Nghiên cứu giám định và phân tích đa dạng di truyền loài xá xị (cinnamomum parthenoxylon (jack) meisn) tại vườn quốc gia tam đảo bằng phương pháp DNA mã vạch (khóa luận công nghệ sinh học lâm nghiệp)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP
----------o0o----------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU GIÁM ĐỊNH VÀ PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI
TRUYỀN LỒI XÁ XỊ (Cinnamomum parthenoxylon (Jack)
Meisn) TẠI VƯỜN QUỐC GIA TAM ĐẢO BẰNG PHƯƠNG
PHÁP DNA MÃ VẠCH
NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ

: 7420201

Giáo viên hướng dẫn

: TS. Hà Bích Hồng

Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Tiến Thành

Lớp

: K61 – CNSH

Khóa học

: 2016 - 2020

Hà Nội, 2020


LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành khóa luận này, em xin chân thành cảm ơn Viện Công nghệ
sinh học Lâm nghiệp đã tạo điều kiện về cơ sở vật chất, trang thiết bị, máy móc
trong q trình thực hiện đề tài nghiên cứu .Trong suốt thời gian thực hiện đề tài
em đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cơ, giúp em hồn thành báo
cáo khóa luận tốt nghiệp và đặc biệt cơ TS. Hà Bích Hồng đã hướng dẫn tận tình
cho em trong thời gian thực hiện đề tài “Ngiên cứu giám định và phân tích đa
dạng di truyền loài Xá xị tại vườn Quốc gia Tam Đảo bằng DNA mã vạch”.
Bằng sự nhiệt huyếtvà kinh nghiê ̣m của mình cơ đã truyền đạt kiến thức để em
nắm rõ tất cả nội dung trong quá trình nghiên cứu để có được bài báo cáo như
hơm nay.
Cuối cùng , em xin kính chúc các thầy , cơ trong Viện Cơng nghệ sinh học
Lâm nghiệp có sức khỏe dồi dào và luôn thành công trong công việc để tiếp tục
truyền đạt cho các khóa sinh viên kế tiếp.
Kinh phí thực hiê ̣n đề tài đươ ̣c hỗ trơ ̣ bởi đề tài cấ p Nhà nước “Khai thác
và phát triển nguồn gen cây Xá xị (Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn.)
ở một số tỉnh miền Bắc”.

Hà Nội, ngày tháng năm 2020
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Tiến Thành

i


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ i
MỤC LỤC ............................................................................................................. ii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ..................................................................... iv
DANH MỤC BANG ............................................................................................. v
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................. vi
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU....................................... 2
1.1. Giới thiêụ chung về cây Xá xi........................................................................
2
̣
1.1.1 Đặc điểm hình thái của cây Xá xi ................................................................
2
̣
1.1.2 Đă ̣c điể m sinh học và sinh thái của cây Xá xi .............................................
3
̣
1.1.3 Giá trị sử dụng của cây xá xị ........................................................................ 5
1.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam ........................................... 6
1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới ............................................................... 6
1.3. Tổng quan về DNA mã vạch (DNA barcode)................................................ 8
1.3.1 Giới thiệu về DNA mã vạch ......................................................................... 8
1.3.2 Các đă ̣c điể m cơ bản của trình tự DNA barcode ......................................... 9
1.3.3 Các DNA mã vạch thường được sử dụng .................................................. 10
1.3.4 Ứng du ̣ng của DNA barcode trên thực vâ ̣t ................................................ 13
1.3.5 Mô ̣t số nghiên cứu về DNA mã va ̣ch trên thực vâ ̣t ................................... 16
CHƯƠNG 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU .................................................................................................... 19
2.1. Mục tiêu nghiên cứu ..................................................................................... 19
2.1.1.Mục tiêu chung ........................................................................................... 19
2.1.2.Mục tiêu cụ thể ........................................................................................... 19

2.2.Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ................................................................. 19
2.3.Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 19
2.4.Vật liệu, hóa chất, các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ............................. 20
2.4.1.Vật liệu nghiên cứu .................................................................................... 20
ii


