Định danh và phân lập một số loại nấm có khả năng tạo trầm hương

LỜI CẢM ƠN
Để nuôi con lớn lên từng ngày bố mẹ đã hi sinh không biết bao nhiêu công
sức nuôi nấng con, công lao to lớn ấy con mãi không quên con cảm ơn bố mẹ.
Để em có thể bƣớc chân đến cánh cổng trƣờng đại học đã trải qua biết bao ngƣời
thầy, ngƣời cô những ngƣời không quảng ngày đêm đêm soạn những trang giáo
án, tìm tịi những phƣơng thức dậy cho chúng em học vì điều đó em xin gửi lời
cảm ơn chân thành đến các thầy cô .
Cho đến ngày hôm nay ngày em sắp bƣớc chân ra khỏi cánh cổng trƣờng
đại học để em có thể làm đƣợc việc trong các cơng ty , xí nghiệp , nhà nƣớc …
Với những kiến thức này để làm nền tảng vào cuộc sống và công việc sau
khi bƣớc ra khởi trƣờng em xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo viện công nghệ
sinh trƣờng đại học lâm nghiệp cùng tồn thể thầy, cơ trong viện cũng nhƣ thầy
cơ trong bộ mơn đã giúp đỡ tận, tình chỉ bảo em trong suốt thời gian em học tập
tại trƣờng
Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô TS. NGUYẾN THỊ
HỒNG GẤM là ngƣời cận kề bên em hƣớng dẫn chỉ bảo thời gian em trong suốt
quá trình thực hiện đề tài khóa luận, là ngƣời đã động viên giúp đỡ trong những
giai đoạn khó khăn.
Ngồi ra tơi cịn may mắn có một ngƣời bạn chịu đựng và giúp đỡ tận
tình một cách chân thành ! Nhung cảm ơn bạn ! .

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ i
MỤC LỤC ............................................................................................................. ii
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................ iv
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................. iv
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
PHẦN I TỔNG QUAN ......................................................................................... 3

1.1. Giới thiệu về cây trầm hƣơng......................................................................... 3
1.1.1. Phân loại ...................................................................................................... 3
1.1.2. Sự phân bố cây trầm hƣơng trong tự nhiên ................................................. 4
1.2. Tổng quan về sản phẩm trầm hƣơng .............................................................. 6
1.2.1. Phân loại sản phẩm trầm hƣơng .................................................................. 6
1.2.2. Sự tạo trầm nhân tạo.................................................................................... 9
1.3. Công dụng của Trầm hƣơng......................................................................... 11
1.3.1. Trầm hƣơng làm dƣợc liệu quý ................................................................. 11
1.3.2.Trầm hƣơng là chất định hƣơng. ................................................................ 11
1.3.3. Trầm hƣơng là vật dâng cúng thiêng liêng nhất trong các tôn giáo. ........ 12
1.4. Tổng quan nghiên cứu tạo trầm hƣơng ........................................................ 12
1.4.1 Tạo trầm hƣơng tại việt nam ...................................................................... 12
1.4.2. Trên thế giới .............................................................................................. 13
1.5. Tổng quan về định danh nấm ....................................................................... 14
1.5.1. Định danh nấm thơng qua hình tháí .......................................................... 14
1.5.2. Định danh nấm bằng phƣơng pháp phân tử .............................................. 14
PHẦN II MỤC TIÊU - NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..... 15
2.1. Mục tiêu nghiên cứu ..................................................................................... 15
2.1.1. Mục tiêu chung .......................................................................................... 15
2.1.2. Mục tiêu cụ thể .......................................................................................... 15
2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 15
2.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất phục vụ nghiên cứu .......................................... 15
2.4. Phƣơng pháp phân lập nấm tạo trầm hƣơng ................................................ 16
ii


2.4.1. Tiến hành xử lý mẫu.................................................................................. 16
2.4.2. Chuẩn bị môi trƣờng phân lập................................................................... 17
2.4.3. Tiến hành cấy mẫu và theo dõi ................................................................. 18
2.4.4. Phƣơng pháp cấy chuyển (truyền) ............................................................ 19

2.5. Phƣơng pháp định danh nấm ........................................................................ 19
2.5.1. Phƣơng pháp sơ bộ định danh thơng qua các đặc điểm hình thái nấm ..... 19
2.5.2. Phƣơng pháp định danh tên loài bằng phân tích phân tử .......................... 20
PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 22
3.1. Kết quả phân lập các chủng nấm tạo Trầm hƣơng từ cây Dó bầu ............... 22
3.2. Kết quả định danh tên loài các chủng nấm tạo Trầm hƣơng phân lập đƣợc. ..... 22
3.2.1. Kết quả sơ bộ định danh thơng qua các đặc điểm hình thái nấm.............. 22
3.2.2. Đặc điểm chủng 3.4................................................................................... 25
3.2. Kết quả định danh tên lồi bằng phân tích phân tử...................................... 26
3.2.1. Kết quả tách DNA tổng số và Kết quả PCR ............................................. 26
3.2.2. Kết quả giải trình tự gen và xây dựng cây tiến hóa, xác định lồi............ 26
1. Kết luận ........................................................................................................... 32
2. Kiến nghị ......................................................................................................... 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO

iii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR ................................................................. 21
Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR ........................................................ 21

