Tài liệu Bài thuyết trình Lai phân tử docx

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
BỘ MÔN : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Lớp : DHO4SH
Lớp : DHO4SH
BÀI THUYẾT TRÌNH
BÀI THUYẾT TRÌNH
LAI PHÂN TỬ
LAI PHÂN TỬ
(DNA Hybridization)
(DNA Hybridization)

1.
1.
Lê Duy Hoàng Chương
Lê Duy Hoàng Chương
2. Lê Vũ Hồng Hải
2. Lê Vũ Hồng Hải
3. Nguyễn Thúy Hằng
3. Nguyễn Thúy Hằng
4. Đặng Cao Hạnh
4. Đặng Cao Hạnh
5. Vũ Quang Hiếu
5. Vũ Quang Hiếu
6. Huỳnh Thanh Hồng
6. Huỳnh Thanh Hồng
7. Trần Ánh Hồng

7. Trần Ánh Hồng
8. Nguyễn Thị Tuyết Nga
8. Nguyễn Thị Tuyết Nga
9. Mã Phạm Quế Mai
9. Mã Phạm Quế Mai
Thành viên :
Thành viên :

DÀN BÀI CHUNG
DÀN BÀI CHUNG
I-Lịch sử lai phân tử
II–Cơ sở của sự lai phân tử
II–Cơ sở của sự lai phân tử
III-Các phương pháp lai phân tử
III-Các phương pháp lai phân tử
IV-Ứng dụng của lai phân tử
IV-Ứng dụng của lai phân tử


Tài liệu tham khảo
Tài liệu tham khảo

I-Lịch sử lai phân tử:
- 1960 Julius Marmur và những đồng nghiệp
của ông quản lý, ngành học tại đại học Harvard
đã khám phá ra quá trình ủ lại (reannealing).
Quá trình này bao gồm sự kết hợp lại của
những mạch đơn thành các phân tử 2 mạch đôi
bền vững. Từ sự khám phá ra quá trình
reannealing, phương pháp lai các sour nucleic

được phát
triển.
triển.
- Sử dụng kỹ thuật những mạch bổ sung từ các
nguồn khác nhau của acid nucleic có thể trộn
lẫn thành dạng phân tử 2 mạch đôi được đặt tên
là thể lai (hybrid).

Sử dụng lai DNA như một kỹ thuật
so sánh dùng cặp base bổ sung để đối
chiếu bộ gene chứa toàn bộ nội dung di
truyền của 2 loài khác nhau và đánh giá
những điểm tương đồng giữa chúng.

Mục đích :
Từ sự phát triển đó, việc lai phân tử mở
rộng ra nhiều kỹ thuật khác nhau và được
dùng vào những mục đích đa dạng.





Khi một phân tử DNA mạch đôi
Khi một phân tử DNA mạch đôi
được đun lên một nhiệt độ vượt quá
được đun lên một nhiệt độ vượt quá
“nhiệt độ nóng chảy” (Tm) thì hai
“nhiệt độ nóng chảy” (Tm) thì hai
mạch sẽ tách rời nhau do sự phá vỡ

mạch sẽ tách rời nhau do sự phá vỡ
các liên kết hydro nối liền hai mạch.
các liên kết hydro nối liền hai mạch.


II–Cơ sở của sự lai phân tử :
II–Cơ sở của sự lai phân tử :
1–Khái niệm về “nhiệt độ nóng chảy “
1–Khái niệm về “nhiệt độ nóng chảy “
của DNA :
của DNA :

Đường cong Tm
Đường cong Tm



- Ảnh hưởng của các thành phần
- Ảnh hưởng của các thành phần
base trong phân tử DNA .
base trong phân tử DNA .


- Ảnh hưởng của độ dài đoạn
- Ảnh hưởng của độ dài đoạn
DNA .
DNA .


- Ảnh hưởng của các điểm bắt

- Ảnh hưởng của các điểm bắt




cặp sai lệch (các mismatch) .
cặp sai lệch (các mismatch) .




- Ảnh hưởng của môi trường
- Ảnh hưởng của môi trường




phản ứng
phản ứng .
2–Các nhân tố ảnh hưởng đến “nhiệt độ
2–Các nhân tố ảnh hưởng đến “nhiệt độ
nóng chảy” của DNA :
nóng chảy” của DNA :



- Sau khi hai mạch của phân tử DNA tách
- Sau khi hai mạch của phân tử DNA tách
rời nhau dưới tác động của Tm, sự bắt cặp sẽ
rời nhau dưới tác động của Tm, sự bắt cặp sẽ

không xảy ra nếu nhiệt độ phản ứng hạ xuống
không xảy ra nếu nhiệt độ phản ứng hạ xuống
đột ngột.
đột ngột.


