Cải tiến kháng mặn của đậu tương thông qua chuyển gen tăng thải loại na qua màng không bào và màng thế bào luận văn thạc sĩ nông nghiệp

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

VŨ THỊ HỢP

CẢI TIẾN KHÁNG MẶN CỦA ĐẬU TƯƠNG THÔNG QUA
CHUYỂN GEN TĂNG THẢI LOẠI Na+ QUA MÀNG KHƠNG
BÀO VÀ MÀNG TẾ BÀO
Chun ngành:

Cơng nghệ sinh học

Mã số:

60.42.02.01

Người hướng dẫn khoa học:

GS.TS. Phan Hữu Tôn
TS. Quách Ngọc Truyền

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên
cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo
vệ lấy bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám
ơn, các thơng tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2017

Tác giả luận văn

Vũ Thị Hợp

i


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hồn thành luận văn, tơi đã nhận được
sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cơ giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè,
đồng nghiệp và gia đình.
Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi được bày tỏ lịng kính trọng và biết
ơn sâu sắc tới GS.TS. Phan Hữu Tôn và TS. Quách Ngọc Truyền là những người thầy,
đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt
q trình học tập và thực hiện đề tài.
Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ
môn Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học Ứng dụng, Khoa Công nghệ Sinh học - Học
viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tơi trong q trình học tập, thực hiện đề tài
và hồn thành luận văn.
Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Viện Cây lương thực
và Cây thực phẩm đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2017

Tác giả luận văn

Vũ Thị Hợp

ii


MỤC LỤC
Lời cam đoan ................................................................................................................ i
Lời cảm ơn ................................................................................................................... ii
Mục lục ...................................................................................................................... iii
Danh mục bảng .............................................................................................................v
Danh mục biểu đồ ....................................................................................................... vi
Danh mục hình ........................................................................................................... vii
Trích yếu luận văn ..................................................................................................... viii
Thesis abstract ...............................................................................................................x
Phần 1. Mở đầu ...........................................................................................................1
1.1.

Đặt vấn đề .......................................................................................................1

1.2.

Mục đích và yêu cầu ........................................................................................3

1.2.1.

Mục đích .........................................................................................................3

1.2.2.

Yêu cầu ...........................................................................................................3

1.3.

Phạm vi nghiên cứu .........................................................................................3

1.4.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ..........................................................................4

1.4.1.

Ý nghĩa khoa học .............................................................................................4

1.4.2.

Ý nghĩa thực tiễn .............................................................................................4

Phần 2. Tổng quan tài liệu ..........................................................................................5
2.1.

Giới thiệu chung về cây đậu tương và ảnh hưởng của mặn lên sinh trưởng
phát triển của cây đậu tương ............................................................................5

2.1.1.

Giới thiệu chung về đậu tương .........................................................................5

2.1.2.

Đậu tương DT26 ............................................................................................ 10

2.1.3.

Ảnh hưởng của mặn lên sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương .............13

2.2.

Cơ chế kháng mặn của cây trồng....................................................................16

2.2.1.

Cơ chế chung ................................................................................................. 16

2.2.2.

Các cơ chế bảo vệ của cây trồng trước stress mặn .......................................... 17

2.3.

Cơ chế chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ........................ 21

2.3.1.

Đặc điểm của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens được ứng dụng trong
chuyển gen vào thực vật................................................................................. 21

2.3.2.

Cơ chế xâm nhập và lây nhiễm của vi khuẩn A.tumefaciens ........................... 22

iii


2.3.3.

Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen thông qua vi khuẩn
A.tumefaciens ................................................................................................ 24

2.4.

Chọn tạo giống cho chịu mặn......................................................................... 26

Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ..........................................................28
3.1.

Địa điểm và thời gian nghiên cứu...................................................................28

3.2.

Vật liệu, hóa chất và thiết bị........................................................................... 28

3.3.

Quy trình chuyển gen..................................................................................... 29

3.4.

Nghiên cứu chuyển gen ................................................................................. 30

3.4.1.

Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn A.tumefaciens đến hiệu quả
chuyển gen vào giông đậu tương ĐT26 ..........................................................30

3.4.2.

Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ AS (Acetosyringone) lên hiệu quả
chuyển gen nhờ A. tumefaciens vào đậu tương ...............................................30

3.4.3.

Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy lên hiệu quả chuyển
gen nhờ A. tumefaciens vào đậu tương ...........................................................31

Phần 4. Kết quả và thảo luận .................................................................................... 36
4.1.

Thiết kế vector nhị phân mang gen cần chuyển ATAVP1 VÀ ATNHX1 .......... 36

4.2.

Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn A.tumefaciens đến hiệu quả chuyển
GEN A.tumefaciens........................................................................................ 37

4.3.

Ảnh hưởng của nồng độ as đến hiệu quả chuyển GEN ................................... 38

4.4.

Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen..................39

4.5.

Kết quả chọn lọc các cây chuyển GEN T1 ..................................................... 41

4.6.

Kết quả đánh giá chọn lọc cây đậu tương chuyển gen kháng mặn
thế hệ T1........................................................................................................ 43

4.7.

Năng suất cây chuyển GEN trong điều kiện mặn ........................................... 46

Phần 5. Kết luận và kiến nghị ................................................................................... 48
5.1. Kết luận ................................................................................................................48
5.2. Kiến nghị .............................................................................................................. 48
Tài liệu tham khảo ....................................................................................................... 49

iv


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1.

Sản lượng đậu tương của các vùng trên cả nước

gia đoạn

2010 – 2015 ..............................................................................................7
Bảng 2.2.

Thành phần dinh dưỡng trong 100g hạt đậu nành ......................................8

Bảng 2.3.

Thành phần các acid amin trong protein đậu nành .....................................9

Bảng 2.4.