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Ảnh cây Dó bầu tiết nhựa...................................................................... 8
Hình 1.2. Ảnh thân cây Dó bầu khoan lỗ tạo trầm hƣơng nhân tạo ..................... 9
Hình 2.1 a, Hình thân gỗ Dó bầu, hình2.1.Hình ảnh các điểm lấy mẫu ........... 17
Hình 2.3. a, Đĩa mơi trƣờng chƣa cấy mẫu b, Đĩa mơi trƣờng đã cấy mẫu vào đĩa18
Hình 3.1. Ảnh ba chủng nấm đã phân lập đƣợc .................................................. 22
Hình 3.2. Ảnh hình thái bên ngồi và soi dƣới kính hiển vi củng 1.2a .............. 22
Hình 3.3. Ảnh nấm chủng 3.1 sau 3 ngày phân lập ............................................ 23

Hình 3.4. Ảnh tốc độ sinh trƣởng của chủng nấm 3.1 ........................................ 24
Hình 3.5.Ảnh soi chủng 3.1 dƣới kính hiển vi .................................................... 24
Hình 3.6.Hình thái bên ngồi của chủng 3.4 ....................................................... 25
Hình ảnh 3.7. Ảnh chụp chủng 3.4 dƣới kính hiển vi ......................................... 25
Hình 3.8: Sản phẩm PCR .................................................................................... 26
Hình 3.9. Sơ đồ cây tiến hóa chủng 1.2a ............................................................ 28
Hình 3.10. Sơ đồ cây tiến hóa chủng .................................................................. 29
Hình 3.11. Sơ đồ cây tiến hóa chủng 3.4 ............................................................ 31

iv


ĐẶT VẤN ĐỀ
Trầm hƣơng (Aquiliria) là tên gọi chung cho một chi thực vật thuộc họ Dó
gồm 15 lồi. Trầm hƣơng thực chất là lƣợng dầu kết tinh trong gỗ cây Dó bầucó
khả năng sinh ra một loại sản phẩm đặc biệt gọi là Trầm hƣơng hay Kì nam.
Trầm hƣơng có rất nhiều cơng dụng đã đƣợc biết và sử dụng từ hàng ngàn năm
qua, ở nhiều nƣớc trên thế giới. Từ xƣa đến nay Trầm hƣơng và Kì nam là loại
sản phẩm đặc biệt quý hiếm của rừng mà thiên nhiên ƣu ái ban tặng cho con
ngƣời. Chính vì vậy mà Trầm hƣơng có giá trị kinh tế rất cao trên thị trƣờng.
Điều này đã làm cho cây Dó bầu trở thành loài thực vật đặc biệt đƣợc nhiều nhà
khoa học và ngƣời dân chú ý, có giá trị đặc biệt về mặt nghiên cứu khoa học ở
Việt Nam nói riêng và các nƣớc trên thế giới nói chung.
Tuy nhiên, những nghiên cứu có tính hệ thống về sự hình thành Trầm
hƣơng trên cây Dó bầu chỉ mới bắt đầu từ vài thập niên gần đây. Hầu hết các kết
quả nghiên cứu đƣợc công bố đều chƣa đƣa ra đƣợc các quy trình tối ƣu cũng
nhƣ là cơ chế hình thành Trầm hƣơng để có thể áp dụng rộng rãi ra sản xuất đại
trà. Trong khi đó cùng với sự mất rừng thì nguồn trầm hƣơng tự nhiên cũng
ngày càng cạn dần.cùng với đó là sự khai thác quá mức và bừa bãi của con
ngƣời làm cho các loài thuộc chi Aquilaria có khả năng cho Trầm bị cạn kiệt.

Ở Việt Nam những ngƣời khai thác Trầm chặt đốn bừa bãi những cây Dó
bầu ở bất kì độ tuổi nào. Với cách khai thác nhƣ vậy thì chỉ trong một thời gian
ngắn những cây có khả năng tạo trầm này (thuộc họ cây Dó bầu) sẽ diệt chủng.
Trƣớc tình hình đó Hội Đồng Bộ Trƣởng (nay thuộc Chính Phủ) đã ban hành
Nghị Định số 18-HDBT ngày 17 tháng 01 năm 1992 quy định danh mục thực
vật rừng, động vật rừng quý hiếm và có chế độ bảo vệ, đã xếp cây Dó bầu vào
danh mục nhóm 1A, tức là bảo vệ nghiêm ngặt.
Tình hình đó hiện nay ở nƣớc ta đã và đang có rất nhiều tổ chức, cơ quan,
cá nhân trồng cây Dó bầu đại trà, nhằm mục đích cải thiện kinh tế, phủ xanh đất
trống đồi trọc, góp phần xóa đói giảm ngèo v.v… Tuy nhiên, phần lớn các dự án
1


đó mới đang ở giai đoạn trồng và thử nghiệm gây tạo Trầm bằng các phƣơng
pháp khác nhau và các kết quả thu đƣợc đều chƣa đƣợc khả quan lắm.
Mặt khác nếu để cây Dó bầu mọc ngồi tự nhiên (ở rừng tự nhiên) thì khả
năng cho Trầm hƣơng của cây Dó bầu rất hạn chế (khoảng 10%). Chỉ một số
cây vì lí do nào đó các tác nhân từ bên ngồi tác động đến cây Dó bầu nhƣ mƣa,
gió, sét đánh làm gãy thân, cành… qua các vết thƣơng đó, vi sinh vật sẽ xâm
nhiễm vào cây. Và cảm ứng sự hình thành dần dần theo thời gian. Nhƣ vậy mất
rất nhiều thời gian để hình thành trầm
Vì vậy đƣợc sự nhất trí của ban lãnh đạo Viện Cơng nghệ sinh học Lâm
nghiệp, cùng bộ môn Công nghệ tế bào - trƣờng Đại học Lâm nghiệp dƣới sự
hƣớng dẫn của TS. Nguyễn Thị Hồng Gấm, tôi thực hiện đề tài khóa luận
‘‘ĐỊNH DANH VÀ PHÂN LẬP MỘT SỐ LOẠI NẤM CĨ KHẢ NĂNG TẠO
TRẦM HƢƠNG’’ để có thế gậy tạo trầm trên cây