2.4.2.Hóa chất...................................................................................................... 20
2.5.Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 21
2.5.1.Phương pháp thu nhận mẫu ........................................................................ 21
2.5.2.Phương pháp tách chiết DNA tổng số........................................................ 21
2.5.3.Kiểm tra sản phẩm DNA sau khi tách chiết ............................................... 22
2.5.4.Phương pháp PCR với các că ̣p mồi đặc hiệu ............................................. 23
2.5.5.Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR ...................................................... 25
2.5.6.Phương pháp phân tích số liệu ................................................................... 25
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 26
3.1.Kết quả tách chiết DNA tổng số ................................................................... 26
3.2.Kết quả nhân bản trình tự DNA mã va ̣ch bằng phương pháp PCR ............. 26
3.2.1.Kết quả nhân bản đoạn trình tự matK ........................................................ 27
3.2.2.Kết quả nhân bản đoạn trình tự rbcL ......................................................... 28
3.2.3.Kết quả bản đoạn gen trnH-psbA ............................................................... 29
3.3.Kết quả phân tích trình tự các đoa ̣n DNA mã va ̣ch ở loài Xá xi ..................
30
̣
3.3.1.Kết quả phân tić h và so sánh trình tự đoa ̣n gen matK ............................... 30
3.3.2.Kết quả phân tić h và so sánh trình tự gen rbcL ......................................... 35
3.3.3.Kết quả phân tić h và so sánh trình tự đoa ̣n gen trnH-psbA ....................... 39
CHƯƠNG 4......................................................................................................... 45
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. 45
4.1.Kế t luâ ̣n ......................................................................................................... 45

4.2.Kiế n nghi .......................................................................................................
45
̣
TÀI LIỆU THAM KHẢO

iii


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Các
chữ viết tắt
ATP
bp
cpDNA
CTAB
Cytb
DNA
(DNA)

Nghĩa tiếng Anh

Nghĩa tiếng Việt

Adenosin triphosphat
Base pair
Chloroplast DNA

Cytochrome b

Adenosin triphosphat

Cặp base
bộ gen lục lạp
Cetyl
trimethylammonium
bromide
Cytochrome b

Deoxyribonucleic acid

Axit deoxyribonucleic

Cetyl trimethylammonium bromide

dNTP

Deoxyribonucleotide triphosphate

EBA
EBB

Extraction Buffer A
Extraction Buffer B

Deoxyribonucleotid
triphosphate
Đệm tách A
Đệm tách B

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

axit ethylenediamine tetraacetic

F-Primer

Foward-Primer

Mồi xuôi

R-Primer

Reverse primer

Mồi ngược

NCBI

National Center for Biotechnology Trung tâm Quốc gia về Thông
Information
tin Công nghệ sinh học

PCR

Polymerase Chain Reaction

RFLP

Restriction
fragment

polymorphism

RNA

Ribonucleic acid

Axit ribonucleic

rRNA

Ribosomal RNA

ARN ribosome

kb

Kilobase (1000 base)

1000 cặp base

TAE

Tris-Acetate-EDTA

Tris-Acetate-EDTA

tRNA

Transfer RNA

ARN vận chuyển

UV

Untraviolet

Tia cực tím

V/p

v/p

Vịng / phút

Phản ứng chuỗi polymerase
length

iv

Phân tích đa hình trình tự DNA


DANH MỤC BANG

Bảng 2.1. Thành phần và nồng độ các chất sử dụng trong phản ứng PCR......... 23
Bảng 2.2. Trình tự và thông tin về cặp mồi ........................................................ 24
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt độ cho phản ứng PCR mồi matK. RbcL, trnH - psbA
............................................................................................................................. 24
Bảng 3.1. Một số lồi có trình tự đoa ̣n gen matK tương đồng với trình tự gen
matK của mẫu VP01 trên ngân hàng gen NCBI ................................................. 32

Bảng 3.2. Một số lồi có trình tự gen matK tương đồng với trình tự gen rbcL của
mẫu VP01 trên ngân hàng gen NCBI .................................................................. 36
Bảng 3.3. Các vị trí sai khác dùng để phân loại đoạn gen rbcL......................... 38
Bảng 3.4. Các vị trí sai khác của 07 mẫu nghiên cứu ở Tam Đảo, tỉnh Vĩnh
Phúc ..................................................................................................................... 41
Bảng 3.5. Một số lồi có trình tự gen trnH-psbA tương đồng với trình tự gen
trnH-psbA của 07 mẫu Xá xị trên ngân hàng gen NCBI .................................... 42

v


DANH MỤC HÌNH
Hình 0.1: Cành mang hoa và quả cây Xá xị ở Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc ........... 2
Hình 1.2: Cây Xá Xị .............................................................................................. 3
Hình 3.1: Kết quả nhân bản đoa ̣n triǹ h tự MatK của 07 mẫu Xá xi ̣ta ̣i Tam Đảo,
Viñ h Phúc ............................................................................................................ 27
Hình 3.2: Kết quả nhân bản đoa ̣n trình tự rbcL của 07 mẫu Xá xi ̣ ta ̣i Tam Đảo,
Viñ h Phúc ............................................................................................................ 28
Hình 3.3: Kết quả nhân bản đoạn gen trnH-psbA ............................................... 29
Hình 3.4: Trin
̀ h tự nucleotide của đoa ̣n gen MatK đươ ̣c nhân bản ở 07 mẫu Xá
xi ta
̣ ̣i Tam Đảo, Viñ h Phúc .................................................................................. 31
Hình 3.5: So sánh trin
̀ h tự nucleotide của đoa ̣n gen matK giữa mẫu VP01 với 06
triǹ h tự tương đờ ng trên ngân hàng gen .............................................................. 33
Hình 3.6: Cây quan hê ̣ di truyề n giữa mẫu VP01 và 06 loài trên ngân hàng gen
dựa trên triǹ h tự đoa ̣n gen MatK ......................................................................... 34
Hình 3.7: Trình tự nucleotide của đoa ̣n gen rbcL đươ ̣c nhân bản ở 07 mẫu Xá xi ̣
ta ̣i Tam Đảo, Viñ h Phúc ...................................................................................... 35

