Phân lập và xác định cấu trúc các chất từ cao chiết điclometan vỏ loài Đỉnh Tùng (Cephalotaxus manii) thu hái tại tỉnh Lâm Đồng, Việt Nam

75

TẠP CHÍ KHOA HỌC  SỐ 2/2016

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC CHẤT
TỪ CAO CHIẾT ĐICLOMETAN VỎ LOÀI ĐỈNH TÙNG

(CEPHALOTAXUS MANII ) THU HÁI TẠI TỈNH
LÂM ĐỒNG, VIỆT NAM
Nguyễn Thị Liễu1(1), Nguyễn Thị Lưu2, Trần Văn Lộc2, Đinh Thị Phịng3, Trần Văn Sung2
1
Trường Đại học Thủ đơ Hà Nội
2
Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam
3
Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam
Tóm tắt: Từ 2 g cao chiết điclometan của dịch chiết tổng methanol bộ phận vỏ loài Đỉnh
Tùng (Cephalotaxus Manii) đã phân lập được hai hợp chất sạch là epicatechin và
epigallocatechin bằng phương pháp sắc kí cột. Cấu trúc của chúng đã được làm sáng tỏ
bằng phương pháp phổ H1NMR, C13NMR và MS kết hợp với tra cứu dữ liệu chuẩn.
Từ khóa: flavonoid, flavan-3-ol, Đỉnh Tùng, cấu trúc catechin.

1.

MỞ ĐẦU

Đặc điểm hình thái loài Đỉnh Tùng (Cephalotaxus Manii) thuộc loại cây gỗ nhỡ, cây
trưởng thành cao khoảng từ 10 - 15 m. Thân trịn, vỏ trơn nhẵn, vỏ non có mầu đỏ, vỏ già
bong thành mảng màu trắng. Cành mảnh, mọc đối và xịe ngang. Lá mọc xoắn ốc, xếp
thành 2 dãy, hình dải, dài 2 - 4cm, rộng 0,2 - 0,4cm, thẳng hay hơi cong ở gần đầu, ở mặt
dưới có 2 dải lỗ khi màu trăng trắng. Đỉnh Tùng phân bố rải rác trên các sườn và đỉnh núi

đất và núi đá vôi với đội cao từ 600 - 1400 m. Kết quả nghiên cứu cũng kết luận Đỉnh
Tùng tái sinh tự nhiên bằng hạt rất tốt. Đặc điểm phân bố và giá trị bảo tồn trên thế giới
Đỉnh Tùng có phân bố từ Đông Bắc Ấn Độ, Lào, Bắc Myanma, Bắc Thái Lan tới Nam
Trung Quốc. Tại Việt Nam, loài này được ghi nhận có ở Lào Cai, Hà Giang, Sơn La, Cao
Bằng, Hịa Bình, Hà Nội (Ba Vì), Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Kon Tum, Gia Lai, Lâm
Đồng và Thanh Hóa [1].

(1)

Nhận bài ngày 18.01.2016 gửi phản biện và duyệt đăng ngày 25.01.2016.
Liên hệ tác giả: Nguyễn Thị Liễu; Email:


76

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ ĐÔ HÀ NỘI

Ở Việt Nam, một loài thuộc chi Cephalotaxus là Đỉnh Tùng ( tên khác là phỉ lược bí )
có tên khoa học Cephalotaxus mannii Hook.f, từ xưa hạt Đỉnh Tùng được ép dầu dùng chế
sơn, nến, dầu hóa cứng hoặc hạt dùng làm thuốc có tác dụng nhuận phế, cầm ho, tiêu ứ.
Lồi Đỉnh Tùng (Cephalotaxus mannii Hook.f) chủ yếu được khai thác để lấy gỗ, làm cây
cảnh hoặc làm thuốc theo kinh nghiệm dân gian.[2]
Nghiên cứu về thành phần hóa học các lồi trong chi Đỉnh Tùng trên thế giới: Loài
này đã được nghiên cứu nhiều về thành phần hóa học, cho đến nay đã có nhiều chất được
phân lập và xác định cấu trúc và nhiều chất trong đó đã được thử hoạt tính sinh học. Khi
tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học lồi Đỉnh Tùng Cephalotaxus mannii trồng ở Ấn
Độ, các nhà khoa học tách được từ dịch chiết Cloroform của thân và rễ của cây này 3 hợp
chất: Cephalomannine, Taxol và Baccatin III. Từ dịch chiết methanol của lá và thân loài
Đỉnh Tùng Cephalotaxus harringtonia var. drupacea, các nhà khoa học Nhật Bản đã phân
lập và xác định cấu trúc của 4 alkaloid là: 5’- des - O - methylharringtonine, 3’S –

