Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị luận án tiến sĩ

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

HUỲNH VĂN CHƯƠNG

KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ
CỦA BỆNH CẦU TRÙNG Ở GÀ VÀ NGHIÊN CỨU
CHẾ TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC SỬ DỤNG
TRONG PHỊNG TRỊ

Chun ngành:

Bệnh lý học và chữa bệnh vật ni

Mã số:

62 64 01 02

Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Đinh Thị Bích Lân
2. PGS.TS. Nguyễn Hữu Nam

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017



LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên
cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ
lấy bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn,
các thơng tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày 28 tháng 7 năm 2017
Tác giả luận án

Huỳnh Văn Chương

i


LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hồn thành luận án, tơi đã nhận được
sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cơ giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè,
đồng nghiệp và gia đình.
Nhân dịp hồn thành luận án, cho phép tơi được bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn
sâu sắc tới thầy cơ PGS.TS. Đinh Thị Bích Lân, PGS.TS. Nguyễn Hữu Nam đã tận tình
hướng dẫn, dành nhiều cơng sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt q trình
học tập và thực hiện đề tài.
Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ
môn Bệnh lý, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Bộ môn Miễn dịch học
và vắc xin, Viện Công nghệ sinh học - Đại học Huế đã tận tình giúp đỡ tơi trong q
trình học tập, thực hiện đề tài và hồn thành luận án.
Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận án.

Hà Nội, ngày 28 tháng 7 năm 2017
Nghiên cứu sinh

Huỳnh Văn Chương

ii


MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan ...................................................................................................................................... i
Lời cảm ơn ......................................................................................................................................... ii
Mục lục ..........................................................................................................................................iii
Danh mục chữ viết tắt....................................................................................................................vii
Danh mục bảng ..............................................................................................................................viii
Danh mục hình ................................................................................................................................. ix
Danh mục biểu đồ ........................................................................................................................... xi
Danh mục đồ thị..............................................................................................................................xii
Trích yếu luận án ...........................................................................................................................xiii
Thesis abstract ................................................................................................................................. xv
Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................................ 1
1.1.

Tính cấp thiết của đề tài ............................................................................................... 1

1.2.

Mục tiêu của đề tài ........................................................................................................ 3

1.3.

Phạm vi nghiên cứu ....................................................................................................... 3

1.4.

Những đóng góp mới của đề tài.................................................................................. 3

1.5.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .................................................................. 3

Phần 2. Tổng quan tài liệu........................................................................................................ 4
2.1.

Giới thiệu về bệnh cầu trùng gà .................................................................................. 4

2.1.1.

Căn bệnh cầu trùng ........................................................................................................ 4

2.1.2.

Đặc điểm dịch tễ .......................................................................................................... 12

2.1.3.

Sinh bệnh học ............................................................................................................... 14

2.1.4.

Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích của gà bị bệnh cầu trùng ............................ 14

2.1.5.

Các phương pháp chẩn đoán bệnh cầu trùng gà .................................................... 16

2.1.6.

Điều trị bệnh cầu trùng gà.......................................................................................... 18

2.1.7.

Miễn dịch chống cầu trùng ở gà ............................................................................... 18

2.1.8.

Vắc xin phòng bệnh cầu trùng gà ............................................................................. 20

2.2.

Tổng quan về công nghệ ADN tái tổ hợp ............................................................... 21

2.2.1.

Giới thiệu chung về công nghệ ADN tái tổ hợp .................................................... 21

2.2.2.

Đặc điểm của hệ thống vector pET, pGEM-T Easy, tạo dòng và biểu
hiện gene trong E. coli ................................................................................................ 21

iii


2.3.

Cơng nghệ chế tạo kháng thể lịng đỏ trứng bằng phương pháp gây
miễn dịch cho gà mái .................................................................................................. 24

2.3.1.

Trọng lượng phân tử và tính chất lý hóa của IgY (Yolk
Immunoglobulin) ......................................................................................................... 24

2.3.2.

Cấu trúc của IgY .......................................................................................................... 24

2.3.3.

Độ bền của IgY ............................................................................................................ 25

2.3.4.

Lợi thế của công nghệ sản xuất IgY ........................................................................ 26

2.3.5.

Tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng gà ......................................................................... 27

2.3.6.

Những ứng dụng của IgY .......................................................................................... 28

Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu .................................................................. 31

3.1.

Địa điểm nghiên cứu ................................................................................................... 31

3.2.

Thời gian nghiên cứu .................................................................................................. 31

3.3.

Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu ................................................................ 31

3.3.1.

Vật liệu nghiên cứu ..................................................................................................... 31

3.3.2.

Thiết bị và hóa chất dùng cho nghiên cứu ............................................................. 31

3.4.

Nội dung nghiên cứu .................................................................................................. 33

3.4.1.

Khảo sát các đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà ..................................... 33

3.4.2.

Nghiên cứu tách dịng gene mã hóa kháng ngun, tạo plasmid mang
gene kháng nguyên, biến nạp vào tế bào E. coli ................................................... 33

3.4.3.

Nghiên cứu biểu hiện gene kháng nguyên, tách chiết, tinh khiết và định
lượng kháng nguyên tái tổ hợp ................................................................................. 33

3.4.4.

Kiểm tra độ tinh khiết và tính đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp .............. 33

3.4.5.

Nghiên cứu sản xuất bột lịng đỏ trứng gà có kháng thể phịng trị bệnh ......... 33

3.5.

Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................... 34

3.5.1.

Phương pháp theo dõi triệu chứng lâm sàng và xác định bệnh tích đại
thể, vi thể của gà mắc cầu trùng ............................................................................... 34

3.5.2.

Phương pháp xác định chỉ tiêu huyết học của gà mắc bệnh cầu trùng ............. 34

3.5.3.

Phương pháp tách chiết ADN để xác định loài cầu trùng gây bệnh ở gà ........ 35

3.5.4.

Phương pháp phân lập gene mã hóa kháng nguyên 3-1E ................................... 35

3.5.5.

Nghiên cứu tạo dịng gene mã hóa kháng ngun trong vector tạo dòng
và biến nạp vào tế bào vật chủ E. coli TOP10. ..................................................... 37

3.5.6.

Nghiên cứu tạo dòng gene 3-1E trong vector pET200/D-TOPO và biểu
hiện gene kháng nguyên 3-1E................................................................................... 39

3.5.7.

Phương pháp tách chiết tinh khiết, xác định tính đặc hiệu và định lượng
của kháng nguyên 3-1E tái tổ hợp ........................................................................... 40

iv


3.5.8.

Phương pháp chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng và trị
bệnh cầu trùng gà ......................................................................................................... 41

3.5.9.