- Lúc đó phân tử DNA sẽ tồn tại trong môi
- Lúc đó phân tử DNA sẽ tồn tại trong môi
trường ở dạng mạch đơn dưới một cấu hình
trường ở dạng mạch đơn dưới một cấu hình
không gian vô trật tự. Ngược lại, nếu sau khi hai
không gian vô trật tự. Ngược lại, nếu sau khi hai
mạch tách rời, nhiệt độ được gíảm từ từ cộng
mạch tách rời, nhiệt độ được gíảm từ từ cộng
với điều kiện thí nghiệm thích hợp, hai mạch sẽ
với điều kiện thí nghiệm thích hợp, hai mạch sẽ
bắt cặp trở lại.
bắt cặp trở lại.






Hiện tượng này được gọi là sự lai phân
Hiện tượng này được gọi là sự lai phân
tử (molecular hybridization).
tử (molecular hybridization).
3-Khái niệm về lai phân tử :
3-Khái niệm về lai phân tử :





Đặc hiệu tuyệt đối : sự tái bắt
Đặc hiệu tuyệt đối : sự tái bắt
cặp chỉ xảy ra giữa hai trình tự hoàn toàn
cặp chỉ xảy ra giữa hai trình tự hoàn toàn
bổ sung.
bổ sung.




Các trình tự bổ sung có thể là
Các trình tự bổ sung có thể là
DNA hay RNA, dẫn đến sự hình thành các
DNA hay RNA, dẫn đến sự hình thành các
phân tử DNA-DNA, RNA-RNA hay các
phân tử DNA-DNA, RNA-RNA hay các
phân tử lai DNA-RNA.
phân tử lai DNA-RNA.




Đặc điểm
Đặc điểm

:
:

-
-
Nồng độ DNA, nghĩa là số
Nồng độ DNA, nghĩa là số
lượng các trình tự bổ sung, càng cao thì
lượng các trình tự bổ sung, càng cao thì
xác suất
xác suất
tiếp xúc
tiếp xúc
với nhau càng tăng ;
với nhau càng tăng ;




tốc độ phản ứng lai phân tử tăng lên.
tốc độ phản ứng lai phân tử tăng lên.


- T
- T
hời gian phản ứng càng
hời gian phản ứng càng
dài thì xác suất tiếp xúc càng lớn hơn và số
dài thì xác suất tiếp xúc càng lớn hơn và số
lượng phân tử lai tăng dần cho đến khi toàn

lượng phân tử lai tăng dần cho đến khi toàn
bộ các trình tự bổ sung đều tái
bộ các trình tự bổ sung đều tái
bắt cặp
bắt cặp
.
.
4-Các yếu tố ảnh hưởng đến sự lai phân tử :
4-Các yếu tố ảnh hưởng đến sự lai phân tử :
4-1 Nồng độ DNA và thời gian phản
4-1 Nồng độ DNA và thời gian phản
ứng
ứng

Nồng độ NaCl 1M làm tăng tốc độ
Nồng độ NaCl 1M làm tăng tốc độ
phản ứng lên từ 5 -10 lần . Nồng độ
phản ứng lên từ 5 -10 lần . Nồng độ
NaCl > 1,2M lại hoàn toàn không còn tác
NaCl > 1,2M lại hoàn toàn không còn tác
dụng.
dụng.


4-2 Nhiệt độ
4-2 Nhiệt độ
Thông thường tốc độ phản ứng lai
Thông thường tốc độ phản ứng lai
cực đại ở nhiệt độ thấp hơn Tm của chính
cực đại ở nhiệt độ thấp hơn Tm của chính

nucleic acid đó độ 25%.
nucleic acid đó độ 25%.
4-3 Độ dài của các trình tự
4-3 Độ dài của các trình tự
Tốc độ lai tăng tỉ lệ thuận với căn
Tốc độ lai tăng tỉ lệ thuận với căn
bậc
bậc
hai
hai
của độ dài các trình tự bổ sung.
của độ dài các trình tự bổ sung.
4-4 Lực ion
4-4 Lực ion

III-Các phương pháp lai phân tử :
III-Các phương pháp lai phân tử :
Các phương pháp lai phân tử rất đa
Các phương pháp lai phân tử rất đa
dạng
dạng
,
,


cơ bản
cơ bản
có thể chia thành
có thể chia thành
3

3
nhóm
nhóm
lớn :
lớn :


- Lai trong pha lỏng
- Lai trong pha lỏng


- Lai trên pha rắn
- Lai trên pha rắn


- Lai tại chỗ (in situ hybridization)
- Lai tại chỗ (in situ hybridization)

1-Lai trong pha lỏng :
1-Lai trong pha lỏng :
- Các mạch đơn nằm trong môi trường
- Các mạch đơn nằm trong môi trường
lỏng là một dung dịch đệm.
lỏng là một dung dịch đệm.
- Sự lai phân tử xảy ra khi các trình tự
- Sự lai phân tử xảy ra khi các trình tự
này gặp nhau do chuyển động nhiệt và
này gặp nhau do chuyển động nhiệt và
khi nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít
khi nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít

nhất vài độ.
nhất vài độ.
1-1 Nguyên tắc :
1-1 Nguyên tắc :

