Nghiên cứu khả năng sinh enzym cellulase của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn cần giờ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

KHƯU PHƯƠNG YẾN ANH

Chuyên ngành : Vi sinh vật
Mã số : 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. TRẦN THANH THỦY
TS. VÕ THỊ HẠNH

Thành phố Hồ Chí Minh – 2007


LỜI CẢM ƠN

Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS. Trần Thanh Thủy, TS. Võ Thị Hạnh- Người
đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả các Thầy Cô trong Bộ môn Vi sinh đặc biệt là cô
Tuyến và Ths. Phương phụ trách phịng thí nghiệm Vi sinh trường Đại học Sư phạm Thành
phố Hồ Chí Minh, quý Thầy Cơ trong khoa Sinh học, cùng tồn thể q Thầy Cơ đã tận tình
giảng dạy trong suốt khóa học.
Tơi xin gởi lời cảm ơn tới Sở Giáo dục đào tạo tỉnh An Giang, Trường THPT Vĩnh
Trạch – An Giang, những người thân trong gia đình, bạn bè, đã giúp đỡ, động viên tôi trong
suốt thời gian học.

Tác giả luận văn

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AMP

:

Adenozin mono photphat

CAP

:

Cataleolite gene Activator Protein

CMCase

:

Carbomexymethyl cellulase

CMC

:

Carboxymethyl cellulose

CBH

:

Cellobiohydrolase hay Exoglucanase

CBHI

:

Exoglucanase I

CBH II

:

Exoglucanase II

DNS

:

Acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic

Enzym

:

Enzyme

EG

:

Endoglucanase

EGI

:

Endoglucanase I

EGII

:

Endoglucanase II

IU

:

Imeasure Unit (đơn vị hoạt độ)

KHV

:

Kính hiển vi

KL

:

Khuẩn lạc

MT

:

Mơi trường

PTN

:

Phịng thí nghiệm

PGA

:

Potato glucose agar

RNM

:

Rừng ngập mặn

VSV

:

Vi sinh vật


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Sự hiện hữu của rừng ngập mặn (RNM) Cần Giờ là kết quả của hơn 25 năm phục hồi
và phát triển bằng các nổ lực to lớn của chính quyền và nhân dân Thành phố Hồ Chí Minh.
Vào ngày 21 tháng 1 năm 2000, Ủy ban MAB/ UNESCO đã công nhận RNM Cần Giờ là
khu dự trữ sinh quyển đầu tiên tại Việt Nam [55].
RNM Cần Giờ là nơi lưu trữ các nguồn gen sinh vật q hiếm và bền vững, có khả
năng chịu đựng điều kiện sống rất đặc biệt khắc nghiệt. Là nơi có hệ VSV vơ cùng phong
phú và đa dạng như nấm sợi, vi khuẩn, xạ khuẩn…., trong đó nấm sợi chiếm số lượng rất
lớn. Nấm sợi đóng vai trị rất quan trọng trong vịng tuần hồn vật chất và năng lượng của hệ
sinh thái RNM, nhờ có khả năng sinh các loại enzym ngoại bào như cellulase, protease,
kitinase, amylase, enzym phân giải dầu…..Đặc biệt, enzym cellulase do nấm sợi sống trong
RNM sinh ra là rất lớn. Do thảm thực vật dày đặc ở RNM Cần Giờ là nơi sinh sống tốt nhất,
nguồn thức ăn dồi dào nhất cho các chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym này.
Enzym cellulase là hệ enzym bao gồm các loại enzym: C1, Cx, β-glucosidase, có khả
năng hoạt động phối hợp để phân giải cellulose thành glucose. Enzym cellulase được ứng
dụng trong nông nghiệp để chế biến thức ăn chăn nuôi, trong công nghiệp thực phẩm để chế
biến thực phẩm, trong quá trình li trích các chất từ thực vật, trong việc phân hủy các phế liệu
giàu cellulose….Theo Bhat (2000), xấp xỉ 20% trong số 1 tỷ USD thu được từ lượng enzym
công nghiệp được bán ra trên thế giới gồm các enzym cellulase, hemicellulase và pectinase.
Đến năm 2005, thị trường enzym công nghiệp trên thế giới tăng từ 1,7- 2,0 tỷ USD.

Hàng năm, nước ta phải nhập ngoại một lượng lớn những nguồn enzym cellulase để
giải quyết vấn đề sản xuất và xử lý ô nhiễm MT. Việt Nam là nước nhiệt đới có nền nơng
nghiệp rất phong phú, đa dạng và đang trên đà phát triển. Vì vậy, lượng phế thải nơng nghiệp
rất dồi dào, cùng với sự cơng nghiệp hóa, hiện đại hóa đất nước, ơ nhiễm MT đang trở thành

nguy cơ thật sự. Thành phần chính trong phế thải rắn trong sinh hoạt công, nông, lâm nghiệp
là cellulose.


Trong khi đó, RNM Cần Giờ là kho dự trữ các chủng VSV có hoạt tính enzym cao
chưa được khai thác. Các cơng trình khoa học nghiên cứu về khả năng sinh enzym cellulase
của các chủng nấm sợi ở RNM Cần Giờ cho đến nay vẫn còn bỏ ngõ.
Từ cơ sở khoa học và thực tiễn trên gợi ý cho tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng
sinh enzym cellulase của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ”.
2. Lịch sử vấn đề nghiên cứu
 Các cơng trình nghiên cứu nấm sợi sinh enzym cellulase
Khả năng sinh enzym cellulase chủ yếu được tổng hợp từ nấm sợi Trichoderma và
Aspergillus.
Ở Mỹ, năm 1983 PTN của Quân đội Mỹ ở Natik và trường đại học Rutgers, sử dụng
chủng Trichoderma viride QM6 hoang dại để sản xuất cellulase đầu tiên. Sau đó, gây biến
chủng và chọn lọc được biến chủng QM9414 có khả năng sinh ra cellulase cao (theo Rehm,
1983) [74].
Năm 1998, YU đã nuôi cấy T. reesei Rut 30 trong MT chứa 5% bột
cellulose và 1% cám mì, thu được hoạt lực CMCase 232,4 IU/g [68].
Năm 2000, Sonia Couri khảo sát khả năng sinh tổng hợp các enzym như
polygalacturonase, cellulase, xylanase và protease từ A. niger 3T5B8 trên nguồn phụ phế liệu
nông nghiệp khác nhau bằng phương pháp lên men bán
rắn và ứng dụng enzym trong việc tách chiết dầu thực vật [61].
Năm 2002, theo báo cáo gần đây của CORAL, dịch nuôi cấy A. niger trong MT
Czapek-Dox chứa CMC1%, cho chạy điện di trên gel SDS-PAGE (chứa 0,2% CMC) phát
hiện có hai vạch có hoạt tính CMCase và trọng lượng phân tử lần lượt là 83.000 và 50.000
Dalton [67].
Ở Việt Nam, năm 1989, Lê Hồng Mai nghiên cứu về sinh tổng hợp và một số đặc tính
của cellulase (typ CMCase) ở A. niger VS-1 trên MT lên men bán rắn [40].
Năm 2001, Huỳnh Anh nghiên cứu về nấm sợi T. reesei sinh tổng hợp enzym cellulase

trên MT lỏng với nguồn cacbon là CMC [40].
Năm 2002, Kiều Hoa nghiên cứu sinh tổng hợp enzym cellulase với nguồn cacbon là
cellulose tinh khiết, cám trấu, bã mía, vỏ cà phê [22].
Năm 2003, Hoàng Quốc Khánh nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp và đặc điểm
cellulase của A. niger Rnnl 363. Châu Hoàng Vũ cũng nghiên cứu thu nhận và tinh sạch
enzym cellulase từ nấm mốc T. reesei bằng phương pháp lên men bán rắn [24], [57].


