Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của lợn mắc viêm phổi do actinobacillus pleuropneumoniae, pasteurella multocida, streptococcus suis và sử dụng vacxin

H C VI N NỌNG NGHI P VI T NAM
¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯

ĐỖ T T Đ T

NGHIÊN CỨU M T SỐ ĐẶC ĐIỂM B NH LÝ CỦA LỢN M C
VIÊM PHỔI DO ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE,
PASTEURELLA MULTOCIDA, STREPTOCOCCUS SUIS VÀ
SỬ DỤNG VACXIN PHọNG B NH

Chuyên ng̀nh: B nh lý h c v̀ chữa b nh v t ni
M̃ ś:

9 64 01 02

TĨM T T LU N ÁN TIẾN SĨ

NHÀ XUẤT BẢN H C VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2021

1


Cơng trình hòn th̀nh t i:
H C VI N NỌNG NGHI P VI T NAM

Người hướng d n: 1. PGS.TS. Nguy n Bá Hiên
2. PGS.TS. Cù Hữu Phú

Ph n bi n 1: GS.TS Nguy n Quang Tuyên
Trường Đ i h c Nông Lâm, Đ i h c Thái Nguyên

Ph n bi n 2: PGS.TS Ph m Ng c Th ch
H c viên Nông nghi p Vi t Nam

Ph n bi n 3: PGS.TS Ph m Công Ho t
B Khoa h c và Công ngh

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại:
Học viện Nơng nghiệp Việt Nam
Vào hồi

giờ, ngày

tháng

năm 2021

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Trung tâm Thông tin, Thư viện Lương Định Của,
Học viện Nông nghiệp Việt Nam

2


PH Nă1.ăM ăĐ U
1.1. TệNHăC PăTHI TăC AăĐ ăTẨI
Trong ngành cơng nghiệp chăn ni ở Việt Nam thì chăn ni lợn đóng vai trị quan
trọng. Tính đến đầu năm 2020, mặc dù ngành chăn nuôi lợn nước ta đã phải trải qua đợt
dịch tả lợn Châu Phi gây thiệt hại nặng nề, tổng số lợn trong cả nước vẫn còn khoảng 20
triệu lợn (Tổng cục Thống kê, 2020). Tuy nhiên, ngành chăn nuôi lợn vẫn luôn phải gánh

chịu nhiều thiệt hại do những bệnh truyền nhiễm khác gây ra, vì vậy việc phòng chống
bệnh nhằm giảm thiệt hại, nâng cao năng suất chăn ni ln cần được coi trọng, phịng
bệnh bằng vacxin là một trong những giải pháp quan trọng.
Trong các bệnh thường gặp trên lợn, những bệnh về đường hơ hấp được xếp vào
nhóm bệnh gây thiệt hại lớn về kinh tế. Bệnh đường hô hấp ở lợn hiện nay nguyên nhân
do nhiều mầm bệnh gây ra, trong đó có cả sự kết hợp của virus và vi khuẩn gây bệnh,
khiến việc điều trị bệnh gặp khơng ít khó khăn. Trong số những vi khuẩn gây bệnh đường
hô hấp ở lợn, vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pleuropneumoniae),
Pasteurella multocida (P. multocida) và Streptococcus suis (S. suis) thường gây viêm
phổi kế phát, giết chết rất nhiều lợn ở các lứa tuổi, đặc biệt quan trọng là lợn sau cai
sữa, gây tổn thất nặng nề cho ngành chăn nuôi lợn ở nước ta (Cù Hữu Phú & cs., 2005).
Hiện nay trên thế giới đã có nhiều cơng ty khác nhau nghiên cứu chế tạo vacxin
phòng bệnh viêm phổi cho lợn do vi khuẩn gây ra, như vacxin Porcilis phòng bệnh phổi
cho lợn do vi khuẩn Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyopneumoniae), P. multocida
serotype A, D và Bordetella bronchiseptica (B. bronchiseptica) gây ra của Intervet sản
xuất, vacxin M+ PAC và vacxin Myco Shield phòng bệnh do vi khuẩn M.
hyopneumoniae gây ra của Intervet sản xuất, vacxin Bayovac SuiShot của hãng Bayer
chế tạo là vacxin vô hoạt phòng bệnh viêm phổi cho lợn trên 5 tuần tuổi đã sử dụng 2
chủng A.pleuropneumoniae serotype 2, 5 và 1 chủng P. multocida serotype D; ... vv.
Như vậy, các vacxin nhập ngoại đã và đang được sử dụng tại các trang trại chăn nuôi
lợn ở nước ta là vacxin phòng bệnh viêm phổi ở lợn được chế tạo từ chủng vi khuẩn
Actinobacillus hoặc M. hyopneumoniae, P. multocida nhưng các chủng vi khuẩn sử
dụng chế vacxin chưa hoàn toàn phù hợp với những nguyên nhân gây bệnh viêm phổi
ở lợn tại thực địa, đồng thời vacxin nhập ngoại lại có giá thành cao.
Tại Việt Nam vacxin đa giá vô hoạt có bổ trợ keo phèn phịng bệnh viêm phổi cho
lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, S. suis và P.multocida gây ra là kế thừa và phát
triển từ đề tài cấp Nhà nước kết quả nghiên cứu của Dự án SXTN đã được nghiệm thu
năm 2014 và đưa vào sản xuất của Viện Thú y. Hiện nay ở nước ta duy nhất có cơng
ty Marphavet sản xuất và được phép lưu hành vacxin đa giá vô hoạt với bổ trợ keo phèn
để phòng viêm phổi cho lợn từ 4 tuần tuổi. Vacxin được chế tạo là vacxin đa giá vô

hoạt bao gồm cả 3 loại vi khuẩn A. pleuropneumoniae, S. suis và P. multocida là nguyên
nhân chủ yếu chủ yếu gây bệnh viêm phổi ở lợn. Tuy nhiên việc sử dụng bổ trợ keo
phèn trong chế tạo vacxin vẫn có những hạn chế nhất định về hiệu lực, khả năng gây
đáp ứng và độ dài miễn dịch chưa cao.
Hiện nay tại Việt Nam chưa có vacxin viêm phổi đa giá vơ hoạt có bổ trợ nhũ
dầu phịng bệnh cho lợn được chế tạo gồm cả 3 loại vi khuẩn A. pleuropneumoniae,
P.multocida và S. suis. Vacxin đa giá có bổ trợ nhũ dầu sẽ làm tăng hiệu lực phòng
1


bệnh của vacxin, liều vacxin tiêm giảm, đặc biệt là thời gian miễn dịch của vacxin
được kéo dài hơn nhiều nhờ phức hợp nhũ kháng nguyên.
Xuất phát từ tình hình thực tiễn của sản xuất, đáp ứng được cơ sở khoa học cho
việc phòng chống bệnh viêm phổi ở lợn, việc nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của
lợn mắc viêm phổi do A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis và sử dụng vacxin
phòng chống bệnh là yêu cầu cần thiết, nhằm đưa ra các giải pháp phòng trị bệnh viêm
phổi ở lợn hiệu quả cao, giảm thiệt hại cho nghành chăn nuôi lợn.
1.2. M CăTIểUăC AăĐ ăTẨI
1.2.1. M cătiêuăchung
Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý và xây dựng giải pháp phòng chống bệnh viêm
phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis bằng vacxin đa giá vơ
hoạt có bổ trợ nhũ dầu.
1.2.2. M cătiêuăc ăth
- Xác định được đặc điểm biến đổi bệnh lý chủ yếu của lợn mắc bệnh viêm phổi do
vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra.
- Xây dựng quy trình sản xuất và quy trình sử dụng, bảo quản vacxin viêm phổi đa
giá vơ hoạt có bổ trợ nhũ dầu phịng bệnh viêm phổi có hiệu quả cao trên đàn lợn cho
người chăn nuôi.
1.3. PH MăVIăNGHIểNăC U
1.3.1. Đ iăt ngănghiênăc u

- Bộ giống vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a và 5b ; vi khuẩn P. multocida
serotype A và D; vi khuẩn S. suis serotype 2 được sử dụng làm giống gốc (Master seed)
lưu giữ tại Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin Công ty Marphavet.
- Lợn mắc bệnh viêm phổi do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis
gây ra.
1.3.2. Ph măviănghiênăc u
Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu các đặc tính vi sinh vật hóa học, cấu trúc kháng
nguyên, độc lực và khả năng sử dụng làm chủng giống sản xuất vacxin của các vi khuẩn A.
pleuropneumoniae serotype 2, 5a và 5b; vi khuẩn P. multocida serotype A và D; vi khuẩn
S. suis serotype 2 được lưu giữ tại Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin Công ty
Marphavet.
Địa điểm nghiên cứu gồm: Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y; Viện Công nghệ sinh học
- Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam ; Phòng thí nghiệm trọng điểm khoa Thú y, Học viện
Nơng nghiệp Việt Nam; Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin; nhà máy sản xuất vacxin
theo tiêu chuẩn GMP WHO thuộc Công ty CP thuốc thú y Marphavet và một số cơ sở
chăn nuôi lợn.
Thời gian nghiên cứu: từ tháng 6 năm 2016 đến tháng 6 năm 2020
1.4. NH NGăĐịNGăGịPăM IăC AăĐ ăTẨI
- Chế tạo thành công vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi lợn do
vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a, 5b; P. multocida serotype A, D và S. suis
serotype 2 gây ra tại Việt Nam ở quy mơ phịng thí nghiệm.