hydroxyl - 5’- des - O - methylharringtonine, 5’- des - O - methylhomoharringtonine và 5’des - O - methylisoharringtonine.
Ở Việt Namhiện nay, chưa có nghiên cứu nào về thành phần hóa học lồi Đỉnh Tùng
Cephalotaxus mannii. Vì vậy, việc nghiên cứu thành phần hóa học vỏ cây Đỉnh Tùng và
xác định cấu trúc các hợp chất phân tách được là cần thiết, có ý nghĩa khoa học và thực
tiễn.
2.

NỘI DUNG

2.1. Vật liệu và phương pháp
a) Nguyên liệu thực vật
Mẫu vỏ cây Đỉnh Tùng (Cephalotaxus Manii) được thu hái tại tỉnh Lâm Đồng, Việt
Nam vào tháng 8 năm 2012. Tên của mẫu được xác định bởi Tiến sĩ Nguyễn Tiến Hiệp,
Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, VAST. Mẫu tiêu bản số CPC 4718 được lưu giữ tại
Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, VAST, Hà Nội.
b) Thiết bị, hóa chất

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi bằng máy Bruker Avance 500 [499,84
MHz (1H-) và 125 MHz (13C-); TMS (δ = 0,0); CD3OD (δ = 49,0); CDCl3 (δ = 77,0)] tại
Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

 Phổ khối ESI-MSđược đo trên máy Agilent LC-MSD-Trap SL tại Viện Hóa học,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.


TẠP CHÍ KHOA HỌC  SỐ 2/2016

77

 Hóa chất gồm điclotetan, methanol, n-hexan, silicagen, sephadex…

c) Phương pháp nghiên cứu
 Phương pháp tách và tinh chế chất
Các cao dịch chiết trong các dung môi khác nhau thu được, được tách và tinh chế bằng
phương pháp sắc kí cột kết hợp với sắc kí lớp mỏng với các hệ dung mơi thích hợp. Sắc ký
cột gồm sắc ký cột thường và sắc ký cột nhanh (flash chromatography) sử dụng silicagel.
Đối với các chất phân cực có thể sử dụng Sephadex LH–20 hoặc ngược pha RP–18. Kiểm
tra các phân đoạn và độ sạch của các chất cũng như theo dõi quá trình tách chất trên cột
bằng sắc kí lớp mỏng với hệ dung mơi thích hợp.
 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các chất
Việc xác định cấu trúc hóa học của các chất sạch được thực hiện thông qua việc kết
hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một
chiều 1D NMR như 1H–NMR, 13C–NMR. Các loại phổ được đo tại phòng cấu trúc, Viện
Hoá học – Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.
2.2. Q trình phân lập các chất sạch
Từ 2 g cao chiết dịch CH2Cl2 tiến hành sắc kí cột sephadex dung mơi 10 phân đoạn
DTV.5 hệ dung môi CH2Cl2/MeOH tỉ lệ phân cực tăng dần 100:0 → 70:30 thu được 5
phân đoạn kí hiệu DTV.5.1 đến DTV.5.5, trong đó phân đoạn 5.3 thu được 15 mg chất
sạch ở dạng rắn kí hiệu DTV3 có Rf= 0.58 hệ sắc kí bản mỏng là CH2Cl2/MeOH= 8:2.
Tiến hành sắc kí cột sefadex 85 mg phân đoạn DTV.5.2 dung mơi MeOH 100% thu được
23mg chất sạch dạng rắn kí hiệu là DTV2 có Rf= 0.46 hệ sắc kí bản mỏng là
CH2Cl2/MeOH= 8:2.
3.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Xác định cấu trúc chất DTV2