Năm 2004, Trần Thạnh Phong khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym cellulase từ T.
reesei và A. niger trên MT lên men bán rắn [40].
Năm 2005, Lê Thị Hồng Nga nghiên cứu sự sinh tổng hợp cảm ứng pectinase và
cellulase của một số chủng nấm mốc [27].
 Các công trình nghiên cứu nấm sợi sinh enzym cellulase từ RNM Cho đến nay,
trên thế giới đã có nhiều cơng trình khoa học nghiên cứu về phân lập và phân loại nấm sợi
trong hệ sinh thái RNM. Nhưng kết quả nghiên cứu còn sơ sài, chưa đáp ứng được nhu cầu
hiểu biết về sự đa dạng của nấm sợi cũng như vai trò của chúng trong hệ sinh thái RNM [64].
Trước đây, người ta cho rằng điều kiện MT RNM quá khắc nghiệt, khơng thích hợp
cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm sợi. Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây cho thấy
trong điều kiện sống đặc biệt như vậy, thì con đường trao đổi chất của nấm sợi cũng khác
hơn con đường trao đổi chất của các VSV trên đất liền. Vì vậy, sẽ có những sản phẩm trao
đổi chất có tính chất đặc biệt hơn, khác lạ hơn trong đó có các enzym, chất kháng sinh mới
…[18].
Nhưng đến nay cũng chưa có cơng trình đi sâu nghiên cứu về hoạt tính sinh học của
các chủng nấm sợi từ RNM.
Ở Việt Nam, cho đến năm 2000 mới chỉ có một thông báo của Mai Thị Hằng và cs về
nấm sợi RNM. Năm 2002, tác giả này tiếp tục nghiên cứu sự đa dạng, nghiên cứu khả năng
diệt côn trùng và khả năng phân giải cacbua hydro của nấm sợi từ RNM ở hai tỉnh Nam
Định, Thái Bình. Riêng ở RNM Cần Giờ chỉ có một số ít nghiên cứu về phân lập. Cho đến
nay, vẫn chưa có nghiên cứu nào về khả năng sinh enzym cellulase của các chủng nấm sợi ở
RNM Cần Giờ [19], [20], [21].

3. Mục đích nghiên cứu
Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase từ RNM
Cần Giờ.
Đề xuất hướng ứng dụng các chủng nấm sợi phân lập được.
4. Đối tượng nghiên cứu
- Hệ sinh thái RNM Cần Giờ.
- Nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase ở RNM Cần Giờ.
- Enzym cellulase sinh ra từ nấm sợi.
5. Phạm vi nghiên cứu


Do hạn chế về thời gian nên đề tài chỉ nghiên cứu phân lập các chủng nấm sợi ở 6 xã
của huyện Cần Giờ: xã Bình Khánh, xã An Thới Đơng, xã Tam Thơn Hiệp, xã Long Hịa, xã
Thạnh An, xã Lý Nhơn. Sau đó, chỉ nghiên cứu một số chủng nấm sợi có khả năng sinh một
loại enzym cellulase trong hệ enzym này.
Đề tài được thực hiện tại PTN Vi sinh, khoa Sinh Trường Đại học Sư phạm Thành phố
Hồ Chí Minh và PTN Vi sinh, Viện Sinh học Nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh.
6. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Phân lập các chủng nấm sợi từ RNM Cần Giờ.
- Tuyển chọn một số chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase cao.
- Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa và phân loại các chủng nấm sợi
được tuyển chọn.
- Nghiên cứu các yếu tố MT ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát triển và sinh tổng hợp
enzym cellulase của các chủng được chọn.
- Bước đầu thử nghiệm sử dụng nấm sợi sinh enzym cellulase vào

việc phân hủy

các chất phế thải, góp phần hạn chế ô nhiễm MT.
7. Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp lấy mẫu từ RNM Cần Giờ.
- Phương pháp vi sinh.
- Phương pháp hóa sinh.
- Phương pháp thực nghiệm.
- Phương pháp thống kê toán học.
8. Dự kiến cấu trúc
Luận văn gồm phần mở đầu, 3 chương và phần kết luận kiến nghị được trình bày như
sau:
Mở đầu
Chương 1: Tổng quan
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Chương 3: Kết quả và bàn luận
Kết luận và kiến nghị.


Chương 1:

TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm tự nhiên RNM Cần Giờ
RNM chiếm một phần đáng kể trong các kiểu rừng ngập nước, thường tồn tại ở vùng
nhiệt đới và cận nhiệt đới. Trên thế giới hiện nay còn khoảng 15 triệu ha RNM phân bố ở các
vùng bờ biển có bùn, các cửa sông lớn, các vịnh cạn và các đầm mặn giáp với biển.
RNM Cần Giờ tiếp giáp với Thành phố Hồ Chí Minh, là “lá phổi xanh” của thành phố.
Có tác dụng giảm tốc độ gió, ngăn bão vào đất liền, hạn chế xói lở bảo vệ bờ biển, bờ sơng,
điều hịa khí hậu, mở rộng diện tích đất bồi và tạo MT phát triển ngành thủy sản. Bên cạnh
đó, RNM Cần Giờ cịn là nơi cung cấp thức ăn, là nơi cư trú, sinh sản của các loài thủy sinh
vật và động vật có xương sống ở cạn. Hiện nay, Cần Giờ còn là địa điểm du lịch hấp dẫn với
3.000 - 5.000 du khách đến tham quan mỗi tuần [83].
RNM Cần Giờ hiện nay có diện tích khoảng 29,380 ha chiếm 41,18 % đất huyện Cần
Giờ [87]. Khí hậu nóng ẩm và chịu chi phối của quy luật gió mùa cận xích đạo với mùa mưa

từ tháng 5 đến tháng 10, mùa khô từ tháng 11 đến tháng 4. Lượng mưa trung bình từ
1.300mm đến 1.400mm hàng năm. Nhiệt độ trung bình là 25,80C, biên độ nhiệt dao động
trong ngày từ 5-7 0C. Chế độ bán nhật triều không đều. Độ mặn dao động 18 ‰ – 30 ‰ [1].
Một nghiên cứu mới đây cho biết RNM Cần Giờ đã có 157 lồi thực vật; 63 lồi phiêu
sinh vật; 130 loài Tảo thuộc 3 ngành: Tảo khuê, Tảo giáp, Tảo lam; 100 lồi động vật đáy
khơng xương sống như tơm, cua, sị ốc. Ngồi ra, cịn có 120 lồi cá, trong đó có các lồi có
giá trị kinh tế cao như cá Ngát, cá Dứa, cá Chẽm; 31 lồi bị sát như cá sấu, trăn, rắn, kỳ đà
nước; 19 loài hữu nhũ như khỉ, heo rừng, rái cá, mèo rừng và 145 loài chim [83]. Đây là các
nguồn thức ăn tốt nhất cho hệ nấm sợi sống trong RNM. Nấm sợi có khả năng tiết ra hệ
enzym cellulase phân hủy hợp chất cellulose có trong lá cây, thân cây ở RNM thành glucose
để sử dụng. Ngoài ra, nấm sợi cịn có thể sinh các loại enzym khác như protease, amylase,
kitinase…phân hủy xác, vỏ tôm, cua, ốc, xác chết các loài động vật khác thành các chất dinh
dưỡng chúng có thể hấp thu [1].


