Phân lập tuyển chọn và nghiên cứu, khả năng phân hủy sinh học hydrocacbon thơm của một vài chủng vi khuẩn được phân lập từ nước ô nhiễm dầu tại quảng ninh

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
---------------------------------





LÊ TIẾN MẠNH





PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU
KHẢ NĂNG PHÂN HỦY SINH HỌC
HYDROCACBON THƠM
CỦA MỘT VÀI CHỦNG VI KHUẨN
ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ NƯỚC Ô NHIỄM DẦU
TẠI QUẢNG NINH





LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái nguyên - 2008

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
---------------------------------




LÊ TIẾN MẠNH



PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU
KHẢ NĂNG PHÂN HỦY SINH HỌC
HYDROCACBON THƠM
CỦA MỘT VÀI CHỦNG VI KHUẨN
ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ NƯỚC Ô NHIỄM DẦU
TẠI QUẢNG NINH


Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC



Người hướng dẫn khoa học: TS. NGHIÊM NGỌC MINH






Thái nguyên - 2008

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Lêi c¶m ¬n!
Trước hết tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành, sâu sắc tới TS.
Nghiêm Ngọc Minh đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá trình
nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Trong quá trình nghiên cứu vừa qua, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và
chỉ bảo tận tình của PGS.TS. Đặng Thị Cẩm Hà và các anh chị Phòng Công
nghệ Sinh học Môi trường, đặc biệt là KS. Đàm Thúy Hằng, Thạc Sỹ Nguyễn
Bá Hữu những người đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn của
mình.
Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học,
Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để
hoàn thành bản luận văn này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm khoa,
các thầy cô và các bạn đồng nghiệp Khoa Sinh – KTNN đã tạo điều kiện,
giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường Đại học Sư
Phạm - Đại Học Thái Nguyên.

Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn
bè đã tạo điều kiện động viên giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tôi
có thể hoàn thành bản luận văn này.
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp
đỡ quý báu đó!
Hà nội, tháng 9 năm 2008
Học viên

Lê Tiến Mạnh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số
liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa có ai công
bố trong một công trình nào khác.


Tác giả


Lê Tiến Mạnh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
MỤC LỤC

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................1
DANH MỤC CÁC BẢNG.................................................................2
DANH MỤC CÁC HÌNH ..................................................................3
MỞ ĐẦU ..........................................................................................
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................8

1.1 Đặc điểm cơ bản của hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân .............8
1.1.1. Tính chất hóa lý ..................................................................8
1.1.2 Tính độc của PAH và ảnh hƣởng của nó tới môi trƣờng
sống .............................................................................................10
1.2. Nguồn gốc phát sinh PAH ..........................................................13
1.2.1. Hiện trạng ô nhiễm PAH trên thế giới và ở Việt Nam ...........13
1.2.2. Nguồn gốc phát sinh ............................................................14
1.3. Các biện pháp xử lý tẩy độc PAH ................................................15
1.3.1 Phƣơng pháp hóa lý ..............................................................16
1.3.2. Phƣơng pháp phân hủy sinh học ...........................................16
1.4. Phân hủy sinh học các PAH bởi vi sinh vật ..................................19
1.4.1. Vi sinh vật phân hủy PAH ...................................................19
1.4.2. Cơ chế phân hủy PAH bởi VSV ...........................................21
1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình phân hủy các hợp chất
hydrocarbon thơm đa nhân .................................................................25
1.6. Các phƣơng pháp phân loại vi sinh vật ........................................29
1.6.1. Phƣơng pháp phân loại truyền thống ...................................29
1.6.2. Phƣơng pháp phân loại bằng sinh học phân tử .....................30
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................33
2.1. Nguyên liệu và hóa chất .............................................................. 33
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
2.1.1. Nguyên liệu.........................................................................33
2.1.2. Hóa chất .............................................................................33
2.2. Môi trƣờng nuôi cấy....................................................................33
2.3. Máy móc và thiết bị nghiên cứu ...................................................34
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................34
2.4.1. Phân lập vi sinh vật trên mẫu nƣớc nhiễm dầu ......................34
2.4.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của một số
chủng vi khuẩn .............................................................................35
2.4.3. Đánh giá khả năng sử dụng PAH của vi khuẩn......................36

2.4.4. Xác định trình tự gen mã hóa 16S rRNA và catechol
2,3-dioxygenase............................................................................36
2.4.4.1. Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn theo
phƣơng pháp của Sambrook, Russell ........................................36
2.4.4.2. Nhân đoạn gen bằng phƣơng pháp PCR ........................37
2.4.4.3. Quy trình biến nạp và chọn dòng ..................................38
2.4.4.4. Phƣơng pháp xác định trình tự gen bằng máy tự
động ........................................................................................40
2.4.4.5. Phƣơng pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại ...........41
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................42
3.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phát triển
trên môi trƣờng chứa PAH .................................................................42
3.2. Đặc điểm hình thái và tế bào của chủng vi khuẩn BQN31 .............44
3.3. Khả năng sử dụng các loại PAH của chủng vi khuẩn
BQN31 .............................................................................................45
3.4. Xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng
BQN31 .............................................................................................49
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
3.4.1. Tách chiết DNA tổng số và nhân đoạn gen mã hóa
16S rRNA bằng kỹ thuật PCR .......................................................49
3.4.2. Tách dòng gen mã hóa 16S rRNA từ chủng BQN31 ............50
3.4.3 Tách DNA plasmid và kiểm tra các dòng khuẩn lạc
thích hợp ......................................................................................52
3.4.4. Trình tự gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn BQN31 .............54
3.5. Nhân đoạn gen mã hóa catechol 2,3 dioxygenase từ chủng
BQN31 .............................................................................................57
IV. KẾT LUẬN ........................................................................................62
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................63

Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
1
BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

bp Base pair (cặp bazơ)
USEPA United State Environmental Protection Agency (Cục bảo vệ
môi trường Hoa Kỳ)
LB Luria-Bertani
PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp)
POP Persistent Organic Pollutant
DNA Deoxyribonucleic acid
RNA Ribonucleic acid
rRNA Ribosomal ribonucleic acid
VSV Vi sinh vật
X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside
μl Microlit
μm Micromet
PAH

Polycyclic aromatic hydrocacbon (hydrocarbon thơm đa
nhân)
ppm đơn vị một phần triệu (mg/l)

Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
2
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1: Tính chất vật lý của một số loại PAH ......................................... 9
Bảng 1.2: Một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy PAH ................. 20

Bảng 1.3: Một số phương pháp phân loại vi sinh vật ................................. 30
Bảng 3.1: Số lượng vi khuẩn phân lập được trên môi trường khoáng
có bổ sung các hợp chất PAH .................................................................... 42
Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn ............................... 44
Bảng 3.3: phổ UV đo khả năng phân hủy các PAH của chủng
BQN31..................................................................................................... 46
Bảng 3.4: Khả năng sử dụng các PAH khác nhau của chủng BQN31 .......... 46
Bảng 3.5: Độ tương đồng của chủng BQN31 so với một số đại diện
đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế .............................................. 56
Bảng 3.6: Độ tương đồng của đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3
dioxygenase của chủng BQN31 so với một số đại diện đã được công
bố trên ngân hàng gen quốc tế ................................................................... 60


Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
3
DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang
Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của một số hydrocacbon thơm đa nhân
(PAH) ...................................................................................................... 8
Hình 1.2: Các con đường phân hủy PAH ở vi sinh vật ............................... 21
Hình 1.3: Ba con đường phân hủy hiếu khí PAH chính của vi khuẩn
và nấm .................................................................................................... 22
Hình 3.1: Khả năng phân hủy phenanthrene của 4 chủng BQN30,
BQN31, BQN32, BQN33.......................................................................... 43
Hình 3.2: Hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn BQN31............................... 45
Hình 3.3: Hình thái tế bào vi khuẩn BQN31 .............................................. 45
Hình 3.4: DNA tổng số của chủng BQN31 ............................................... 50

Hình 3.5: Sản phẩm PCR nhân đoạn gene mã hóa 16S rRNA của
chủng BQN31........................................................................................... 50
Hình 3.6: Kết quả biến nạp chủng BQN31 ................................................ 51
Hình 3.7: Sản phẩm điện di kiểm tra DNA plasmid của các dòng
được lựa chọn ........................................................................................... 52
Hình 3.8: Sản phẩm cắt DNA plasmid của dòng số 13 ............................... 53
Hình 3.9: Sản phẩm làm sạch DNA plasmid dòng số 13 của chủng
vi khuẩn BQN31....................................................................................... 53
Hình 3.10: Trình tự đầy đủ đoạn gen 16S rRNA của chủng BQN31 ........... 54
Hình 3.11: Cây phát sinh loài dựa trên so sánh trình tự các đoạn gen
mã hóa 16S rRNA của chủng BQN31 và một số chủng vi khuẩn đại
diện. Thước đo thể hiện hai nucleotide khác nhau trên 1.000
nucleotide so sánh..................................................................................... 55
Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
4
Hình 3.12: Sản phẩm PCR nhân đoạn gen mã hóa enzyme catechol
2,3-dioxygenaza từ DNA tổng số chủng BQN31 và cặp mồi C23OF
và C23OR ................................................................................................ 58
Hình 3.13: Trình tự nucleotide và trình tự axít amin suy diễn đoạn
gen mã hóa enzyme catechol 2,3-dioxygenaza của chủng
Sphingomonas sp. BQN31 ........................................................................ 58
Hình 3.14: Cây phát sinh loài dựa trên so sánh trình tự các đoạn gen
mã hóa enzyme catechol 2,3-dioxygenaza của chủng Sphingomonas
sp. BQN31 và một số chủng vi khuẩn đại diện. Thước đo thể hiện
một nucleotide khác nhau trên 100 nucleotide so sánh ................................ 59


Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

5
MỞ ĐẦU

Trong thời đại ngày nay, cùng với sự phát triển nhanh chóng của xã
hội, nhu cầu về nguyên liệu và nhiên liệu của con người ngày càng tăng, đã
kéo theo sự mở rộng các ngành công nghiệp khai thác, chế biến như: công
nghiệp dầu mỏ, khai thác chế biến than, công nghiệp sản xuất sơn, sản xuất
các hóa chất tẩy rửa...
Quảng Ninh là một tỉnh nằm trong vùng kinh tế trọng điểm Bắc Bộ, có
tốc độ tăng trưởng kinh tế cao so với bình quân chung của cả nước. Trong
những năm gần đây, các ngành công nghiệp và dịch vụ chiếm một tỷ trọng
lớn, khoảng trên 80% GDP của tỉnh. Các ngành công nghiệp khai thác và chế
biến than, xi măng, đóng tàu, nhiệt điện, sản xuất vật liệu xây dựng đang có
tốc độ phát triển nhanh. Quảng Ninh là một trong những điểm trung chuyển
xăng dầu lớn nhất cả nước. Hoạt động vận tải đường bộ, đường thủy; các hoạt
động du lịch, vận tải khách du lịch….diễn ra hết sức sôi động. Các hoạt động
trên đã tạo ra một bộ mặt kinh tế rất đa dạng của Quảng Ninh. Tuy nhiên, các
hoạt động đó cũng đã gây ra những hậu quả không nhỏ về môi trường, đặc
biệt là các hoạt động vận chuyển và khai thác than, chế biến và sử dụng vật
liệu nổ, các hoạt động vận tải, trung chuyển xăng dầu… ở Quảng Ninh.
PAH là một nhóm các hợp chất hữu cơ có hai hay nhiều vòng thơm.
Chúng có mặt khắp nơi trong môi trường (đất, không khí, các nguồn nước và
các lớp trầm tích) và là một trong các thành phần có trong các sản phẩm của
dầu mỏ [16]. Một số PAH có khả năng gây ung thư tiềm tàng, gây đột biến và
là chất gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. Tổ chức bảo vệ môi trường Mỹ
(USEPA) đã xếp PAH vào nhóm những chất ô nhiễm điển hình và tiến hành
kiểm soát sự có mặt của PAH trong các hệ sinh thái dưới nước cũng như trên
cạn [16], [50].

Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
6
Trong nước thải tại nhiều cơ sở sản xuất công nghiệp ở Quảng Ninh,
ngoài một số hợp chất hữu cơ, vô cơ (NH
4
NO
3
) thì sự có mặt của dầu và một
số các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân (PAH) đang là vấn đề lớn đặt ra
đòi hỏi các cấp chính quyền địa phương cần phải quan tâm xử lý triệt để. Hiện
nay để khắc phục hậu quả này có nhiều phương pháp có thể áp dụng như sử
dụng hóa chất, hấp phụ, lắng đọng… Tuy nhiên các phương pháp này đòi hỏi
chi phí lớn và vẫn có thể gây ra ô nhiễm thứ cấp.
Qua thử nghiệm thực tế, phương pháp xử lý bằng công nghệ sinh học
đã và đang khẳng định tính ưu việt của nó. Đó là giá thành rẻ, có thể tiến hành
thuận lợi trong điều kiện tự nhiên, độ an toàn rất cao và thân thiện với môi
trường. Do vậy, trên thế giới và ở Việt Nam đã có nhiều nhà khoa học tập
trung nghiên cứu về điều tra về phân bố, cấu trúc các tập đoàn vi sinh vật, khả
năng phân hủy PAH của các chủng đơn cũng như các tập đoàn vi sinh vật.
Các gen tham gia quá trình phân hủy sinh học PAH cũng được quan trắc trong
quá trình xử lý, của các tập đoàn VSV bản địa và trong các nghiên cứu phân
hủy PAH ở điều kiện phòng thí nghiệm. Catechol là một trong các sản phẩm
trung gian của quá trình phân hủy sinh học các hợp chất vòng thơm, do vậy
các gen mã hóa các enzym chuyển hóa catechol được nhiều nhà nghiên cứu
quan tâm.
Chính vì những yêu cầu thực tiễn trên, chúng tôi đã lựa chọn nghiên
cứu và thực hiện đề tài “Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu khả năng
phân hủy sinh học hydrocarbon thơm của một vài chủng vi khuẩn được
phân lập từ nước ô nhiễm dầu tại Quảng Ninh”.

Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
7
Mục tiêu nghiên cứu:
Phân lập và tuyển chọn ra được một số chủng vi khuẩn có khả năng
phân huỷ hợp chất hydrocacbon thơm.
Nội dung nghiên cứu của luận văn bao gồm:
1. Phân lập và tuyển chọn một số loại vi khuẩn có khả năng phân hủy
PAH.
2. Nghiên cứu, đánh giá khả năng phân hủy sinh học PAH của một số
chủng vi khuẩn đã được phân lập.
3. Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái tế bào của một đại diện vi khuẩn
có khả năng phân hủy PAH.
4. Phân loại định tên đại diện vi khuẩn có khả năng phân hủy PAH dựa
trên việc xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA.
Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
8
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Đặc điểm cơ bản của hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân
1.1.1 Tính chất hóa lý
Các PAH có mặt khắp nơi trong môi trường, những hợp chất này có 2-
6 vòng benzen kết hợp với nhau. Trọng lượng phân tử vào khoảng 128 – 278
g/mol (Hình 1.1).