Hình 3.8: So sánh triǹ h tự nucleotide của mẫu VP01 với 06 trình tự tương đồ ng
trên ngân hàng gen .............................................................................................. 37
Hình 3.9: Cây quan hê ̣ di truyề n giữa mẫu VP01 và 06 loài trên ngân hàng gen
dựa trên triǹ h tự đoa ̣n gen rbcL ........................................................................... 39
Hình 3.10: So sánh trình tự nucleotide của đoa ̣n gen trnH-psbA ở 07 mẫu Xá xi ̣
............................................................................................................................. 40
Hình 3.11: Cây qua hệ di truyền giữa 07 mẫu nghiên cứu và 07 loài trên
NCBI…. .............................................................................................................. 43

vi


ĐẶT VẤN ĐỀ
Xá xị là loài cây đa tác dụng và có phân bố ở một số tỉnh miền Bắc Việt
Nam như Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Bắc Kạn, Tuyên Quang, Thái
Nguyên, tỉnh Vĩnh Phúc, v.v. Ngoài giá trị cho gỗ dùng trong xây dựng, làm tà
vẹt và đóng đồ, các bộ phận của cây còn được chưng cất tinh dầu dùng trong
công nghiệp và y dược. Xá xị cho gỗ tốt, có vân đẹp, khi khơ ít bị nứt nẻ hay
biến dạng, không bị mối mọt, chịu nước, dễ gia công chế biến. Quả được dùng
chữa cảm, sốt, lỵ, ho gà. Tinh dầu Xá xị được sử dụng rộng rãi trong cơng nghệ
hố mỹ phẩm, thực phẩm và dược phẩm. Tinh dầu cịn được dùng làm thuốc xoa
bóp, chữa thấp khớp, đau nhức. Lá dùng làm thuốc cầm máu, chữa đau dạ dày,
phong thấp, mẩn ngứa ngoài da.
Tinh dầu chứa trong hầu hết các bộ phận (lá, vỏ, thân và rễ) của cây. Tinh
dầu Xá xị có giá trị thương mại rất lớn trên thị trường Quốc tế. Tình trạng khai
thác bừa bãi Xá xị để cất tinh dầu trong thời gian qua ở nước ta làm cho loài cây
này đang đứng trước nguy cơ tuyệt chủng. Hiện nay, Xá xị được xếp trong nhóm
IIA thuộc Nghị định 06/2019/NĐ-CP của Chính phủ năm 2019, nhóm CR cực
kỳ nguy cấp trong Sách Đỏ Việt Nam năm 2007. Đồng thời với việc bảo tồn,
cần nghiên cứu thử nghiệm gieo trồng và đưa loài Xá xị vào đối tượng gây trồng

trong các chương trình trồng rừng ở nước ta.
Với mu ̣c đích xác đinh
̣ chính xác loài Xá xi ̣ và nghiên cứu tiń h đa hiǹ h di
truyề n của loài này phu ̣c vu ̣ cho công tác bảo tồ n và phát triể n nguồ n gen, em
thực hiê ̣n đề tài “Nghiên cứu giám đinh
̣ và phân tích đa da ̣ng di truyề n loài
Xá xi ̣ ( Cinnamomum parthenoxylon ( Jack) Meisn) ta ̣i vườn quố c gia Tam
Đảo bằ ng phương pháp DNA mã va ̣ch”.