Hình 1.1. Bản đồ RNM Cần Giờ [83]
Vậy, hệ nấm sợi là một mắt xích quan trọng trong chuỗi thức ăn, là một nhân tố khơng
thể thiếu trong chu trình chuyển hóa vật chất ở RNM Cần Giờ. Chúng sử dụng chất hữu cơ
từ thảm thực vật và hệ động vật phong phú làm thức ăn, đồng thời có tác dụng làm giảm ô
nhiễm MT ở RNM Cần Giờ.
1.2. Nấm sợi tổng hợp enzym cellulase
Rất ít VSV có khả năng sinh tất cả các loại enzym cần thiết để phân giải cellulose ở dạng
tinh thể. Chúng phải tiết ra hệ enzym phức tạp, có khả năng phân hủy cellulose theo phương
thức khác nhau như thủy phân, oxy hoá [51], [52].
Cellulose bị phân rã dưới tác dụng của vi khuẩn háo khí và kỵ khí. Song khả năng
phân hủy cellulose khơng bằng nấm, do vi khuẩn thường tạo ra enzym cellulase với hàm
lượng nhỏ thấp hơn 0,1g/l [51]. Cellulase được sinh tổng hợp chủ yếu từ vi khuẩn trong dạ
cỏ Ruminococcus albus (Berger 1963), vi khuẩn hiếu khí Cellulomonas sp (Elberson, 2000),
vi khuẩn kỵ khí Clostridium sp (Parsiegla, 1998) [39], các lồi xạ khuẩn Streptomyces,
Thermomonospora …[51].

Nấm

sợi

là

nhóm được nghiên cứu nhiều nhất trong lĩnh vực phân hủy cellulose. Các enzym cellulase
sản sinh từ nấm sợi được tạo ra với nồng độ rất cao, khơng có các dạng vật lý phức tạp như
cellulase bắt nguồn từ vi khuẩn và có tác dụng phân hủy rất mạnh cellulose. Các chi nấm có
khả năng sinh cellulase phổ biến là: Aspergillus, Alternaria tenuis, Celluvirio gilvus,
Clasdosporium, Penicillium, Fusarium, Myrotheticum, Trichoderma … [39].
1.2.1. Đặc điểm hình thái của nấm sợi
Nấm sợi là VSV có nhân chuẩn. Thành tế bào nấm chủ yếu cấu tạo từ kitin-glucan,
kitozan. Hệ nấm sợi được cấu tạo bởi các sợi nấm (hypha) không vách ngang hoặc có vách


ngang (septum). Các sợi nấm vừa phát triển theo chiều dài do tăng trưởng ở ngọn, vừa phân
nhánh tạo thành hệ sợi nấm (mycelium) hay còn gọi là khuẩn ty thể (hình 1.2). Hệ sợi nấm
phát triển thành các dạng KL khác nhau tùy theo cơ chất rắn, lỏng hay mềm (hình 1.3). KL
nấm sợi thường có dạng hình trịn, hoặc gần trịn. Bề mặt KL có thể mượt, nhẳn bóng, dạng
bột, dạng sợi, dạng hạt, dạng xốp, phẳng, có những vết khía xun tâm, hoặc lồi lõm khơng
đều. Mép KL trơn, răng cưa….

Hình 1.2. Bào tử mọc ra khuẩn ty [78]

Hình 1.3. KL nấm [78]

Một số sợi nấm có thể tiết sắc tố vào MT hoặc tiết chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt sợi
nấm.

Các đặc điểm hình thái khác như có bó sợi, bó giá, thể quả, hạch nấm, giọt tiết, sắc tố
hòa tan…, làm KL nấm sợi có tính đặc trưng lồi [78].

Phương thức dinh dưỡng của nấm

là hấp phụ qua màng, khơng có cơ quan tiêu hóa, khơng có khả năng quang hợp. Đa phần là
các cơ thể hoại sinh, một số kí sinh, một số gây bệnh trên người và động thực vật [18].
Nấm sợi sinh sản chủ yếu bằng bào tử, bào tử có thể hình thành theo kiểu vơ tính hoặc
hữu tính.
Bào tử vơ tính. Bao gồm các động bào tử, bào tử trần, bào tử kín. Bào tử trần là dạng
bào tử phổ biến nhất.

Hình 1.4. Các dạng bào tử trần của nấm sợi [78]


Sinh sản hữu tính. Nấm sợi có các hình thức sinh sản hữu tính như: đẳng giao, dị giao, và
tiếp hợp.

Hình 1.5. Sự tiếp hợp của nấm sợi [78]
Ngồi ra, lớp nấm Túi và nấm Đảm sinh sản hữu tính bằng bào tử túi (ascospores) và bào tử
đảm (basidiospores).
1.2.2. Đặc điểm phân loại của nấm sợi
Trong tự nhiên có khoảng 1 triệu đến 1,5 triệu loài nấm nhưng mới định tên được khoảng
10.000 chi và 70.000 loài. Trung Quốc đã điều tra được 40.000 loài. Phân loại vi nấm vẫn
đang ở thời kỳ phân loại học hình thái (Phenetic classifications) dựa vào đặc điểm hình thái,
ni cấy, một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa và phương thức sinh sản. Trong những năm gần
đây, tiến bộ của sinh học phân tử và kỹ thuật kính hiển vi điện tử đã đem lại một diện mạo
mới cho việc nghiên cứu phân loại học và sinh lý học nấm.
Hiện nay, tồn tại các hệ thống phân loại nấm không thống nhất với nhau, chủ yếu là các hệ
thống phân loại theo Ainsworth và cộng sự (1973), V.Arx (1981), Ainsworth & Bisby

(1995), Alexopoulos & Mins (1996), Robert A. samson (1989), Saccardo P.A (1880-1886),
Barron G.L (1968), Ellis M.B (1971), Bùi Xuân Đồng (1977, 1984) …[78].
Trong luận văn này, chúng tôi dựa vào đặc điểm mơ tả trong các khóa phân loại:
Saccardo P.A (cải tiến), Bùi Xuân Đồng (1977, 1984), Đặng Hồng Miên, Nguyễn Đức
Lượng (2003), Nguyễn Lân Dũng (2006) để phân loại [8], [9], [10], [12] [14], [27], [74].
1.2.3. Khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học của nấm sợi
Nấm sợi được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm nhiều do khả năng sinh các chất có
hoạt tính sinh học được ứng dụng rộng rãi, lợi ích kinh tế cao như: nguồn enzym, các chất
kháng sinh, các axit hữu cơ, các chất có khả năng phân giải nguồn cacbonhydro được ứng
dụng trong xử lý ô nhiễm MT do tràn dầu, khai thác các mỏ dầu trong lòng đất ….[5], [6],
[40], [43].