Phương pháp đánh giá hiệu quả phòng và điều trị bệnh cầu trùng của
chế phẩm ........................................................................................................................ 42

3.5.10.

Phương pháp xử lý số liệu ......................................................................................... 43

Phần 4. Kết quả và thảo luận ................................................................................................ 44
4.1.

Tỷ lệ nhiễm, cường độ nhiễm, triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại
thể, vi thể ở gà mắc cầu trùng ................................................................................... 44

4.1.1.

Tỷ lệ và cường độ nhiễm cầu trùng gà nuôi tại huyện Phú Vang, Thừa
Thiên Huế ...................................................................................................................... 44

4.1.2.

Tỷ lệ nhiễm cầu trùng theo lứa tuổi ở gà từ 1 đến 42 ngày tuổi ........................ 44

4.1.3.

Triệu chứng lâm sàng chủ yếu ở gà mắc bệnh cầu trùng .................................... 46

4.1.4.

Bệnh tích đại thể chủ yếu ở gà mắc bệnh cầu trùng ............................................. 47

4.1.5.

Bệnh tích vi thể chủ yếu ở một số cơ quan của gà mắc bệnh cầu trùng ........... 50

4.2.

Kết quả nghiên cứu các chỉ tiêu huyết học của gà mắc bệnh cầu trùng ........... 54

4.2.1.

Một số chỉ tiêu hồng cầu ở gà từ 1-42 ngày tuổi mắc bệnh cầu trùng .............. 55

4.2.2.

Kết quả nghiên cứu các chỉ tiêu hệ bạch cầu ở gà mắc bệnh cầu trùng
(35-42 ngày tuổi) ......................................................................................................... 56

4.2.3.

Kết quả nghiên cứu hàm lượng protein huyết thanh ở gà mắc bệnh cầu
trùng (35-42 ngày tuổi)............................................................................................... 58

4.3.

Kết quả phân lập gene mã hóa kháng nguyên 3-1E ............................................. 59

4.3.1.

Thu và tinh sạch Oocyst cầu trùng gà ...................................................................... 59

4.3.2.

Xác định loài cầu trùng bằng phương pháp PCR .................................................. 59

4.3.3.

Kết quả tách chiết ARN tổng số ............................................................................... 60

4.3.4.

Kết quả thực hiện PCR ............................................................................................... 61

4.3.5.

Tinh sạch sản phẩm PCR ........................................................................................... 62

4.4.

Kết quả nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gene 3-1E.......................................... 63

4.4.1.

Kết quả tạo dòng gene kháng nguyên 3-1E vào vector tách dòng .................... 63

4.4.2.

Phân tích trình tự gene 3-1E ...................................................................................... 64

4.4.3.

Kết quả tạo dịng gene mã hóa kháng ngun 3-1E vào vector biểu hiện
pET200/D-TOPO......................................................................................................... 66

4.4.4.

Kết quả về tinh khiết và khả năng liên kết của kháng nguyên 3-1E cùng
đuôi dung hợp 6His với cột Ni2+ ............................................................................. 68

4.5.

Tối ưu điều kiện biểu hiện của kháng nguyên 3-1E tái tổ hợp .......................... 70

v


4.5.1.

Kết quả sinh trưởng của E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp mang gene mã
hóa kháng nguyên 3-1E.............................................................................................. 70

4.5.2.

Kết quả về khảo sát đường cong sinh trưởng ........................................................ 71

4.5.3.

Kết quả về tỷ lệ tiếp giống tối ưu ............................................................................. 72

4.5.4.

Kết quả tốc độ lắc tối ưu lên khả năng sinh trưởng của vi khuẩn E. coli
chủng BL21 (DE3) ...................................................................................................... 73

4.5.5.

Kết quả về môi trường biểu hiện tối ưu .................................................................. 74

4.5.6.

Nồng độ tối ưu của chất cảm ứng IPTG ................................................................. 74

4.5.7.

Thời gian cảm ứng của chất cảm ứng tối ưu.......................................................... 75

4.5.8.

Nhiệt độ cảm ứng tối ưu ............................................................................................ 76

4.5.9.

Mật độ tế bào tối ưu .................................................................................................... 77

4.6.

Tách chiết, tinh sạch, định lượng và xác định tính đặc hiệu của kháng
nguyên 3-1E tái tổ hợp ............................................................................................... 78

4.6.1.

Tách chiết, tinh sạch và định lượng kháng nguyên tái tổ hợp 3-1E.................. 78

4.6.2.

Tính đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp ........................................................... 78

4.7.

Chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng và trị bệnh cầu
trùng gà .......................................................................................................................... 79

4.7.1.

Xác định liều lượng kháng nguyên thích hợp để gây miễn dịch cho gà .......... 79

4.7.2.

Nghiên cứu lựa chọn tá chất gây miễn dịch cho gà.............................................. 80

4.7.3.

Định lượng kháng thể IgY ......................................................................................... 81

4.7.4.

Xác định hiệu giá kháng thể trong chế phẩm lòng đỏ ......................................... 82

4.7.5.

Đánh giá hiê ̣u quả phòng bệnh của chế phẩ m ....................................................... 83
Đánh giá hiê ̣u quả điề u tri ̣của chế phẩ m ............................................................... 86

4.7.6.

Phần 5. Kết luận và kiến nghị ............................................................................................... 89
5.1.

Kết luận ......................................................................................................................... 89

5.2.

Kiến nghị ....................................................................................................................... 90

Danh mục các cơng trình đã cơng bố ......................................................................................... 91
Tài liệu tham khảo ......................................................................................................................... 92
Phụ lục

vi

....................................................................................................................................... 106


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Tiếng Anh

Tiếng Việt

Bp

Base pair

Cặp ba zơ

BSA

Bovine serum albumin

Albumin huyết thanh bò

cDNA

Complementary Deoxyribonucleic acid

Sợi ADN bổ sung

DNA

Deoxyribonucleic acid

Axít Deoxyribonucleic

ELISA

Enzyme - Linked ImmunoSorbent Assay

Thử nghiệm miễn dịch hấp phụ

gắn enzyme

HI

Hemagglutination inhibition

Ức chế ngưng kết hồng cầu

IgY

Yolk Immunoglobulin

Kháng thể long đỏ trứng

IPTG

Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside

kDa

Kilo dalton

Kilo dalton

NC

Negative control

Đối chứng âm

OD

Optical density

Mật độ quang học

PBS

Phosphate buffer saline

Dung dịch muối đệm phốt phát

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi trùng hợp

RIA

Radioimmunoassay

Phương pháp miễn dịch phóng
xạ

RT - PCR

SARS

Reverse transcription polymerase chain

Phản ứng chuỗi trùng hợp

reaction

phiên mã ngược

Severe acute respiratory syndrome

Hội chứng viêm phổi cấp tính

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide

Điện di trên gel polyacrylamide

gel electrophoresis
WSF

Water soluble fraction

Phần hòa tan trong nước

vii


DANH MỤC BẢNG
TT
4.1.