Các loại đất mặn (phân theo nồng độ) và ảnh hưởng

đối với

cây trồng .................................................................................................14
Bảng 4.2.

Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn A.tumefaciens khác nhau đến hiệu
quả chuyển gen vào đậu tương ................................................................37

Bảng 4.3.

Ảnh hưởng của nồng độ AS bổ sung khác nhau đến hiệu quả chuyển
gen đậu tương .........................................................................................39

Bảng 4.4

Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy tới chuyển gen AtAVP1 và
AtNHX1 nhờ vi khuẩn A. tumefaciens ....................................................40

Bảng 4.5.

Số chồi chuyển gen thu được ..................................................................41

Bảng 4.6.

Khối lượng chất khô ở hai nồng độ 0mM và 100mM ..............................45

v


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 4.2. Khối lượng chất khô, trọng lượng rễ, trọng lượng thân đậu tương
chuyển gen và ở hai nồng độ muối 0mM và 100 mM .............................. 45
Biểu đồ 4.4. Cường độ quang hợp ...............................................................................46
Biểu đồ 4.5. Độ xanh của lá .........................................................................................46

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Diện tích, năng suất và sản lượng đậu tương thế giới từ 2003 đến 2013 .............5
Hình 2.2. Sản lượng đậu tương cả nước giai đoạn 2000 – 2015 ...................................6
Hình 2.3. Diện tích trồng đậu tương ở Việt Nam .........................................................6

Hình 2.4. Thử nghiệm giống đậu tương ĐT26 tại Giao Thủy – Nam Định vụ
xuân 2013 ................................................................................................. 10
Hình 2.5. Tóm tắt giai đoạn sinh trưởng và phát triển của đậu tương ĐT26 ............... 11
Hình 2.6. Giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng..............................................................12
Hình 2.7. Giai đoạn sinh trưởng thực (R) ..................................................................13
Hình 2.8. Cơ chế kháng mặn ..................................................................................... 16
Hình 2.9. Sơ đồ cơ chế kháng mặn ở thực vật ...........................................................17
Hình 2.10. Cấu tạo của vùng T-Plasmid của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens...... 21
Hình 2.11. Cơ chế gây bệnh của Agrobacterium tumefaciens ..................................... 22
Hình 2.12. Mơ hình chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens ................24
Hình 3.1. Minh họa phương pháp ống nhựa ..............................................................34
Hình 3.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nảy mầm. ..............................................................34
Hình 4.1. Vecter nhị phân tăng cường biểu hiện hai gen AtAVP1 và AtNHX1

được sử dụng để chuyển vào đậu tương……………………………39
Hình 4.2. Callus của các công thức (A) Gen AtNHX, (B) gen AtAVP ......................38
Hình 4.3. Một số hình ảnh chuyển gen đậu tương ở điều kiện nồng độ AS thêm
vào 200uM, mật độ vi khuẩn OD=0,8, thời gian đồng nuôi cấy 3 ngày. .....41
Hình 4.4. Cây chuyển gen và đối chứng khi sơn lá .................................................... 42
Hình 4.5. Kết quả chạy điện di với gen Avp1 ....................................................... 42
Hình 4.6. Kiểm tra mức độ biểu hiện phân tử của cây chuyển gen.............................43
Hình 4.7. Đậu tương chuyển gen AtAVP1 (A2 ADN A3) và AtNHX1 (N1 ADN
N3) trong điều kiện đối chứng(nồng độ muối 0mM) và điều kiện thí
nghiệm (nồng độ muối 0mM 100). ........................................................... 44
Hình 4.8. Kết quả sử lý mặn sau 5 tuần ..................................................................... 47

vii


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Vũ Thị Hợp
Tên luận văn: Cải tiến kháng mặn của đậu tương thông qua chuyển gen tăng thải
loại Na+ qua màng không bào và màng tế bào.
Ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 24.03.00.48

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nơng nghiệp Việt Nam
Mục đích nghiên cứu:
- Chuyển được thành công hai gen AtAVP1 và AtNHX1 có chức năng đã được
chứng minh điều khiển quá trình loại thải Na+ ra khỏi sinh chất nhằm tăng khả năng
kháng mặn của đậu tương.
- Xác định được nồng độ vi khuẩn gây nhiễm, nồng độ AS và thời gian đồng
nuôi cấy tối ưu cho việc chuyển gen thành cơng.
- Phân tích hiệu quả, chọn lọc được cây chuyển gen tốt ở các thế hệ, To và T1.
Phương pháp nghiên cứu:
Nghiên cứu được thực hiện theo phương pháp nuôi cấy mơ hiện hành, mỗi thí
nghiệm được bố trí 4 công thức với 2 lần lặp lại, số mẫu/công thức là 50 mẫu đối với
các thí nghiệm xác định yếu tố ảnh hưởng và 3 lần lặp lại, số mẫu/công thức là 9 mẫu
với các yếu tố phân tích sinh lý. Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel
2007, IRRISTAT 5.0.
Kết quả chính và kết luận:
Bố trí các thí nghiệm theo mục đích đề ra và đã xác định được:
i) Mật độ vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium
tumefasien là ở giá trị OD = ),8 tương đương với mật độ vi khuẩn là 192x109. Trong đó
tỉ lệ chồi mang gen chuyển ra rễ cao chồi đạt 83,46% đối với gen AtNHX1 và 87,6%
với gen AtAVP1 . ii) Nồng độ AS thích hợp cho chuyển gen là 200ul. Ở nồng độ này tỷ
lệ chồi mang gen chuyển ra rễ đạt đối với gen AtNHX1 và 90,6% với gen AtAVP1 là
87,43 iii) Thời gian đồng nuôi cấy tối ưu là trong 3 ngày. Tỉ lệ chồi ra rễ đạt đối với gen
AtNHX1 là 87,56% và 88,43% với gen AtAVP1 iv) Đã thu được tỉ lệ cây T0 đối với