 Hoạt tính enzym thủy phân ngoại bào


Enzym là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hóa học trong và
ngồi cơ thể [29]. Đến nay, các nhà khoa học đã tìm được khoảng 3.500 loại enzym, trong
đó phần lớn là enzym từ thực vật và VSV. Nấm sợi có tiềm năng lớn nhất sinh các loại
enzym ngoại bào mạnh, phân giải và chuyển hố các hợp chất hữu cơ, vơ cơ khó tan trong tự
nhiên. Một số enzym đã được tinh sạch, nghiên cứu kỹ và ứng dụng phổ biến như: cellulase,


protease, amylase, pectinase và kitinase [6].

Enzym cellulase. Xúc tác phân giải các hợp chất ligno - cellulose thành glucose. Lignocellulose là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật gồm cellulose (30-40%), hemicellulose

và

lignin

(15-30%).

Các

chủng

nấm

sợi

Trichoderma,

Penicillium,

Aspergillus….có khả năng sinh enzym cellulase được sử dụng trong sản xuất thực phẩm, làm
phân bón, xử lý chất thải hữu cơ chứa cellulose…[19], [20], [21].
 Enzym protease. Protein là các polyme cấu tạo từ các axit amin liên kết nhau bằng
liên kết peptid rất dễ bị cắt đứt tạo thành các chuỗi polypeptid ngắn. Nấm sợi có khả năng
phân giải mạnh protein thường gặp thuộc các chi Aspergillus, Penicillium,… Được sử dụng
nhiều nhất trong công nghiệp bột giặt, sữa, bia, các lĩnh vực khác như công nghiệp dược,
công nghiệp thuộc da, công nghiệp thực phẩm, xử lý chất thải…[5], [6], [29].
 Enzym amylase. Xúc tác quá trình thủy phân tinh bột, chất dự trữ chủ yếu của thực
vật thành đường glucose. Tổ hợp phức hệ enzym amylase (α-amylase, β-amylase và
glucoamylase) sẽ cắt đứt các liên kết α-1,4-glucoside và α-1,6-glucoside trong phân tử tinh
bột để tạo ra sản phẩm cuối cùng là glucose. Nấm sợi có khả năng phân giải tinh bột nhanh
chóng là những tác nhân khơng thể thiếu ở RNM như Aspergillus, Penicillium, Trichoderma,
Rhizopus, Mucor….. Được ứng dụng trong sản xuất sirô, sản xuất bia, bánh mì, cồn, nước
tương, nước chấm, trong chế biến thực phẩm gia súc, trong công nghiệp dệt…[29], [30].
 Enzym kitinase. Kitin là các biopolyme chứa các gốc N-acetyl-glucozamin liên kết
với nhau bởi mối liên kết β-1,4-glucoside. Trong RNM, lượng kitin trong xác, vỏ tôm, cua,

ốc…rất nhiều. Nấm sợi Trichoderma, Glycladium, Chaetomium,… sinh enzym kitanase phân
giải kitin, đồng thời tăng cường hiệu quả tiêu diệt các lồi nấm gây bệnh có thành tế bào là
kitin, chống các lồi cơn trùng có vỏ kitin.
Như vậy, nấm sợi cịn có vai trị làm tác nhân kiểm soát sinh học chống các VSV gây
bệnh và cơn trùng có hại trong nơng-lâm- ngư nghiệp [18], [19].


Các chủng nấm sợi Acremonium, Aspergillus, Penicillium cịn có khả năng sinh enzym
phân giải dầu mỏ và khí đốt là hợp chất có cấu tạo phức tạp và khó phân giải, góp phần xử lý
ơ nhiễm dầu do các tai nạn chìm tàu dầu. Đặc biệt là ở RNM Cần Giờ lượng dầu tràn vào từ
biển gây ô nhiễm và độc hại đối với sinh vật sinh sống ở RNM Cần Giờ, các lồi nấm sợi có
khả năng phân giải dầu sẽ sử dụng dầu như nguồn thức ăn và bảo vệ MT ở đó.

Hình 1.6. Hoạt tính enzym của nấm sợi trên MT thạch [78]
 Khả năng sinh kháng sinh của nấm sợi
Kháng sinh là một trường hợp riêng biệt của tính đối kháng, là hiện tượng một VSV
với sản phẩm trao đổi chất của mình có tác dụng kìm hãm hoặc ức chế sự phát triển của
VSV khác.
Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ nấm sợi chiếm tỉ lệ khá lớn. Chất kháng sinh
được sử dụng chủ yếu trong y học như: Cephalo-sporin-C, Griseofluvin, Penicillin là một thứ
vũ khí chống lại các vi khuẩn gây bệnh viêm màng não, bệnh viêm màng phổi, bạch cầu, uốn
ván. Trong phẫu thuật chữa các bệnh nhiễm trùng vết thương. Những vấn đề về chất kháng
sinh được sinh ra từ VSV đang là vấn đề quan tâm hàng đầu và phát triển mạnh mẽ trong
nhiều lĩnh vực cuộc sống ngày nay [10].
 Khả năng sinh các axit hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng Ngày nay, nhu
cầu sử dụng axit hữu cơ ngày càng nhiều. Các axit hữu cơ như axit axetic, axit lactic và một
số axit hữu cơ khác được ứng dụng nhiều trong công nghệ chế biến mủ cao su, trong công
nghiệp nhẹ và cả trong y học. Năm 2004, Võ Thị Hạnh đã nghiên cứu sản xuất axit xitric
bằng nấm sợi A. niger từ rỉ đường mía và bã khoai mì [17]. Ngồi ra, các nhà khoa học Nhật
Bản tổng hợp được chất kích thích sinh trưởng Giberrelin từ hai chủng nấm sợi F.

monoforme và F. oxysporum [29].