2

PHẦN I TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về cây trầm hƣơng
1.1.1. Phân loại
Cây Trầm hƣơng (Dó bầu) thuộc :
Lớp (Class): Magnoliopsida
Bộ (Order): Myrtales
Họ (Family): Thymelaeaceae
Chi Aquilaria có tất cả 24 lồi (Species) khác nhau gồm:
1.Aquilaria beccariana van Tiegh
2.Aquilaria hirta Ridl
3.Aquilaria microcarpa Baill
4.Aquilaria cumingiana (Decne) Ridl
5.Aquilaria filaria (Oken) Merr
6.Aquilaria brachyantha (Merr) Hall.f
7.Aquilaria urdanetensis (Elmer) Hall.f
8.Aquilaria citrinaecarpa (Elmer) Hall.f
9.Aquilaria apiculata Elmer
10.Aquilaria parvifolia (Quis) Ding Hou
11.Aquilaria rostrata Ridl
12.Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte
13.Aquilaria banaense Pham-Hoang-Ho
14.Aquilaria khasiana H.Hallier
15.Aquilaria subintegra Ding Hou
16.Aquilaria grandiflora Bth
17.Aquilaria secundana D.C
18.Aquilaria moszkowskii Gilg
19.Aquilaria tomentosa Gilg
20.Aquilaria bailonii Pierre ex Lecomte
21.Aquilaria sinensis Merr
22.Aquilaria apiculata Merr

3


23.Aquilaria acuminate (Merr) Quis
24.Aquilaria yunnanensis S.C Huang
Tiến sĩ Lê Công Kiệt (Việt Nam) và tiến sĩ Paul Kessler (Hà Lan) vừa phát
hiện loài thứ 25 ở cao nguyên Trung Bộ trong năm 2005 có tên khoa học là
Aquilaria rugosa L.C.Kiet & PJ.A .[ 3 ]
Cây Dó bầu thuộc lồi Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte
1.1.2. Sự phân bố cây trầm hương trong tự nhiên
a) Trên thế giới
Trong tự nhiên giống cây Aquilaria, tức cây Trầm hƣơng, phân bố khắp các
nƣớc vùng Châu Á từ Trung - Cận Đông, Nam Á, Trung Quốc cho đến các nƣớc
Đông Nam Á…
Ở vùng Trung - Cận Đông cây Trầm hƣơng mọc nhiều trên những rặng núi
hiểm trở phía Nam Ả Rập.
Ở Trung Quốc Trầm hƣơng mọc tập trung ở một số tỉnh Miền Nam, nhiều
nhất là Quảng Đông và Hải Nam, nhƣng chất lƣợng trầm khơng cao (Thổ Trầm).
Vùng này có 3 lồi chính, đó là: Aquilaria grandiflora Bth, Aquilaria sinensis
Merr, Aquilaria yunnanensis S.C. Huang. [2 ]
Ở vùng Nam Á cây Trầm hƣơng có nhiều ở Ấn Độ, chủ yếu là lồi
Aquilaria
khasiana H. Hallier.
Vùng Đơng Nam Á bao gồm các quốc gia:
+ Malaysia: Có 4 loài: Aquilaria beccariana van Tiegh, Aquilaria
microcarpa Baill, Aquilaria hirta Ridl và Aquilaria rostrata Ridl.[12]
+ Thái Lan: Chủ yếu là loài Aquilaria subintegra Ding Hou.
+ Indonesia (tập trung chủ yếu ở đảo Sumatra) có 4 lồi: Aquilaria
beccariana van Tiegh, Aquilaria hirta Ridl, Aquilaria microcarpa Baill,
Aquilaria moszkowskii Gilg.[15,17]

+ Philippin: Bao gồm các loài: Aquilaria cumingiana (Decne) Ridl,
Aquilaria filaria (Oken) Merr, Aquilaria apiculata Merr, Aquilaria acuminate
(Merr.) Quis.
4


+ Singarpore: Chủ yếu là loài Aquilaria hirta Ridl.
+ Campuchia, Trầm hƣơng thƣờng mọc phân tán trong các khu rừng nằm
ven biển, có 2 lồi chính là: Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte, Aquilaria
baillonii Pierre ex Lecomte.
+ Ở Việt Nam: Trầm hƣơng có tất cả 4 lồi, đó là: Aquilaria crassna Pierre
ex Lecomte, Aquilaria baillonii Pierre ex Lecomte, Aquilaria banaense PhamHoang-Ho và loài Aquilaria rugosa L.C.Kiệt & PJ.A Kessler (do tiến sĩ Lê
Công Kiệt (Việt Nam) và tiến sĩ Paul Kessler (Hà Lan) tìm thấy ở cao nguyên
Trung Bộ). Đây là loài thứ 4 ở Việt Nam và thứ 25 trên thế giới.[ 4]
b) Ở Việt Nam
Ở Việt Nam cây Trầm hƣơng phân bố tại các địa bàn nhƣ:
+ Phía Bắc: Hồng Liên Sơn, Vĩnh Phú, Hịa Bình, Hà Tây, Quảng Ninh,
Cao Bằng, Lạng Sơn, Hà Bắc.
+ Miền Trung: Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị,
Thừa Thiên, Quảng Nam, Đà Nẵng, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú yên, Bình
Thuận, Khánh Hòa. [14 ]
+ Tây Nguyên: Gia Lai, Kontum, ĐăLăk, Lâm Đồng.
+ Miền Nam: Bình Phƣớc, Đồng Nai, Tây Ninh, An Giang, Kiên Giang,
Đảo Phú Quốc. Đặc biệt thấy nhiều trên suốt chiều dài của dãy Trƣờng Sơn,
song do sự khai thác bừa bãi của dân, đến nay chỉ còn thấy cây Dó bầu ở những
vùng xa xơi, đầu nguồn rừng già.
Trong tự nhiên cây Dó bầu thƣờng mọc trong vùng rừng nhiệt đới ẩm trên
địa hình có độ cao so với mực nƣớc biển từ 300-1000m, nhƣng tập trung nhiều
nhất ở độ cao 700m và rất thích hợp ở những nơi có độ dốc từ 25 0 trở lên. Tuy
nhiên trong thực tế cây Dó bầu vẫn sinh trƣởng tốt ở những nơi có độ cao trên