PAH là những chất kỵ nước. Khả năng gây ô nhiễm môi trường tùy
thuộc khả năng hòa tan của chúng trong môi trường nước [16], [48]. Đặc
điểm về khả năng hòa tan và áp suất hơi của PAH là nhân tố chính ảnh hưởng
đến khả năng phân tán của chúng trong khí quyển, thủy quyển và sinh quyển.
Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của một số hydrocarbon
thơm đa nhân (PAH)

Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
9
Số lượng vòng benzen trong cấu trúc hóa học của các PAH quyết định khả
năng hòa tan của các PAH trong nước. PAH giảm khả năng hòa tan trong
nước hay tăng tính kỵ nước khi số lượng vòng benzen tăng [54]. Khả năng
hòa tan của các PAH rất biến động, từ những chất khó hòa tan nhất là
benzo(b)perylen có chỉ số hòa tan là 0,003 mg/l cho đến chất dễ hòa tan nhất
là naphthalen có chỉ số hòa tan tới 31 mg/l. Nếu khả năng hòa tan trong nước
của PAH thấp, hay hệ số hấp phụ cao sẽ dẫn đến các PAH có xu hướng bị hấp
phụ trong cặn bùn, đất đá và trầm tích, do đó ảnh hưởng rất nhiều tới khả

năng chúng bị phân hủy sinh học bởi vi sinh vật [10]. Ngược lại, khả năng
hòa tan trong nước của PAH cao thì khả năng bị phân hủy bởi vi sinh vật
cũng cao. Điều đó cho thấy khả năng hòa tan trong nước của các PAH có ảnh
hưởng đặc biệt quan trọng trong quá trình phân hủy sinh học PAH.
Bảng 1.1: Tính chất vật lý của một số loại PAH [31]
* Kp
d
= [octanol]/ [nước]
Trong các tính chất vật lý của PAH, hệ số Kp
d
phản ánh khả năng hấp
phụ lên bề mặt vật liệu rắn. Nếu hệ số Kp
d
cao, các PAH có xu hướng tăng
Loại PAH

Số
vòng
thơm
Nhiệt độ
nóng chảy
(
o
C)
Nhiệt độ
sôi
(
o
C)
Độ tan

trong
nước
(mg/l)
LogKp
d

Áp suất
hơi ở
20
o
C
(torr)
Phenanthrene 3 101 340 1,29 4,45 6,8x10
-4

Anthracene 3 216 340 0,07 4,46 2,0x10
-4
Fluoranthene 4 111 250 0,26 5,33 6,0x10
-6

Benzo[a]anthracene 4 158 400 0,24 5,61 5,0x10
-9
Pyrene 4 149 360 0,14 5,32 6,8x10
-7
Chrysene 4 255 488 0,02 5,61 6,3x10
-7
Benzo[a]pyrene (BaP) 5 179 496 0,0038 6,04 5,0x10
-7
Dibenzo[a]anthracene 5 262 524 0,0005 5,97 1,0x10
-10

Benzo[g,h,i]perylen 6 222 -- 0,0003 7,23 1,0x10
-10

Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
10
khả năng hấp phụ lên bề mặt các vật liệu rắn, đồng nghĩa với sự giảm khả
năng phân hủy sinh học.
Áp suất hơi và nhiệt độ sôi của các PAH cũng có vai trò quan trọng
trong quá trình xử lý loại bỏ PAH khỏi các vùng bị ô nhiễm do nó ảnh hưởng
đến khả năng hóa hơi của mỗi PAH. Khi áp suất hơi tăng, khả năng bay hơi
của các PAH cũng tăng, mà sự bay hơi cũng là một con đường để loại bỏ
PAH khỏi nguồn ô nhiễm. Khả năng bay hơi của các PAH cũng phụ thuộc
vào kích thước và khối lượng phân tử. Naphthalene có kích thước nhỏ nhất
nên có khả năng bay hơi đến 89%, trong khi đó benzo[a]pyrene (BaP) là hợp
chất có kích thước lớn, chỉ có khả năng bay hơi 1%. Phenanthrene là đồng
phân của anthracene có độ bay hơi thấp hơn do cấu trúc phân tử chứa các
vòng thơm không thẳng hàng như trong cấu trúc của anthracene (Hình 1.1 và
Bảng 1.1).
PAH còn bị phân hủy dưới ánh sáng tử ngoại từ bức xạ mặt trời. Trong
khí quyển, PAH có thể phản ứng với những chất ô nhiễm như nitrogen oxid,
sulfur oxid tạo thành các dạng dione, nitro và dinitro PAH và sulfonic acid.
1.1.2 Tính độc của PAH và ảnh hưởng của nó tới môi trường sống
Tính độc của PAH đã được người ta biết đến từ những năm 30 của thế
kỷ XX, khi Hieger và Cook cùng những cộng sự khác nghiên cứu và thấy
tinh thể benzo(a)pyrene màu vàng gây khối u ở động vật thí nghiệm [17]. Với
con người, PAH có thể là tác nhân gây đột biến và dẫn đến ung thư [16],
[31], [11], [27]. Ở quy mô phòng thí nghiệm, một số nghiên cứu đã chỉ ra
rằng, quá trình gây ung thư bởi PAH là một quá trình phức tạp, đa giai đoạn
và phụ thuộc vào nhiều yếu tố: kích thước phân tử PAH, độ phân cực trong