Tuy nhiên, có rất nhiều lồi nấm sợi mọc trên các nguyên vật liệu, đồ dùng, thực
phẩm, phá hỏng hoặc làm giảm chất lượng của chúng. Một số nấm sợi tiết độc tố gây ngộ
độc hoặc có thể gây ung thư. Ví dụ: A. flavus sinh độc tố Aflatoxin gây ung thư gan. Một số
gây bệnh cho người và động vật như hen suyễn, bạch huyết, nấm tay chân…, bệnh nấm rỉ sắt
ở thực vật, bệnh vàng lùn, thối cổ bông ở lúa…[29].
1.3. Enzym cellulase từ nấm sợi
Ngày nay, nguồn enzym từ VSV như amylase, cellulase, protease, kitinase…được chú
ý nhiều nhất do có những ưu điểm: Có hoạt tính cao; khối lượng enzym thu được nhiều do
tốc độ sinh sản của VSV nhanh; nguyên liệu rẻ tiền; có thể sản xuất theo quy mô công
nghiệp …[29].
1.3.1. Khái quát về enzym
 Cấu trúc
Enzym là một loại protein được sinh vật tổng hợp nên và tham gia vào các phản ứng
sinh học [30].
Enzym có phân tử lượng từ 20.000 đến 1.000.000 Dalton, được cấu tạo từ L-axit amin
liên kết nhau bởi liên kết peptid. Bộ phận đặc hiệu tham gia phản ứng gọi là trung tâm hoạt
động của enzym.
Enzym gồm 2 nhóm: Nhóm enzym một cấu tử gồm những enzym có thành phần hóa
học duy nhất là protein và nhóm enzym hai cấu tử gồm những enzym có hai thành phần:
phần protein thuần gọi là apoenzym có vai trị xúc tác, phần thứ hai là coenzym gồm những
chất hữu cơ đặc hiệu có vai trị thúc đẩy q trình xúc tác. Ngồi ra, có một số kim loại như
Fe, Cu, Zn, Mn, …đóng vai trị liên kết giữa enzym và cơ chất, liên kết giữa apoenzym và
coenzym, tham gia trực tiếp vào quá trình vận chuyển điện tử [30].
 Cơ chế hoạt động
Hoạt động của phân tử enzym được biểu hiện trong trung tâm hoạt động. Trung tâm
hoạt động của enzym (E) có cấu trúc khơng gian tương ứng với cơ chất (S) mà chúng tham
gia. Phản ứng khơng có sẳn mà được hình thành trong quá trình enzym tiếp xúc với cơ chất

giống như chìa khóa vào ổ khóa tạo thành enzym - cơ chất (E-S).
Cơ chế tác động của enzym vào cơ chất qua ba giai đoạn:
Giai đoạn 1: Enzym (E) tương tác với cơ chất (S) bằng những liên kết yếu tạo thành
phức enzym - cơ chất (E-S).
Giai đoạn 2: Khi cơ chất (S) tạo phức với enzym (E) sẽ bị thay đổi cấu hình khơng
gian và mức độ bền vững các liên kết. Các liên kết bị phá vỡ và tạo ra sản phẩm. Phức
Giai đoạn 3: Enzym sẽ được giải

enzym cơ chất (E-S) sẽ được tách ra.

phóng, cơ chất sẽ chuyển thành sản phẩm và tách khỏi enzym.
Phản ứng tổng quát:
E

+

S



E-S



E

+

P

E- enzym (enzyme) ; S- cơ chất (substracte) ; P- sản phẩm (Products)
1.3.2. Cellulose và enzym cellulase
1.3.2.1. Cellulose
Cellulose là polymer sinh học phong phú nhất trên trái đất (Murashima, 2002), được
sinh tổng hợp chủ yếu bởi thực vật với tốc độ 4.109 tấn/năm. Hàng năm có khoảng 232 tỷ
tấn chất hữu cơ được thực vật tổng hợp thành nhờ quá trình quang hợp. Hàng ngày, hàng giờ
một lượng lớn cellulose được tích lũy trong đất. Do các sản phẩm tổng hợp của thực vật thải
ra, cây cối chết đi, cành lá rụng xuống, một phần do con người thải ra dưới dạng rác rưởi,
giấy vụn, mùn cưa…[5], [6]. Trong số này có đến 30% là màng tế bào thực vật mà thành
phần chủ yếu là cellulose. Cellulose chiếm đến 89% trong bông và 40-50% trong gỗ [52].
Cellulose là polymer mạch thẳng, mỗi đơn vị là một disaccharit gọi là cellobiose có
cấu trúc từ hai phân tử D-glucose được nối với nhau qua liên kết β-D-1,4-glucoside.
Cellulose cấu tạo dạng sợi, các sợi liên kết lại tạo thành những bó nhỏ gọi là các micrơfibrin
có cấu trúc khơng đồng nhất. Có những phần đặc gọi là phần kết tinh và phần xốp hơn gọi là
phần vơ định hình.


Hình 1.7. Cấu trúc đơn vị cellulose [84]

Hình 1.8. Liên kết hydro trong cấu trúc phân tử của cellulose [84]

Hình 1.9. Cấu tạo của phân tử cellulose trong không gian [84]
1.3.2.2. Enzym cellulase
 Cấu trúc
Trong thiên nhiên không gặp cellulase ở dạng tinh khiết. Nó thường tồn tại ở dạng kết
hợp với các enzym khác như: cellulase, hemicellulase, pentozanase thành hệ enzym gọi là
Citolase [39]. Cellulase là một phức hệ enzym bao gồm các enzym C1, Cx và β-glucosidase
tham gia những phản ứng kế tiếp nhau khi phân hủy cellulose tạo thành glucose [29].

Hình 1.10. Cấu trúc enzym cellulase trong khơng gian [86]
 Enzym C1: Có tác dụng cắt đứt liên kết hydro biến cellulose tự nhiên thành
cellulose phản ứng (cellulose vơ định hình).
 Enzym Cx: Cịn gọi là enzym β-1,4 glucanase, thủy phân cellulose phản ứng thành
cellobiose. Enzym này được chia thành hai loại:


- Endocellulase hay Endoglucanase (EG) (EC.3.2.1.4): Có tác dụng thủy phân liên kết
β-1,4-glucozit tại các điểm bất kỳ trên mạch phân tử cellulose. Được chia làm hai loại EGI,
EGII. Cả hai loại enzym này có thể hoạt động ở nhiệt độ khá cao.

Hình 1.11. Cấu trúc tinh thể của endoglucanase [81]
- Exocellulase hay exoglucanase (CBH) (EC.3.2.1.91): Phân giải chuỗi trên thành
disaccarit gọi là cellobiose từ đầu không khử. Bao gồm hai loại CBHI và CBHII:
* CBHI có trọng lượng phân tử khoảng 65KD, chứa khoảng 496 axit amin. Enzym này
tác động lên cellulose vơ định hình, ưu tiên liên kết với vùng tinh thể của cellulose, không
tác động lên cellulose biến tính như CMC.
* CBHII có trọng lượng phân tử là 53KD, chứa khoảng 471 axit amin. CBHII liên kết
với cả vùng tinh thể và vùng vơ định hình, khơng tác động lên cellulose biến tính [52].

Hình 1.12 . Cấu trúc CBH [80]

Hình 1.13. Vị trí cắt exoglucanase [80]

 β-glucosidase hay cellobiase (EC.3.2.1.21): Thủy phân cellobiose thành glucose.
Là nhóm enzym khá phức tạp, có khả năng hoạt động ở pH rất rộng từ 4,4 đến 8,4. Trọng
lượng phân tử 50- 95 KD, có thể hoạt động ở nhiệt độ cao.
 Cơ chế hoạt động
C1

Cellulose

Cx
Cellulose
phản ứng

Cellobiose

β-Glucosidase
Glucose

Hình 1.14. Cơ chế tác động của enzym cellulase [39]