dƣới 40m so với mực nƣớc biển. Nhìn chung, Dó bầu là lồi thực vật ƣa sáng,
mọc rải rác trong các khu rừng nhiệt đới, mọc ở độ cao 50-1200m. Nơi cao nhất
đƣợc tìm thấy ở núi Chu Yang Sinh thuộc tỉnh Đăklăk của Việt Nam. Thƣờng
thì cây Dó bầu mọc riêng lẻ nhƣng cũng có khi tìm thấy một nhóm 5-6 cây mọc
gần nhau. Theo Lê Mộng Chân (1995), Dó bầu là cây mọc nhanh, lƣợng tăng
5


trƣởng đƣợc ghi nhận là 1-1,2m/năm về chiều cao, và 1,2-1,5cm/năm về đƣờng
kính. Cây đƣợc 8 tuổi trở lên có khả năng cho hoa kết quả. Dƣới tán rừng thứ
sinh cây Dó bầu tái sinh kém. Thƣờng thì gặp cây Dó bầu tái sinh ở những
khoảng trống trong rừng nhƣ bìa rừng ven những con đƣờng mịn … Ngồi ra
thì Dó bầu cũng có khả năng tái sinh bằng chồi rất tốt. Việc nhân giống bằng
phƣơng pháp chiết cành, ghép cành, có tác động của thuốc kích thích cũng đƣợc
thực hiện, và phƣơng pháp nuôi cấy mô cũng phổ biến rộng rãi.[16]
1.2. Tổng quan về sản phẩm trầm hƣơng
1.2.1. Phân loại sản phẩm trầm hương
Sản phẩm trầm hƣơng thực chất là tên gọi bao gồm tinh dầu và gỗ của cây
Dó bầu. Sự tạo trầm là q trình tích lũy tinh dầu ở một số khu vực của mô gỗ
bên trong thân cây dƣới tác động của yếu tố tự nhiên, theo cơ chế đặc biệt của
cây. Quá trình này xảy ra trong một thời gian dài đến chục năm. Nói cách khác,
hiện tƣợng tụ trầm là kết quả của tiến trình bệnh lý diễn ra trong mơ gỗ của cây
Dó bầu.
Dó bầu hƣơng, cịn gọi là cây Dó Xót, Dó Bả Mía hay cây Hàn, có khả
năng kết tụ trầm chất lƣợng cao trong thiên nhiên.
Dó bầu trắng, Dó bầu đen, Dó bầu Lƣỡi trâu có khả năng tụ trầm thấp hơn
(dùng làm nhang).
Theo Vũ Văn Cần và Vũ Văn Dũng (1978) có thể phân loại nguồn gốc hai
loại Trầm là Trầm sinh (Trầm lấy từ cây sống ) và Trầm rục (Trầm lấy từ cây
đốn hay cây đã chết lâu ngày). Trầm sinh lấy từ cây còn sống thƣờng có màu

sáng, ngƣợc lại Trầm rục đƣợc lấy từ cây có màu tối đen xì hay màu cánh dán
thƣờng ngƣơi ta lấy Trầm rục từ gốc hoặc rễ của cây. Giá Trầm sinh cao hơn
Trầm rục 2 - 3 lần và mỗi cây có Trầm có thể thu đƣợc 5 - 10 kg Trầm. Ngoài ra
phần gỗ xung quanh khối Trầm kỳ cũng bị biến đổi ít nhều sao với so với sự
xuất hiện rải rác của các chi Trầm xen ké các sợi gỗ thƣờng gọi là Tok trong
tiếng Khmer. Tok khi cháy có mùi hƣơng thơm đặc biệt đƣợc dùng làm Nhang.
Theo Phillipir (1997) các dạng Trầm và sản phẩm của Trầm đƣợc ghi nhận trên
6