phân tử, hóa học lập thể và các phản ứng xảy ra trong quá trình trao đổi chất,
các nguyên tố mang điện tích mà có ảnh hưởng đến sự gắn kết của các sản
phẩm trao đổi chất với các đại phân tử là DNA, RNA. Một số nghiên cứu
Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
11
khác đã đưa ra kết luận: các PAH có khối lượng phân tử nhỏ, cấu tạo phân tử
chỉ có một, hai, ba vòng thơm là rất độc, trong khi các PAH có khối lượng
phân tử lớn lại có thể gây độc ở mức độ gen, hoặc gây ra đột biến, bởi chúng
có khả năng gắn vào các phân tử DNA, RNA, hoặc protein, gây nên những
biến đổi ở mức phân tử [16], [42].
Naphthalene là một chất ô nhiễm thuộc nhóm PAH gây ảnh hưởng tới
một loạt các cơ quan như phổi, thận và kìm hãm quá trình hô hấp. Nhiễm độc
naphthalene ở người dẫn tới bệnh thiếu máu và viêm thận. Ngoài ra, sự thay
đổi về da và mắt ở những người bị phơi nhiễm naphthalen cũng đã được công
nhận. Phenanthrene được biết như chất cảm quang với da người, chất gây dị
ứng với động vật, đột biến tới hệ thống vi khuẩn trong các điều kiện đặc biệt.
Chất này gây yếu các nhiễm sắc thể tương đồng và kìm hãm sự nối liền các kẽ
hở gian bào. Ngoài ra, các PAH khác như acenaphthalene, fluoranthene,
fluorene đều gây độc cho động và thực vật. Độc tính của benzo(a)pyrene,
benzo(a)anthracene, benzo(b)fluoranthrene, benzo(k)fluoranthrene, dibenzen
(a,h)anthracene và indenol(1,2,3-c,d)pyrene đã được nghiên cứu chứng minh
gây ung thư cho người. Trong tự nhiên hiếm khi bắt gặp các PAH đơn lẻ mà
chỉ gặp chúng ở dạng hỗn hợp nhiều PAH, do đó độc tính của chúng càng
được tăng cường [53].
PAH thâm nhập gián tiếp vào cơ thể con người thông qua chuỗi thức
ăn, đường hô hấp hoặc qua sự tiếp xúc trực tiếp với nguồn ô nhiễm, gây ung
thư, đột biến gen. Rất nhiều PAH có chứa “vùng bay” và vùng tương tự nó
“vùng K”. Cả hai vùng này đều cho phép trao đổi chất, tạo ra dạng liên kết
“epoxit-vùng bay” và “epoxit- vùng K” có khả năng hoạt động cao và một số

chúng là nguyên nhân gây ra ung thư [53].
Khi xâm nhập vào cơ thể, PAH nhanh chóng xâm nhập vào các mô mỡ
và tiếp tục di chuyển đến những cơ quan khác. Tùy từng loại PAH với liều
Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
12
lượng và thời gian tác động mà mức độ ảnh hưởng đến cơ thể khác nhau.
Chẳng hạn, với naphthalene, nếu tiếp xúc trong thời gian ngắn, nồng độ thấp,
nó có thể gây dị ứng, viêm tấy da, mắt. Khi xâm nhập vào hệ tiêu hóa,
naphthalene sẽ gây bệnh thiếu máu do chúng phá vỡ các tế bào hồng cầu. Nếu
tiếp xúc với naphthalene trong thời gian dài với nồng độ lớn hơn 10 ppm sẽ
dẫn tới các bệnh kinh niên, gây ung thư da phổi và có thể làm giảm khả năng
thụ thai ở phụ nữ và có thể làm nguy hiểm tới sự phát triển của thai nhi [31].
Trong số các PAH, người ta đặc biệt chú ý đến benzo[a]pyrene vì tính
độc hại của nó. Benzo[a]pyrene (BaP) là một thành phần có trong khói thuốc
lá, và là một trong những nguyên nhân dẫn đến ung thư phổi [16], [31]. Nhiều
nghiên cứu đã chứng minh BaP có thể chuyển hóa thành các loại oxid với sự
xúc tác của phức hệ cytochrome P450, mà những oxid này có thể phản ứng
với các DNA gây đột biến. BaP cũng được xác định là nguyên nhân gây ung
thư cho con người và động vật [16], [31], [55].
Một vài nghiên cứu trên đối tượng động, thực vật cho thấy, động vật
nếu tiếp xúc với naphthalene ở nồng độ cao, thì chỉ trong thời gian ngắn cũng
có thể gây mờ mắt, gây độc ở mức độ vừa phải. Hiệu ứng mạnh hơn,
naphthalene có thể gây chậm phát triển, thậm chí gây chết với động thực vật.
Nghiên cứu ngưỡng độc của naphthalene đối với loài cá vược, người ta đã xác
định LC50 là 240 g/l (LC50 là liều gây chết 50% mẫu sinh vật thí nghiệm).
Bằng việc thử nghiệm với một nhóm chuột cho sử dụng anthracene với lượng
1,8 µg/l, người ta thấy rằng, sau 2 tuần gây nhiễm, tỷ lệ chuột xuất hiện khối
u là 40% [31].
Sự tồn tại của các hợp chất PAH trong môi trường vùng bờ biển có thể