Theo Mandels và Reese (1964), đầu tiên, enzym C1 phá vỡ liên kết hydrogen trong
phân tử cellulose tạo thành cellulose phản ứng.
Sau đó Cx tiếp tục thủy phân cellulose phản ứng thành các phân tử cellobiose. Cuối cùng, βglucosidase phân cắt cellobiose thành glucose.
 Điều hòa sinh tổng hợp enzym cellulase
Khả năng sinh tổng hợp cellulase trong các loài nấm sợi được điều hòa ở mức độ
phiên mã, mức độ mRNA mã hóa cho CBHI ln cao nhất (Pettila, 1993). Tỷ lệ enzym
CBHI cao nhất chiếm khoảng 50% trong hổn hợp cellulase được tiết ra bởi T. reesei (theo
Gritzali và Brown, 1979), mức độ mã hóa các thành phần khác của enzym cellulase ln ở
trạng thái ổn định [40]
Q trình sản sinh enzym cellulase được kiểm soát theo cơ chế cảm ứng và ức chế bởi
glucose. Cellulase được sinh ra khi nấm sợi sinh trưởng trên MT có chứa cellulose, dẫn xuất
của cellulose, lactose. Cịn trên MT có chứa glucose, fructose hoặc glycerol thì cellulase
khơng tạo thành enzym cellulase (Biaria và Mishra, 1989).
Hơn nữa, hoạt tính cellulase cịn phụ thuộc vào sự có mặt của các chất ức chế trong
MT nuôi cấy. Nhiều hợp chất phenol đã được chứng minh là có tác dụng kìm hãm sự phát
sinh cellulase ở S. commune [52].

Khi nuôi cấy nấm cũng xảy ra hiện tượng hoạt hóa cellulase. Chẳng hạn, hai loại
proteaza axit được tạo ra trong điều kiện phân hủy cellulose có khả năng làm tăng 10 lần
hoạt tính endoglucanase của P. chrysosporium [52].
Q trình tổng hợp enzym cellulase cảm ứng cịn chịu tác động của AMP vịng
(AMPv). Chất này có tác dụng kích thích q trình sao chép mã của các operon phân giải
nhờ một loại protein đặc biệt làm trung gian gọi là protein nhận AMPv (CAP). Khi AMPv
kết hợp với CAP tạo thành phức hợp có tác dụng hoạt hóa gen operator làm cho RNApolymerase dễ dàng kết hợp với chúng để bắt đầu sao chép mã [30].
Nấm sợi chịu tác động trực tiếp của các yếu tố bên ngoài rất mạnh và phản ứng lại với
tác động đó rất nhanh. Vì thế, có thể sử dụng pH, nhiệt độ và đặc biệt là cơ chất mà chúng
tham gia phân hủy để điều khiển tổng hợp enzym. Khi ta cho cơ chất với liều lượng tăng dần
thì khả năng tổng hợp enzym cảm ứng sẽ tăng dần. Nếu cứ tiếp tục tăng liều lượng cơ chất
thì sẽ đến một mức nào đó q trình này sẽ chựng lại và giảm do tăng áp suất thẩm thấu bởi
cơ chất [30].


1.3.3. Các yếu tố MT ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và tạo thành enzym cellulase
của nấm sợi trên MT lên men bán rắn
1.3.3.1. Thành phần MT nuôi cấy nấm sợi sinh enzym cellulase
 Nguồn dinh dưỡng cacbon
Trong MT nuôi cấy nấm sợi sinh enzym cellulase nhất thiết phải có cellulose là chất
cảm ứng và nguồn cacbon.

Nấm sợi có khả năng đồng hóa rất nhiều nguồn cacbon khác

nhau. Nguồn cacbonhydrat là dễ hấp thu nhất, trong đó glucose là nguồn cacbon duy nhất
tham gia vào phản ứng trong ba chu trình chuyển hóa: con đường Embden Meyerhof (1930),
Pentose và Entner Doudoroff. Cơ chất dùng để cảm ứng nấm sợi sinh enzym cellulase
thường là giấy lọc, bông, bột cellulose, cám, lõi ngơ, mùn cưa, bã mía, trấu, rơm, than bùn,
CMC, ….Các chủng Trichoderma ni trên MT có nguồn cacbon là giấy lọc cho hoạt tính
enzym cao nhất [38].

Ngày nay, bã mía được dùng như một cơ chất cảm ứng nấm sợi sinh enzym cellulase.
Trên thế giới, lượng bã mía thải ra rất lớn khoảng 150 triệu tấn/năm. Ở Việt Nam, bã mía
phần lớn dùng để đốt lị hơi, làm phân bón hữu cơ, bột giấy, trồng nấm ăn….Tuy nhiên,
không sử dụng hết và đã gây ô nhiễm MT xung quanh. Bã mía có hàm lượng cellulose rất
cao 46% (theo A.G.Keller, 1964), ngồi ra cịn chứa hemicellulose, lipid và sáp, chất
khống, lignin, silic nên là một cơ chất cảm ứng tuyệt vời cho nấm sợi sinh enzym. Ngồi ra,
cám mì thường được sử dụng với tỉ lệ (6 : 4) do nó có chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng cần
thiết cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym của nấm sợi, có tính chất vật lý rất thích
hợp để vừa đảm bảo khối kết dính cần thiết, vừa đảm bảo lượng dinh dưỡng cần thiết.
 Nguồn dinh dưỡng nitơ
Các nguồn nitơ thích hợp nhất đối với các sinh vật sinh cellulase là muối nitrat. Natri
nirat làm cho MT kiềm hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo thành cellulase. Các hợp chất
nitơ hữu cơ có tác dụng khác nhau đến sinh tổng hợp cellulase tùy vào đặc tính sinh lý của
từng chủng. Cao nấm men có tác dụng nâng cao hoạt lực cellulase, cao ngơ có khả năng sinh
tổng hợp exoglucanase và endoglucanase mạnh hơn nấm men. Nước chiết nấm men chủ yếu
kích thích sự tạo thành endoglucanase, cịn cao ngơ kích thích CHBI và CBHII. Tác dụng
kích thích của các hợp chất này là do sự có mặt của các axit amin, các nguyên tố khoáng và
những nhân tố kích thích sinh trưởng [38], [39], [40].
 Nguồn dinh dưỡng khoáng


Các chất khống như Fe, Mn, Zn, Mo, Cu… có vai trị quan trọng như tham gia vào
q trình chuyển hóa vật chất qua màng và thành tế bào nấm sợi, tham gia vào thành phần
cấu tạo prôtêin, enzym, điều hịa pH MT ni cấy nên ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp
cellulase. Nồng độ tối thích của Zn là 0,11- 2,2 mg/l, Fe 2 - 10 mg/l, Mn 3,4 - 27,2 mg/l.
Biotin và Tiamin khơng có ảnh hưởng đến sự tổng hợp enzym này [38].
1.3.3.2. Yếu tố MT ảnh hưởng đến khả năng sinh enzym cellulase
Ảnh hưởng của độ ẩm
Độ ẩm trong MT lên men bán rắn là hàm lượng nước có trong cơ chất rắn. Các cơ chất
khác nhau có khả năng giữ nước khác nhau từ 30- 80% (Moo-Young, 1983). Trong q trình