Tên bảng

Trang

Tỷ lệ và cường độ nhiễm cầu trùng trên đàn gà tại một số xã của huyện
Phú Vang ........................................................................................................ 44

4.2.

Tỷ lệ nhiễm cầu trùng theo lứa tuổi của gà..................................................... 45

4.3.

Triệu chứng lâm sàng ở gà mắc bệnh cầu trùng ............................................. 46

4.4.

Kết quả mổ khám gà bị mắc bệnh cầu trùng .................................................. 48

4.5.

Tần suất xuất hiện các giai đoạn phát triển của cầu trùng gà trên tiêu
bản vi thể các cơ quan gà bệnh ....................................................................... 50

4.6.

Chỉ tiêu hồng cầu ở gà mắc bệnh cầu trùng .................................................... 55

4.7.

Chỉ tiêu hệ bạch cầu của gà mắc bệnh cầu trùng ............................................ 57

4.8.

Hàm lượng protein huyết thanh ở gà mắc bệnh cầu trùng .............................. 58

4.9.

Tỷ lệ nhiễm các loài cầu trùng gây bệnh ở gà ................................................ 60

4.10.

Sinh trưởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng
nguyên 3-1E ở các môi trường khác nhau ...................................................... 70

4.11.

Sinh trưởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng
nguyên 3-1E ở các tỷ lệ tiếp giống khác nhau ................................................ 73

4.12.

Sinh trưởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng
nguyên 3-1E ở các tốc độ lắc khác nhau ........................................................ 73

4.13.

Kết quả kiểm tra lượng kháng thể trong lòng đỏ trứng của gà được gây
miễn dịch với kháng nguyên có bổ sung tá chất ............................................. 80

4.14.

So sánh tỷ lệ mắc bệnh cầu trùng ở gà đươ ̣c và không đươc̣ phòng bê ̣nh

4.15.

bằ ng kháng thể kháng kháng nguyên 3-1E ..................................................... 84
So sánh tỷ lệ chế t ở gà đươ ̣c và không đươ ̣c phòng bê ̣nh bằ ng kháng thể

4.16.

kháng kháng nguyên 3-1E .............................................................................. 85
So sánh sinh trưởng của gà đươc̣ /không đươ ̣c phòng bê ̣nh bằ ng kháng

4.17.

thể kháng kháng nguyên 3-1E ........................................................................ 85
Lượng Oocyst trong phân gà trước và sau điề u tri ̣......................................... 86

4.18.

Tỷ lệ khỏi bệnh của gà sau điề u tri .................................................................
86
̣

4.19.

Ảnh hưởng của kháng thể /kháng sinh lên sinh trưởng của gà ........................ 87

viii

DANH MỤC HÌNH
TT

Tên hình

Trang

2.1.

So sánh cấu trúc phân tử của IgY gà và IgG thỏ ................................................... 25

4.1.

Gà mắc bệnh cầu trùng, phân lẫn máu, đứng co cụm, mào yếm nhợt nhạt ............... 47

4.2.

Gà chết khi bị mắc bệnh cầu trùng ........................................................................... 47

4.3.

Manh tràng căng phồng đỏ sẫm bên trong có máu ............................................... 49

4.4.

Manh tràng bên trong xuất huyết màu đỏ sẫm ...................................................... 50

4.5.

Oocyst cầu trùng, 20x ................................................................................................. 52

4.6.

Chất chứa lẫn máu trong ruột gà mắc cầu trùng, màu đỏ tươi, HE 10x .................. 52

4.8.

Giai đoạn tiền Schizont của cầu trùng trong ruột gà, HE.40x ............................ 53

4.7.

Hồng cầu tràn ngập trong ruột gà mắc cầu trùng, HE. 40x................................. 53

4.9.

Megatozit và Schizont 2 (liệt tử) trong ruột gà, HE. 40x ..................................... 54

4.10.

Thâm nhiễm bạch cầu ái toan ở hạ niêm mạc ruột của gà mắc cầu
trùng, HE. 40x .............................................................................................................. 54

4.11.

Oocyst thu được bằng phương pháp phù nổi ......................................................... 59

4.12.

Sản phẩ m PCR với các cặp mồi đă ̣c hiê ̣u cho một số loài Eimeria .................. 59

4.13.

Ảnh điện di ARN tổng số trên agarose gel 1% có sử dụng formaldehyde
để biến tính .................................................................................................................... 61

4.14.

Ảnh điê ̣n di sản phẩ m PCR trên agarose gel 1% .................................................. 62

4.15.

Ảnh điện di sản phẩm sau tinh sạch trên agarose gel 1%.................................... 62

4.16.

Ảnh nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường chọn lọc ................................................. 63

4.17.

Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm plasmid pGEM T-easy-3-1E trong
chủng E. coli TOP10 trên agarose gel 1% .............................................................. 64

4.18.

Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi M13 trên agarose gel
1% ................................................................................................................................... 64

4.19.

Mức độ tương đồng giữa gene 3-1E được phân lập với gene 3-1E đã
được công bố (AF13613) ........................................................................................... 65

4.20.

Mức độ tương đồng của trình tự amino axit của kháng nguyên 3-1E đã
phân lập và kháng nguyên 3-1E đã được công bố (AAD39362) ....................... 65

4.21.

Tế bào E. coli BL21 (DE3) mang gene 3-1E ......................................................... 67

4.22.

Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm plasmid TOPO-3-1E sau khi tách từ
chủng E. coli BL21 (DE3) ......................................................................................... 67

ix


4.23.

Biểu hiện của protein 3-1E trong E. coli BL21 tái tổ hợp trên gel SDSPAGE 15%. .................................................................................................................. 68

4.24.

Ảnh tinh sạch và khả năng liên kết giữa đuôi 6xHis với phối tử Ni2+ .................. 69

4.25.

Đường cong sinh trưởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gene mã
hóa kháng nguyên 3-1E.............................................................................................. 72

4.26.

Ảnh hưởng của môi trường lên mức đô ̣ biể u hiê ̣n kháng nguyên tái tổ
hợp 3-1E ........................................................................................................................ 74

4.27.

Kết quả biểu hiện kháng nguyên 3-1E tái tổ hợp ở các nồng độ IPTG
khác nhau ...................................................................................................................... 75

4.28.

Ảnh hưởng thời gian cảm ứng của IPTG lên sản xuất kháng nguyên tái
tổ hợp 3-1E ................................................................................................................... 76

4.29.