gen AtAVP1 là 73,59 và AtNHX1 là 80. Các cây T0 này đã được trồng trong nhà lưới,
100% cây ra hoa và kết quả cho hạt. Chọn ngẫu nhiễn các hạt của dòng 13 T0 đem gieo
trồng đã thu được thế hệ T1 qua các phân tích phân tử thu được có ¾ cây AtAVP1 có
biểu hiện gen và 9/9 cây AtNHX có biểu hiện gen chuyển. v) Các cây có gen chuyển T1
đã được đem trồng trong chậu cát theo phương pháp ống nhựa PVC có cải biến.kết quả

viii


thu được cho thấy các cây này có khả năng kháng mặn ở nồng độ muối 100mm (tương
đương với hàm lượng muối 5,8g/l). Khả năng quang hợp của các cây chuyển gen cao
hơn so với đối chứng nhưng hàm lượng chất khô cũng như độ xanh và chiều cao của
chúng hạn chế hơn so với cây đối chứng. Sau 5 tuần sử lý mặn các cây chuyển gen có ra
hoa kết quả nhưng không tạo được hạt. Như vậy các cây chuyển gen có khả năng chịu
được mặn ở nồng độ 100mM nhưng khơng có khả năng tạo hạt.

ix


THESIS ABSTRACT
Student: Vu Thi Hop
Thesis title: Improvement of salt tolerance in transgenic soybean by enhancing Na+
export through tonoplast and plasma membrane.
Branch: Biotechnology

Code: 24.03.00.48

Training institution: Vietnam Agricultural Academy
Aims of the study:
-

Successful transfer of two AtAVP1 and AtNHX1 genes into soybean DT26

-

Determining the bacterial density best suited for the trangenic soybean.

-

Determining the Acetosyringone best suited for the trangenic soybean.

-

Determining the most Co-culture time for for the trangenic soybean.

Method of the study:
The study was conducted according to the current tissue culture method, with 4
replications for each experiment, 2 replicates, 50 samples for the aims of the study 2,3
and 4, 3 replicates, 12 samples for the aims of the study. Recipe for experiment in the
nursery. Data is processed using Microsoft Excel 2007, IRRISTAT 5.0.
Findings and conclusions:
i)The bacterial density best is OD = 0,8 for trangennic soybea, ii)
the Co-culture time best is 200ul and iii) the Acetosyringone best í 200ul, iv) The rate of
T0 plants for AtAVP1 was 73.59 and AtNHX1 was 80. The T0 were grow on the
greenhouse anh the rate is 100. v) Transgenic T1 plants were planted in modified
sandwich pots using modified PVC pipe. The results showed that these plants were
resistant to salinity at 100 mM salinity (equivalent to the content Salt 5.8g / l). In the
peseresen studen, apparently, higher salt concentration had more damege to leaf and the
grennese lost much faster than the lower NaCl concentration treatments. However,
we did not observe any difference on grow, biomass or seed

trangennic and WT under thí stress conditions.

x

yields between the


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Đậu tương (Glycine max L mew) là cây cơng nghiệp ngắn ngày, có giá
trị kinh tế và được trồng phổ biến tại nhiều vùng ở nước ta. Sản phẩm từ đậu
tương được sử dụng rất đa dạng như dùng trực tiếp hạt thô hoặc chế biến thành
đậu phụ, ép dầu, nước tương, làm bánh kẹo, sữa đậu nành,... đáp ứng nhu cầu
đạm thực vật trong khẩu phần ăn hàng ngày của người cũng như gia súc (Abe H
et al, 2003).
Ở nước ta đậu tương vốn được trồng tập trung ở Đồng bằng sông Hồng
và Đồng bằng sông Cửu Long và thường được luân canh với cây lúa nước. Từ
cuối năm 2014 hiện tượng ElNino đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến nước ta, theo
báo cáo của Liên Hợp Quốc, Việt Nam là một trong những quốc gia chịu tác
động nặng nề nhất của biến đổi khí hậu làm cho nhiệt độ trung bình tăng cao,
lượng mưa giảm mạnh là nguyên nhân gây nên tình trạng hạn hán, xâm nhập
măn làm cho nước sông và nước vùng nước ngầm ven biển bị nhiễm mặn ở các
khu vực Nam Trung Bộ, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ, và đồng bằng sơng Cửu
Long. Đây cũng chính là một trong các vùng có sản lượng đậu tương lớn nhất
trước đó. Xâm thực mặn đã đe dọa cuộc sống và diện tích đất canh tác của người.
Để hạn chế tác hại của mặn đối với cây trồng, có rất nhiều biện pháp đã được sử
dụng để cải tạo đất mặn làm hạn chế tính mặn của đất như thau chua rửa mặn. Tuy
nhiên các biện pháp này thường gây tốn kém về mặt nhân công cũng như kinh tế.
Cùng với sự phát triển của cơng nghệ sinh học hiện nay thì biện pháp tạo giống
chống chịu mặn đang được chú ý. Vì đây là biện pháp hiệu quả và kinh tế nhất.