ni cấy nấm sợi thu enzym cellulase độ ẩm có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh enzym
và hoạt tính của enzym. Độ ẩm tối ưu để nuôi cấy nấm sợi là 50-60%, nếu độ ẩm vượt quá
60% tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển, nếu độ ẩm <60% gây hiện tượng tạo nhiều bào tử
ở nấm sợi, hoạt tính của enzym sẽ giảm. Kim (1985) cho biết tốc độ sinh trưởng tối ưu của T.
reesei ở độ ẩm 60%, nhưng khả năng sinh tổng hợp cellulase ở độ ẩm thấp hơn xấp xỉ 50%
[38], [40].
Ảnh hưởng của pH
Sự sinh trưởng của nấm sợi sẽ gây ra sự thay đổi pH đáng kể trong cơ chất. Cơ chất bị
oxy hóa khơng hồn tồn sẽ sinh ra acid, hoặc hấp thụ ion amonium sẽ làm giảm pH. Ngược
lại, sự giải phóng ammonia qua sự loại nhóm amin của urea hoặc các amin khác sẽ làm tăng
pH. pH tối ưu cho các loài nấm sợi khác nhau được sử dụng trong lên men bán rắn có giá trị
từ thấp nhất là 3 đến cao nhất là 8 (Prior, 1992) tùy vào từng chủng nấm sợi khác nhau. Nấm
sợi Aspergillus, Penicillium và Rhizopus có thể giảm pH của MT xuống dưới 3, Đối với các
chủng nấm Trichoderma, Sporotrichum, Pleurotus, pH ổn định hơn ở khoảng 4 và 5 [40].
Trong suốt q trình ni cấy nấm sợi ta có thể điều chỉnh pH của MT bằng axit HCl,
H2SO4, NaOH, KOH. Durand (1988) đã điều chỉnh pH trong nuôi cấy T. viride ở qui mô
pilot trên MT hạt cà phê-đường bằng cách phun dung dịch urea, do hoạt động của urease của
nấm sợi làm tăng pH qua việc tạo ammonia [29].
Ngồi ra, việc điều chỉnh pH thích hợp trong q trình ni cấy nấm sợi hạn chế sự
tạp nhiễm vi khuẩn làm ảnh hưởng đến hoạt tính enzym [73].
 Ảnh hưởng nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh enzym cellulase.
Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của đa số nấm sợi từ 280C-320C, tối đa dưới 500C [40],


[73]. Nếu nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp có thể kìm hãm sự sinh trưởng thậm chí có thể giết
chết sợi nấm, quá trình tổng hợp enzym sẽ bị ức chế. Theo Raimbaut & Alazard (1989) cho
biết nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của A. niger trên MT bột khoai mì là 35- 400C, ngược
lại ở 450C, sự nảy mầm của sợi nấm bị ức chế, khả năng sinh enzym giảm [40].
 Ảnh hưởng của MT khí

MT khơng khí quan trọng nhất là khoảng khơng gian giữa các tiểu phần cơ chất, vì
đây là nơi mà sinh khối nấm sợi sinh trưởng. Oxygen phải khuếch tán từ khoảng không giữa
các hạt cơ chất vào sinh khối, và CO 2 phải khuếch tán từ sinh khối vào khoảng không giữa
các hạt cơ chất. Trong nuôi cấy người ta thường thiết kế dụng cụ nuôi cấy sao cho sự lưu
thơng khơng khí dễ dàng và cao nhất. Ni trên khay thì phía dưới đáy các khay có đục lỗ để
khơng khí dễ lưu thơng, ni trong hộp thì thiết kế xung quanh hộp có đục lỗ vừa nhỏ sao
cho MT khơng bị thốt ra ngồi, đồng thời có tác dụng thơng khí, nấm sợi sẽ phát triển đều ở
tất cả các mặt có tiếp xúc với khơng khí….
Trong ni cấy nấm sợi sinh enzym cellulase, để tạo khả năng thống khí tốt hơn,
người ta thường cho thêm trấu với lượng khoảng 20- 25% sẽ làm tăng độ xốp của MT, tạo
nên những khoảng trống để khơng khí có thể lưu thơng trong lịng MT, đồng thời trấu cịn là
cơ chất cảm ứng cho sự tổng hợp của enzym cellulase [38].
 Ảnh hưởng của cơ chất và các chất kìm hãm
Ở giai đoạn đầu, khi nồng độ cơ chất tăng, tốc độ phản ứng sẽ tăng, nhưng khi tốc độ
phản ứng đạt cực đại, dù ta có tăng nồng độ cơ chất, tốc độ phản ứng cũng sẽ hồn tồn
khơng có khả năng tăng theo [39]. Nguồn cacbon và nitrogen ảnh hưởng mạnh đến tốc độ
sinh trưởng và hoạt tính enzym. Do đó, nếu cơ chất khơng chứa đủ các thành phần dinh
dưỡng thì phải bổ sung thêm kịp thời.
Các chất kìm hãm là những chất hóa học có thể làm giảm hoặc mất hoạt tính enzym,
thường là những ion, các phân tử vơ cơ, hữu cơ… Các chất kìm hãm cạnh tranh có cấu trúc
khơng gian tương tự cấu trúc không gian của cơ chất nên sẽ kết hợp với enzym ở trung tâm
hoạt động, kết quả là enzym không thể kết hợp được với cơ chất. Các chất kìm hãm khơng
cạnh tranh kết hợp với enzym ở vị trí ngồi trung tâm hoạt động của enzym làm giảm tốc độ
phản ứng của enzym [30].
1.3.4. Ứng dụng của enzym cellulase
 Một số chế phẩm enzym cellulase trên thế giới và Việt Nam


Ngày nay, trên thế giới và cả Việt Nam, các chế phẩm sinh học chứa các VSV có khả
năng sinh các loại enzym được sản xuất và sử dụng ngày càng rộng rãi và phổ biến trong các

lĩnh vực chăn nuôi, trồng trọt,…. Điều này giúp giảm bớt giá thành sản xuất, hạn chế được
tình trạng ơ nhiễm MT.
Enzym cellulase kỹ thuật chủ yếu được thu nhận từ Trichoderma reesei, Aspergillus
niger…và gần đây là các chủng vi khuẩn [30].
Ở Đan Mạch, hãng Novo Nordisk có chế phẩm “Celluclast” dùng trong thức ăn gia
súc [40].
Ở Pháp, hãng Lyven dùng “Cellulases” từ T. reesei và từ A. niger trong công nghiệp
thực phẩm [40].
Ở Nhật, hãng Amano hàng năm đã sản xuất trên 8000 tấn chế phẩm enzym các loại để
dùng trong nông nghiệp. Enzym “Panxenlase” chứa cellulase, hemicellulase, protease và
amylase, hoạt tính dùng trong chăn nuôi. Chế phẩm “Cellubrix”, “Cellusoft”, “Onozuka”
dùng trong công nghiệp làm mềm vải, trong thức ăn gia súc [40].
Ở Canada, hãng Logen sử dụng “Cellulase” trong thức ăn gia súc, công nghiệp giấy,
chế biến hạt, sản xuất ethanol [77].
Ở Liên Xô, chế phẩm “Cellolignorin” được sử dụng trong chăn ni, hoạt tính 1-50
đơn vị/g, chứa cellulase, hemicellulase, pectinase [77].