Ảnh hưởng của nhiệt độ cảm ứng lên sản xuất kháng nguyên 3-E ................... 76

4.30.

Ảnh hưởng của mật độ tế bào trước khi bổ sung chất cảm ứng ........................ 77

4.31.

Lượng kháng nguyên 3-1E thu được sau khi tinh sạch bằng gel
ProBondTM Nickel - Chelating Resin ...................................................................... 78

4.32.

Kết quả Western blot kiểm tra tính đặc hiệu của kháng nguyên 3-1E................ 79

4.33.

Ảnh điện di định lượng kháng thể IgY trên gel SDS-PAGE 12% .................... 82

4.34.

Bột lòng đỏ trứng sau khi đông khô ........................................................................ 83

4.35.

Ảnh kết quả ELISA một số mẫu kháng thể IgY3-1E .......................................... 83

4.36.

Oocyst phát triển thành dạng gây nhiễm ................................................................ 84

x


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
TT
4.1.

Tên biểu đồ

Trang

Kết quả kiểm tra lượng kháng thể trong trứng của gà được gây miễn
dịch với các tá chất khác nhau........................................................................... 81

xi


DANH MỤC ĐỒ THỊ
TT
4.1.

xii

Tên đồ thị

Trang

Kết quả ELISA khảo sát lượng kháng thể kháng 3-1E..........................................80


TRÍCH YẾU LUẬN ÁN
Họ và tên nghiên cứu sinh: Huỳnh Văn Chương
Tên luận án: Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu
chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị
Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi;

Mã số: 62 64 01 02

Cơ sở đào tạo: Học viện Nơng nghiệp Việt Nam

Mục đích nghiên cứu
Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu của gà mắc bệnh cầu trùng tại Thừa
Thiên Huế và tạo ra chế phẩm sinh học chứa kháng thể IgY đặc hiệu kháng kháng
nguyên 3-1E của cầu trùng gà, sử dụng cho đánh giá hiê ̣u quả phòng trị bệnh cầu
trùng gà.
Phương pháp nghiên cứu
Luận án sử dụng các phương pháp: Các biểu hiện lâm sàng được xác định bằng
phương pháp thường quy, thu Oocyst cầu trùng bằng phương pháp phù nổi và kiểm tra
trên kính hiển vi. Tất cả những gà chết do cầu trùng được mổ khám thu mẫu bệnh phẩm
để xác định bệnh lý đại thể và vi thể, mẫu bệnh phẩm được cố định trong dung dịch
formon 10%, tiêu bản vi thể được làm theo quy trình tẩm đúc parafin và nhuộm bằng
Haematoxylin- Eosin. Một số chỉ tiêu huyết học được xác định bằng máy tự động Cell
Dyn 3700.
ARN tổng số của cầu trùng gà được phân lập bằng Kit “SV Total RNA Isolation
System (Promega)” tổng hợp sợi ADN bổ sung từ khuôn ARN được thực hiện bằng Kit
“First Strand cDNA Synthesis (Fermentas) ” và được sử dụng làm khuôn để khuếch đại
bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu (topo3-1E.F: 5’-CACCATGGGTGA AGA
GGC TGA TAC-3’; topo3-1E.R: 5’TTA GAA GCGCCCTGGTACA-3’). Sản phẩm PCR
được gắn vào vector pGEM-T Easy (Promega), gene 3-1E được cắt từ vector pGEM-T
Easy/3-1E và tinh sạch bằng Kit “Wizard® SV Gel and PCR CleanUp System (Promega)”,
sau đó gắn vào vector biểu hiện pET200/D-TOPO, phản ứng gắn được thực hiện ở 4°C
qua đêm.
Mức độ biểu hiện của protein 3-1E được xác định bằng SDS-PAGE (15% w/v), sau
đó gel được nhuộm với Coomassie Blue R-250. Protein 3-1E được tinh sạch bằng Kit
“ProBondTM Puriication System (Invitrogen, USA)”, theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

xiii


Kết quả chính và kết luận

Gà mắc bệnh cầu trùng biểu hiện các triệu chứng chủ yếu như: ủ rũ, ít vận động,
tiêu chảy, phân có màng nhầy, có bọt và lẫn máu.
Biến đổi bệnh lý chủ yếu tập trung ở ruột non và manh tràng xuất huyết, manh tràng
căng phồng lên và lớp niêm mạc bị bào mòn. Các tổn thương vi thể như sung huyết,
xuất huyết nặng, thoái hóa, hoại tử tế bào, thâm nhiễm tế bào viêm tại manh tràng,
ngồi ra cũng có các tổn thương bệnh lý tại hồi tràng và trực tràng. Trên tiêu bản vi thể
quan sát được các giai đoạn phát triển khác nhau của cầu trùng ở tế bào biểu mô ruột.
Gà mắc bệnh cầu trùng dẫn đến các chỉ tiêu hệ hồng cầu giảm, số lượng bạch cầu
tăng, công thức bạch cầu cũng thay đổi, số lượng bạch cầu trung tính và ái toan tăng, trong
khi số lượng tế bào lympho giảm. Protein tổng số, lượng Albumin và tỷ lệ A/G đều giảm.
Phân lập đoạn mã hóa gene 3-1E từ Oocyst cầu trùng thu được đoạn gene có chiều
dài là 513bp, mã hóa chuỗi polypeptide chứa 170 amino axit, tương đồng 99% so với
gene3-1E được công bố trên GeneBank (mã số: AF113613). Phân tích điện di SDS cho
thấy protein dung hợp 3-1E có khối lượng phân tử khoảng 26kDa.
Mơi trường ni cấy LB cho khả năng sinh trưởng tốt nhất với tỷ lệ tiếp giống 2%
(OD600 = 0,8), lắc 200 vòng/phút ở 37ºC sau 11 giờ nuôi cấy. Tuy nhiên, mức độ biểu
hiện của protein dung hợp 6xHis-3-1E lại cho kết quả tốt nhất trên môi trường YJ trong
cùng một điều kiện tối ưu (nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,8mM, ni lắc ở 200
vịng/phút, nhiệt độ cảm ứng 20ºC trong thời gian 10 giờ). Sắc ký lọc gel 6xHis cho
thấy sản phẩm protein dung hợp 6xHis-3-1E có khối lượng phân tử khoảng 26kDa.
Bằng phương pháp đông khô đã thu được 6-7g bột lịng đỏ từ mỗi quả trứng, sau khi
hồn nguyên với PBS theo tỷ lệ 1:9 (w/w), chế phẩm có hiệu giá kháng thể đặc hiệu đạt
1/280.000. Sử dụng bột lòng đỏ chứa kháng thể kháng 3-1E tái tổ hợp cho kết quả tốt
trong phòng và điều trị bệnh cầu trùng do Eimeria acervulina, Eimeria tenella, Eimeria
maxima ở gà, như làm giảm tỷ lệ mắc bệnh, giảm tỷ lệ chết, giảm thải Oocyst, tăng tỷ lệ
khỏi bệnh và tăng khả năng sinh trưởng ở gà.