Giống mới có khả năng kháng mặn cần phải cần phải đảm bảo một số đặc
điểm về giải phẫu sinh lý sinh hóa. Về mặt giải phẫu cây kháng mặn thường có lá
ít và nhỏ, số lượng khí khổng trên lá giảm để hạn chế sự thoát hơi nước, lá
thường mọng nước, tầng cutin và tầng sáp phủ dày, làm giảm sự hình thành mơ
dẫn, tăng sự hình thành các túi tiết, lignin rễ sớm. Các cây chịu mặn thường giảm
tỷ lệ thân, rễ/lá để hạn chế sự thoát hơi nước nhằm tránh sự mất nước trong điều
kiện mặn.
Thực vật kháng mặn có khả năng tích lũy một lượng muối cao trong cơ
thể chủ yếu là NaCl sau đó sẽ thải ra bên ngồi mơi trường hay tích lũy trong các
mô già để tránh ảnh hưởng đến sinh trưởng. Một cách thức khác hiệu quả hơn là

1


tránh hấp thụ ion Na nhờ sự hấp thu có chọn lọc của rễ, hay sự vận chuyển qua
mạch hoặc loại thải Na vào không bào để tránh sự tổn hại do muối gây ra.
Phản ứng thích nghi với stress mặn đã được xác định ở mức phân tử, tế bào,
trao đổi chất và mức độ sinh lý (Gupta et al., 2014). Ở thực vật, chỉ có một thiểu số
(~1%) các loài thực vật được phân loại là cây chịu mặn. Các cây chịu mặn thường
phân bố rộng rãi cả về phát sinh loài và địa lý. Mặc dù một số cơ chế sinh lý chung
về khả năng chịu mặn đã được tìm hiểu (ví dụ điều chỉnh thẩm thấu, vận chuyển,
loại trừ và hấp thụ ion Na, nhưng sự đa dạng của những phản ứng này và các
protein cơ bản vẫn chưa được biết (Flowers et al., 2008).
Breedam chỉ ra rằng: có khoảng 10.000 lồi cây ưa mặn, trong đó 250 là

cây trồng chủ lực tiềm năng. Một số loài thực vật ưa mặn đang được phát triển
như cây Salicornia bigelovii là một giống cây hàng năm ngập mặn ở bờ biển Ả
Rập, Pakistan và Ấn Độ trên ven hồ muối Sri Lanka... Nhóm nghiên cứu Rana
Munns tại CSIRO của Úc (Commonwealth Scientific) và Tổ chức Nghiên cứu
công nghiệp tại Canberra đã thành công trong việc lai tạo giống lúa mới có khả

năng kháng mặn bằng cách lai tạo giống lúa mì hoang sơ có khả năng chịu mặn
với giống lúa mì Durum Modern khơng phải là giống chịu mặn. Khả năng loại
trừ natri của giống lúa mới này được gắn liền với hai gen Nax1 và Nax2 (Dr.
Mae-Wan ADN Prof. Joe, 2009). Các nghiên cứu của Dahai Gao, Qian Wang,
Yuxia Wu, Haiyan Xu, Qiushi Yu, Jianquan Liu 2007 cũng đã tìm thấy gen chịu
mặn ở cây cải xoong Thellungiella salsuginea (họ cải-Brassiaceae). Theo họ đây
là một điển hình của cây chịu mặn (halophyte). Bộ gen của Thellungiella cũng đã
được giải trình tự, kích thước bộ gen tương đối nhỏ và đây là nguồn gen quý để có
thể chuyển vào các cây lương thực, thực phẩm nhằm tăng khả năng chống chịu
mặn để đối phó với biến đổi khí hậu trên diện rộng (Dahai Gao et al., 2007). Bên
cạnh việc tuyển chọn các dòng thực vật chuyển gen nhờ lai tạo, các thí nghiệm
biến đổi gen cũng đã được tiến hành trong hơn 30 năm để tạo cải tạo khả năng
kháng mặn cho cây trồng quan trọng. Trên cơ sở đọc các đoạn gen nhân bản (Read
contig) để xác định các gen chịu mặn trong các loài kháng mặn sẽ cung cấp một
ngân hàng gen để cải thiện khả năng chịu mặn của các cây trồng thông thường.
Khi nghiên cứu về sự giải mã của gen, người ta cũng đã xác định được
gen mã hóa cho các protein Na+ / H+ antiporter thuộc họ gen NHX và ATVcó
tác dụng vận chuyển lượng muối dư thừa vào không bào giúp điều chỉnh phản
ứng stress muối trong cây Arabidopsis (họ cải), một cây hoang dã khá phổ biến.

2


(Dr. Mae-Wan Ho ADN Prof. Joe Cummins 2009,), (Mark ADNerson 2014).
Các gen này đã được tách chiết và chuyển vào cây cà chua nhờ đó cà chua biến
đổi gen tích lũy muối trong không bào và cách ly chúng khỏi tế bào chất của tế bào
mà khơng có trong quả làm tăng khả năng chịu mặn của cà chua. (Dr. Mae-Wan
Ho ADN Prof. Joe Cummins 2009). Ở Việt Nam các nghiên cứu chuyển gen
kháng mặn trên cây đậu tương DT26 còn rất hạn chế mà chủ yếu là các nghiên cứu
đánh giá ảnh hưởng của nồng độ muối lên cây đậu tương. Lê Hồng Giang và cộng