thị trƣờng là Trầm mảnh, Trầm bóng, Trầm vụn, Trầm bánh, tinh dầu Trầm
dùng làm hƣơng liệu và dƣợc liệu.
Việc phân tích Trầm và và tinh dầu Trầm đã đƣợc Erhartdtd và cộng sự
Hopwood (1997) thực hiện bằng phƣơng pháp sắc khí kết hợp với phổ (Gas
Chromatogasraphy/ Mass Spectrometry). Ghi nhận có hai sesquiterpen tồn tại
phổ biến trong gỗ cũng nhƣ trong tinh dầu đó là Armodendrene và Selinene. Tuy
nhiên Selinen không xuất hiện trong mẫu gỗ Trầm chất lƣợng thấp. Mặt khác,
Guaiene và một số sesquitenrpen có trong mẫu gỗ Trầm thự nhiên nhƣng chỉ
gặp trong mẫu tinh dầu trong khi Guaiene - một đồng phân của Aromadenderne
có nhiều trong mẫu tinh dầu nhƣng khơng có ttrong mẫu gỗ tự nhiên. [3,4]
Trầm hƣơng hiện nay đƣợc chia làm 2 loại: Trầm hƣơng tự nhiên và Trầm
hƣơng nhân tạo.
a) Trầm hương tự nhiên
Sự tạo trầm trong tự nhiên của cây Dó bầu là sự biến đổi của các phần tử
gỗ do tác động bệnh lý bởi vết nứt gãy, sự xâm nhập của các loài nấm vi sinh…
xảy ra một cách tự nhiên năm này sang năm khác. Cây trầm dƣới ảnh hƣởng của
các vi sinh vật và khoáng chất trong đất, sản sinh ra trầm hƣơng. Khi cây trầm
hƣơng mới bắt đầu kết trầm, cần 1 thời gian dài để tạo trầm lựợng tốt. Do điều
kiện hình thành phức tạp, nên không phải cây nào cũng tạo đƣợc trầm. Khi bị
nhiễm bệnh ở một vùng nào đó cây sẽ tích tụ nhựa đến đây để tự băng bó vết

thƣơng, xem nhƣ một khả năng tự đề kháng để chống lại bệnh nên tạo ra trầm,
kỳ. Ở Việt Nam có cây Dó bầu hƣơng, loại cây có khả năng tạo thành trầm.
Trong tự nhiên không phải bất kỳ thân cây Dó bầu nào cũng có trầm - kỳ,
chỉ có những cây bị bệnh mới chứa trầm ở phần lõi thân. Ở phần này nếu quan
sát kỹ qua kính lúp ta thấy các tế bào gỗ thối hóa, biến dạng mất mộc tố, chứa
một chất nhựa thơm (tinh dầu) biến thành những khối hình thể khơng đều, lồi
lõm có rãnh dọc, trong trong màu sậm đó là kỳ nam. Chung quanh kỳ nam gỗ
cũng biến chất ít nhiều đó là tóc. Khi đốt cháy tóc tỏa ra mùi thơm (dùng làm
nhang đốt).
7


Trầm kỳ thƣờng tìm thấy ở những cây Dó bầu bị bệnh sau thời gian từ 10 20 năm hoặc lâu hơn. Cây bị bệnh lá có màu vàng và nhỏ dần, thân cây có nhiều
u bƣớu, xuất hiện những điểm nâu đỏ. Gỗ cây trở thành một chất bóng nhƣ đá
sỏi có những nếp nhăn giống nhƣ cánh chim ƣng, đó là những cây có trầm và
kỳ.[2]

Hình 1.1. Ảnh cây Dó bầu tiết nhựa
Trầm hƣơng thiên nhiên có giá cả trăm triệu đồng 1 kg cực kỳ quý hiếm.
Dó bầu hƣơng sẵn chứa một nguồn tinh dầu với hƣơng thơm đặc biệt quyến
rũ các loại côn trùng, vi sinh, vi nấm. Chúng thích cộng sinh và phát triển trong
thân cây, thuận lợi cho việc tăng tiết một số chất cần thiết để kích thích sự tụ
Trầm. Dó bầu hƣơng có thớ gỗ mềm hơn các loại Dó bầu khác, giúp các côn
trùng dễ đục khoét, các vi sinh vật khác dễ tạo vết thƣơng nơi thân cây, mộc tố
dễ bị thối biến khi tinh dầu Trầm tích tụ. Ðó yếu tố thuận lợi cho việc kết Trầm
chất lƣợng cao.[2]
b) Trầm hương nhân tạo .
Hiện nay nhu cầu trầm hƣơng trên thế giới ngày càng gia tăng, trong khi đó
lƣợng trầm tự nhiên gần nhƣ đã cạn kiệt do việc khai thác bừa bãi. Chi Aquilaria
cho trầm kỳ đƣợc liệt kê trong sách đỏ của IUCN (The International Union for

the Conservation of Nature and Natural Resources) và một số loài trong đó có
cây Dó bầu đƣợc xem có nguy cơ tuyệt chủng, cần đƣợc bảo tồn và phục hồi.
Sự hình thành trầm hƣơng tự nhiên trong thân gỗ cây Dó bầu là một quá trình
lâu dài phải mất một thời gian từ vài chục năm trở lên và không phải bất cứ cây
nào cũng cho trầm.
8


Ở Việt Nam, song song với việc nhân giống cây Dó bầu để trồng (trong
vƣờn hộ gia đình hoặc ở trang trại…) việc cấy tạo trầm cũng đã xuất hiện ở một
số địa phƣơng nhƣ: Hà Tỉnh, Quảng Nam, Đồng Nai, Khánh Hồ, Phú Quốc,
Bình Định… Nhƣng đây là cách làm có tính bộc phát theo kinh nghiệm của mỗi
ngƣời. Có nơi ngƣời ta dùng đinh hoặc mẫu sắt hình tam giác đƣợc cắt ra từ
thùng phuy cũ đóng trực tiếp vào thân cây. Có nơi ngƣời ta dùng khoan điện
khoan vào thân cây ở nhiều vị trí khác nhau, sau đó bơm hóa chất vào các lỗ đã
khoan. Các hóa chất đó có thể là H2SO4 lỗng, HCOOH, KMnO4, HCl,
NaHSO3, FeCl3 hoặc FeSO4…[14]