78

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ ĐÔ HÀ NỘI

Phổ

13

C-NMR của chất DTV2 có tín hiệu của 15 ngun tử cacbon với những đặc

trưng của khung flavan-3-ol gồm: 7 tín hiệu của cacbon bậc 4 ở C100.12 – 157.71ppm;
7 tín hiệu của nhóm methin trong đó có 5 tín hiệu của 5 methin nhân thơm ở C95.5- 119.4
ppm và 2 tín hiệu của 2 nhóm oxymethin (C-2, C-3) ở C68.8 ppm và 82.8 ppm; 1 tín hiệu
của nhóm metylen (C-4) ở C28.5ppm.
Trên phổ 1H-NMR có hai tín hiệu dd ở H2.75 (dd, J = 17.0,2.5 Hz, H-4ax) và H2.89
(dd,J = 16.0, 5.0 Hz, H-4eq), một tín hiệu cộng hưởng ở H4.83(b,r J = 7.5 Hz, H-2), một
multiplet ở H4.2 (H-3) và 5 proton thơm gồm: Cặp d ở H5.94 (1H) và 5.97 (1H) có cùng
hằng số tương tác (J = 2.2 Hz) cho thấy hai proton này ở vị trí meta (H-6 và H-8), như vậy
vịng A có hai nhóm thế ở C-5 và C-7. Các tín hiệu d ở H 6.79 (d ,J = 8,1 Hz; H-5’), d ở 
(d, J = 2 Hz; H-2’) và dd ở H 6.81 (dd, J = 8.0; 2.0 Hz, H-6’) cho thấy vịng B có
hai nhóm thế ở C-3’ và C-4’.
H6.86

Kết hợp số liệu phổ 1H-NMR, DEPT, 13C-NMR (bảng 1 và2) và pic ion m/z 291
[M+H]+ ở phổ ESI-MS đã xác định được công thức phân tử của chất DTV2 là C 15H14O6.

Qua phân tích các dữ kiện phổ và so sánh với số liệu đã công bố [5,7], cấu trúc của
chất DTV2 được xác định là epicatechin.
3.2. Xác định cấu trúc chất DTV3


79

TẠP CHÍ KHOA HỌC  SỐ 2/2016

Dữ liệu phổ 13C-NMR bao gồm qua tín hiệu của 15 nguyên tử cacbon: tín hiệu của 6
cacbon bậc 4 ở δC116- δC158ppm; 6 tín hiệu của nhóm methin (CH), trong đó có 4 nhóm
methin nhân thơm ở δC95.52 – 120.04 ppm và tín hiệu của 2 nhóm oxymethin (C-2, C-3)
ở δC 68,77 (C-2) và 82.79 ppm (C-3); 1 tín hiệu của nhóm metylen ở δC 28.45 ppm (C-4).
Phổ 1H-NMR của hợp chất DTV3 có tín hiệu cộng hưởng ở δH 2,68 ppm (dd, J=16.1;
8.1 Hz, H-4ax) và 2,87 ppm (dd, J=16.1, 5.4 Hz, H-4eq), một doublet ở δH 4.60 ppm (d,
J=7.5 Hz, H-2) và tín hiệu ở δH 4.0 ppm (J=7.5, H-3). Phía trường thấp có một tín hiệu
doublet của hai proton thơm ở H 6.81( d,1.9 Hz) gợi ý cho thấy hai proton này đối xứng
với nhau. Ở vị trí meta trong vòng thơm như vậy, vòng B bị thế ở C-1’ và C-3’, C-4’, C-5’.
Tín hiệu doublet (d) ở H5.89 và 5.95 (mỗi tín hiệu 1H) có cùng hằng số tương tác (J = 2.3
Hz) chứng tỏ hai proton này ở vị trí meta với nhau (H-6 và H-8). Như vậy, vịng A phải có
hai nhóm thế ở C-5 và C-7.
Kết hợp số liệu phổ 1H-NMR, DEPT, 13C-NMR (bảng 1 và2) và pic ion m/z 307
[M+H]+ ở phổ ESI-MS đã xác định được công thức phân tử của chất DTV3 là C15H14O7.
Các dữ liệu phổ 1HNMR và 13C-NMR hoàn toàn phù hợp với những đặc trưng của khung
flavan-3-ol. Qua phân tích các dữ kiện phổ và so sánh với số liệu đã công bố [7,8 ], cấu
trúc của chất DTV3 được xác định là: 3,3’,4',5’,5,7-hexahydroxyflavan (epigallocatechin,
hay teacatechin II).
Bảng 1: Số liệu phổ1HNMR của chất DTV2 và DTV3[500 MHz, CD3OD, H (ppm)]
Vị trí
H

Chất DTV2

Epicatechin

Chất DTV3

Epigallocatechin

H-2

4.83 br,s

4.75 br,s

4.60 br,s (7.5)

4,62 br, s


80

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ ĐÔ HÀ NỘI

H-3
H-4

4.20 m

4.20 br s

4.00 m (7.5)