sự đã chỉ ra nồng độ muối NaCl 4 g/l ảnh hưởng đáng kể đến tỷ lệ sống và sinh
trưởng của cây đậu tương. Để chuyển gen thành công nhờ vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens cần phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố trong đó quan trọng nhất là ba yếu tố
nồng độ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, thời gian đồng nuôi cấy và nồng độ
Acetosyringone (AS) thích hợp.
Chính vì các lý do trên chúng tơi tiến hành thực hiện đề tài “Cải tiến
kháng mặn của đậu tương thông qua chuyển gen tăng thải loại Na+ qua
màng khơng bào và màng tế bào”.
1.2. MỤC ĐÍCH VÀ U CẦU
1.2.1. Mục đích
- Tạo được cây chuyển gen AtAVP1 và AtNHX1 có chức năng đã được
chứng minh điều khiển quá trình loại thải Na+ ra khỏi sinh chất nhằm tăng khả
năng kháng mặn của đậu tương;
- Xác định được nồng độ vi khuẩn gây nhiễm, nồng độ AS và thời gian
đồng nuôi cấy tối ưu cho việc chuyển gen thành cơng;
- Phân tích hiệu quả, chọn lọc được cây chuyển gen tốt ở các thế hệ, To và T1.
1.2.2. Yêu cầu
- Xác định được các yếu tố thuận lợi nhất cho sự chuyển hai gen có chức
năng điều khiển quá trình loại thải Na ra khỏi sinh chất AtAVP1 và AtNHX1;
- Chuyển thành công được hai gen trên vào giống đậu tương DT26;
- Kiểm tra được biểu hiện gen chuyển ở thế hệ, To và T1.
1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Đề tài chuyển gen này được thực hiện tại bộ môn sinh lý sinh hóa viện cây
lương thực và cây thưc phẩm thuộc viện khoa học nông nghiệp Việt Nam. Đối
tượng chuyển gen là giống đậu tương DT26, đây là giống mới do trung tâm Đậu
đỗ thuộc Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam đề xuất vào năm 2002, tỷ lệ quả
3


3 hạt cao trung bình 18-22%. Năng suất đạt trung bình ở độ ẩm 12% là 22-28

tạ/ha. Trong điều kiện thâm canh cao, ở diện tích hẹp, năng suất có thể đạt tới 3032 tạ/ha. Hạt màu vàng đẹp, hàm lượng protêin cao (42,21%) và lipit 19,72%.
DT26 có khả năng kháng bệnh gỉ sắt, đốm nâu và khả năng chịu ruồi đục thân,
chống đổ khá và được trồng phổ biến ở nước ta.
1.4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
- Ứng dụng quy trình chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium mang
vector chứa 2 gen AtAVP1 và AtNHX1 giúp tăng tính chống mặn.
- Đây là nghiên cứu đầu tiên ở VN trong việc sử dụng các gen vận chuyển
+

Na nhằm cải thiện tính kháng mặn ở đậu tương.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Tạo được cá thể giống đậu tương có khả năng kháng mặn, giúp phát triển
ngành sản xuất đậu tương ở VN ở những vùng gặp mặn, thích ứng với biến đổi
khí hậu, hiện tương ENINO.

4


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY ĐẬU TƯƠNG VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA
MẶN LÊN SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG
2.1.1. Giới thiệu chung về đậu tương
2.1.1.1. Nguồn gốc đậu tương
Cây đậu tương có tên khoa học là Glycine max L mew thuộc họ Đậu
(Fabaceae), là cây trồng ngắn ngày được trồng phổ biến trên thế giới. Theo các
tài liệu cổ xưa thì Trung Quốc được coi quê hương của cây đậu tương. Từ Trung
Quốc, đậu tương đã lan dần khắp thế giới (Olhoft et al., 2003).
Vào khoảng năm 200 trước công nguyên được đưa sang trồng ở triều tiên,
Nhật Bản và đến năm 1954 mới được đưa sang Mỹ. Tại đây do sự ủng hộ của

thời tiết mà đậu tương nhanh chống được nhân rộng và hiện tại đã trở thành vùng
sản xuất đậu tương chính của thế giới. Hiện tại Braxin đang là quốc gia dẫn đầu
về sản lượng đậu tương trên thế giới.

20032004200520062007200820092010201120122013

Hình 2.1. Diện tích, năng suất và sản lượng đậu tương thế giới
từ 2003 đến 2013
Nguồn: FAOSTAT (2014)

Từ thế kỉ 13 đậu tương được đưa vào trồng tại Việt Nam bắt đầu ở các
tỉnh miền bắc nước ta (Lê Quý Đôn đã ghi chép lại trong sách “Vân đài loại
5


ngữ”). Hiện nay đậu tương đã được trồng phổ biến tại Việt Nam và tập trung chủ
yếu tại đồng bằng sông Hồng và đồng bằng sông Cửu Long. Theo số liệu thống kê
chính thức, đậu tương đang được trồng tại 25 trong số 63 tỉnh thành cả nước, với
khoảng 65% tại các khu vực phía Bắc và 35% tại các khu vực phía Nam. Tuy nhiên
hiện nay diện tích và sản lượng đậu tương đang có nguy cơ bị thu hẹp do điều kiện
khí hậu thay đổi nóng lên và hiện tượng xâm nhập mặn diễn biến phức tạp

Hình 2.2. Sản lượng đậu tương cả nước giai đoạn 2000 – 2015
Nguồn: FAOSTAT (2014)

Hình 2.3. Diện tích trồng đậu tương ở Việt Nam
(Nguồn: FAOSTAT,2014)
6

Bảng 2.1. Sản lượng đậu tương của các vùng trên cả nước
gia đoạn 2010 – 2015
2010