2


- Xây dựng được quy trình sản xuất, sử dụng và bảo quản vacxin đa giá vơ hoạt nhũ
dầu phịng bệnh viêm phổi ở lợn lần đầu tiên tại Việt Nam ở quy mơ phịng thí nghiệm.
Vacxin đa giá phịng bệnh viêm phổi do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và
S. suis gây ra trên lợn, có chất bổ trợ nhũ dầu đầu tiên được sản xuất tại Việt Nam, giúp
tăng hiệu quả phòng bệnh, kéo dài thời gian miễn dịch và khả năng bảo hộ so với vacxin

cùng loại có bổ trợ keo phèn.
1.5. Ý NGHƾAăKHOAăH CăVẨăTH CăTI NăC AăĐ ăTẨI
1.5.1. ụănghƿaăkhoaăh c
Kết quả nghiên cứu của đề tài đã góp phần bổ sung thêm các thơng tin về quy
trình sản xuất vacxin đa giá nhũ dầu phịng bệnh viêm phổi lợn do vi khuẩn A.
pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra tại Việt Nam tại quy mô phịng thí
nghiệm. Đồng thời là cơ sở cho việc nghiên cứu sản xuất vacxin đa giá có chất bổ trợ nhũ
dầu phòng bệnh viêm phổi lợn trên dây chuyền sản xuất vacxin quy mô công nghiệp.
1.5.2. ụănghƿaăth căti n
- Kết quả gây bệnh thực nghiệm với các vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P.
multocida và S. suis cùng với các bệnh tích lâm sàng của lợn mắc bệnh được sử dụng là
phương pháp chẩn đoán lâm sàng bệnh viêm phổi do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P.
multocida và S. suis gây ra cho lợn nhanh chóng, có hiệu quả kinh tế cao.
- Vacxin vô hoạt đa giá nhũ dầu sản xuất thành công sẽ được sử dụng rộng rãi trong
thực tế sản xuất, góp phần khống chế hiệu quả bệnh viêm phổi do vi khuẩn A.
pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra ở lợn nuôi tại Việt Nam.
PH N 2.ăT NGăQUANăTẨIăLI U
2.1. TỊNHăHỊNHăNGHIểNăC U TRểNăTH ăGI I V ăB NHăVIểMăPH Iă ăL Nă
VẨăVACXINăPHọNGăB NHă
Bệnh viêm phổi - màng phổi được Pattison phát hiện lần đầu tiên vào năm 1957 (Pattison
& cs., 1957) và đã được Shope (1964) mô tả ca bệnh cấp tính với các triệu chứng tương tự ở
đàn lợn ni tại một trang trại thuộc Argentina và gọi tên mầm bệnh là Haemophilus
pleuroneumonia. Với kết quả nghiên cứu ADN, Haemophilus pleuroneumonia được xếp vào
giống Actinobacillus và được đặt tên là Acitinobacillus pleuropneumoniae. Đây là một cầu
trực khuẩn gram âm, có giáp mơ. Hiện có 15 serotype được phân bố theo từng vùng. Mỗi
serotype có thể tạo ra ngoại độc tố Apx I, II hoặc III. Các ngoại độc tố này chính là tác nhân
chính gây thương tổn trên phổi và làm giảm năng suất của lợn (Herczeg & cs., 2014). Vào
những năm đầu của thế kỷ 21, một thế hệ vacxin mới, vacxin tiểu đơn vị bao gồm ba ngoại
độc tố RTX chính (ApxI, ApxII, và ApxIII) và một protein 42 kDa bên ngoài màng của A.
pleuropneumoniae đã được nghiên cứu cho thấy có khả năng bảo vệ cao chống lại tất cả 12

kiểu huyết thanh chính (kiểu huyết thanh 1-12) trong điều kiện thí nghiệm cũng như trong các
thử nghiệm thực tế (Van Den Bosch & Frey, 2003).
Bệnh viêm phổi do Pasteurella gây ra là kết quả của sự lây nhiễm của vi khuẩn P.
multocida cho phổi. Bệnh thường thấy ở giai đoạn cuối của bệnh viêm phổi cục bộ hay ở
những bệnh ghép ở đường hô hấp ở lợn (PRDC). Hội chứng này là một trong những bệnh

3


gây thiệt hại cho lợn đặc biệt khi chúng sản sinh tăng lên. Những tài liệu đã công bố thừa
nhận rằng những tổn thương ở bệnh viêm phổi khi giết mổ rất điển hình, thậm chí cả ở
những đàn lợn được quản lý tốt. Những báo cáo qua nghiên cứu nhiều năm tập chung ở
lợn với những bệnh tích viêm phổi tại lúc mổ khám dao động từ thấp là 30% đến cao nhất
là 80%. Những số liệu gần đây tại Mỹ cho thấy trong 6634 mẫu lấy từ lợn để kiểm tra phổ
biến là 74% lợn bị viêm phổi và 13 % với chứng viêm màng phổi.
Những ghi nhận đầu tiên về bệnh do S. suis gây ra ở lợn được Jansen và Van Dorssen
mô tả ở Hà Lan vào năm 1951 và tại Anh vào năm 1954 (Field & cs., 1954). (De Moor,
1963) lần đầu tiên đã phân lập được vi khuẩn Streptococcus gây dung huyết dạng alpha,
dựa vào kết quả giám định đặc tính sinh hóa và định serotype đã xếp vào nhóm Lancefield
R, S, RS và T. (Elliott & cs., 1966) thấy rằng các vi khuẩn nhóm S do Moor phân lập giống
với PM Streptococcus mà ông phân lập đều thuộc nhóm Lancefield D và đề nghị gọi là
Streptococcus suis serotype 1. Windsor & Elliott (1975) đã phân lập chủng Streptococcus
suis tương ứng với nhóm R do Moor phân lập và đề nghị gọi là Streptococcus suis serotype
2. Clifton-Hadley (1984) thông báo phân lập được vi khuẩn Streptococcus suis thuộc nhóm
T từ hạch amidan, dịch âm đạo và bao quy đầu của lợn và được Gottschalk & cs. (1989) gọi
là Streptococcus suis serotype 15.
2.2. TỊNHăHỊNHăNGHIểNăC UăT IăVI TăNAMăV ăB NHăVIểMăPH Iă ăL Nă
VẨăVACXINăPHọNGăB NHă
Các nghiên cứu ở trong nước cho thấy, khi lợn mắc hội chứng rối loạn hô hấp và
sinh sản thường gặp các loại vi khuẩn gây bệnh kế phát trong đường hô hấp như

Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Streptococcus suis serotype 2,
Bordetella bronchiseptica Nguyễn Hữu Nam & Nguyễn Thị Lan (2007), Bùi Quang Anh
& cs. (2008), Nguyễn Thị Kim Lan & cs. (2017), Cù Hữu Phú (2005) đã làm cho dịch
trầm trọng với bệnh lý nặng, kéo dài và tỷ lệ chết cao. Theo Lê Văn Dương (2013) tại các
ổ dịch lợn mắc hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản tại tỉnh Bắc Giang đã phân lập được
các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida, S. suis, trong đó cao nhất là S.
suis (55,10%), tiếp sau là A. pleuropneumoniae (19,59%) và thấp nhất là P. multocida
(17,44%). Các tác giả đã nghiên cứu chế tạo Autovaccine từ các chủng vi khuẩn trên phân
lập được dùng để phòng bệnh viêm phổi cho lợn, kết quả cho thấy Autovaccine thử nghiệm
có khả năng phịng bệnh viêm phổi cho lợn, cho đáp ứng miễn dịch trên bốn tháng và hiệu
lực bảo hộ là 93,33%.
PH Nă3.ăV T LI U,ăN IăDUNG VÀ PH
NGăPHỄPăNGHIểNăC U
3.1. Đ AăĐI MăNGHIểNăC U
- Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y; Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học
Việt Nam; Phịng thí nghiệm trọng điểm khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam;
Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin; nhà máy sản xuất vacxin theo tiêu chuẩn WHO
thuộc Công ty CP thuốc thú y Marphavet và một số cơ sở chăn nuôi lợn.
3.2.ăTH IăGIANăNGHIểNăC U
Đề tài thực hiện từ tháng 6 năm 2016 đến tháng 6 năm 2020.
4