Hình 1.2. Ảnh thân cây Dó bầu khoan lỗ tạo trầm hương nhân tạo
1.2.2. Sự tạo trầm nhân tạo
Trên thế giới, việc nghiên cứu cấy tạo trầm đã đƣợc các nhà khoa học theo
đuổi hơn 40 năm qua và đã có những thành cơng đáng kể. Ở Mỹ, trƣờng Đại học
Harvard đã nghiên cứu thành công phƣơng pháp cấy tạo trầm vào những năm 80
của thế kỷ 20. Đến năm 1994-1995 trƣờng ĐH Kyoto (Nhật), nghiên cứu thành
công phƣơng pháp cấy tạo trầm bằng men vi sinh và phƣơng pháp này tiếp tục
đƣợc GS. Gishi Honda thử nghiệm tại Trung Quốc với tỉ lệ thành công trên
80%. Những năm gần đây, GS. Gishi Honda (Nhật) và GS.TS Trần Kim Qui
(Việt Nam) đã ứng dụng quy trình cơng nghệ sinh học này để gây tạo trầm trên
9

thân gỗ của cây Dó bầu tại Lâm Đồng - Việt Nam, kết quả bƣớc đầu cho thấy
sau cấy men từ 6-12 tháng lƣợng trầm thu đƣợc trên một cây vào khoảng
700gr.[4]
Cho đến nay có một vài cơng trình nghiên cứu về sự tạo Trầm ở Việt Nam,
tuy nhiên để vận dụng một cách hiểu biết và chắc chắn về cơ chế tạo Trầm để
sản xuất bền vững vẫn đang là thử thách với các nhà khoa học. Lý do cho tới
nay chƣa thực hiện hoàn chỉnh nào đƣợc thực hiện mặc dù đã có những cơng
trình đƣợc tiến trên cây Dó bầu cịn non đƣợc trơng trên mơi trƣờng đƣợc kiểm
sốt theo Phạm Văn Hộ (1985) Dó bầu có Trầm là cây bị bệnh mà nguồn bện đó
mới biết đƣợc gần đây. Khảo sát của Juladudin (1997) cho rằng vùng Tok của
Trầm chứa một loại nấm đƣợc xác định là Cryptosphaeria mangifera. Ông đã
xác định bằng cách những cây Dầu Dó lành nhiễm nấm. Sau một thời gian vùng
bị nhiễm nấm có mầu sẫm và trở thành Tok rõ rệt và khi đôt cũng tỏa mùi trầm
rõ rệt. Tuy nhiên đó chỉ là những tín hiệu khởi đầu cho sự tạo trầm và việc
nghiên cứu còn quá ngắn để đi đến nấm Trầm Kỳ. [4]
Trầm có thể xuất hiện ở trên cây Dó bầu ở cây to hay cây nhỏ, nhƣng trong
thực thế nhiều cây Dó bầu đã to đến 50-60cm những vẫn chƣa tạo Trầm xong lại
có những cây mới chỉ có đƣờng kính 15cm nhƣng cũng đã tạo Trầm. Các thí
nghiệm gần đây cho thấy có thể kích thích tạo Trầm ở những cây có độ tuổi
khoảng 4-5 tuổi. Tuy nhiên thực tế cho thấy ở những cây Dó bầu già cho tạo
Trầm tốt hơn, theo kinh nghiệm dân gian có thể phân biệt cây đã có Trầm qua
một số đặc điểm hình thái của cây và điều kiện ngoại cảnh ở một số đặc điểm
sau :
 Cấy lớn có đƣờng kính > 25cm
 Thân cành có u bƣớu, cây nhiều mắt , bị bệnh , hoặc bị thƣơng
 Lá cằn cỗi màu vàng
 Vỏ khó bóc hơn những cây bình thƣờng
 Gỗ màu vàng
 Cây mọc trên đất sỏi đá

10


Cây Trầm hƣơng xuất hiện ở: gốc rễ, đoạn thân, cành ở độ cao 60 cm trở
lên khó có khả năng tạo Trầm hoặc có ít Trầm hƣơng, phần nhiều Trầm hƣơng
nằm ở gốc đặc biệt là rễ. Chính vì vậy mà khi tìm Trầm hƣơng rễ mọc tới đâu
ngƣời ta sẽ đào tới đó.[4]
Gần đây nhóm nghiên cứu Rừng Mƣa Nhiệt Đới Châu Âu kết hợp với
trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên tỉnh Kiên Giang và An Giang đã tiến hành
một chƣơng trình nghiên cứu nhằm gây tạo Trầm hƣơng trên cây Dó bầu trồng
từ hạt ở Phú Quốc . [4]
Huỳnh Văn Mỹ (1997) cho biết ở Tiến Phƣớc (Quảng Nam) nông dân đã tự
nghiên cứu xử lý kỹ thuật để tạo Trầm trên cây Dó bầu từ 10 năm tuổi trở lên.
Kết quả sự tao Trầm theo ý muốn. Đây là vấn đề mà các nhà khoa học cần
nghiên cứu đánh giá và nhân rơng để có thể sản xuất đại trà. [4]
1.3. Công dụng của Trầm hƣơng
1.3.1. Trầm hương làm dược liệu quý
Theo Đông y, trầm hƣơng là vị thuốc q hiếm, có vị cay, tính ơn, vào ba
kinh: tì, vị, thận; có tác dụng dáng khí, nạp thận, bình can tráng ngun dƣơng,
chữa các bệnh đau bụng, đau ngực, nôn mửa, hen suyển, lợi tiểu, giảm đau, trấn
tĩnh, hạ sốt, cấm khẩu, thổ huyết, khó thở, kích dục
Theo Tây y, trầm hƣơng có tính kháng sinh, tạo kháng thể mạnh (diệt
khuẩn, làm lành vết thƣơng), có tác dụng chữa một số bệnh nhƣ bệnh về tim
mạch (suy tim, đau ngực), bệnh về hô hấp (hen suyễn), bệnh về thần kinh (an
thần, mất ngủ, giảm đau, trấn tĩnh …), bệnh về tiêu hoá (đau bụng, buồn nơn,
tiêu chảy), bệnh về tiết niệu (bí tiểu tiện). Đặc biệt có thể dùng trầm hƣơng để
chữa trị ung thƣ tuyến giáp.[4, 16]
1.3.2.Trầm hương là chất định hương.
Tinh dầu có giá trị đặc biệt là dùng làm chất định hƣơng (giữ cho hƣơng
thơm lâu và đậm mùi), đƣợc sử dụng cho sản xuất các loại chất thơm, các loại