2011

2012

2013

2014

Sơ bộ 2015

CẢ NƯỚC
Hà Nội

298.6
56.4

266.9
50.5

173.5
19.8

168.2
30.4

156.5

27.4

146.4
30.2

Hà Tây
Vĩnh Phúc

..
10.9

..
8

..
4.6

..
4.5

..
4.1

..
4.6

Bắc Ninh
Quảng Ninh

5.5

1

3.9
1

3.1
1

2.7
1

2.6
0.8

1.9
0.6

Hải Dương
Hưng Yên

2.4
7.5

1.7
6.6

1.3
4.9

1.2

4.7

1.2
3.9

1.1
4.3

Thái Bình
Hà Nam

27.1
17.7

24.8
17.5

12.5
7.4

8.7
7.5

9.3
7

8.3
5.6

Nam Định

Hà Giang

3.7
23

4.7
24.2

3
25.8

2.8
28.8

4.6
30.5

3.4
31.8

Cao Bằng
Bắc Kạn

4.6
3.1

4.6
2.8

4.6

2.5

4.1
2.1

4.1
1.6

4
1.6

Tuyên Quang
Lào Cai

4.8
4.9

5.1
5.3

3.7
5.2

2.9
5.2

2.2
5.3

1.9

5.5

Thái Nguyên
Lạng Sơn
Bắc Giang

2.3
2.3
2.6

2.4
2.1
2.1

2.2
1.8
1.9

2
1.8
1.5

1.7
1.7
1.4

1.5
1.5
1.3

Điện Biên
Lai Châu

10
2.2

9.5
2.6

8.8
2.5

7.2
2.8

7.2
2.4

6.4
2.3

Sơn La
Hoà Bình

10.6
2.1

10.6
1.7

4.6
0.9

3.4
0.9

2.6
0.8

1.5
0.7

Thanh Hố
Đắk Lắk

9.3
11.7

14.4
11.4

12.1
11.4

13.8
6

11.2
5.1

6.3
4.6

Đắk Nơng

31.1

21.5

11.1

9.3

8.4

8.5

Đồng Nai

2.2

1.1

0.9

0.6

0.4

0.5

Đồng Tháp
An Giang

9.8
1.2

4.5
0.6

3.4
0.8

1.8
0.4

1.4
0.2

0.6
0.1

Qua các số liệu trên ta có thể thấy diện tích và sản lượng đậu tương đang
sụt giảm nghiêm trọng qua các năm do diện tích đất canh tác bị thu hẹp do xâm
nhập mặn và kỹ thuật canh tác cũng như giống còn hạn chế.

7


2.1.1.2. Giá trị kinh tế của đậu tương

a. Giá trị về mặt thực phẩm
Hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao trong đó quan trọng là
protein và lipit.
Protein của đậu tương được đánh giá là loại protein có giá trị cao nhất
trong các loại protein có nguồn gốc từ thực vật, hàm lượng protein trong đậu
tương cao hơn hàm lượng protein có trong thịt cá và cao hơn gấp 2 lần so với các
loại đậu khác. Nhiều nhà khoa học xem đậu tương như là chìa khóa để giải quyết
nạn thiếu protein trong dinh dưỡng của con người. Đậu tương còn được dùng để
chữa bệnh tiểu đường, suy nhược thần kinh, suy nhược dinh dưỡng … (Bùi Chí
Bửu và cs. 2010).
Đậu tương của nước ta có chất lượng khá tốt protein khoảng 38–40%,
trọng lượng 1000 hạt: 90–120g, hạt vàng hoặc xanh, rốn hạt nâu hoặc đen. Một
số giống mới chọn gần đây có cải thiện hơn về chất lượng: hạt vàng, trịn, rốn
trắng, ít nứt, trọng lượng 1000 hạt: 180–270g protein 43–47%.
Bảng 2.2. Thành phần dinh dưỡng trong 100g hạt đậu nành
Loại hạt

Calorie

Protein (g)

Lipid (g)

Glucid (g)

Xơ (g)

Tro (g)

Hạt xanh

Hạt trắng

436
444

40,8
39,0

17,9
19,6

35,8
35,5

6,0
4,7

5,3
5,5

Hạt vàng

439

38,0

17,1

40,3

4,9

4,6

Nguồn: Sinha Sk (1979)

Protenin đậu tương chứa một số acidamin thiết yếu cho con người và có
hàm lượng lipid cao hơn hẳn nên được coi là cây cung cấp dầu thực vật chính.
Chất béo trong đậu nành dao động từ 13,5–24%, trung bình 18%. Chất béo đặc
trưng chứa khoảng 6,4–15,1% acid béo no (acid stearic, acid acid archidonic) và
80–93,6% acid béo không no (acid enoleic acid linolenic, acid linolenic, acid
oleic). (Nguyễn Thị Chinh và cs. 2007).
Ngoài ra các nhà khoa học hiện nay cũng thấy rằng đậu tương còn chứa
chất lexithin, có tác dụng làm cho cơ thể trẻ lâu, sung sức, làm tăng thêm trí nhớ và
tái sinh các mô, làm cứng xương và tăng sức đề kháng của cơ thể (Phạm Văn
Thiều, 2006). lecithine có tác dụng điều hồ lượng cholesterol, ngăn ngừa tích luỹ
cholesterol, thúc đẩy q trình phân tách và bài xuất nó ra khỏi cơ thể con người,
nó dược chiết tách từ dầu đậu tương. Bên cạnh đó các nhà khoa học cũng phát hiện

8


hợp chất Isoflavone có trong đậu tương giúp tăng tính đàn hồi lớp collagen, giữ
độ ẩm và kéo dài tuổi thọ cho tế bào da (Vinasoy, 2012).
Bảng 2.3. Thành phần các acid amin trong protein đậu nành
Loại acid amin
Isoleucine
Leucine
Lysine
Methionine

Cystein
Phenylalanine
Threonine
Tryptophane
Valine
Histidin

Phần trăm%
1,1
7,7
5,9
1,6
1,3
5,0
4,3
1,3
5,4
2,6
Nguồn: Kitrigin (1981)

Ngoài hai thành phần quan trọng là protein và lipid đậu tương cịn chứa
nhiều thành phần khác có lợi cho con người : vitamin, enzyme, chất khoáng Ca,
P, Fe,... và một số enzyme có lợi.
b. Giá trị về cơng nghiệp
Đậu tương được sử dụng nhiều trong công nghiệp là nguyên liệu cho
nhiều ngành công nghiệp khác nhau: chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, sản
xuất xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo nhưng chủ yếu nhất vẫn là sử dụng trong
công nghiệp chế biến dầu thực vật. Hiện nay dầu đậu tương chiếm 50% dầu thực
vật. Sở dĩ chúng được ưa chuộng vì có đặc điểm khơ chậm, ngưng tụ ở nhiệt độ
-15 đến -18oC, chỉ số iốt cao: 120 – 127, chứa các hợp chất tốt cho sức khỏe.