3.3.ăV TăLI UăNGHIểNăC U
- Bộ vi khuẩn sử dụng làm giống gốc (Master seed) sản xuất vacxin viêm phổi lợn lưu
giữ tại Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin gồm có:
+ Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 2, 5a và 5b.
+ Vi khuẩn Pasteurella multocida serotype A và D
+ Vi khuẩn Streptococcus suis serotype 2
- Mơi trường, hóa chất dùng trong nghiên cứu, sản xuất vacxin đa giá phòng viêm phổi

ở lợn
+ Các loại môi trường dùng để nuôi cấy, lưu giữ vi khuẩn do hãng Oxoid (Anh) và
Merck (Pháp) sản xuất: Môi trường nước thịt, thạch thường, thạch máu, thạch MacConkey,
thạch Chocolate, BHI broth, BHI agar, TSB, PLLO agar …
+ Các loại mơi trường, hóa chất dùng để giám định, xác định các đặc tính sinh hóa
của vi khuẩn: Mơi trường đường các loại, dung dịch Kovac’s, dung dịch H2O2 3%, giấy
thử Oxidase, nước muối 6,5%, ...
+ NAD do hãng Oxoid (Anh) sản xuất.
+ Chất bổ trợ nhũ dầu IMS 1313 do công ty Seppic- Pháp cung cấp.
- Động vật thí nghiệm:
+ Lợn sau cai sữa khỏe mạnh khơng tiêm vacxin có kháng nguyên A.
pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis.
+ Chuột nhắt trắng: 18- 20 g khỏe mạnh.
- Máy móc, dụng cụ thí nghiệm
+ Các máy móc, dụng cụ dùng trong phịng thí nghiệm, các hố chất sát trùng, tiêu
độc, rửa dụng cụ ... để thực hiện các kỹ thuật như PCR, RT-PCR; ELISA, ....
+ Dây chuyền công nghệ chế tạo vacxin quy mô công nghiệp như bộ máy lên men
sục khí 15 lít và 120 lít SATORIUS của Đức; hệ thống ra chai tự động của Ý.
3.4.ăN IăDUNGăNGHIểNăC U
3.4.1.ăNghiênăc uătri uăch ngălơmăsƠng,ăb nhătíchăđ iăth ăc aăl năm căb nhădoăviă
khu năA. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra
- Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh do vi khuẩn
A. pleuropneumoniae gây ra.
- Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh do vi khuẩn
P. multocida gây ra.
- Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh do vi khuẩn
S. suis gây ra.
3.4.2. Nghiênăc uăđánhăgiáăkh ănĕngă năđ nhăđ cătínhăsinhăh căc a b gi ngăs năxu tă
vacxinăphòngăb nhădoăviăkhu năA. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra
- Nghiên cứu đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất vacxin

phịng bệnh do vi khuẩn A. pleuropneumoniae gây ra.
- Nghiên cứu đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất vacxin
phòng bệnh do vi khuẩn P. multocida gây ra.
5


- Nghiên cứu đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất vacxin
phịng bệnh do vi khuẩn S. suis gây ra.
3.4.3. Nghiênăc uăquyătrìnhăs năxu tăvacxinăđaăgiáăvơăho tănhǜăd uăphòngăb nhăviêmă
ph i ăl nădoăviăkhu năA. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra

- Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vacxin đa giá vơ hoạt nhũ dầu phòng
bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra.
- Nghiên cứu đánh giá chất lượng vacxin bán thành phẩm.
- So sánh khả năng sinh miễn dịch của vacxin đa giá bổ trợ keo phèn và vacxin
đa giá bổ trợ nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae,
P. multocida và S. suis.
- Xây dựng quy trình sử dụng vacxin đa giá vơ hoạt nhũ dầu phịng bệnh viêm
phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra.
- Xây dựng quy trình bảo quản vacxin đa giá vơ hoạt nhũ dầu phịng bệnh viêm
phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra.
3.5.ăPH
NGăPHỄPăNGHIểNăC U
3.5.1. Ph ngăphápăgơyăb nhăth cănghi măbằngăcácăch ngăviăkhu năA. pleuropneumoniae,
P. multocida và S. suis master seed
Chọn 24 con lợn sau cai sữa (4 tuần tuổi) khỏe mạnh khơng tiêm vacxin viêm phổi
có kháng ngun A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis. Trước khi gây bệnh
cho lợn, tiến hành lấy máu kiểm tra kháng thể (âm tính) có trong máu lợn với A.
pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis. Lợn được chia làm 8 lơ, mỗi lơ có 3 con.
Liều gây bệnh bằng 100 liều LD 50, với đường gây bệnh dưới da lợn. Lợn đối chứng

được tiêm BHI broth vô trùng. Theo TCVN 8685.
3.5.2. Ph ngăphápănuôiăc yăviăkhu năvƠăgiámăđ nhăđ cătínhăsinh hóa
Phương pháp giám định các đặc tính ni cấy trên các loại mơi trường, đặc tính
sinh vật hóa học của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis
nghiên cứu theo (Moller & cs., 1996; Quinn & cs., 2012) và theo TCVN- 8685. Bệnh
phẩm là phổi, dịch ngoáy vùng hầu họng được cấy sơ cấp lên môi trường thạch máu hoặc
môi trường thạch chọn lọc Colombia. Sau khi ni cấy trong tủ ấm có 5% CO2, có thể
chọn 1-2 khuẩn lạc nghi ngờ đặc trưng để giám định vi khuẩn về mặt hình thái và đặc tính
sinh hóa tùy theo loại vi khuẩn. Việc kiểm tra đặc tính sinh hóa theo TCVN 8685.
3.5.3. Ph ngăphápăPCR
- Xác định A. pleuropneumoniae bằng kỹ thuật PCR theo (Gram & cs., 1998)
- Xác định các type giáp mô A, B, D của vi khuẩn P. multocida dựa trên phản ứng
PCR được mô tả bởi (Đỗ Ngọc Thúy & cs., 2007).
- Bốn serotype S. suis gây bệnh thường gặp nhất ở lợn là serotype 1, 2, 7 và 9 được
xác định bằng phản ứng PCR.
3.5.4. Ph ngăphápăđánhăgiáăđ căl căviăkhu nătrênăchu tăvƠăl n
Độc lực của các chủng A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis trong nghiên
cứu này, được xác định trên chuột nhắt trắng và trên lợn. Xác định độc lực của các chủng

6


A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis nghiên cứu trên chuột nhắt trắng theo
phương pháp của (Carter, 1995), tính liều LD50 theo (Reed & Muench, 1938).Với mỗi
chủng vi khuẩn, sử dụng canh trùng được nuôi cấy ở 37◦C/24 giờ, riêng với A.
pleuropneumoniae ni cấy trong điều kiện có 5% CO2 mỗi một chủng vi khuẩn được
tiêm cho 2 chuột thí nghiệm vào dưới da với liều 0,2 ml/con. Với lợn, mỗi lợn được gây
bệnh thực nghiệm ở liều 5 ml/con (Theo TCVN 8685).
3.5.5. Ph ngăphápăch ăt oăvacxinăđaăgiáăvôăho tănhǜăd u
Giống gốc master seed: được lưu giữ tại Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin

gồm: Vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a và 5b; Vi khuẩn P. multocida serotype
A và D; vi khuẩn S. suis serotype 2. Bộ giống gốc này đang được sử dụng để sản xuất
vacxin đa giá vô hoạt có bổ trợ keo phèn phịng bệnh viêm phổi cho lợn, đã được phép lưu
hành trên toàn quốc. Các vi khuẩn của bộ giống gốc này có cấu trúc kháng nguyên ổn
định, kháng nguyên tính cao, sản sinh các loại độc tố và độc lực cao (Hồ sơ đăng ký lưu
hành thuốc thú y: Sản phẩm: MAR-APPSVAC - vacxin viêm phổi lợn đa giá, 2015).
3.5.6.ăPh ngăphápăki m nghi m vacxin
* Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu vô trùng
Kiểm tra cảm quan, đậm độ và vô trùng: Vacxin được kiểm tra vô trùng (không tạp
nhiễm vi khuẩn và nấm mốc) theo tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8684:2011 và theo quy trình
của Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y quốc gia.
* Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu an toàn
Kiểm tra an toàn: Vacxin được kiểm tra an toàn trên chuột nhắt trắng bằng cách
tiêm bắp đùi liều 0,5 ml/con. Bên cạnh đó vacxin cũng được kiểm tra an toàn trên lợn bằng
cách tiêm vacxin liều gấp đôi (4 ml/con) cho lợn 4 tuần tuổi với đường tiêm bắp. Theo dõi
các phản ứng của chuột nhắt và lợn để xem mức độ an toàn của vacxin thử nghiệm.
* Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực
Kiểm tra hiệu lực: Vacxin được kiểm tra phải có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch đạt
hiệu lực ≥ 70% khi cơng cường độc. Lợn thí nghiệm là lợn khỏe mạnh, trên 4 tuần tuổi.
3.5.7. Ph ngăphápăx ălỦăs ăli u
Số liệu thu được trong nghiên cứu được tổng hợp và xử lý bằng phần mềm
Microsoft Excel 2019 và phần mềm R phiên bản 4.0.2.

PH Nă4.ăK T QU VÀ TH O LU N
4.1. K TăQU ăNGHIểNăC UăTRI UăCH NGăLỂMăSẨNG,ăB NHăTệCHăĐ IăTH ă
C AăL NăM CăB NHăDOăVIăKHU NăA. PLEUROPNEUMONIAE, P. MULTOCIDA
VÀ S. SUIS GÂY RA
4.1.1. K tăqu ănghiênăc uătri uăch ngălơmăsƠng,ăb nhătíchăđ iăth ăc aăl năm căb nhă
doăviăkhu năA. pleuropneumoniae gây ra
4.1.1.1 Kết quả kiểm tra yếu tố độc lực trên lợn

Dựa trên kết quả xác định độc lực và liều LD 50 của vi khuẩn A. pleuropneumoniae,
7


chúng tôi đã xác định được liều vi khuẩn gây bệnh thực nghiệm như sau:
A. pleuropneumoniae serotype 2: 4,5 x 109 CFU/ml; Chủng vi khuẩn
A. pleuropneumoniae serotype 5a và 5b có cấu trúc kháng nguyên và độc lực tương
đồng nhau, nên chúng tôi chọn chủng 5a đại diện cho 2 chủng 5a và 5b để gây bệnh
thực nghiệm cho lợn với liều A. pleuropneumoniae serotype 5a: 5 x 10 9 CFU/ml. Kết
quả đánh giá khả năng gây bệnh ở lợn của giống vi khuẩn A. pleuropneumoniae được
thể hiện ở bảng 4.1.
B ng 4.1. K t qu đánhăgiáăkh nĕngăgơyăb nh
A. pleuropneumoniae

l n c a vi khu n

K tăqu ătheoădõi
S ăl nă
Phân
Lô thí Ch ngăviăkhu năăgơyă Li uăgơyă
thí
Tỷăl ă
nghi m
b nh
b nhă
nghi m S ăconă Th iăgiană ch t l păl iă
ch t
ch t
vi
(ml/con)

(con)
(%)
khu n
A. pleuropneumoniae
5
3
3/3
6 – 12 h 100
3/3
serotype 2
Lô 1
A. pleuropneumoniae
5
3
2/3
6 – 20 h 66,7
3/3
serotype 5a
Lô 2 Đối chứng
0
3
0
0

B ng 4.2. Tri u ch ng lâm sàng và b nhătíchăđ i th c a l năđ
A. pleuropneumoniae
Bi u hi n
Sốt
Ho, thở khó
Chảy máu mũi

Khí quản chứa dịch nhày lẫn máu
Viêm dính phổi và thành ngực

S l n
gây b nh (con)
6
6
6
6
6

c gây nhi m

S l n
bi u hi n (con)
6
6
5
5
6

Tỷ l
6/6
6/6
5/6
5/6
6/6

Ghi chú: A: Lợn chảy máu mũi; B: Phổi viêm dính thành ngực

Hình 4.1. M t s b nhătíchăđ i th c a l năđ
8

c gây nhi m A. pleuropneumoniae


4.1.1.2 Kết quả giám định lại vi khuẩn sau khi gây bệnh thực nghiệm bằng kỹ thuật
PCR
Sau khi gây bệnh thực nghiệm, chúng tôi đã lấy mẫu, phân lập lại vi khuẩn gây
bệnh để khẳng định các chủng vi khuẩn nghiên cứu chính xác là A.pleuropneumoniae.
Hình ảnh 4.2 chụp kết quả điện di những sản phẩm PCR của 03 mẫu đã phân lập
đều cho sản phẩm với độ dài 950 bp, đặc hiệu với độ dài của gen omlA của vi khuẩn
A. Pleuropneumoniae.
khuẩn A. Pleuropneumoniae.
M 1

2

3

Ghi chú:
- Giếng 1, 2, 3: Sản phẩm PCR xác định gen
1000 bp

omlA (950 bp) của A. pleuropneumoniae;

950 bp

- Giếng M: 1000 bp marker

Hình 4.2. S n ph m c a kỹ thu tăPCRăxácăđ nh vi khu n A. pleuropneumoniae
4.1.2. K tăqu ănghiênă c uătri uă ch ngă lơmă sƠng,ăb nhătíchăđ iăth ăc aă l năm că
b nhădoăviăkhu năP. multocida gây ra
4.1.2.1. Kết quả kiểm tra yếu tố độc lực trên lợn
Dựa trên kết quả xác định độc lực và liều LD50 của vi khuẩn P. multocida, chúng
tôi đã xác định được liều vi khuẩn gây bệnh thực nghiệm như sau: P. multocida serotype
A: 4,5 x 109 CFU/ml và P. multocia serotype D: 4,5 x 10 9 CFU/ml.
B ng 4.3. K t qu đánhăgiáăkh nĕngăgơyăb nh

l n c a vi khu n P. multocida
K tăqu ătheoădõi

S ăl nă
Lơ thí

Ch ngăviăkhu năgơyă

Li uăgơyă

thí

nghi m

b nh

b nhă

nghi m

(ml/con)

(con)

P. multocida serotype A

5

3

P. multocida serotype D

5

Đối chứng

0

Lô 1
Lô 2

9

Phân

Th iă

Tỷăl ă

gian

ch t

ch t

(%)

3/3

20- 28 h

100

3/3

3

3/3

20- 24 h

100

3/3

3

0

S ăconă
ch t

0

l păl iă
vi
khu n


B ng 4.4. Tri u ch ng lâm sàng và b nhătíchăđ i th c a l năđ

c gây nhi m

P. multocida
S l n gây b nh
(con)

S l n bi u hi n
(con)

Tỷ l

Sốt
Ho, thở khó

6
6

6
6

6/6
6/6

Da đỏ tím
Viêm phổi thùy

6
6

5
6

5/6
6/6

Bi u hi n

Phổi lợn bị viêm

Hình 4.3. M t s b nhătíchăđ i th c a l năđ c gây nhi m P. multocida
4.1.2.2 Kết quả giám định lại vi khuẩn sau khi gây bệnh thực nghiệm bằng kỹ thật PCR
Sau khi gây bệnh, chúng tôi đã lấy mẫu, phân lập lại vi khuẩn gây bệnh thực nghiệm
và xác định các serotype giáp mô A, B, D của vi khuẩn P. multocida dựa trên phản
ứng PCR.
Ghi chú
-Giếng M: 1000 bp marker
-Giếng 1, 2, 3, 4: chủng phân
lập serotype A (1044 bp)
-Giếng 5: đối chứng dương
serotype A (1044 bp);

-Giếng 6: đối chứng dương
serotype B (760 bp);
-Giếng 7: đối chứng dương
serotype D (657 bp)

Hình 4.4. S n ph m c a kỹ thu tăPCRăxácăđ nh vi khu n P. multocida
4.1.3. K tăqu ănghiênăc uătri uăch ngălơmăsƠng,ăb nhătíchăđ iăth ăc aăl năm căb nhă
doăviăkhu năS. suis gây ra
4.1.3.1. Kết quả kiểm tra yếu tố độc lực trên lợn
Dựa trên kết quả xác định độc lực và liều LD50 của vi khuẩn S. suis, chúng tôi đã xác
định được liều vi khuẩn gây bệnh thực nghiệm là : 4,5 x 109 CFU/ml.
10