1


CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Giới thiêụ chung về cây Xá xi ̣
Xá Xị có tên khoa học: Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn.
Tên đồng nghĩa: Laurus parthenoxylon Jack, 1820; Laurus porrecte Roxb.
1832; Sassafras parthenoxylon (Jack) Nees, 1836; Cinnamomum simondii
Lecomte, 1913; Cinnamomum porrectum (Roxb.) Kosterm. 1952.
Tên khác: Co chấu, Re dầu, Re hương.
1.1.1 Đặc điểm hình thái của cây Xá xi ̣
Cây gỗ, kích thước trung bình hoặc lớn; thân hình trụ thẳng, cao 20-25m,
đường kính thân (40-70) cm; rụng lá nhiều hay ít; gốc cây phình to và đơi khi có
bạnh gốc. Vỏ ngồi màu nâu, nâu xám đến xám đậm, thường nứt dọc và bong ra
từng mảng; thịt vỏ có màu nâu đỏ nhạt. Cành non trịn, thơ, có cạnh, màu lục
xám. Lá đơn nguyên, mọc cách; phiến lá hình trứng hay hình bầu dục thn;
kích thước 5-15 x 2,5-8cm; đầu có mũi nhọn, ngắn; gốc hình nêm hay nêm rộng;
hai mặt nhẵn; gân bên 3-8 đôi; cuống lá dài 1,2-3cm. Cụm hoa dạng chuỳ hay
tán; mọc ở đầu cành hay nách lá; mỗi cụm mang khoảng 10 hoa. Hoa lưỡng tính;
bao hoa 6 thuỳ, màu trắng vàng; nhị 9, bao phấn 4 ơ, chỉ nhị có lơng, 3 nhị vịng

trong có 2 tuyến mật; nhị lép 3. Quả mọng, hình cầu, đường kính 0,6-1cm; đế
hình chén, có khía răng, khi chín màu xanh vàng hoặc tím đen[1].

(Phùng Văn Phê, 2019)

Hình 1.1: Cành mang hoa và quả cây Xá xị ở Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc
2


Hình 1.2: Cây Xá Xị
1.1.2 Đặc điểm sinh học và sinh thái của cây Xá xi ̣
Mùa hoa tháng 3-6, mùa quả tháng 6-10. Mọc trong rừng rậm nhiệt đới
thường xanh, ẩm trên núi đất hay núi đá vôi, ở độ cao 500-1.000m thậm chí đến
3.000m. Cây ưa tầng đất mặt sâu, dày, tơi xốp, nhiều mùn và thoát nước. Khi
cịn non ưa ẩm và chịu bóng, nhưng cây trưởng thành lại ưa sáng. Sinh trưởng
tốt trong các loại hình rừng có mật độ cây trung bình. Tái sinh chồi khỏe[1],[5].
 Giá trị nguồn gen và tình trạng bảo tồn
Nguồn gen hiếm Xá xị là loài cây đa tác dụng và có phân bố ở một số tỉnh
phía Bắc và Bắc Trung bộ Việt Nam như Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh,
Bắc Kạn, Tuyên Quang, tỉnh Vĩnh Phúc, Thái Nguyên, Thanh Hóa, Nghệ An,
Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên-Huế, Quảng Nam, Lâm Đồng,
Đồng Nai, Bình Phước, Bình Thuận. Ngoài giá trị cho gỗ dùng trong xây dựng,
3


làm tà vẹt và đóng đồ, các bộ phận của cây cịn được chưng cất tinh dầu dùng
trong cơng nghiệp và y dược. Xá xị cho gỗ tốt, có vân đẹp, khi khơ ít bị nứt nẻ
hay biến dạng, khơng bị mối mọt, chịu nước, dễ gia công chế biến. Lá dùng làm
thuốc cầm máu, chữa đau dạ dày, phong thấp, mẩn ngứa ngoài da. Quả được
dùng chữa cảm, sốt, lỵ, ho gà.

Tinh dầu Xá xị được sử dụng rộng rãi trong cơng nghệ hố mỹ phẩm, thực
phẩm và dược phẩm. Tinh dầu cịn được dùng làm thuốc xoa bóp, chữa thấp
khớp, đau nhức. Tinh dầu chứa trong hầu hết các bộ phận (lá, vỏ, thân và rễ) của
cây. Tuy nhiên, hàm lượng tinh dầu được xác định chủ yếu là từ lá. Tinh dầu Xá
xị có giá trị thương mại rất lớn trên thị trường Quốc tế [5],[6].
Là loài cây quý, hiếm và có giá trị lại cộng thêm khả năng tái sinh tự nhiên
kém cùng với đó là tình trạng khai thác bừa bãi Xá xị để cất tinh dầu trong thời
gian qua ở nước ta làm cho loài cây này đang đứng trước nguy cơ tuyệt chủng.
Loài có khu phân bố chia cắt, bị khai thác rất nghiêm trọng, hiện nay cịn tìm
thấy rất ít cây trưởng thành. Xá xị được xếp trong nhóm IIA thuộc Nghị định
32/2006/NĐ-CP của Chính phủ năm 2006, nhóm cực kỳ nguy cấp CR A1a,c,d
trong Sách Đỏ Việt Nam năm 2007. Do vậy, bảo tồn nguồn gen Xá xị là việc
làm hết sức cấp thiết. Tuy nhiên, để công tác bảo tồn có hiệu quả, cần phối hợp
đồng bộ cả biện pháp bảo tồn ngoại vi và bảo tồn nội vi. Trong đó giải pháp tối
ưu và thiết thục nhất đó là nghiên cứu phát triển cùng với các chương trình trồng
rừng [1],[6]
Nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái của các lồi thuộc họ Long não nói
chung và chi Long não nói riêng cho tới nay đã có nhiều cơng trình. Điển hình
như “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh vật học loài Vù hương (Cinnamomum
balansae Lecomte) làm cơ sở cho công tác bảo tồn tại rừng đặc dụng Yên Tử Quảng Ninh” (Phùng Văn Phê, năm 2007).
Trong đềình tự gen matK tương đồng với trình tự gen
rbcL của mẫu VP01 trên ngân hàng gen NCBI
STT Tên lồi