nƣớc hoa, mỹ phẩm cao cấp, đắt tiền và có tính chất huyền bí, linh thiêng đối
với một số tơn giáo, nhất là đối với Hồi giáo. Nhờ có tinh dầu trầm mà các hoá
mỹ phẩm toát ra mùi thơm êm dịu và quyến rũ bậc nhất. Sử dụng hoá mỹ phẩm
11


có tinh dầu trầm làm cho da dẻ mát dịu, con ngƣời thêm tƣơi tắn, hƣng phấn, vì
thế chúng đƣợc xem nhƣ là ngƣời bạn vĩnh hằng của sắc đẹp [16,9]
1.3.3. Trầm hương là vật dâng cúng thiêng liêng nhất trong các tơn giáo.
Trầm hƣơng có tính chất cháy cao, khi đốt tỏa mùi rất thơm và đƣợc cho là
hƣơng thơm hữu ích bật nhất. Nhiều nƣớc phƣơng Đơng có tập quán đốt trầm
hƣơng hoặc nhang sản xuất từ trầm hƣơng trong dịp cúng lễ tổ tiên, đất trời, thần
thánh; đốt trầm hƣơng để chữa bệnh, trừ tà, tạo sự may mắn, hƣng phấn. Một số
tôn giáo đốt trầm hƣơng trong các nghi lễ đƣợc xem là vật giao lƣu truyền cảm
giữa con ngƣời của thế giới thực tại với thế giới thần linh, là hình thức dâng
cúng linh thiêng cao quý nhất. Ở Nhật Bản ngày xƣa cũng nhƣ ngày nay, sử
dụng trầm hƣơng là thể hiện nét thẩm mỹ, quyền lực kinh tế và chính trị.
Trầm hƣơng cịn sử dụng vào các mục đích khác nhƣ: Làm vật cất giữ có
giá trị, q biếu, vật trang trí đặc biệt nơi ở của vua chúa, của các vị chức sắc tơn
giáo cấp cao; mang theo bên mình hoặc cất giữ trong nhà để phịng gió độc, tạo
sự may mắn. Trầm hƣơng còn dùng để ƣớp xác, để chế tác đồ thủ công mỹ nghệ
và một số vật dụng khác ….[8,9]
1.4. Tổng quan nghiên cứu tạo trầm hƣơng
1.4.1 Tạo trầm hương tại việt nam
Trƣớc nhu cầu trên thế giới Trầm hƣơng nguyên liệu cộng với giá cả ngày
càng tăng, thiên nhiên ƣu đãi ….Hiện nay đã có nhiều dự án các cơ quan tổ chức
trong và ngoài nƣớc đầu tƣ trồng cây Dó bầu để tạo Trầm hƣơng. Nhƣ ơng
Nguyễn Ngọc Tồn chủ tịch hội đồng quảng trị cơng ty Fong San đã đầu tƣ
trồng 60 hecta Dầu dó tại xã An Khƣơng huyện Bình Long tỉnh Bình Phƣớc đến
nay đã bƣớc đầu gây tạo Trầm thành công và bƣớc đầu cho thu hoạch chính vì

thế mà cơng ty đã nhân rộng mơ hình này tại nhiều tỉnh thành trong cả nƣớc nhƣ
: Quảng Nam, Đà Nẵng, Phú Yên, Lâm Đồng , Gia Lai …..( theo tài liệu sở Lâm
Nghiệp tỉnh Gia Lai )
Ngoài ra nhiều tỉnh thành trên cả nƣớc bà con cũng phát triển cây Dầu Dó
ngay tại nhà mình theo king nghiệm dân gian họ truyền nhau và mày mò cách
tạo Trầm sao cho hiệu quả nhƣ đốt cháy sắt vào, cấy mảnh bom đạn vào các vết
12