đe dọa tới sức khỏe con người và môi trường biển thông qua các tác động trực
tiếp hoặc qua các chuỗi thức ăn trong chu trình vật chất [61].
Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
13
Do tính độc hại như vậy, cơ quan bảo vệ môi trường Mỹ (USEPA) đã
xếp PAH vào danh sách một trong những chất ô nhiễm điển hình và đã tiến
hành kiểm định sự có mặt của PAH trong hệ sinh thái dưới nước cũng như
trên cạn [16], [53].
1.2. Nguồn gốc phát sinh PAH
1.2.1. Hiện trạng ô nhiễm PAH trên thế giới và ở Việt Nam
Các hydrocarbon thơm đa nhân đã được tìm thấy ở nhiều môi trường
sinh thái khác nhau, kể cả môi trường không khí. Trong môi trường nước,
PAH phân bố rộng rãi. Người ta ước tính, hàng năm có khoảng 2,3x10
5
tấn
các hợp chất này đã xâm nhập vào các hệ sinh thái dưới nước. Đặc biệt, với
hệ sinh thái bị ô nhiễm PAH vùng ven bờ biển thường có nguồn gốc từ phế
thải và công nghiệp hóa dầu, công nghiệp khai thác và vận chuyển dầu mỏ,
nước thải công nghiệp và sinh hoạt, cháy rừng và cháy đồng cỏ [61]. Người ta
đã định lượng được nồng độ BaP trong nước uống là 0,0002 đến 0,024 g/l.
Trong 90 mẫu nước kiểm tra ở Mỹ cho thấy nồng độ của 6 PAH từ 0,001 đến
0,01 g/l, 1% mẫu nước kiểm tra cho thấy nồng độ trung bình lớn hơn 0,1
g/l [31].
Nhiều công trình nghiên cứu còn cho thấy, sự có mặt của PAH trong
các mẫu trầm tích với nồng độ đáng kể. Một số nơi có mức độ ô nhiễm PAH
rất cao: nồng độ các hợp chất PAH ở vịnh Boston (Mỹ) có thể lên tới 100.000
ng/g. Nguyên nhân chủ yếu là do trong môi trường biển hầu hết các hợp chất
PAH hòa tan kém trong nước đã dẫn đến việc chúng được tích lũy trong các
lớp trầm tích [31].

Trong không khí cũng chứa một lượng đáng kể PAH. Đã có hơn 500
PAH và các hợp chất liên quan được phát hiện trong không khí, đặc biệt là
BaP chiếm tỷ lệ cao nhất. Vào những năm 1970, ở Mỹ, nồng độ BaP trong
không khí trung bình là 1- 5 ng/m
3
. Trong 30 năm trở lại đây, nồng độ BaP có
Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
14
xu hướng giảm, tuy nhiên con số này hiện nay vẫn còn cao, khoảng 4 ng/m
3
ở
Copenhagen (Đan Mạch). Ở Trung Quốc, việc đốt than trong các hộ gia đình
tạo ra một lượng BaP khoảng 14,7 g/m
3
, ở Ấn Độ là 4 g/m
3
[31]
Người ta cũng tìm thấy hydrocarbon thơm đa nhân nhiều trong đất bề
mặt. Nồng độ của PAH trong đất rừng rất dao động (từ 5 - 100 g/kg), mà
nguồn chủ yếu là từ xác thực vật do quá trình cháy, hay hấp phụ PAH từ
không khí. Với đất nông nghiệp, mức độ ô nhiễm PAH từ 10 đến 100 g/kg,
chủ yếu do mưa làm ngưng tụ các hợp chất PAH từ khí quyển và đi vào đất.
Nếu tính cho cả đất rừng và đất nông nghiệp, lượng ô nhiễm trung bình là
1000 g/kg. Đối với đất bị nhiễm dầu, nồng độ ô nhiễm lớn hơn nhiều so với
vùng đất rừng và đất nông nghiệp, bởi PAH là một thành phần chính có trong
dầu mỏ [55].
Trong đất ở thành thị, nồng độ PAH khoảng 600 – 3000 g/kg, và có
thể cao hơn nữa ở những vùng có các hoạt động vận tải và sản xuất công
nghiệp [55].