Kí hiệu

Tỉ lệ tương đồng

1

Cinnamomum parthenoxylon

KX546848.1

100%

2

Cinnamomum burmannii

KX546826.1

99.81%

3

Cinnamomum aromaticum

KP094936.1

99.81%

4

Cinnamomum dubium

MK243402.1

99.62%

5

Cinnamomum heyneanum

KY945255.1

99.62%

6

Cinnamomum malabatrum

KY945245.1

99.62%

Nhìn vào bảng 3.2 ta có thể thấy trình tự gen rbcL của mẫu VP01 tương
đồng 100% với lồi Cinnamomum parthenoxylon (KX546848.1) và có mức độ
sai khác nhỏ so với hai loài Cinnamomum burmannii (KX546826.1);
Cinnamomum aromaticum ( KP094936.1) là 0.19%. Cịn với lồi Cinnamomum
dubium
(MK243402.1),
Cinnamomum
heyneanum
(KY945255.1);
Cinnamomum malabatrum (KY945245.1) là 0.38%.%. Sự sai khác về trình tự
đoa ̣n gen rbcL của mẫu VP01 và 06 loài tương đồ ng trên ngân hàng gen đươ ̣c
thể hiê ̣n trên hin
̀ h 3.8.

36


Hình 3.7: So sánh trình tự nucleotide của mẫu VP01 với 06 trình tự
tương đồ ng trên ngân hàng gen
C.par: Cinnamomum parthenoxylon; C.bur: Cinnamomum burmannii; C.aro: Cinnamomum
aromaticum; C.dub: Cinnamomum dubium; C.hey: Cinnamomum heyneanum; C.mal:
Cinnamomum malabatrum

Kế t quả so sánh trình tự đoa ̣n gen rbcL cho thấ y sự tương đờ ng 100% của
mẫu VP01 với loài Cinnamomum parthenoxylon. Cịn với các lồi khác có sự sai
khác ở các vị trí được thể hiện trong bảng 3.3.

37


Bảng 3.2: Các vị trí sai khác dùng để phân loại đoạn gen rbcL
Vị trí

Lồi

38

45

46

261

VP01

A

G

A

T

Cinnamomum parthenoxylon

A

G

A

T

Cinnamomum burmannii

C

G

A

T

Cinnamomum aromaticum

A

G

A

C

Cinnamomum dubium

A

A

G

T

Cinnamomum heyneanum

A

A

G

T

Cinnamomum malabatrum

A

A

G

T

Bảng 3.3 cho thấy mẫu VP01 và 05 loài C. parthenoxylon, C. aromaticum,
C. dubium,C. heyneanum, C. malabatrum ở vị trí 38 đều là nucleotide loại A chỉ
có lồi C. burmannii là nucleotide loại C. Ở vị trí 45 và 46 của mẫu VP01 và 03
loài C. parthenoxylon, C. burmannii, C. aromaticum lần lượt là nucleotide loại
G và nucleotide loại A. Cịn 03 lồi C. dubium,C. heyneanum,C. malabatrum ở
vị trí 45,46 lần lượt là nucleotide loại A và nucleotide loại G. Vị trí 261 ở mẫu
VP01 và 05 lồi C. parthenoxylon, C. burmannii, C. dubium,C. heyneanum, C.
malabatrum đều là nucleotide loại T, loài C. aromaticum là nucleotide loại C.
Qua phân tích sự khác nhau ta ̣i các vi ̣ trí nucleotide cho thấ y mẫu VP01 và loài
C. parthenoxylon có trin
̀ h tự tương đồ ng 100%, loài C. Burmannii và C.
aromaticum có mức đô ̣ tương đồ ng rấ t cao (chỉ khác 1 nucleotide), còn ba loài
C. dubium,C. heyneanum và C. malabatrum tương đồ ng 100%. Mố i quan hê ̣ di
truyề n của các loài này dựa trên trình tự đoa ̣n gen rbcL phản ánh rõ ràng hơn về
sự tương đồ ng trên và đươ ̣c thể hiê ̣n ở hình 3.9.