1-2 Phân tích định lượng các phân tử lai :
1-2 Phân tích định lượng các phân tử lai :
-
Phương pháp dùng quang phổ kế
Phương pháp dùng quang phổ kế
-
Phương pháp sử dụng nuclease S1
Phương pháp sử dụng nuclease S1
-
Phương pháp sắc kí trên hydroxylapatite
Phương pháp sắc kí trên hydroxylapatite
3 phương pháp
3 phương pháp
thường được sử dụng:
thường được sử dụng:

i.
i.
Phương pháp dùng quang phổ kế
Phương pháp dùng quang phổ kế


-

DNA mạch đôi hấp thu ánh sáng yếu hơn
DNA mạch đôi hấp thu ánh sáng yếu hơn
DNA mạch đơn.
DNA mạch đơn.
-


Sự chuyển từ mạch đôi sang dạng mạch
Sự chuyển từ mạch đôi sang dạng mạch
đơn được xác định dễ dàng thông qua việc đo
đơn được xác định dễ dàng thông qua việc đo
biến động giá trị của mật độ quang (OD) ở
biến động giá trị của mật độ quang (OD) ở
bước sóng 260 nm.
bước sóng 260 nm.
-


Giá trị mật độ quang tăng lên khi phân tử
Giá trị mật độ quang tăng lên khi phân tử
mạch đôi chuyển thành mạch đơn, hiện
mạch đôi chuyển thành mạch đơn, hiện
tượng này có tên gọi là
tượng này có tên gọi là
hiệu ứng siêu sắc
hiệu ứng siêu sắc


(
(

hyperchromic effect
hyperchromic effect
).
).

Hiệu ứng siêu sắc
Hiệu ứng siêu sắc
:
:
Nhuộm tím phân tử DNA ,
Nhuộm tím phân tử DNA ,
nếu đem chúng đun nóng
nếu đem chúng đun nóng
lên và làm lạnh từ từ thì
lên và làm lạnh từ từ thì
kết quả là các phân tử
kết quả là các phân tử
DNA sẽ trở nên tím đậm
DNA sẽ trở nên tím đậm
hơn lúc đầu một chút. Nếu
hơn lúc đầu một chút. Nếu
hạ nhiệt độ một cách đột
hạ nhiệt độ một cách đột
ngột thì chúng sẽ trở nên
ngột thì chúng sẽ trở nên
rất đậm. Đó là do hiện
rất đậm. Đó là do hiện
tượng các mạch đơn DNA
tượng các mạch đơn DNA
hấp thu tia UV mạnh hơn

hấp thu tia UV mạnh hơn
DNA mạch đôi.
DNA mạch đôi.

-


Nuclease S1 là enzyme thủy giải các
Nuclease S1 là enzyme thủy giải các
nucleic acid mạch đơn bất kể là DNA hay
nucleic acid mạch đơn bất kể là DNA hay
RNA trong một số điều kiện thực nghiệm.
RNA trong một số điều kiện thực nghiệm.
-


Dung dịch phản ứng lai được trích ra một
Dung dịch phản ứng lai được trích ra một
phần, đem xử lí với nuclease S1.
phần, đem xử lí với nuclease S1.
-


Các mạch đơn sẽ bị thủy giải, các nucleic
Các mạch đơn sẽ bị thủy giải, các nucleic
acid còn lại tương ứng với các phân tử lai
acid còn lại tương ứng với các phân tử lai
được thu nhận qua phương pháp tủa rồi
được thu nhận qua phương pháp tủa rồi
đem định lượng .

đem định lượng .
ii.
ii.
Phương pháp sử dụng nuclease S1
Phương pháp sử dụng nuclease S1



iii.
iii.
Phương pháp sắc kí trên hydroxylapatite
Phương pháp sắc kí trên hydroxylapatite
-


Hydroxylapatite là những tinh thể phosphat
Hydroxylapatite là những tinh thể phosphat
calci .
calci .
-
Kỹ thuật này sử dụng các mồi đánh dấu
Kỹ thuật này sử dụng các mồi đánh dấu
(đoạn nucleotide hoặc kháng thể ) để lai với
(đoạn nucleotide hoặc kháng thể ) để lai với
ADN,ARN hoặc với các protein ở trong các tế
ADN,ARN hoặc với các protein ở trong các tế
bào mà không cần tách chiết.
bào mà không cần tách chiết.
-

Sau khi các hỗn hợp bị đốt nóng, chúng
Sau khi các hỗn hợp bị đốt nóng, chúng
được làm lạnh để những mạch đơn va chạm
được làm lạnh để những mạch đơn va chạm
ngẫu nhiên. Các hỗn hợp được ủ khoảng
ngẫu nhiên. Các hỗn hợp được ủ khoảng
120h ở 60
120h ở 60
0
0
C trong một dung dịch đệm Natri
C trong một dung dịch đệm Natri
phosphat.
phosphat.