1.2.2. Nguồn gốc phát sinh
Có nhiều nguyên nhân dẫn đến sự phát sinh của PAH, nhưng chúng đều
có bản chất chung là do các quá trình đốt cháy không hoàn toàn các vật liệu
hữu cơ trong tự nhiên hay cho hoạt động sản xuất của con người. Trong tự
nhiên, PAH được phát sinh là từ các quá trình địa chất tự nhiên, hóa lỏng khí
than, các vụ cháy đồng cỏ, cháy rừng thậm chí trong các trận mưa [16], [28],
[31], [38].
Con người cũng có thể gián tiếp hay trực tiếp làm phát sinh PAH vào
môi trường từ việc đốt nhiên liệu (than đá, dầu diesen, ...) trong sinh hoạt hay
trong sản xuất (đốt nhiên liệu cho các phương tiện máy móc có động cơ, quá
trình đốt rác tại các nhà lò đốt). Các vụ tràn dầu do sự cố hay trong quá trình
vận chuyển cũng làm phát sinh một lượng đáng kể PAH vào môi trường [31].
Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
15
Tại các nước công nghiệp phát triển, các hoạt động có liên quan đến
đốt cháy tạo ra một lượng lớn PAH. Các PAH này được tích tụ lại trong đất
và làm tăng nồng độ PAH nhanh chóng trong vòng 100 -150 năm trở lại đây
[31].
PAH là nhóm hợp chất độc, nhưng chúng lại khá quan trọng trong công
nghiệp, đặc biệt trong các ngành công nghiệp dược, nhuộm, sản xuất đồ nhựa
và sản xuất thuốc trừ sâu [31]: naphthalene, anthracene, phenanthrene thường
được sử dụng trong công nghiệp sản xuất thuốc nhuộm. Naphthalene cũng
được dùng như thuốc xông diệt bướm trong các gia đình. Đặc biệt,
phenanthrene cũng được ứng dụng trong công nghiệp dược dùng để sản xuất
thuốc ngủ. Ở New York (Mỹ), hỗn hợp phenanthrene và anthracene được sử
dụng để chống rỉ cho những thiết bị trữ nước [31]. Benzo[a]pyrene được sử
dụng để hạn chế muội và khói, trong công nghệ quét hắc ín, hay còn sử dụng
để liên kết các phần tích điện lại với nhau. Người ta cũng có thể tìm thấy
trong hợp chất Creosote, một chất hóa học được sử dụng làm chất bảo quản

gỗ (PAH chiếm đến 85% khối lượng của creosote) [20], [31]. BaP cũng được
sử dụng là tác nhân gây đột biến lên động vật thí nghiệm, để kiểm tra đặc tính
gây ung thư của nó trong thời gian ngắn [31].
1.3. Các biện pháp xử lý tẩy độc PAH
Tính chất độc hại và cấu trúc khó bị phân hủy trong tự nhiên của PAH
đã trở thành một vấn đề cấp bách đang được chú ý. Người ta đã và đang
nghiên cứu nhiều biện pháp hóa học, lý học, sinh học v.v…nhằm phân hủy
PAH. Việc làm thay đổi cấu trúc hóa học của chất độc nhằm tạo ra các sản
phẩm ít độc hoặc không độc cho môi trường và con người đang là một thách
thức đối với các nhà khoa học và công nghệ. Để giảm độc tính của các chất
này, người ta hay phá vỡ cấu trúc phân tử của chúng bằng cách sử dụng
enzyme cắt vòng. Đến nay, trên thế giới, người ta đã đưa ra một số phương
Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
16
pháp tiêu độc như: cô lập, chôn lấp, xử lý hóa học, đốt ở nhiệt độ cao, lý học,
sinh học v.v.
1.3.1 Phương pháp hóa lý
Trong cấu tạo hóa học của PAH, do có cấu trúc vòng thơm, PAH tương
đối khó phân hủy trong tự nhiên. Phương pháp chôn lấp hay được áp dụng đối
với nhiều chất thải, rác thải, kể cả các chất thải nguy hại trong đó có chất độc
hóa học [22]. Ưu điểm của phương pháp này là không tốn kém nhưng nhược
điểm là các chất độc vẫn nằm trong đất chứ không được phân hủy, các chất
độc hóa học này sẽ là nguồn tiềm tàng gây ô nhiễm cho môi trường.
Công nghệ thiêu đốt cũng đã được sử dụng trên thế giới, phương pháp
xử lý này tương đối triệt để song giá thành lại cao và có khả năng gây ô
nhiễm thứ cấp bởi các sản phẩm phụ tạo trong quá trình vận hành. Các
phương pháp hóa học như declo hóa, oxy hóa, phương pháp vật lý như quang
hóa, sử dụng tia bức xạ, tia cực tím, hay áp suất cao cũng mang lại hiệu quả
nhất định. Theo Draper và cộng sự (1987), xử lý bằng phương pháp quang

hóa, 80% chất độc bị phân hủy dưới tác động của chùm tia cực tím cường độ
20 W/cm
3
ở nhiệt độ 20
o
C trong thời gian 3 ngày [25]. Tuy nhiên, những
phương pháp trên có nhược điểm là không có tác dụng với lớp đất có độ sâu
dưới vài milimet, do đó chỉ xử lý được lớp đất rất mỏng trên bề mặt [49].
Mặc dù làm sạch PAH có thể được tiến hành bằng nhiều biện pháp lý
hóa đã nêu ở trên, nhưng các phương pháp này có nhược điểm là gây ô nhiễm
thứ cấp nên không an toàn và không xử lý triệt để. Mặt khác, giá thành của
việc sử dụng các phương pháp đó l ại cao nên xu hướng sử dụng chúng ngày
càng giảm.
1.3.2. Phương pháp phân hủy sinh học
Hiện nay, phương pháp sinh học đang bắt đầu được quan tâm bởi tính
an toàn và hiệu quả không những về mặt công nghệ mà còn về kinh tế. Chìa
Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
17
khóa của công nghệ phân hủy sinh học là thúc đẩy tập đoàn vi sinh vật bản
địa tham gia vào quá trình phân hủy ở mức cao nhất. Các nghiên cứu cơ bản
đều nhằm mục đích thúc đẩy hiệu quả quá trình tẩy độc thông qua việc kích
thích tập đoàn vi sinh vật trong các điều kiện phân hủy khác nhau tạo ra kết
quả cuối cùng là các sản phẩm ít độc hoặc hoàn toàn không độc. Chính vì vậy,
công nghệ phân hủy sinh học đã trở thành công nghệ thân thiện với môi
trường.
Phương pháp phân hủy sinh học đã được các nhà khoa học trên thế giới
nghiên cứu và áp dụng trong những năm gần đây và cũng đã đạt được khá
nhiều thành tựu. Công nghệ sinh học đảm bảo an toàn cho môi trường hơn tất
cả các công nghệ khác. Đặc biệt, trong điều kiện sinh thái đa hệ, việc áp dụng