38


Hình 3.8: Cây quan hê ̣ di truyền giữa mẫu VP01 và 06 loài trên ngân
hàng gen dựa trên trình tự đoa ̣n gen rbcL

Dựa vào hình 3.9 ta thấy cây quan hệ di truyền được chia thành 02 nhóm
chính. Nhóm thứ nhất gồm 03 lồi Cinnamomum dubium, Cinnamomum
heyneanum, Cinnamomum malabatrum, có trình tự gen tương đồng nhau,
khơng có sự sai khác ở các vị trí trong trình tự gen. Nhóm thứ hai gồm 04 loài,
trong đó mẫu VP01 và lồi Cinnamomum parthenoxylon có trình tự gen giống
nhau nên khoảng cách di truyề n bằ ng 0, đồ ng thời có sai khác với 2 loài còn la ̣i
trong nhóm là Cinnamomum burmannii và Cinnamomum aromaticum. Tuy
nhiên, vì các loài trên đề u thuô ̣c chi Cinnamomum nên có quan hê ̣ di truyề n rấ t
gầ n nhau thể hiêṇ ở chỉ số khoảng cách di truyề n rấ t thấ p.
Như vậy, đoa ̣n trình tự mã va ̣ch rbcL có khả năng giám đinh
̣ loài Xá xi.̣
Tuy nhiên, đoa ̣n trình tự này không thể hiêṇ sự đa da ̣ng di truyề n giữa các cá thể
trong cùng xuấ t xứ
3.3.3. Kết quả phân tích và so sánh trình tự đoa ̣n gen trnH-psbA
Thực tế khi nhân bản đoa ̣n gen trnH-psbA chúng tôi thu được sản phẩ m
PCR có kích thước trên 400 bp. Nhưng khi phân tích trình tự đoa ̣n gen bằng
phầ n mề m BioEdit, chúng tôi nhâ ̣n thấ y đoạn gen trnH-psbA với kích thước
374bp có chất lượng rất tốt. Vì vậy, chúng tôi sử dụng đoa ̣n trình tự có kích
thước 374bp của đoạn gen trnH-psbA để phân tích, so sánh. Kế t quả so sánh 07
trình tự đoa ̣n gen trnH-psbA của 07 mẫu Xá xi ̣ VP01, VP02, VP03, VP05,
VP06, VP07, VP12 được thể hiện trên hình 3.10.

39


Hình 3.9: So sánh trình tự nucleotide của đoa ̣n gen trnH-psbA ở 07 mẫu Xá xi ̣

Từ hình 3.10 ta thấy trình tự đoa ̣n gen trnH-psbA của 7 mẫu Xá xi ̣có sự sai
khác ta ̣i 8 vi ̣trí nucleotide. Ta ̣i các vi ̣trí sai khác có thể nhâ ̣n thấ y mẫu VP06 và
VP07 có trình tự tương đồ ng nhau 100%, còn các mẫu khác có sự sai khác mô ̣t

cách ngẫu nhiên. Đây có thể là do quá trình đô ̣t biế n điể m diễn ra mô ̣t cách ngẫu
nhiên trong quầ n thể . Các nucleotide sai khác ở từng mẫu đươ ̣c thố ng kê trong
bảng 3.4.

40


Bảng 3.3: Các vị trí sai khác của 07 mẫu nghiên cứu ở Tam Đảo, tỉnh Vĩnh
Phúc

Vị trí

133

175

207

265

300

314

339

351

VP01

A

A

A

A

C

G

G

G

VP02

A

A

G

A

A

T

G

T

VP03

G

G

G

A

A

G

A

T

VP05

A

A

G

G

A

G

A

T

VP06

A

A

G

G

A

T

A

T

VP07

A

A

G

G

A

T

A

T

VP12

G

G

G

G

A

T

G

T

Sau khi có kết quả so sánh các trình tự nucleotide của 07 mẫu Xá xị tại
Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc với nhau để thấy rõ hơn về sự đa hình của các mẫu
Xá xị, chúng tôi đã sử dụng công cụ BLAST để tìm kiếm các lồi có trình tự
tương đồng trên ngân hàng gen quốc tế NCBI từ đó có thể xác định được sự đa
hình cũng như quan hệ di truyền giữa các loài với 07 mẫu Xá xị tại Tam Đảo.
Do tấ t cả 07 mẫu Xá xi ̣ ta ̣i Tam Đảo đề u có trình tự nucleotide khác nhau
nên chúng tôi thực hiê ̣n viê ̣c so sánh từng triǹ h tự của từng mẫu với các triǹ h tự
tương đồ ng trên ngân hàng gen quố c tế . Từ kết quả so sánh và tìm tiếm riêng lẻ
của 07 mẫu Xá xi,̣ chúng tôi lựa cho ̣n ra 07 lồi có trình tự đoa ̣n gen trnH-psbA
tương đồng cao với cả 07 mẫu Xá xi nghiên
cứu như đươ ̣c thống kê ở bảng 3.5.
̣