xiv

THESIS ABSTRACT
PhD candidate: Huynh Van Chuong
Thesis title: Research on pathological characteristics of chicken infected with coccidia
and development of bioproduct for prevention and treatment of coccidiosis in chicken
Major: Veterinary pathology and Therapeutics of the diseases of domestic animals
Code: 62 64 01 02
Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)
Research Objectives
Survey on some mainly pathological characteristics of chicken infected with
coccidiosis in Thua Thien Hue provine and produce a bioproduct containing specific
IgY antibodies against 3-1E antigen of chicken coccidia used in for prevention,
treatment efficacy of coccidiosis in chicken.
Materials and Methods
The clinical parameters were determined by conventional method, Oocyst
isolation by flotation method. All died chickens caused by coccidiosis were slaughtered
to collect the samples for determination of both macroscopic and microscopic
pathological changes. Tissue samples were fixed in 10% neutral buffered formalin and
stained with Haematoxylin - Eosin stain. The change of several hematological
parameters were determined by automated Cell Dyn 3700 sytem.
Total RNA of coccidia was isolated by SV Total RNA Isolation System Protocol
(Promega). First strand cDNA from RNA templates was made First Strand cDNA Synthesis
Kit (Fermentas) and was then used as template in PCR amplification with the specific primers
(topo3-1E.F: 5’-CACCATGGGTGA AGA GGC TGA TAC-3’; topo3-1E.R: 5’TTA GAA
GCGCCCTGGTACA-3’). PCR products (3-1E gene) were ligated into pGEM-T Easy vector
(Promega), The 3-1E gene was cut from pGEM-T Easy/3-1E vector, and purified by
Wizard® SV Gel and PCR CleanUp System Kit (Promega),they were then ligated into
pET200/D-TOPO expression vector, The ligation mix was incubated at 4°C overnight.
Expression levels of 3-1E protein were determined by sodium dodecyl sulfate-15%
polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE, 15% w/v). The gel slice was then stained
with Coomassie Blue R-250. The 3-1E protein was purified by ProBondTM Purification

System kit (Invitrogen, USA), according to the manufacturer’s instructions.
Main findings and conclusions
Chickens infected with coccidia consist of mainly clinical signs such as: droop,
inactiveness, watery diarrhea with mucus, bloody or creamy exudate feces.

xv


The main macroscopic lesions of infected chickens showed hemorrhagic and huge
necrosis in intestine and caecum, distended caecum and eroded mucosal layer. The
microscopic lesions consisted of severe hemorrhage, necrosis, degeneration of epithelial
cells, inflammatory infiltrations in caecum, on the other side, pathogenic characteristics
could also be observed in ileum and rectum. The different stages of coccidia were also
observed in the epithelial cells.
Erythro-system parameters decreased, leukocytes number increased and its formula
was changed, number of neutrophils and eosinophils increased, in case of lymphocytes
decreased. The protein total of serum, its formula and A/G ratio were decreased.
We cloned and expressed a gene coding 3-1E antigen from Eimeria isolated from
Thua Thien Hue province, Vietnam. The open reading frame of 3-1E gene has 513bp in
length, encoding a polypeptide chain with 170 amino acid residuces. Homology search
showed that our 3-1E gene is 99% similarity with 3-1E gene of Genebank (accession
number: AF113613). SDS electrophoresis showed that expression of the 3-1E gene in
E. coli BL21 (DE3) produced a fusion protein with molecule of ~26kDa.
Improvement of the recombinant antigen expression level in E. coli strain BL 21
Star TM (DE3) encoding gene 3-1E of Eimeria was conducted. The result showed that
LB medium has given the best growth of E. coli BL 21 (DE3) in comparison with other
media in the same 2% initial seed inoculum size (OD600 = 0.8), shaking 200 rpm at
37oC for 11hrs. However, the highest level of fusion protein (6xHis-3-1E) was obtained
from YJ medium in the same optimum culture condition (0.8mM IPGT-Isopropyl β-D1-thiogalactopyranoside for 10hrs at 20oC). Molecular weight of purified 6xHis-3-1E
protein from 6xHis affinity chromatography was about 26kDa.

By using lyophilized method, 6-7g of powder from 1 egg, after reverting with PBS
(1: 9, w/w) the solution presented specific antibody titer reaching 1/128.000. Using egg
yolk powder containing antibodies against recombinant 3-1E antigen showed good
results in prevention and treatment of coccidiosis that caused by E. acervulina, E.
tenella, E. maxima in chicken, such as: reducing morbidity, mortality, Oocyst shedding
as well as increasing recovery rate and growth performance.

xvi


PHẦN 1. MỞ ĐẦU

1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Bệnh cầu trùng gà là nguyên nhân chính gây thiệt hại lớn cho ngành chăn
nuôi gia cầm (Allen and Fetterer, 2002). Trên tồn thế giới hàng năm ước tính
thiệt hại trên 2 tỷ USD (Williams, 1998). Bệnh có khả năng lây lan rấ t nhanh, tỷ
lê ̣ mắ c bê ̣nh và tỷ lê ̣ chế t cao ở gà con (30-100%), làm tăng số gà còi cọc, giảm
tốc độ tăng trưởng cho toàn đàn, giảm sản lượng trứng ở gà đẻ từ 20-40%, giảm
chất lượng thịt và tăng tiêu tốn thức ăn (Tyzzer, 1932; Edgar, 1955). Bệnh gây ra
bởi ký sinh trùng đơn bào (Protozoa), thuộc phân lớp Coccidia, họ Eimeriidae và
chi Eimeria (Finlay et al., 1993; Lillehoj and Lillehoj, 2000). Gà ở tất cả các lứa
tuổi đều có thể nhiễm cầu trùng, trong đó thường gặp nhất là gà ở giai đoạn 2-3
tuần tuổi (Lillehoj and Lillehoj, 2000; Lillehoj et al., 2004).
Hiện nay có nhiều lồi Eimeria gây bệnh trên gà, trong đó có 7 lồi gây bệnh
chủ yếu: E. tenella, E. acervulina, E. maxima, E. necatrix, E. brunetti,
E. praecox và E. mitis (Shirley, 1986). Mỗi một loài Eimeria khác nhau có vị trí gây
bệnh khác nhau trong đường tiêu hóa (Fanatico, 2006; Nguyễn Hữu Hưng, 2010).
Cho đến nay, để phịng trị bệnh cầu trùng người chăn ni chủ yếu dùng
kháng sinh bổ sung vào trong thức ăn và nước uống. Tuy nhiên, phương pháp
này còn nhiều hạn chế như: Xuất hiện một số chủng Eimeria có khả năng kháng