công nghệ phân hủy sinh học PAH nói riêng và các nguồn chất độc nói chung
sẽ mang lại hiệu quả kinh tế xã hội cao nhất [59], [61].
Quá trình làm sạch sinh học có thể thực hiện ở quy mô lớn nhỏ khác
nhau và ở điều kiện hiếu khí hoặc kị khí. Việc tẩy độc bằng phân hủy sinh học
có thể được tiến hành riêng rẽ hoặc kết hợp với các phương pháp khác, sau
vài tháng hoặc vài năm các chất ô nhiễm có thể được hoàn toàn loại bỏ.
Phương pháp phân hủy sinh học không đòi hỏi các điều kiện phức tạp (nhiệt
độ cao, áp suất lớn, quá trình xúc tác…) không gây ra ô nhiễm thứ cấp, thân
thiện với môi trường, chi phí thấp, do đó rất phù hợp với điều kiện ở nước ta.
Tuy nhiên, phương pháp sinh học thường diễn ra với tốc độ chậm, thời gian
xử lý kéo dài. Đây chính là một nhược điểm cơ bản của nó, đòi hỏi có lời giải
đáp từ phía các nhà khoa học.
Xử lý chất ô nhiễm theo phương pháp sinh học có thể được tiến hành
theo hai hướng chính: tăng cường sinh học và kích thích sinh học. Tăng
cường sinh học là phương pháp sử dụng tập đoàn vi sinh vật bản địa đã được
làm giàu hoặc vi sinh vật sử dụng các chất độc từ nơi khác, thậm chí vi sinh
Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
18
vật đã được cải biến về mặt di truyền bổ sung vào các môi trường bị ô nhiễm.
Tuy nhiên, vẫn còn có những khó khăn trong việc bổ sung vi sinh vật vào các
nơi bị ô nhiễm do chi phí lớn; hiệu quả phân hủy nhiều khi không cao do
nhiều nguyên nhân (sự cạnh tranh của vi sinh vật, độ độc của môi trường; sự
thiếu hụt nguồn dinh dưỡng, các chất đa lượng và vi lượng cần thiết cho hoạt
động phân hủy của vi sinh vật) [26].
Kích thích sinh học là quá trình thúc đẩy sự phát triển, hoạt động trao
đổi chất của tập đoàn vi sinh vật bản địa có khả năng sử dụng các chất độc hại
thông qua việc điều chỉnh các yếu tố môi trường như độ pH, độ ẩm, nồng độ
O
2

, chất dinh dưỡng, các cơ chất, các chất xúc tác v.v.
Kích thích sinh học hiện là khuynh hướng được sử dụng rộng rãi trong
xử lý ô nhiễm theo phương pháp phân hủy sinh học [26]. Trong hoạt động
sống, vi sinh vật cần nguyên tố N, P, một số chất dinh dưỡng khác và các điều
kiện sống thích hợp. Từ nguồn ô nhiễm, người ta có thể phân lập những
chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng PAH, nghiên cứu các đặc tính sinh lý,
sinh hóa của chúng để từ đó tìm ra điều kiện sống tối ưu của chúng từ đó ứng
dụng cho việc kích thích hoạt động sống của tập đoàn vi sinh vật bản địa
trong việc phân hủy sinh học PAH tại vùng ô nhiễm. Để tăng cường quá trình
phân hủy sinh học, việc bổ sung các nguồn dinh dưỡng như nguồn cacbon,
nitơ, photpho theo phải theo tỷ lệ nhất định đã đề cập ở phần trên là C:N:P =
100:10:1. Ngoài ra, các yếu tố môi trường cũng cần điều chỉnh thích hợp, đảm
bảo cho tốc độ phân hủy ở mức ổn định và đạt hiệu quả cao nhất.
Đôi khi người ta cũng kết hợp cả hai biện pháp để có thể tăng cường sự
phân hủy sinh học. Có nghĩa là vừa bổ sung các chủng vi sinh vật nuôi cấy có
khả năng phân hủy chất ô nhiễm, đồng thời cũng tạo điều kiện tối ưu cho tập
đoàn vi sinh vật bản địa hoạt động. Như vậy, hoạt động của tập đoàn vi sinh