41


Bảng 3.4: Mợt số lồi có trình tự gen trnH-psbA tương đồng với trình tự gen
trnH-psbA của 07 mẫu Xá xị trên ngân hàng gen NCBI
Mẫu

VP01

VP02

VP03

VP05

VP06

VP07

VP12

Loài

Cinnamomum
parthenoxylon

97.49% 98.61% 98.61% 98.33% 98.61% 98.61% 99.44%

Cinnamomum
camphora

97.59% 98.86% 98.66% 98.40% 98.66% 98.66% 99.47%

Cinnamomum
burmannii

96.80% 97.87% 97.60% 97.60% 97.87% 97.87% 98.40%

Cinnamomum
tamala

96.53% 97.60% 97.33% 97.33% 97.60% 97.60% 98.13%

Cinnamomum
chekiangense

96.54% 97.61% 97.34% 97.34% 97.61% 97.61% 98.14%

Cinnamomum
bodinieri

96.53% 97.60% 97.60% 97.33% 97.60% 97.60% 98.40%

Cinnamomum
97.49% 98.61% 98.61% 98.33% 98.61% 98.61% 99.44%
longpipaniculatum

Từ kế t quả so sánh và cho ̣n lựa trình tự đó, chúng tôi xây dựng được cây
quan hê ̣ di truyền giữa 07 mẫu Xá xi ̣ nghiên cứu và 07 lồi tương đờ ng trên
NCBI dựa trên trình tự đoa ̣n gen trnH-psbA và kế t quả được thể hiện trên hình
3.11.

42


Hình 3.11: Cây qua hệ di truyền giữa 07 mẫu nghiên cứu và 07 loài trên NCBI

43


Dựa vào hình 3.11 ta thấy cây quan hệ di truyền được chia làm hai nhóm
chính. Nhóm thứ nhất gồm 07 mẫu nghiên cứu VP01, VP02, VP03, VP05,
VP06, VP07, VP12 với đô ̣ tin câ ̣y cao (boostrap 98%). Các mẫu Xá xị khơng có

sự sai khác nhiều về trình tự nucleotide do chúng có cùng xuất xứ. Nhóm thứ hai
gồm 07 loài trên ngân hàng gen Cinnamomum parthenoxylon, Cinnamomum
camphora, Cinnamomum burmannii, Cinnamomum tamala Cinnamomum
chekiangense, Cinnamomum bodinieri, Cinnamomum longpipaniculatum với giá
tri ̣ boostrap là 97%, các loài này đều thuộc chi Long não và khơng có sự sai
khác nhiều về trình tự nucleotide.
Như vậy, đoa ̣n trình tự mã va ̣ch trnH-psbA có khả năng giám đinh
̣ loài Xá
xi ̣ không hiêụ quả bằ ng hai trình tự matK và rbcL. Tuy nhiên, đoa ̣n trình tự mã
va ̣ch này la ̣i có hiêụ quả trong sự đánh giá đa da ̣ng di truyề n giữa các cá thể
trong cùng x́ t xứ, có khả năng giám định dưới lồi tốt. Kế t quả này cũng
tương tự như kế t quả của dự án “Xây dựng bô ̣ cơ sở dữ liêụ DNA mã va ̣ch phu ̣c
vu ̣ công tác quản lý giố ng cây lâm nghiêp̣ đã đươ ̣c công nhân là giố ng Quố c gia”
do PGS. TS. Hà Vă Huân chủ nhiê ̣m đã khẳ ng đinh
̣ đoa ̣n triǹ h tự trnH-psbA là
triǹ h tự hiêụ quả nhấ t trong nghiên cứu đa da ̣ng di truyề n ở mức dưới loài.

44


CHƯƠNG 4
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1.

Kết luâ ̣n

- Tách chiế t thành công DNA tổ ng số từ 07 mẫu lá Xá xi ̣ sử du ̣ng bô ̣ kit
tách chiế t DNA thực vâ ̣t của hañ g Qiagen. Hàm lươ ̣ng DNA tổ ng số không cao
nhưng đủ tiêu chuẩ n để thực hiêṇ phản ứng PCR.
- Nhân bản thành công 03 đoa ̣n trình tự DNA mã va ̣ch là matK, rbcL, trnHpsbA ở 07 mẫu Xá xi co