kháng sinh (Chapman, 1997), tạo ra một loại thuốc mới địi hỏi chi phí cao
(Lillehoj and Lillehoj, 2000), bổ sung kháng sinh kéo dài dẫn đến tồn dư trong
sản phẩm gia cầm làm ảnh hưởng đến người tiêu dùng. Vì vậy, ta ̣o ra các chế
phẩm có tác dụng phịng và trị bệnh cầu trùng, thay thế kháng sinh là nhu cầu cấp
bách của thực tiễn.
Protein 3-1E là mô ̣t kháng nguyên bề mă ̣t có khung đo ̣c mở dài 513bp, mã
hóa đoạn polypeptide dài 170 amino axit với khối lươ ̣ng phân tử là 18.523kDa,
tồn tại ở giai đoa ̣n Sporozoite và Merozoite của một số loài như E. acervulina,
E.tenella, E. maxima. Đã có những nghiên cứu sử dụng kháng nguyên 3-1E tái tổ
hợp làm vắc xin chống lại E. acervulina, E. tenella và E. maxima (Lillehoj et al.,
2000). Tiêm chủng bằ ng vắc xin ADN dựa trên gene 3-1E cũng gây đươ ̣c đáp
ứng miễn dich
̣ chố ng la ̣i cầ u trùng gà (Lillehoj et al., 2000; Ma et al., 2011).

1


Áp dụng công nghệ protein tái tổ hợp để sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp
3-1E và dùng kháng nguyên này để gây tối miễn dịch cho gà sẽ tạo được kháng
thể có khả năng chống lại đồng thời nhiều loài cầu trùng. Đây là lợi thế của
phương pháp tiếp cận mới có áp dụng cơng nghệ cao so với các phương pháp
tách chiết kháng nguyên truyền thống.
Công nghệ chế tạo kháng thể truyền thống dùng cho điều trị bệnh ở người
và động vật thường sử dụng các gia súc lớn như ngựa, cừu. Tuy nhiên, cơng nghệ
này có nhược điểm là kích thước động vật lớn, địi hỏi lượng kháng nguyên để
gây miễn dịch phải nhiều, để có kháng thể phải lấy máu động vật tách huyết
thanh hoặc huyết tương rồi tinh chế kháng thể với qui trình chế tạo phức tạp, việc
lấy máu động vật không được thường xuyên dẫn đến sản lượng kháng thể thu
được từ mỗi cá thể động vật khơng nhiều (Hồng Ngọc Hiển và Nguyễn Văn
Việt, 1998; Lê Thu Hồng, 2004).

Lồi gà có khả năng sinh kháng thể tương tự như động vật có vú. Trong số
các kháng thể trong máu gà mái có một lớp kháng thể được chuyển qua và tích tụ
trong lòng đỏ trứng, được gọi là IgY (yolk immunoglobulin). Muốn sản xuất
kháng thể IgY chỉ cần gây miễn dịch cho gà mái và thu hoạch trứng. Gà mái ở độ
tuổi đẻ ổn định, việc thu hoạch trứng được thực hiện hàng ngày với lượng kháng
thể thu được từ mỗi quả trứng rất lớn so với kích thước của gà mẹ. Kỹ thuật tách
chiết tinh sạch IgY từ lòng đỏ trứng cũng tương đối đơn giản, từ đó cơng nghệ
chế tạo IgY bằng cách gây miễn dịch cho gà mái và thu hoạch kháng thể từ lòng
đỏ trứng do gà đẻ ra trở nên đặc biệt hấp dẫn cho yêu cầu sản xuất lượng lớn
kháng thể sử dụng cho chẩn đoán và điều trị bệnh ở động vật cũng như cho người
(Dias da Silva and Tambourgi, 2010; Schade et al., 2005).
Kháng thể lòng đỏ trứng gà đã được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu và
hiệu quả của nó trong phịng và trị bệnh nhiều bệnh truyền nhiễm đã được chứng
minh. Mặt khác, kháng thể lịng đỏ có giá thành thấp, dễ bảo quản, có độ an tồn
và tính đặc hiệu cao, đặc biệt là chỉ tác động lên mầm bệnh, khơng ảnh hưởng
đến vi sinh vật có lợi trong cơ thể, không gây ra hiện tượng kháng thuốc và
không làm ảnh hưởng đến chất lượng của thực phẩm. Bên cạnh đó, việc dùng
kháng thể trong phịng và điều trị bệnh là một giải pháp được lựa chọn hàng đầu
trong định hướng phát triển của ngành chăn nuôi, để hạn chế lạm dụng kháng
sinh trong phịng trị bệnh ở vật ni.

2


1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
Xác định được các đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà trên đàn gà
được nuôi tại Phú Vang - Thừa Thiên Huế.
Sản xuất được kháng nguyên tái tổ hợp 3-1E làm nguyên liệu tạo kháng thể
kháng cầu trùng gà.
Xác định được hiệu quả phòng trị bệnh cầu trùng gà của chế phẩm sinh học

chứa kháng thể IgY đặc hiệu kháng kháng nguyên 3-1E.
1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Về thời gian: Các nghiên cứu được thực hiện từ 2012-2015, tại Viện công
nghệ sinh học - Đại học Huế và Bộ môn bệnh lý, Khoa thú y - Học viện Nông
nghiệp Việt Nam.
Về không gian: Đề tài tiến hành khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh
cầu trùng ở gà Tre nuôi thịt tại địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế và nghiên cứu chế
tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị.
1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
Kết quả luận án cho thấy triệu chứng lâm sàng, tổn thương đại thể, vi thể và
thay đổi các chỉ tiêu huyết học của gà Tre mắc bệnh cầu trùng tại Thừa Thiên
Huế. Đồng thời, xuất phát từ lợi thế của công nghệ sản xuất globulin miễn dịch
từ lòng đỏ trứng (kháng thể IgY), từ nhu cầu có các chế phẩm kháng thể đặc hiệu
thay thế cho thuốc kháng sinh chống lại bệnh cầu trùng gà. Đề tài được tiến hành
để tạo ra một chế phẩm sinh học có chứa kháng thể đặc hiệu kháng kháng nguyên
3-1E của cầu trùng gà. Điểm mới trong nghiên cứu này là ứng dụng công nghệ
sinh học để tạo ra kháng nguyên tái tổ hợp 3-1E và gây miễn dịch cho gà mái đẻ.
Sau đó thu trứng có chứa kháng thể đặc hiệu kháng kháng nguyên 3-1E. Thành
công trong nghiên cứu này là đã chế tạo được bột lịng đỏ trứng có chứa kháng
thể kháng kháng ngun 3-1E của cầu trùng gà và sử dụng trong phòng và điều
trị bệnh cho kết quả tốt như: Làm giảm tỷ lệ mắc bệnh, giảm tỷ lệ chết, giảm thải
Oocyst, tăng tỷ lệ khỏi bệnh và tăng khả năng sinh trưởng của gà.
1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
Đây là một cơng trình nghiên cứu trong lĩnh vực sinh học phân tử để tạo ra
kháng nguyên tái tổ hợp 3-1E, làm nguyên liệu cho việc sản xuất kháng thể để
phòng và điều trị bệnh cầu trùng cho gà, góp phần làm giảm thiệt hại kinh tế và nâng
cao hiệu quả cho ngành chăn nuôi gia cầm.