B ng 4.5. K t qu đánhăgiáăkh nĕngăgơyăb nh l n c a vi khu n S. suis
Lơ thí Ch ngăviăkhu nă
nghi m

gơyăb nh

K tăqu ătheoădõi

Li uăgơyă S ăl năthí
b nhă

nghi m S ăconă Th iă

(ml/con)

(con)

ch t gianăch t

Lô 1

S. suis serotype 2

5

3

3/3

Lơ 2

Đối chứng

0

3

0

36 h

Sốt
Ho, thở khó
Triệu chứng thần kinh
Viêm phổi
Viêm khớp

Viêm màng não

S l n
gây b nh (con)
3
3
3
3
3
3

Phơnăl pă

ch t

l iăviă

(%)

khu n

100

3/3

0

B ng 4.6. Tri u ch ng lâm sàng và b nhătíchăđ i th c a l năđ
Bi u hi n

Tỷăl ă

c gây nhi m S. suis

S l n
bi u hi n (con)
3
3
3
3
1
3

Tỷ l
(%)
3/3
3/3
3/3
3/3
1/3
3/3

Viêm khớp ở lợn

Hình 4.5. M t s tri u ch ng lâm sàng, b nhătíchăđ i th c a l n gây nhi m S. suis

4.1.3.2. Kết quả giám định lại vi khuẩn sau khi gây bệnh thực nghiệm bằng kỹ
thuật PCR
Sau khi gây bệnh, chúng tôi đã lấy mẫu, phân lập lại vi khuẩn gây bệnh thực nghiệm
và xác định vi khuẩn với mồi của phản ứng PCR. Kết quả hình 4.6 cho thấy: chủng S.

suis nghiên cứu, sau quá trình chạy PCR và điện di đều cho một sản phẩm đặc hiệu và
giống nhau là 688 bp

11


M 1 2 3
Ghi chú:

Giếng M: 1000 bp marker
Giếng 1, 2, 3: sản phẩm PCR xác
định gen gdh (688 bp) của S. suis
1000 bp
688 bp

Hình 4.6. S n ph m c a kỹ thu t PCRăxácăđ nh S. suis
4.2. K Tă QU ă ĐỄNHă GIỄă KH ă NĔNGă Nă Đ NHă Đ Că TệNHă SINHă H Că C Aă
GI NGăS NăXU TăVACXINăPHọNGăB NHăDOăVIăKHU NăA. PLEUROPNEUMONIAE,
P. MULTOCIDA VÀ S. SUIS GÂY RA
4.2.1. K tăqu ăđánhăgiáăkh ănĕngă năđ nhăđ cătínhăsinhăh căc aăgi ngăs năxu tăvacxină
phòngăb nhădoăviăkhu năA. pleuropneumoniae gây ra
4.2.1.1. Kết quả kiểm tra đặc điểm ni cấy và đặc điểm hình thái
Kết quả kiểm tra đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm hình thái vi khuẩn
A. pleuropneumoniae thể hiện ở hình 4.7.

Hình A: Khuẩn lạc của APP trên thạch PPLO

Hình B: Vi khuẩn APP trên kính hiển vi

Hình 4.7. Khu n l c A. pleuropneumoniae và hình thái vi khu n khi soi trên kính hi n vi

4.2.1.2. Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa
Sau khi ni cấy trên mơi trường, chúng tơi cũng tiến hành kiểm tra đặc tính
sinh hóa của giống sản xuất. Kết quả kiểm tra các đặc tính sinh hóa cho thấy: 100% số
chủng dương tính với các phản ứng Oxidase, Catalase, Urease, CAMP, O.N.P.G và cần
yếu tố V cho quá trình phát triển, 100% số chủng đều âm tính với phản ứng Indol. Các
chủng A. pleuropneumoniae được kiểm tra có khả năng lên men các loại đường

Glucose, Maltose, Mannitol, Xylose và khơng có chủng nào lên men các loại đường:
12


Arabinose, Lactose, Raffinose, Sorbitol. Như vậy cả 3 chủng A. pleuropneumoniae
được lựa chọn dùng cho nghiên cứu đều mang các đặc tính sinh vật hóa học điển hình
của vi khuẩn A. pleuropneumoniae như mô tả của (Moller & cs., 1996), cũng phù hợp
với các nghiên cứu của (Trịnh Quang Hiệp & cs., 2004; Cù Hữu Phú & cs., 2005;
Nguyễn Thị Thu Hằng, 2010).

4.2.1.3. Kết quả kiểm tra yếu tố độc lực bằng kỹ thuật PCR
Trong nghiên cứu này, chúng tôi ứng dụng kỹ thuật Multiplex PCR để xác định
sự có mặt của các gen mã hóa độc tố Apx ở 3 chủng A. pleuropneumoniae nghiên cứu.
Kết quả thể hiện ở bảng 4.7.
B ng 4.7. K t qu xácăđ nh gen s năsinhăđ c t c a gi ng s n xu t
A. pleuropneumoniae
Ký hi u
Serotype
ch ng
A1
A2
A3

2
5a
5b

Ch ngămangăgenăđ c t Apx

S
ch ng

apxICA

apxIICA

apxIIICA

apxIBD

apxIIIBD

1
1
1

0
1
0

1
1

0

1
0
1

1
1
1

1
0
1

Kết quả cho thấy, các chủng A. pleuropneumoniae nghiên cứu đều có mang từ 3
đến 4 gen quy định sản sinh độc tố Apx. Tất cả 2 chủng thuộc serotype 5 đều mang ba
loại gen mã hóa độc tố, trong đó chủng có serotype 5a mang tổ hợp gen
apxICA/apxIICA/apxIBD, cịn chủng có serotype 5b mang tổ hợp gen
apxIIICA/apxIBD/apxIIIBD.
4.2.2. K tăqu ăđánhăgiáăkh ănĕngă năđ nhăđ cătínhăsinhăh căc aăgi ngăs năxu tăvacxină
phịngăb nhădoăviăkhu năPasteurella multocida gây ra
4.2.2.1. Kết quả kiểm tra đặc điểm ni cấy và đặc điểm hình thái
Kết quả kiểm tra đặc điểm ni cấy và đặc điểm hình thái vi khuẩn P. multocida thể
hiện ở hình 4.8.

Hình A: Khuẩn lạc của P. multocida

Hình B: Vi khuẩn P. multocida trên KHV

Hình 4.8. Khu n l c P. multocida và hình thái vi khu n khi soi trên kính hi n vi

13


4.2.2.2. Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa
Tất cả các chủng đều dương tính với phản ứng Indol, Oxidase, Catalase. 100% chủng
có khả năng lên men các loại đường Glucose, Galactose, Mannitol, Saccharose, Fructose
và không lên men các đường Lactose, Arabinose, Maltose.
4.2.2.3. Kết quả kiểm tra yếu tố độc lực bằng kỹ thuật PCR
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phản ứng Multiplex PCR để xác định các
type giáp mô A, B, D của các chủng P. multocida được lựa chọn dùng cho nghiên cứu
theo quy trình đã được chuẩn hóa của Bộ mơn Vi trùng - Viện Thú y (Đỗ Ngọc Thúy &
cs., 2007). Các cặp mồi được sử dụng là CAPA-F và CAPA-R dùng để xác định type A,
CAPB-F và CAPB-R để xác định type B, CAPD-F và CAPD-R để xác định type D.
B ng 4.8. K t qu xácăđ nh y u t đ c l c c a gi ng s n xu t P. multocida
TT

KH ch ng

Serotype A

1

A4

+

2

A5

Serotype B

Serotype D
+

4.2.3. K t qu đánhăgiáăkh nĕngă năđ nhăđ c tính sinh h c c a gi ng s n xu t vacxin
phòng b nh do vi khu n S. suis gây ra
4.2.3.1. Kết quả kiểm tra đặc điểm ni cấy và đặc điểm hình thái
Kết quả kiểm tra đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm hình thái vi khuẩn S. suis thể hiện ở
hình 4.9.

