môi trƣờng ở các giá trị
pH=3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, nuôi cấy ở nhiệt độ 28˚C trong 2-14 ngày. Quan sát và đo
đƣờng kính khuẩn lạc nấm.
2.4.3. Phương pháp định tên nấm
2.4.3.1. Phương pháp định danh thơng qua đặc điểm hình thái
- Quan sát hình thái và màu sắc hệ sợi của các chủng đã phân lập đƣợc;
- Quan sát sự hình thành bào tử và sự biến đổi màu sắc của bào tử nấm
bằng mắt thƣờng;

- Quan sát các hình thái hệ sợi và bào tử nấm dƣới kính kiển vi ở vật kính
40x, 100x sau đó:
 Lấy mẫu lên lam kính rồi nhỏ nhuộn bằng xanh metyelen để trong 3
phút rồi rửa bằng nƣớc;
 Nhuộn tiếp dung dịch lugol trong 1 phút rồi rửa lại bằng nƣớc;
 Rửa mẫu bằng côn trong 30 giây;
 Soi dƣới kính hiển vi quan sát bắt màu và các bào tử trên kính hiển
vi.
19