Ngồi ra, cịn có các chế

phẩm cellulase khác được tạo ra bởi các nhà sản xuất: Cellulaset và Novozyme 234 [NO],
Econase C15 [AO], Rohament CT [RM], Avizyme [FR], Sumizyme c [SN], Meicelase MC
[MJ], Cellulase
TAP [AM], Cytolase [GR] [74].
Ở Việt Nam, Viện Sinh học nhiệt đới đã sản xuất các chế phẩm BioI, BioII, BioIII …
có dạng bột, chứa các enzym amylase, protease, cellulase và các VSV dùng bổ sung vào thức
ăn cho bị, heo, cá. Chế phẩm có tác dụng phịng chống các chứng rối loạn tiêu hóa, kích
thích tăng trọng, giảm tiêu hao thức ăn, phân hủy những thức ăn thừa và khí thải ở đáy
ao…[78]
Trung tâm Cơng nghệ sinh học Tp. Hồ Chí Minh sản xuất chế phẩm Trichotech chứa
vi nấm Trichoderma, chế phẩm này có dạng rắn, tơi xốp, nhẹ, màu xám nâu đậm, giúp cây

trồng chống được các loại nấm bệnh….[82].


Công ty TNHH TM và sản xuất Mai Xuân (TP. Hồ Chí Minh) sản xuất chế phẩm
TRICHO-MX chứa vi nấm Trichoderma, có dạng bột. Có tác dụng hạn chế nấm hại, cải tạo
đất, ủ phân bón cho cây trồng.
Cơng ty TNHH TM và sản xuất thuốc thú y- thuốc thủy sản Minh Dũng (Bình Dương)
đã sản xuất nhiều chế phẩm chứa vi nấm Aspergillus sinh enzym cellulase, dùng xử lý nước
ao ni tơm cá, kích thích tiêu hóa, ở gia súc…như: MD-Bio-Zemix, Biofat, Bio vitamin,
Biolaczym…..
 Ứng dụng của enzym cellulase
Enzym cellulase thu hút được sự chú ý của các nhà cơng nghệ vì chúng có thể được
 Ứng dụng trong xử

ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực sau:
lý chất thải hữu cơ chứa cellulose

Các chất thải hữu cơ chứa cellulose

thường là những chất rất khó phân hủy. Trong điều kiện tự nhiên thời gian phân hủy rất lâu
(trên 8 tháng), ở điều kiện khí hậu nhiệt đới. Thời gian phân hủy các chất thải này càng lâu
càng gây ô nhiễm đất, nước, khơng khí. Các chất thải này cũng khó tham gia vào dây chuyền
chuyển hố vật chất của thiên nhiên, gây mất cân bằng sinh thái. Để khắc phục tình trạng
này, các nhà khoa học đã đưa vào khối ủ chế phẩm VSV giàu cellulase, kết quả là các chất
thải bị phân hủy trong thời gian dưới 1 tháng, góp phần hạn chế MT [38].
 Ứng dụng trong sản xuất sản phẩm thực phẩm, thực phẩm gia
súc

Các sản phẩm thực phẩm được sản xuất từ các nguyên liệu thực vật chứa nhiều

cellulose gây ra hiện tượng khó tiêu hóa ở người. Người và những động vật khơng nhai lại
thường thiếu VSV phân giải cellulose trong đường tiêu hóa. Do đó, việc chế biến thực phẩm
nhất là một số sản phẩm đồ hộp bằng chế phẩm cellulase có ý nghĩa làm tăng hiệu suất sử
dụng thức ăn. Nhiều nghiên cứu cho thấy việc thêm chế phẩm cellulase vào thực phẩm gia
súc làm tăng trọng đàn lợn và tăng chất lượng thịt [38].
 Ứng dụng làm phân bón VSV
Các chế phẩm VSV có khả năng tổng hợp cellulase mạnh, khi được bón vào đất trồng
có nhiều chất hữu cơ chứa cellulose sẽ phân hủy nhanh các chất hữu cơ tạo thành mùn, giúp
cây trồng phát triển nhanh [29], [38].

 Ứng dụng trong kỹ thuật di truyền

Enzym cellulase sẽ phá vỡ thành tế bào thực vật để tạo tế
bào trần, rất cần thiết trong quá trình chuyển gen của tế bào thực vật [38].



Ứng dụng trong công nghệ bột cellulose và giấy, công nghệ sợi dệt, công nghiệp chất tẩy
rửa

Đây là hướng được các nhà sản


xuất quan tâm nhiều trong những năm gần đây. Sử dụng enzym cellulase để tách mực khỏi
giấy báo và tạp chí cũ, cải thiện tính chất quang học cũng như độ bền cơ lý của giấy sản xuất
từ bột khử mực. Ở Mỹ, hơn 40%, ở Nhật Bản khoảng 55% tổng lượng giấy sử dụng là bắt
nguồn từ giấy loại.

Trong công nghệ sợi

dệt, enzym này được sử dụng để xử lý quần áo bị, làm bóng vải bơng, vải sợi nhân tạo giúp
vải mềm mại hơn, độ hút ẩm tăng lên, bề mặt vải đẹp hơn.
Trong công nghiệp chất tẩy rửa, các chất tẩy rửa chứa enzym
cellulase làm sạch các chất bẩn trong lịng xơ bơng tốt hơn sử dụng phương pháp tẩy rửa
thông thường [54].


Chương 2:

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
 Đối tượng nghiên cứu
- Nấm sợi sinh enzym cellulase phân lập từ RNM Cần Giờ.
- Các VSV kiểm định: E. coli, Bacilllus subtilis được cung cấp từ Viện Pasteur.
 Hóa chất
- Các hóa chất có nguồn gốc từ Việt Nam: Glucose, dầu DO, pepton, cazêin, kitin, tinh
bột tan, agar, cồn đốt, nước cất, nước biển.
- Các hóa chất có nguồn gốc từ Trung Quốc: K2HPO4 , KH2PO4., KCl, NaCl, NaOH,
NaNO3, MgSO4. 7H2O, FeSO4.7H2O, HgCl2, Na-acetate, lugol, lactophenol,

xanh

metylen Loeffler….
- Hóa chất có nguồn gốc từ Đức: thuốc thử DNS, Yeast extract, ….
- Hóa chất có nguồn gốc từ Nhật Bản: CMC, muối Tartrat K Natri…
 Cách pha chế thuốc thử DNS (2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic acid) [32].
- Dung dịch acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic: Cân 10g DNS cho vào becher (cốc thủy
tinh) 1000ml, thêm 400ml nước cất, đặt becher vào nước 800C, khuấy đều. Thêm dung dịch
NaOH (16g NaOH trong 150 ml nước cất) từ từ vào dung dịch DNS, khuấy ở nhiệt độ 800C.
Thêm 300g muối Tartrat K Natri vào dung dịch DNS,

khuấy ở nhiệt độ 800C, làm lạnh đến nhiệt độ phịng vào bình định mức 1000ml, thêm nước
cất đến vạch và lắc đều. Bảo quản dung dịch DNS trong chai màu nâu có nắp.

-

Dung dịch lactose: Hòa tan 0,12g lactose với 80ml nước cất và chuyển vào bình định mức
100ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều.
- Dung dịch DNS-lactose: Trộn 150ml DNS với 50ml dung dịch lactose.

 Thiết bị, dụng cụ
 Các thiết bị
Nồi hấp vô trùng Autoclave (Đài Loan)
Tủ cấy vô trùng (Việt Nam)
Tủ sấy Memmert (Đức)
Tủ ấm Sanyo (Nhật)