Hình A: Khuẩn lạc của S. suis

Hình B: Vi khuẩn S. suis trên kính hiển vi

Hình 4.9. Khu n l c S. suis và hình thái vi khu n khi soi trên kính hi n vi
4.2.3.2. Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa
Chủng kiểm tra khơng phát triển trong mơi trường NaCl 6,5% và âm tính với phản
ứng KOH 3%. Chủng đều âm tính với phản ứng Oxydase, Catalase, Indol. Chủng kiểm
tra lên men các loại đường: Glucose, Galactose, Maltose, Lactose và khơng có chủng nào
lên men các đường Mannitol, Sorbitol.
14


4.3. NGHIểNă C Uă QUYă TRỊNHă S Nă XU Tă VACXINă ĐAă GIỄă VỌă HO Tă
NHǛă D Uă PHọNGă B NHă VIểMă PH I
ă L Nă DOă VIă KHU Nă
A. PLEUROPNEUMONIAE, P. MULTOCIDA VÀ S. SUIS GÂY RA
4.3.1. Nghiênăc uăxơyăd ngăquyătrìnhăs năxu tăvacxinăđaăgiáăvơăho tănhǜăd uăphịngăb nhă

viêmăph i ăl nădoăviăkhu năA. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra
4.3.1.1. Kết quả theo dõi các lơ lên men sục khí

Chúng tơi đã chế tạo vacxin dạng vơ hoạt có bổ trợ keo phèn và nhũ dầu theo
quy trình thường quy của Bộ mơn Vi trùng - Viện Thú y và quy trình sản xuất vacxin
theo dây chuyền sản xuất công nghiệp của nhà máy vacxin GMP-WHO. Các chủng
vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis được nuôi cấy riêng từng loại
vi khuẩn, mỗi loại vi khuẩn được nuôi cấy 3 lô khác nhau bằng phương pháp lên men
sục khí.
B ng 4.10. K t qu nuôi c y vi khu n bằngăph ngăphápălênămenăs c khí
Lo i vi khu n

S l n ni c y

S l ng vi khu n
trung bình (x 109 CFU/ml)

A. pleuropneumoniae

3

10,67 ± 0,52 CFU/ml

P. multocida

3

13,33 ± 1,37 CFU/ml

S. suis

3

11,00 ± 0,89 CFU/ml

4.3.1.2. Chuẩn bị các loại kháng nguyên và bán thành phẩm
Sau khi vô hoạt vi khuẩn trong canh trùng thu được bằng cách sử dụng formol với tỷ
lệ 0,3%, tiến hành kiểm tra vô trùng trên các loại mơi trường nước thịt, thạch máu và nước
thịt yếm khí. Các loại kháng nguyên sau khi kiểm tra đảm bảo vô hoạt 100% sẽ được tiến
hành pha trộn với bổ trợ nhũ dầu IMS-1313 theo hướng dẫn của Seppic với tỷ lệ 25% (3
phần canh trùng kháng nguyên + 1 phần nhũ dầu).
Dựa trên kết quả lên men sục khí mỗi loại kháng nguyên (A. pleuropneumoniae
serotype 2, 5a và 5b; S. suis serotype 2 và P. multocida serotype A và D), cần tiến hành
pha trộn các loại kháng nguyên với nhũ dầu (25%) để có trong mỗi một liều tiêm vacxin
cho lợn (2ml vacxin/lợn) đảm bảo như sau:
+ Kháng nguyên A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a và 5b có 4 - 4,5x109 CFU/liều
tiêm.
+ Kháng nguyên S. suis serotype 2: 4- 4,5 x109 CFU/liều tiêm
+ Kháng nguyên P. multocida A và D: 4- 4,5 x109 CFU/liều tiêm.
Sau khi vacxin bán thành phẩm được sản xuất, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra độ thuần
khiết của vi khuẩn bằng phương pháp làm tiêu bản quan sát vi sinh vật chết và kiểm tra dưới
kính hiển vi.

15


4.3.2. K t qu đánhăgiáăch tăl

ng vacxin bán thành ph m

Chúng tôi đã tiến hành kiểm tra vô trùng bằng phương pháp nuôi cấy trên các loại
môi trường như sau:
B ng 4.11. K t qu ki mătraăđ măđ , thu n khi t và vô trùng c a lô gi ngăđ năgiá
Lo iăviăkhu n

S ălơăthíă

Ch ătiêuăki mătra

nghi m

Đ măđ ă
(x 109 CFU/ml)

Thu năkhi t
n (%)

Vô trùng
n (%)

A. pleuropneumoniae

3

10,67 ± 0,52

3/3 (100)

3/3 (100)

P. multocida

3

13,33 ± 1,37

3/3 (100)

3/3 (100)

S. suis

3

11,00 ± 0,89

3/3 (100)

3/3 (100)

B ng 4.12. K t qu ki m tra thu n khi t và vô trùng c aăvacxinăđaăgiáăbánă
thành ph m
Ch ătiêuăki mătra

Lơăthíănghi m

Thu năkhi t

Vơ trùng

1
2

Đạt
Đạt

Đạt
Đạt

3
Tổng hợp

Đạt
3/3 (100%)

Đạt
3/3 (100%)

Sau khi đã kiểm tra 3 lô canh trùng chế tạo được đều đạt các tiêu chuẩn chế vacxin,
tiến hành trộn lẫn các lô canh trùng với nhau theo tỷ lệ phù hợp để đạt được một hỗn hợp
canh trùng đồng nhất, rồi bổ sung nhũ dầu với tỷ lệ 1/4 để đảm bảo trong 2 ml vacxin có
chứa 4- 5 x 109 CFU.
Kiểm tra an toàn của vacxin chế tạo trên chuột nhắt trắng: chọn mỗi lô 10 chuột, mỗi
con chuột tiêm vacxin với liều 0,5 ml/con vào bắp đùi. Theo dõi chuột trong vòng 10 ngày.
B ng 4.13. K t qu ki m tra an toàn c a vacxin bán thành ph m
trên chu t nh t tr ng
Th i gian S chu t thí S chu t
Đ t thí Li u tiêm và
theo dõi nghi m
s ng

nghi m đ ng tiêm
(ngày)
(con)
(con)
1
2
3

0,5 ml/con;
tiêm bắp đùi
0,5 ml/con;
tiêm bắp đùi
0,5 ml/con;
tiêm bắp đùi

Tỷ l
s ng
(%)

10

10

10

100

10

10

10

100

10

10

10

100

16

Bi u hi n
Chuột phát triển, ăn
uống bình thường
Chuột phát triển, ăn
uống bình thường
Chuột phát triển, ăn
uống bình thường


Lợn được kiểm tra an toàn với liều tiêm gấp đôi liều sử dụng theo tiêu chẩn kiểm nghiệm
vacxin vi khuẩn vô hoạt: tất cả 5 lợn trên 4 tuần tuổi được tiêm vacxin theo mỗi lô đều sống
khỏe mạnh, khơng con nào có biểu hiện phản ứng sau khi tiêm qua 10 ngày theo dõi. Điều
này khẳng định rằng vacxin chế tạo đã đạt yêu cầu về chỉ tiêu an toàn 100% trên lợn.
B ng 4.14. K t qu ki m tra an toàn c a vacxin bán thành ph m trên l n
Th i gian S l n thí

Tỷ l
Đ t thí Li u tiêm và
S l n
theo dõi
nghi m
s ng
nghi m đ ng tiêm
s ng (con)
(ngày)
(con)
(%)
1

4 ml/con;
tiêm bắp

2

4 ml/con;
tiêm bắp

3

4 ml/con;
tiêm bắp

Bi u hi n
Lợn khỏe mạnh, khơng có phản

10

10

10

5

5

5

5

5

5

100 ứng nơi tiêm và phản ứng tồn
thân
Lợn
100 ứng
thân
Lợn
100 ứng
thân

khỏe mạnh, khơng có phản
nơi tiêm và phản ứng tồn
khỏe mạnh, khơng có phản
nơi tiêm và phản ứng tồn

B ng 4.15. K t qu th hi u l c c a vacxin trên chu t nh t tr ng
bằngăph ngăphápăthay th
Lô chu t

Lo i canh trùng tiêm

S l

ng chu t

côngăc

ngăđ c

S l ng chu t
ch t (con)

Th i gian ch t
chu t (gi )

APP serotype 2

5

0/5

APP serotype 5a

5

1/5

APP serotype 5b

5

0/5

Thí nghiệm P. multocida serotype A

5

0/5

P. multocida serotype D

5

0/5

S. suis serotype 2

5

0/5

Không tiêm

5

0/5

APP serotype 2

5

5/5

24

APP serotype 5a

5

5/5

48

APP serotype 5b

5

5/5

48-72

P. multocida serotype A

5

5/5

48

P. multocida serotype D

5

5/5

24

S. suis serotype 2

5

5/5

72

Đối chứng

17

48


B ng 4.16. K t qu ki m tra hi u l c vacxin trên l n bằng
ph ngăpháp tr ng tài

Lơ l n

Đ ng
tiêm

Thí
Dưới da
nghi m

Đ i
ch ng

Dưới da

Li u
tiêm
(ml)