3

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. GIỚI THIỆU VỀ BỆNH CẦU TRÙNG GÀ
2.1.1. Căn bệnh cầu trùng
Bệnh cầu trùng đã được phát hiện bởi Rivolta (1983), căn bê ̣nh là một loại
ký sinh trùng có trong phân gà, đến năm 1864 mới xác định được Eimeria là
nguyên sinh động vật sinh sản theo bào tử thuộc lớp Sporozoa, bộ Cocoidie,
họ Eimeriaidae.
Ngày nay, bệnh cầu trùng ở gà thế giới đã xác định có khoảng 12 lồi
Eimeria. Trong đó có 9 lồi đã được xác định rõ tên, kích thước, màu sắc gồm
E. tenella, E. acervulina, E. mitis, E. brunetti, E. necatrix, E. maxima, E. praecox,
E. hagani, E. mivatti. Có 7 loài cầu trùng gà trong số 9 loài trên gây bệnh phổ
biến (trừ Eimeria hagani, Eimeria mivatti) (Conway and Mckenzie, 2007).
2.1.1.1. Phân loại cầu trùng ở gà
Cầu trùng thuộc giống Eimeria với hình thái và kích thước khác nhau được
xác định là có khả năng gây bệnh cầu trùng trên gà. Trong đó, có một số loài gây
bệnh chủ yếu sau:
a. Eimeria tenella
Các Oocyst của E. tenella có hình ovan, vỏ bọc màu trắng xám hoặc xanh
nhạt, khơng có lỗ sinh dục (Micropil), cực của Oocyst có nhân phân cực. Kích
thước Oocyst từ 14,2-31,2 x 9,5-24,8μm. Q trình tạo thành bào tử nang ở mơi
trường bên ngồi kéo dài 24-48 giờ, chúng ký sinh không những trên bề mặt
niêm mạc mà còn thâm nhập sâu vào trong các lớp của màng dịch thuộc manh
tràng và trực tràng (Lê Văn Năm, 2004).
b. Eimeria acervulina
Các Oocyst của E. acervulina có hình quả trứng gà hoặc hình ovan. Đầu
nhỏ của Oocyst có một lỗ sinh dục, đầu to có nhân phân cực. Oocyst có vỏ bọc
nhẵn, có kích thước là 17,7-20,2 x 13,7-16,3μm. Oocyst có hai lớp vỏ, khơng có
thể cặn. Sporocyst có hình trứng, khơng có thể cặn. Thời gian hình thành bào tử
nang ở mơi trường bên ngồi là 24 giờ. E. acervulina ký sinh ở vùng đầu của ruột

non. Oocyst nằm trong ruột tạo nên những điểm màu trắng hay xám hoặc lan
rộng ở mặt ruột non (Lê Văn Năm, 2004).

4


c. Eimeria maxima
Oocyst của E. maxima có hình quả trứng hoặc hình ovan. Vỏ bọc của
Oocyst xù xì, màu nâu nhạt. Tại đầu nhỏ của Oocyst có một lỗ sinh dục và phía
dưới là nhân phân hạt. Kích thước của Oocyst là 24,4-42,5 x 16,5-29,8μm tức là
loại Oocyst lớn. Thời gian hình thành bào tử nang ở mơi trường bên ngồi cơ thể
là 48 giờ, ký sinh khơng những trong các lớp tế bào biểu bì, bề mặt niêm mạc mà
còn trong các lớp sâu của màng dịch thuộc đoạn tá tràng và đoạn dưới tá
tràng (Lê Văn Năm, 2004).
d. Eimeria mitis
Oocyst của E. mitis có dạng hình trịn, vỏ bọc khơng màu, khơng nhân phân
hạt. Kích thước nhỏ 11,0-19,0 x 10-17,1μm. Thời gian hình thành bào tử nang
trong mơi trường bên ngoài là 48 giờ, loài này ký sinh trong tá tràng và ruột non
dưới tá tràng (Lê Văn Năm, 2004).
e. Eimeria necatrix
Phân bố rộng trên thế giới, giai đoạn sinh sản vơ tính thứ nhất và thứ hai
xảy ra ở ruột non, giai đoạn sinh sản vơ tính thứ 3, tiền giao tử và giai đoạn sinh
sản giao tử xảy ra ở ruột già.
Oocyst của E. necatrix có hình ovan hoặc hình trịn và nhân phân hạt, kích
thước nhỏ 13-22,7 x 11,3-18,3μm. Vỏ Oocyst cứng và bào tử nang hình thành
trong 48 giờ. E. Necatrix ký sinh chủ yếu ở ruột non ngay dưới tá tràng. Sporocyst
hình trứng, có thể Stieda, khơng có thể cặn (Lê Văn Năm, 2004).
f. Eimeria praecox
Loài này phân bố rộng, định vị trên 1/3 phía trên ruột non của gà. Oocyst
của E. praecox có hình trái xoan, vỏ cứng khơng màu. Nhân phân cực nằm một

bên hoặc xen kẽ giữa các nguyên bào tử. Kích thước nhỏ 16,6-27,7 x 14,819,4μm. Thời gian tạo thành bào tử nang là 24-36 giờ, loài này ký sinh ở đầu ruột
non. Giai đoạn sinh sản xảy ra ở tế bào biểu mô nhung mao ruột thường dọc theo
một phía của nhung mao và ở phía dưới của nhân tế bào, có 3 hoặc 4 q trình
sinh sản vơ tính (Lê Văn Năm, 2004).
g. Eimeria hagani
Oocyst hình bầu dục, kích thước 15,8-29,9 x 14,3-29,5μm, khơng có lỗ
nỗn, khơng màu. Thời gian sản sinh bào tử là 48 giờ. Loài này ký sinh ở phần
đầu ruột non (Nguyễn Thị Kim Lan và cs., 2008).