Ngồi ra chúng cịn được dùng để sản xuất thuốc cho y học
c. Giá trị về mặt nông nghiệp
Làm thức ăn cho gia súc
Đậu tương là nguồn thức ăn tốt cho gia súc 1kg hạt dậu tương tương
đương với 1,38 đơn vị thức ăn chăn ni. Tồn bộ cây đậu tương có hàm lượng
đạm rất cao thường được dùng để cho gia súc ăn trực tiếp hay có qua chế biến
(Bùi Chí Bửu, 2012). Lá, thân đậu tương phơi khô nghiền nhỏ dùng làm thức ăn
khô trong chăn nuôi. Sản phẩm thải loại của ngành công nghiệp ép dầu là khô
dầu đậu tương cũng được sử dụng triệt để do vẫn còn thành phần dinh dưỡng khá
cao protein 46-48% - lipid 1% 6,2% N, 0,7% P 2O5, 2,4% K2O (Ngô Thế Dân
và cs, 1999).

9


Cải tạo đất trồng
Đậu tương là cây luân canh cải tạo đất tốt vì với 1 ha trồng đậu
tương nếu sinh trưởng, phát triển tốt khi thu hoặc lên sẽ để lại trong đất từ
30-60 kg N (Phạm Gia Thiều, 2000). Thân lá đậu tương dùng ủ bón ruộng
thay phân hữu cơ rất tốt bởi hàm lượng N trong thân chiếm 0,05%, trong lá
chiếm 0,19% (Đào Quang Vinh và cộng sự, 1994) vì vậy có thể giảm chi
phí về phân bón N. Dùng đậu tương để phủ, trống xói mịn ở vùng đồi núi
và hạn chế việc sử dụng phân bón hóa học đặc biệt là phân có chứa N làm
giảm tác nhân gây ô nhiễm môi trường.
2.1.2. Đậu tương DT26
2.1.2.1. Nguồn gốc và đặc điểm
Giống đậu tương DT26 là giống mới được chọn lọc từ tổ hợp lai giữa
ĐT2000 x ĐT12 do Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ thuộc Viện
Khoa học Nông nghiệp Việt Nam công bố năm 2002. Đến năm 2008 được công
nhận là giống sản xuất thử theo Quyết định số 111/QĐ-TT-CCN ngày 03 tháng

06 năm 2008. Đây là giống cho năng suất tốt có khả năng chống chịu khá với
bệnh gỉ sắt, đốm nâu; đặc biệt là khả năng phục hồi chống đổ sau khi bị dòi đục
thân, tỷ lệ quả 3 hạt cao, là một trong những giống có triển vọng, góp phần mang
lại hiệu quả kinh tế cao.

Hình 2.4. Thử nghiệm giống đậu tương ĐT26 tại Nam Định vụ xuân 2013
Nguồn:

10


Giống đậu tương ĐT26 có hoa màu trắng, hạt vàng, rốn quả màu nâu
đậm, khi quả chín có màu nâu. Chiều cao cây trung bình từ 45 – 60cm, phân
cành khá từ 2 – 3 cành/cây, tỷ lệ quả 3 hạt cao. Khối lượng 100 hạt (18 – 19g).
Thời gian sinh trưởng trung bình 90 – 95 ngày; năng suất 21 – 29 tạ/ha tùy
thuộc vào mùa vụ và điều kiện thâm canh. DDT26 là giống thích hợp nhất
trong vụ Xn và vụ Đơng.
Chu kì sinh trưởng và phát triển.

Hình 2.5. Tóm tắt giai đoạn sinh trưởng và phát triển của đậu tương DT26
Nguồn:

Đậu tương DT 26 có chu kì sinh trưởng và phát triển từ khi giao trồng
đến khi thu hoạch vào khoảng thời gian 90 – 95 ngày là giống đậu tương dài
ngày. Một chu trình sinh trưởng gồm hai giai đoạn là sinh trưởng sinh
dưỡng(V) và sinh trưởng thực (R). Giai đoạn thứ nhất là giai đoạn sinh trưởng
của các cơ quan sinh dưỡng như rễ, thân, lá còn giai đoạn thứ hai chuyển sang
giai đoạn hình thành các cơ quan sinh sản và dự trự như hoa, quả, hạt…
Giai đoạn thứ nhất: giai đoạn sinh dưỡng

11


Hình 2.6. Giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng
Nguồn:

Giai đoạn VE: giai đoạn nảy mầm
Giai đoạn VC: giai đoạn ra lá mầm
Giai đoạn V1: ra lá đơn và xuất hiện lá mầm thật(lá mầm 3 thùy)
Giai đoạn V2: ra lá đơn và 2 lá thật đầu tiên phát triển dủ kích thước
Thời kì từ gieo đến mọc(VE - VC): bắt đầu từ khi hạt giống được gieo
xuống đất hút nước và trương ra cho đến khi cây có hai lá mầm. Giai đoạn này
thường từ 4 – 5 ngày nếu nhiệt độ cao và từ 7 – 10 ngày nếu nhiệt độ thấp.
Thời kì mọc đến ra hoa thời kì đầu cây sinh trưởng chậm đến khi chuẩn
bị ra nụ trổ hoa thì cây bắt đầu tăng nhanh sinh trưởng.
Giai đoạn 2: sinh trưởng thực(R): gồm 8 giai đoạn
R1: Ra hoa; R2: Ra hoa rộ; R3: bắt đầu ra quả; R4: Quả đầy đủ; R5: bắt
đầu làm hạt; R6: Chắc già; R7: bắt đầu chín; R8: chín hồn tồn
Ở giai đoạn R1, 1 hoa sẽ ra trên bất kì đốt cây nào. Lúc này đậu tương
vẫn phát triển cả thân, rễ và lá. Đến giai đoạn R2 hoa sẽ nở ở 1 trong 2 đốt cao
nhất trên thân chính có lá phát triển đầy đủ. Sau khi ra hoa và thụ phấn khoảng
5 – 7 ngày bắt đầu hình thành quả. Khi quả phát triển tối đa thì hạt bắt đầu phát
triển. Tốc độ tích lũy chất khơ của hạt tăng nhanh cho đến khi hạt vào chắc. Độ
ẩm thời kì này có vai trị quyết định đến sự phát triển của quả và hạt. Khi hạt
đạt đến giai đoạn R7 một quả bình thường trên thân chính bắt đầu chuyển sang