4,20 m

2.75 dd (17.0, 2.5) 2.75 dd (16.7, 2.9)

2.68 dd (16.1,8.1)

2,76 dd (17, 3)

2.89 dda (16.0,5.0) 2.86 dd (16.7, 4.6)

2.87 dd (16.1,5.4)

2,89 dd (17, 5)

H-6

5.94 d (2.2)

5.93 d (2.3)

5.88 d (2.3)

5,93 d (2)

H-8

5.97 d (2.2)

5.96 d (2.3)

5.96 d (2.3)

5,96 d (2)

H-2'

7.00 d (1.5)

6.99 d (1.9)

6.81 d (1.9)

6,80 d (2.1)

H-5'

6.78 da (8.1)

6.78 d (8.1)

-

-

H-6'

6.81 dd (8.0, 2.0)

6.82 dd (8.1, 1.8)

6.81 d( 1.9)

6.80 d (2.1)

a)

Tín hiệu có cường độ lớn hơn;

Bảng 2: Số liệu phổ
(ppm]

b)

Tín hiệu có cường độ nhỏ hơn

CNMR của chất DTV2 và DTV3 [3,4] [125 MHz, CD3OD, C

13

Vị trí C

Chất DTV2

Epicatechin[3]

Chất DTV3

Epigallocatechin
[4]

2

79.8

79.89

68.77

79.9

3

67.5

67.49

82.79

67.5

4

28.5

29.24

28.45

29.4

5

157.4

157.37

156.87

157.9

6

95,5

95.93

95.52

95.9

7

157.71

157.62

157.52

158.0

8

96.4

96.45

96.31

96.5

9

157.67

157.67

157.77

157.7


81

TẠP CHÍ KHOA HỌC  SỐ 2/2016

10

100.12

100.12

100.83

100.7

1'

132.29

132.29

132.19

131.6

2'

115.35

115.35

115.25

115.8

3'

146.1

145.95

146.19

129.2

4'

145.9

145.79

146.17

157.4

5'

115.9

115.94

116.10

129.2

6'

119.4

119.43

120.04

115.8

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, Nxb Trẻ TP Hồ Chí Minh.

2.

/>
3.

Fajun Yang, Helieh S. OZ, Shirish Barve, Willem J. S. De Villiers, Craig and Gary W. Varilex
(2001), Mol. Pharmacol. 60, pp.528-533.

4.

Dang Ngoc Dung, Pham Thien Ngoc, Nguyen Thi Ha (2002), Tạp chí Nghiên cứu Y học 18
(2), tr.36-39.

5.

Takashi Tanaka, Chie Mine and Isao Kouno (2002), Tetrahedron 58, pp.8851-8856.

6.

Gen-Ichiro Nonaka, Osamu Kaahara, Itsuo Nishioka (1983), A new class of dimeric flavan-3ol gallates, theasinensins A, B and proanthocyanidin gallates from green tea leaf. Chem.
Pharm. Bull. 31 (11), pp.3905-3914. (pho C EC).

7.

Trinh Thi Thuy, Pham Thi Ninh, Nguyen Huy Cuong, Tran Van Sung (2008), “Catechin và
epicatechin từ cây Dây săng máu (Celastrus paniculatus Willd.)”, Tạp chí Dược liệu (Journal
of Materia Medica-Hanoi), 13 (3), tr.108-110.

8.

Tran Van Sung, Trinh Thi Thuy, Le Thi Hong Nhung, Ngo Van Quang, Nguyen Thi Ha, Bui
Thi Thu Huong ( 2007), “Separation, purification and structure determination of (-) epigallocatechin-3-gallat from the leaves of Camilla sinesis.” Tạp chí Khoa học và Công nghệ
(Journal of Science and Technology), 45 (1B), tr.450-455.


82

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ ĐÔ HÀ NỘI

ISOLATED AND DETERMINE STRUCTURE OF SUBSTANCES FROM
DICLOROMETHANE EXTRACTS OF BARKSCEPHALOTAXUS MANII
SPECIES IN LAM DONG PROVINCE, VIETNAM

Abstract: From 2g Dichloromethane extracts of total methanol extract barks of
Cephalotaxus Manii, two compounds epicatechin and epigallocatechin have been
isolated by chromatography method. Their structures were elucidated by spectroscopic
methods H1NMR, 13CNMR and MS and combined with the standard data.
Keywords: flavonoid, flavan-3-ol, Cephalotaxus Manii, catechin structure.