5 ml

5 ml

Lo i canh trùng tiêm

S l n công
S
c ngăđ c (con)

l n ch t
(con)

Th i gian
ch t (gi )

A. pleuropneumoniae serotype 2

3

0/3

A. pleuropneumoniae serotype 5a

3

0/3

A. pleuropneumoniae serotype 5b

3

0/3

P. multocida serotype A

3

1/3

P. multocida serotype D

3

0/3

S. suis serotype 2

3

0/3

A. pleuropneumoniae + S. suis +
P. multocida

3

A. pleuropneumoniae serotype 2

2

2/2

24

A. pleuropneumoniae serotype 5a

2

2/2

24

A. pleuropneumoniae serotype 5b

2

2/2

72

P. multocida serotype A

2

2/2

24

P. multocida serotype D

2

2/2

24

S. suis serotype 2

2

2/2

72

A. pleuropneumoniae + S. suis +
P. multocida

2

2/2

24

72

0/3

Ghi chú: LD50 của A. pleuropneumoniae serotype 2 là 4,3 x 107 CFU/0,2 ml và serotype 5 là 4,8 x
107 CFU/0,2 ml. LD50 của chủng P. multocida serotype A là 4 x 107 CFU/0,2 ml và serotype D là
4,2 x 107 CFU/0,2 ml. LD50 của S. suis serotype 2 là 4,4 x 107 CFU/0,2 ml

4.3.3. K t qu so sánh kh nĕngăsinhămi n d ch c aăvacxinăđaăgiáăb tr keo phèn và
vacxinăđaăgiáăb tr nhǜăd u ch ng l i vi khu n A. pleuropneumoniae, P. multocida và
S. suis
4.3.3.1. Kết quả kiểm tra kháng thể của vacxin vô hoạt nhũ dầu
Vacxin bán thành phẩm đa giá đã đạt được chỉ tiêu về cảm quan, vơ trùng, an tồn
và hiệu lực. Tuy nhiên, để biết được khả năng bảo hộ và thời gian bảo hộ của vacxin với
bản động vật, hiệu giá kháng thể theo thời gian cần được xác định.
Kết quả xác định hiệu giá kháng thể của vacxin đa giá cho thấy: trước thời điểm tiêm
vacxin, những lợn thí nghiệm được kiểm tra và thấy đều âm tính kháng thể trong máu. Tuy
nhiên, vacxin đa giá đã giúp cho cơ thể lợn sản sinh kháng thể ở mức cao. Vào thời điểm 21

ngày sau tiêm vacxin, hàm lượng kháng thể chống A. pleuropneumoniae dao động từ 6,5 ±
0,71 log2 đến 7,4 ± 0,52 log2. Hàm lượng kháng thể chống P. multocida type A và D là
6,5 ± 0,53 và 6,4 ± 0,52 còn hàm lượng kháng thể chống S. suis type 2 là 6,0 ± 0,00 log2.
Với hiệu giá kháng thể ở những thời điểm sau đó (2 tháng, 3 tháng, 4 tháng, 5 tháng) đã
cho thấy, hàm lượng kháng thể chống lại những mầm bệnh xét nghiệm giảm dần.

18


B ng 4.17. K t qu ki m tra kháng th trên l n tiêm vacxin vô ho tănhǜăd u phòng
viêm ph i l n kháng l i vi khu n A. Pleuropneumoniae (serotype 2, 5a, 5b), P.
multocida (serotype A, D), và S. suis serotype 2
Ch ătiêuătheoădõi
A. pleuropneumoniae
serotype 2
A. pleuropneumoniae
serotype 5a
A. pleuropneumoniae
serotype 5b
P. multocida serotype A
P. multocida serotype D
S. suis serotype 2

K tăqu ăxácăđ nhăhi uăgiáăkhángăth (log2)
Sau tiêm vacxin

Tr că
tiêm
21 ngày
vacxin

2 tháng

3 tháng

4 tháng

5 tháng

-

6,7d ± 0,48

4,9c ± 0,57

4,6bc ± 0,52 4,0ab ± 0,00 3,4a ± 1,26

-

6,5c ± 0,71

5,0b ± 0,82

4,3ab ± 0,48 3,9a ± 0,32 3,6a ± 0,52

-

7,4d ± 0,52

5,8c ± 0,92

4,7b ± 0,67 4,1ab ± 0,32 3,8a ± 0,42

-

6,5b ± 0,53 6,4b ± 0,52
6,4c ± 0,52 5,9bc ± 0,32
6,0c ± 0,00 5,9c ± 0,32

6,2b ± 0,42
5,8b ± 0,42
5,8c ± 0,42

5,9b ± 0,32 5,2a ± 0,79
5,7b ± 0,48 4,9a ± 0,32
4,9b ± 0,32 4,0a ± 0,00

Ghi chú: a, b, c: Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P < 0,05
4.3.3.2. Kết quả so sánh hình thành kháng thể kháng vi khuẩn A. pleuropneumoniae
của vacxin đa giá bổ trợ keo phèn và vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu

Lợn thí nghiệm được chia ra 3 lơ: lơ 1 có 5 lợn được tiêm vacxin có bổ trợ keo
phèn; Lơ 2 có 5 lợn, được tiêm vacxin có bổ trợ nhũ dầu; Lơ 3 có 3 lợn đối chứng, được
tiêm nước sinh lý. Huyết thanh của lợn sau khi tiêm vacxin 21 ngày, sử dụng để xác định
hàm lượng kháng thể hình thành trong máu sau khi tiêm vacxin 21 ngày
B ng 4.18. K t qu so sánh hình thành kháng th kháng vi khu n
A. pleuropneumoniae c aăvacxinăđaăgiáăb tr keoăphènăvƠăvacxinăđaăgiáăb tr nhǜă
d u bằngăph ng pháp ELISA
S
S tai

TT

1
2
3
4
5

TN1
TN2
TN3
TN4
TN5

6 TN6
7 TN7
8 TN8
9 TN9
10 TN10
11 TN11
12 TN12
13 TN13
14
15

Lo i
vacxin

Đ ng
tiêm

Li u
tiêm

Serotype 2

OD450

0,712
0,47
Keo phèn Dưới da 2 ml
1,215
0,633
0,441
Trung bình
1,795
1,361
Nhũ dầu
Bắp
2 ml
1,53
1,265
2,365
Trung bình
0,043
Nước thịt Dưới da 2 ml
0,047
0,048
Đối chứng dương
1,030

Đối chứng âm
0,054

19

S/P

Serotype 5
Đánhă
giá
OD450
S/P

67,418 +
42,623 +
118,955 +
59,324 +
39,652 +
65,59a ± 31,98
178,381 +
133,914 +
151,230 +
124,078 +
236,783 +
164,88b ± 45,17
-1,127
-0,717
-0,615

0,591

1,421
0,54
0,59
0,112
2,365
1,53
1,265
1,361
1,795
0,045
0,049
0,052
1,002
0,058

Đánhă
giá

56,462 +
144,386 +
51,059 +
56,356 +
5,720
62,80a ± 55,33
244,385 +
155,932 +
127,860 +
138,029 +
184,004 +
170,04b ± 46,70

-1,377
-0,953
-0,636


Kết quả ở bảng 4.18 cho thấy: trong 10 lợn được tiêm vacxin viêm phổi đa giá có 9/10
lợn dương tính với kháng thể kháng vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2 và 5. Trong
khi đó lợn đối chứng đều âm tính với kháng thể này. Kết quả cũng cho thấy: các chỉ số
OD và S/P đánh giá vacxin nhũ dầu kích thích cơ thể lợn hình thành kháng thể kháng vi
khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2 và 5 tốt hơn ở lợn được tiêm vacxin viêm phổi đa
giá có bổ keo phèn.
4.3.3.3. Kết quả so sánh hiệu giá kháng thể kháng vi khuẩn P. multocida của vacxin đa
giá bổ trợ keo phèn và vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu
Để so sánh hiệu giá kháng thể kháng vi khuẩn P. multocida serotype A và D hình
thành trong máu lợn sau khi tiêm hai loại vacxin vơ hoạt có bổ trợ keo phèn và bổ trợ
nhũ dầu khác nhau ở lợn sau 21 ngày được tiêm vacxin, chúng tôi đã lấy máu lợn ở cả
3 lô khác nhau trước và sau khi tiêm 21 ngày, tiến hành làm phản ứng ngưng kết.
B ng 4.19. K t qu so sánh hi u giá kháng th kháng vi khu n P. multocida c a vacxin
đaăgiáăb tr keoăphènăvƠăvacxinăđaăgiáăb tr nhǜăd u
S
S tai Lo i vacxin Đ
TT
1