12


màu vàng hoặc nâu đậm. khoảng 4-6 ngày sau khoảng 95% số quả đạt đến màu

vàng đặc trưng là bắt đầu giai đoạn chín hồn tồn. Lúc này hạt trở nên rắn, vỏ
hạt có màu vàng tươi, vỏ quả chuyển sang mà nâu, lá úa vàng và rụng bớt là
cây đã bắt đầu chuyển sang giai đoạn thu hoạch.

Hình 2.7. Giai đoạn sinh trưởng thực (R)
Nguồn:

2.1.3. Ảnh hưởng của mặn lên sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương
Do ảnh hưởng của hiện tượng biến đổi khí hậu tồn cầu khiến trái đất
nóng lên, hiệu ứng nhà kính gia tăng làm nước biển dâng cao khiến cho hiện
tượng xâm ngập mặn diễn biến phức tạp. Trên thế giới có khoảng 20% diện tích
đất canh tác đã bị nhiễm mặn và diện tích này được dự báo sẽ cịn tăng lên (Zhu,
2001). Đất nhiễm măn đe dọa đến hơn 100 nước nông nghiệp làm suy giảm năng
suất và chất lượng cây trồng trên những diện tích đất ngập mặn (Phang et al.,
2008; Zhu, 2001). Tại Việt Nam theo số liệu thống kê có khoảng gần 2 triệu ha
đất bị nhiễm mặn (Lang et al., 2001) chiếm 6% diện tích đất canh tác của cả
nước và tập trung chủ yếu ở ĐBSH và ĐBSCL và có nguy cơ tăng nhanh và lan
rộng trên các khu vực khác.
Hiện nay, để đánh giá độ mặn của đất, trên thế giới người ta dùng đại
lượng EC là độ dẫn điện của đất, có đơn vị là dS/m (1dS/m = 0,64‰). Đất mặn là
những loại đất có độ dẫn điện (EC) lớn hơn 4 dS/m ở 25oC (Abel et al, 1964)
tương đương với nồng độ muối hòa tan khoảng 2,56 ‰. Natri và Clorua là các
ion chiếm tỉ lệ nhiều nhất trong các loại đât mặn.

13


Bảng 2.4: Các loại đất mặn (phân theo nồng độ) và ảnh hưởng
đối với cây trồng
Cấp độ mặn

Quy ước

ECse(mS/cm)

Tổng muối hịa tan (%)

0

Khơng mặn

0-2

<0,15

1

Mặn ít

4-8

0,15-0,35

2

Mặn trung bình

8-15

0,35-0,65

3

Mặn nhiều

>15

>0,65
Nguồn: Utah State University)

Khi bị nhiễm mặn cây trồng sẽ chịu tác động trên ba yếu tố
- Thiếu nước cho cây do thế thẩm thấu thấp ngồi mơi trường xung quanh rễ;
- Bị độc do quá nhiều ion Na+ và Cl- xâm nhập vào trong mô rễ;
- Mất cân bằng các nguyên tố dinh dưỡng do sự cạnh tranh của các nguyên
tố dinh dưỡng với Na+ ( Trần Thị Phương Liên, 1998).
Sinh trưởng phát triển của cây trồng khi bị mặn tác động sẽ bị sự ức chế
hoặc phá hủy hàng loạt các quá trình tổng hợp và trao đổi chất trong cây trồng
dẫn đến gây nên các tác hại:
Gây hạn sinh lý
Việc dư thừa muối trong đất đã làm tăng áp suất thẩm thấu của dung dịch
đất. Cây không lấy được nước và chất khoáng từ đất khi nồng độ muối tan trong
đất nhỏ hơn nồng độ dịch bào của rễ, tức áp suất thẩm thấu và sức hút nước của
rễ cây phải lớn hơn áp suất thẩm thấu và sức hút nước của đất. Nếu độ mặn của
đất tăng cao dẫn đến mức sức hút nước của đất vượt quá sức hút nước của rễ thì
cây sẽ bị mất nước. Cây khơng hấp thu được nước nhưng q trình thốt hơi
nước của lá vẫn diễn ra bình thường sẽ làm mất cân bằng nước gây nên hiện
tượng hạn sinh lý. Việc tăng áp suất thẩm thấu trong đất mặn quá mức là nguyên
nhân quan trọng nhất gây hại cho cây trồng trên đất mặn.
Mặn ảnh hưởng đến đến các hoạt động sinh lý cây thơng qua một số q
trình sau:

- Sự trao đổi nước: mặn thường cản trở sự hấp thu nước của cây và có thể
gây nên hạn sinh lý và cây bị héo lâu dài…
- Sự tổng hợp xytokinin bị ngừng vì rễ là cơ quan tổng hợp phytohormon
này, nên làm cây thiếu xytokinin ảnh hưởng đến sinh trưởng của các cơ quan trên
mặt đất.

14