̣ ́ xuấ t xứ ta ̣i vườn quốc gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc.
- Giải trình tự nucleotide của các đoa ̣n triǹ h tự DNA mã va ̣ch ở 07 mẫu Xá
xi phu
̣
̣c vu ̣ đăng ký bản quyề n trên ngân hàng gen quố c tế .
- Giám đinh
̣ đươ ̣c loài Xá xi ̣ có xuấ t xứ ta ̣i tỉnh Vĩnh Phúc sử du ̣ng các
triǹ h tự DNA mã va ̣ch matK, rbcL, trnH-psbA. Trong đó, đoa ̣n trình tự matK,
rbcL có hiê ̣u quả giám đinh
̣ loài hiê ̣u quả nhấ t so với đoa ̣n trình tự DNA mã
va ̣ch còn la ̣i.
- Xác đinh
̣ đươ ̣c sự đa da ̣ng di truyề n của các cá thể Xá xi ̣ trong quầ n thể
Xá xi ̣ta ̣i vườn quố c gia Tam Đảo sử du ̣ng chỉ thi ̣DNA mã va ̣ch trnH-psbA.
4.2.

Kiến nghi ̣

Do thời gian thực hiêṇ đề tài bi ̣ ha ̣n chế nên chưa nghiên cứu đươ ̣c nhiề u
mẫu Xá xi ̣ ta ̣i vườn quố c gia Tam Đảo, tỉnh Viñ h Phúc. Cầ n tiế p tu ̣c phân tích
thêm các mẫu ta ̣i xuấ t xứ trên để khẳ ng đinh
̣ về sự đa da ̣ng di truyề n giữa các cá
thể trong cùng mô ̣t xuấ t xứ và giữa các xuấ t xứ với nhau. Từ đó có cơ sở khoa
ho ̣c cho sự bảo tồ n và phát triể n nguồ n gen Xá xi ̣ta ̣i miề n Bắ c, Viê ̣t Nam.

45


TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1. Bộ Khoa học và Công nghệ (2007), sách Đỏ Việt Nam (phần thực vật), Nxb
Khoa học tự nhiên & Công nghệ, Hà Nội
2. Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2008), “Cơ sở di truyền học phân tử và tế
bào”, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội.
3. Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi (2004), Kỹ thuật di truyền và ứng dụng,
NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội.
4. Nguyễn Đức Lượng (2002), Công nghệ gen. NXB Đại học Quốc Gia TP Hồ
Chí Minh.
5. Nguyễn Tiến Bân (chủ biên) - Danh lục các loài thực vật Việt Nam, Tập II,
Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, 2003.
6. Phạm Hoàng Hộ - Cây cỏ Việt Nam, Quyển 1, Nhà xuất bản Trẻ, Tp. Hồ Chí
Minh, 1999
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
7. Chase M. W., Nicolas S., Mike W., James M. D., Rao P. K., Nadia H., DNA
Vincent S. (2005), “LDNA plants DNA DNA mã vạchs: short-term DNA
long-term goals”, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 360 (1462), pp.
1889-1895.
8. Kress W. J., Erickson D. L. (2008), “DNA barcodes: Gens, genomics, DNA
bioinformatics”, Proc Natl Acad Sci U S A, 105(8), pp. 2761-2762.
9. Richards, P.W. 1996. The Tropical rain forest (2nd edition). Cambride,
University Press.
10. Taberlet P., Eric C., Franỗois P., Ludovic G., Christian M., Alice V.,
Thierry V., Gérard C., Christian B., DNA Eske W. (2007),” Power DNA
limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA
barcoding”, Nucleic Acids Res, 35(3), pp14.
11. Van DeWiel C. C. M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J. L.,
Duistermaat C. H., Smulders (2009), “DNA barcoding discriminates
the noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle

ranunculoides L.f.), from non-invasive relatives”, Molecular Ecology
Resources(9), pp.1086-1091.
12. Vijayan K. DNA Tsou C. H. (2010), “DNA barcoding in plants: taxonomy
in a new perspective”, Current science, vol. 99, pp. 1530 –
13. Vijayan K. DNA Tsou C. H. (2010), “DNA barcoding in plants: taxonomy
in a new perspective”, Current science, vol. 99, pp. 1530 - 1540.
14. Wu Zhengyi DNA Piter H. Reven (Co-chairs of the Editorial Committee),
1994-2010. Flora of China. Volume 1-25, Science Press (Beijing) DNA
Missouri Botanical Garden Press (St. Louis).
15. Yao H., Song J., Liu C., Luo K., Han J. (2010), “Use of ITS2 region as
theuniversal DNA barcode for plants DNA animals”, PLoS ONE (5),
pp.13102.
16. Yong H. L., Jinlan R., Shilin C., Jingyuan S., Kun L., Dong L. DNA Hui Y.
(18 December, 2010) “Authentication of Taxillus chinensis using DNA
barcoding technique”, Journal of Medicinal Plants Research Vol. 4(24),
pp. 2706-2709.
WEBSITE
17. />18. />19. />D8763_9_L%C3%AA%20Th%E1%BB%8B%20H%E1%BB%93ng%20
Nhung-S152573%20_%20CHUONG%202.pdf