TN1

2

TN2

3
4
5

TN3
TN4
TN5

6
7
8

TN6
TN7
TN8

Keo phèn

ng tiêm

Serotype
A

2 ml

3Log2

+

3Log2

+

3Log2

+

3Log2

+

Dưới da

Trung bình
2 ml
Nhũ dầu

Bắp

9 TN9
10 TN10
11 TN11
12 TN12
13 TN13

Nước thịt

Đánhă Serotype
Đánhăgiá
giá

D

Li u
tiêm

Trung bình
2 ml
Dưới da

4Log2
+
4Log2
+
4Log2
+
3,60 Log2 ± 0,55
4Log2
+
4Log2
+
5Log2
+

4Log2
+
4Log2
+
4Log2
+
3,60 Log2 ± 0,55

4Log2
+
4Log2
+
5Log2
+

4Log2
+
5Log2
+
4,40 Log2 ± 0,55
-

4Log2
+
5Log2
+
4,40 Log2 ± 0,55
-

Kết quả cho thấy: hàm lượng kháng thể kháng vi khuẩn P. multocida serotype A
và D ở lợn được tiêm vacxin viêm phổi đa giá có bổ trợ nhũ dầu có cao hơn so với 5
lợn được tiêm vacxin viêm phổi đa giá có bổ keo phèn.

20


4.3.3.4. Kết quả so sánh hiệu giá kháng thể kháng vi khuẩn S. suis của vacxin đa giá
bổ trợ keo phèn và vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu

Kết quả này bước đầu cho thấy khơng có sự khác biệt khả năng hình thành kháng thể
kháng vi khuẩn S. suis serotype 2 ở lợn được tiêm vacxin viêm phổi đa giá có bổ trợ nhũ
dầu. Do đó cần tiếp tục nghiên cứu với số lượng mẫu nhiều hơn và thời gian miễn dịch
kéo dài hơn để đánh giá về khả năng bảo hộ của 2 loại vacxin bổ trợ keo phèn và bổ trợ
nhũ dầu đối với lợn.
B ng 4.20. K t qu so sánh hi u giá kháng th kháng vi khu n S. suis c aăvacxinăđaă
giá b tr keoăphènăvƠăvacxinăđaăgiáăb tr nhǜăd u
Số TT

Số tai

Loại vacxin

Đường tiêm

Liều tiêm

Serotype 2

Đánh giá

1

TN1

Keo phèn

Dưới da

2ml

3Log2

+

2

TN2

Keo phèn

Dưới da

2ml

3Log2

+

3

TN3

Keo phèn

Dưới da

2ml

4Log2

+

4

TN4

Keo phèn

Dưới da

2ml

4Log2

+

5

TN5

Keo phèn

Dưới da

2ml

4Log2

+

Trung bình

3,60 Log2 ± 0,55

6

TN6

Nhũ dầu

Bắp

2ml

4Log2

+

7

TN7

Nhũ dầu

Bắp

2ml

4Log2

+

8

TN8

Nhũ dầu

Bắp

2ml

4Log2

+

9

TN9

Nhũ dầu

Bắp

2ml

4Log2

+

10

TN10

Nhũ dầu

Bắp

2ml

5Log2

+

Trung bình

4,20 Log2 ± 0,55

11

TN11

Nước thịt

Dưới da

2ml

-

-

12

TN12

Nước thịt

Dưới da

2ml

-

-

13

TN13

Nước thịt

Dưới da

2ml

-

-

4.3.4. K tăqu ăxácăđ nhăli uătiêmăvacxinăviêmăph iăl n
Nhằm xác định liều tiêm vacxin viêm phổi lợn phù hợp để có hiệu lực bảo hộ đàn
lợn sau khi tiêm vacxin cao nhất và có độ dài miễn dịch dài nhất như sau: Lơ lợn thí
nghiệm gồm 15 con, chia làm 3 nhóm khác nhau, mỗi nhóm lợn thí nghiệm có 5 lợn.

21


B ng 4.21. K t qu xácăđ nh kháng th

l n tiêm vacxin v i li u tiêm khác nhau

K t qu xácăđ nh hi u giá kháng th
M u HT Tr c tiêm
vacxin

Sau tiêm vacxin
A. pleuropneumoniae

P. multocida

S. suis

1
2

KT1
KT2

-

5Log2
5Log2

5Log2
5Log2

5Log2
5Log2

3

KT3

-

5Log2

5Log2

5Log2

4

KT4

-

5Log2

5Log2

5Log2

5

KT5

-

5Log2

5Log2

5Log2

6

KT6

-

5Log2

5Log2

6Log2

7

8
9

KT7
KT8
KT9

-

5Log2
5Log2
6Log2

5Log2
6Log2
6Log2

5Log2
5Log2
5Log2

10
11
12
13
14

KT10
KT11
KT12

KT13
KT14

-

6Log2
6Log2
7Log2
6Log2
6Log2

6Log2
6Log2
6Log2
6Log2
7Log2

6Log2
6Log2
6Log2
7Log2
6Log2

15

KT15

-

6Log2

6Log2

6Log2

Kết quả cho thấy: ở nhóm 1 (KT1-KT5) tiêm 1 mũi duy nhất với liều tiêm 2ml/con,

Lợn ở nhóm 2 (KT6-KT10): tiêm 2 mũi với liều tiêm 1ml/con, cách nhau 7 ngày
Lợn ở nhóm 3 (KT11-KT15): tiêm 2 mũi với liều tiêm 2ml/con, cách nhau 7
ngày, sau khi tiêm vacxin 1 tháng, hiệu giá kháng thể kháng vi khuẩn A.
pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis cao nhất so với 2 nhóm trên và đạt hiệu
giá từ 6Log2 đến 7Log2.
Như vậy có thể đánh giá liều tiêm vacxin cho lợn đạt hiệu lực bảo hộ cao nhất là tiêm
vacxin viêm phổi lợn 2 mũi, với liều tiêm 2ml/con /mũi cách nhau 7 ngày, tiêm dưới da
sau hốc tai.
4.3.4. K tăqu ăxơyăd ngăquyătrìnhăs năxu tăvacxinăđaăgiáăvơăho tăb ătr ănhǜăd uă
phịngăb nhăviêmăph iă ăl n
Trên kết nghiên cứu chế tạo và đánh giá chất lượng vacxin đa giá vơ hoạt bổ trợ
nhũ dầu phịng bệnh viêm phổi cho lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae; P. multocida
và S. suis gây ra ở lợn tại các lứa tuổi khác nhau, chúng tơi đã xây dựng được quy trình
sản xuất vacxin đa giá vơ hoạt có bổ trợ nhũ dầu được tóm tắt ở trang sau.

22


Tóm tắt quy trình sản xuất vacxin viêm phổi đa giá bổ trợ nhũ dầu
Ghi chú: - TW: Tryptone Water

- TYE: Tryptone Yeast Extract Broth

- PLLO: Pleuropneumonia-like organism

- TSB: Tryptic Soy Broth

- BHI: Brain Heart Infusion

- THB: Todd Hewitt Broth

4.3.5. K tă qu ă xơyă d ngă quyă trìnhă s ă d ngăvacxină đaăgiáăvơă ho tăb ătr ănhǜă d uă
phịngăb nhăviêmăph iăchoăl n
Trên kết quả nghiên cứu sử dụng vacxin phịng bệnh viêm phổi ở lợn tại thực địa,
chúng tơi xây dựng quy trình sử dụng vacxin phịng bệnh viêm phổi lợn do vi khuẩn
A. pleuropneumoniae; P. multocida và Streptococcus suis gây ra. Vacxin viêm phổi được
tiêm bắp thịt với liều lượng như sau:
+ Lợn từ 21 ngày tuổi, sau cai sữa: tiêm 1 lần với 1 mũi tiêm duy nhất: 2ml/con
+ Lợn nái chửa: 1 năm tiêm 2 lần, mỗi 1 lần tiêm cần tiêm 2 mũi khác nhau: Mũi 1:
2ml/con, tiêm cho lợn nái chửa trước khi đẻ 1 tháng; Mũi 2: 2ml/con, sau mũi 1: 7- 10
ngày.
+ Lợn đực giống: 1 năm tiêm 2 lần, mỗi mũi tiêm 2 ml/con.
23