5


h. Eimeria brunetti
E. brunetti là lồi cầu trùng có độc lực cao gần như E. tenella. Nang trứng
hình bầu dục khơng màu, kích thước 20,7-30,3 x 18,1-24,2μm. E. brunetti sinh
sản bào tử kết thúc trong vòng 24 giờ, trong nang trứng có một cực hay một số
hạt cực, trong thời kỳ nội sinh phát triển trong ruột già, phần cuối ruột non cũng
như trực tràng, lỗ huyệt cũng có thể bị nhiễm (Nguyễn Thị Kim Lan và cs., 2008).
k. Eimeria mivati
Nang trứng của E. mivati có hình trứng, hình bầu dục khơng màu, có lỗ
nỗn và hạt cực, kích thước 10,7-20 x 10,1-15,3μm. E. mivati sinh sản bào tử tiến
hành trong 18-24 giờ. Thời kỳ phát triển nội sinh của cầu trùng gây tổn thương tế
bào biểu bì, nhung mao hay những khe hốc suốt chiều dài ruột non (Nguyễn Thị
Kim Lan và cs., 2008).
2.1.1.2. Vòng đời phát triển của cầu trùng
Chu kỳ sinh học của cầu trùng giống Eimeria gồm 3 giai đoạn: giai đoạn
sinh sản vơ tính, giai đoạn sinh sản hữu tính và giai đoạn sinh sản bào tử. Hai giai
đoạn đầu thực hiện trong tế bào biểu mơ ruột cịn giai đoạn thứ ba diễn ra ở ngoài
cơ thể vật chủ (Nguyễn Thị Kim Lan và cs., 2008).
a. Giai đoạn sinh sản vơ tính

Khi các Oocyst xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêu hóa, dưới tác dụng của
dạ dày cơ và các enzyme trong dịch tiêu hóa làm cho vỏ Oocyst bị phá hủy, giải
phóng các Sporocyst và sau đó nhanh chóng xâm nhập vào tế bào biểu bì ruột,
thận, mật,… đơi khi vào mơ bào dưới niêm mạc. Tại đây cùng với sự phân chia
của hạt nhân các Oocyst lớn lên nhanh chóng có hình trịn, hình ovan hoặc hình
elip với nhiều nhân gọi là thể phân lập thuộc thế hệ 1 (Schizont 1).
Ở Schizont 1, xung quanh mỗi nhân nguyên sinh chất xuất hiện và bao quanh
để hình thành dạng ký sinh nhỏ, hình bầu dục. Lúc này chúng được gọi thể phân
lập trung gian (Merozoite). Các Merozoite thế hệ 1 (kích thước 5 x 15µm) sinh
trưởng rất nhanh làm tan vỡ tế bào biểu bì của vật chủ (số lượng Merozoite trong
một Schizont thay đổi rất lớn tùy loài dao động từ 8 đến 16, có khi tới 120.000
Merozoite). Khi các tế bào biểu bì nơi cư trú bị phá hủy thì các Merozoite lập tức
tấn công sang các tế bào biểu bì mới và quá trình phát triển này được lặp lại như
cũ. Đến đây các ký sinh này thuộc thế hệ thứ hai và được gọi là Schizont 2.
Tùy theo các lồi cầu trùng và vật chủ có thể hình thành tiếp các thế hệ

6


Schizont 3, Schizont 4,… một cách ồ ạt theo cấp số nhân kiểu phản ứng dây
chuyền nguyên tử làm cho hàng loạt tế bào biểu bì của vật chủ bị phá vỡ gây tổn
thương nặng nề cho niêm mạc nơi bị nhiễm (Nguyễn Thị Kim Lan và cs., 2008).
Mỗi chủng cầu trùng khác nhau có giai đoạn sinh sản vơ tính khác nhau, để
hình thành nên các thể phân lập và số thế hệ thể phân lập tùy theo loài. Sau khi kết
thúc giai đoạn sinh sản vơ tính chúng chuyển sang giai đoạn sinh sản hữu tính.
b. Sinh sản hữu tính
Giai đoạn sinh sản hữu tính bắt đầu phát triển từ thể phân lập thế hệ cuối
cùng của cầu trùng. Sau một số đợt sinh sản vơ tính (tùy loài cầu trùng), các
Schizont thế hệ 1, 2, 3,... chuyển sang sinh sản hữu tính và bắt đầu tạo ra các thể
Gamet có hình dạng giống Schizont nhưng phát triển hoàn toàn khác. Từ thể phân

lập thế hệ cuối cùng chúng phân chia thành các thể phân đoạn và xâm nhập vào
các tế bào biểu bì ký chủ, biến thành các thể sinh dưỡng. Các thể sinh dưỡng này
lại tiếp tục phát triển tạo nên các giao tử đực và giao tử cái. Sau đó các tế bào
giao tử cái biến thành những tế bào sinh dục cái lớn, ít hoạt động và có lỗ nỗn.
Nhờ 2 lơng roi, giao tử đực di chuyển đến gặp giao tử cái, chui vào giao tử
cái qua lỗ noãn. Trong giao tử cái diễn ra q trình đồng hố nhân và ngun
sinh chất để tạo thành hợp tử. Hợp tử phân tiết một màng bao bọc bên ngồi, lúc
này nó được gọi là nỗn nang (Oocyst) có hình bầu dục, hình trịn hoặc hình
trứng hay hình quả lê. Đến đây các Oocyst rơi vào trong lịng ruột và kết thúc q
trình sinh sản hữu tính.
Thời gian nội sinh kết thúc, Oocyst theo phân gà ra bên ngồi mơi
trường. Thời gian sinh sản hữu tính kéo dài từ 3-22 ngày tùy vào từng lồi cầu
trùng. Thời gian từ khi gà chứa Oocyst có sức gây bệnh đến khi gà thải Oocyst
trong phân là 4,5-5 ngày (đối với loài E. acervulina, E. mitis) và 6,5 ngày với
loài E. tenella (Nguyễn Thị Kim Lan và cs., 2008).
c. Sinh sản bào tử
Khi Oocyst theo phân ra ngoài, trong lớp vỏ bọc bên ngoài đã chứa đầy
nguyên sinh chất. Ở ngoại cảnh, gặp điều kiện thuận lợi như nhiệt độ, độ ẩm sau
vài giờ trong nguyên sinh chất đã xuất hiện khoảng sáng và nguyên sinh chất bắt
đầu phân chia. Sau 13-48 giờ tùy vào từng loài cầu trùng nguyên sinh chất sẽ
hình thành 4 túi bào tử (Sporocyst). Trong mỗi túi bào tử, nguyên sinh chất lại
phân chia, kéo dài ra tạo thành 2 bào tử con (Sporozoite). Lúc này, trong Oocyst

7