thƣơng để dẫn dụ kiến khi kiến lên ăn dầu vơ tình sẽ tổn thƣơng cây và tạo ra
Trầm mắt kiến. [7]
Đề tài điều tra số liệu khai thác Trầm ngồi tự nhiên của 59 cây Dó bầu của
Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam trong đó có 13 cây có khả năng xuất khẩu
chiếm 21 %, 21 cây có dấu hiệu hình thành Trầm hƣơng ở các vị trí khác nhau
cây chiếm 35,6% cịn lại 25 cây khơng có Trầm hƣơng
Đề tài gây tạo Trầm hƣơng bằng tác động cơ giới của kỹ sƣ Nguyễn Hồng
Lam (trung tâm Nghiên cứu Lâm đặc sản). Đề tài đã thực trên 54 cây Dó bầu ở
độ tuổi 6- 18 tuổi. Kết quả đối với 27 cây chỉ tác động cơ giớ làm tổn thƣơng
cây mà khơng gây tác động gì thêm vaftheo định kỳ 2 năm quan sát một lần. Đôi
với 27 cây còn lại sau khi tác động cơ giới làm tổn thuong mà khơng phun
Benlat thì sau 2 năm khơng có dấu hiệu gì, sau 4 năm 6 năm 8 năm mới thấy có
tạo trầm , cịn 27 cây sau khi chấn thƣơng có sử dụng Benlat để phun thì không
cho kết quả tạo Trầm hƣơng. Nhƣ vậy việc tạo Trầm có liên quan đến bệnh lý
của cây.
Đề tài nghiên cứu khả năng tạo Trầm bằng chế phẩm sinh học (Lt ) của
trung tâm Nghiên cứu Lâm đặc sản - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam cho
thấy: sau khi gây chấn thƣơng bằng tác động cơ giới nhƣ đục khoan vào thân
cây 0,8m, 1,2m, 1,5m so với mặt đất sau đó đƣa chế phẩm sinh học vào vết
thƣơng. -Đề tài tiến hành trên 3 nhóm tuổi khác nhau của cây Dó bầu (Nhóm 1:
từ 4 - 8 tuổi; Nhóm 2 : từ 10 - 14 tuổi và Nhóm 3 : từ 16 - 20 tuổi). Ngoài ra,

phạm vi đề tài còn đánh giá sự tạo Trầm ở rừng trồng tập trung và phân tán. Kết
quả sự hình thành Trầm ở các lứa tuổi của cây là nhƣ nhau; nhƣ vậy, sự tạo
Trầm bằng chế phẩm sinh học không phụ thuộc vào lứa tuổi của cây, tuy nhiên ở
những cây có độ tuổi cao hơn có đƣờng kính to hơn cho Trầm nhiều hơn.[7,8,9]
1.4.2. Trên thế giới
Ở Ấn độ TS. Shiva thì cho rằng kết quả hình thành Trầm trong tự nhiên có
liên quan đến bện lý của cây nhƣng nguồn gốc gây bệnh thì tác giả chƣa kết luận
Ở Malysia sau khi tìm hiểu về vấn đề tạo Trầm hƣơng ngồi tự nhiên thì
tiến sĩ khoa học Julajudin đã đi đến kết luận. Quá trình hình thành Trầm trong tự
13


nhiên có liên quan đến bện lý của cây nguồn gốc hình thành Trầm là do sự cộng
sinh của các loài nấm Criptophoerica mangifera với thân gỗ mà thành (1996)
Năm 1989 tiến sĩ Naiyna Thpongijem và công sự (Thái Lan) nghiên về vấn
đề tạo Trầm quá trình hình thành Trầm cho rằng kết quả hình thành Trầm hƣơng
trên cây Dó bầu là kết quả cộng sinh của các loại nấm Cephalosoptrium,
Botriodiplodia, Chactomium.[17,19]
1.5. Tổng quan về định danh nấm
1.5.1. Định danh nấm thơng qua hình tháí
- Quan sát màu sắc của tản nâm trên bề mặt môi trƣờng
- Quan sát tốc đội sinh trƣởng của sợi nấm và
- Quan sát hình thái bào tử soi dƣới kính hiển vi ( hình dạng, kích thƣớc
bào tử…) sau dựa vao khóa phân loại (Jaladaddin) là loài nào [6]
1.5.2. Định danh nấm bằng phương pháp phân tử
- Do có nhiều lồi nấm có nhiều đặc điểm hình thái gần giống nhau nên
việc định danh bằng hình thái khơng có độ tin cậy, hoặc khơng định danh đƣợc .
- Cùng với tến bộ của khoa học đặc biệt là kỹ thuật sinh học phân tử,có thể
giải quyết vẫn đề về đinh có độ chính xác đáng tin cậy nhƣ: Kỹ thuật PCR, kỹ
thuât RFLP,RADP và kỹ sử dụng Ezyme cắt, kỹ thuật đọc trình tự tác động lên

cấu trúc của DNA, kỹ thuật của các lồi nấm từ đó cho phép định danh một cách
chính xác hơn.
Kỹ thuật PCR là kỹ thuật sử dụng những cặp mồi “olgigonucleotide’’
khuyếch đại một đoạn DNA đặc biêt nào đó trong một quy trình tự động hóa. Có
nhiều ứng dụng của PCR trong nghiên cứu khoa học, thƣơng mại ctrong đó đặc
có ý nghĩa quan trọng trong đối với thực vật và kỹ thuật này giúp định danh tên
loài sinh vật một cách chính xác mà điều này khó thực hiện đƣợc nếu chỉ dựa
vào hình thái và khả năng tạo nấm. Bên cạnh đó phản ứng PCR nhanh và nhạy
hơn các kỹ thuật vi sinh khác, phản ứng này vẫn tiến hành tốt với lƣợng mẫu ít
và khơng cần đến sự có mặt của vi sinh vật. Điều đó đƣợc Kamel A. Abdelsalam cộng tác viên (2003) chứng minh khi thực hiện khi phản ứng cặp mồi
ITS- Fu-f, và ITS-Fur và phản ứng vẫn chạy khi nồng độ DNA của F.
oxysporum trong khoảng 10ng-20ng [10,12]
14


PHẦN II
MỤC TIÊU - NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu nghiên cứu
2.1.1. Mục tiêu chung
Phân lập và định danh đƣợc một số chủng nấm tạo Trầm hƣơng
2.1.2. Mục tiêu cụ thể
- Phân lập đƣợc ít nhất 02 chủng nấm tạo Trầm hƣơng từ cây Dó bầu;
- Định danh đƣợc tên loài 02 chủng nấm tạo Trầm hƣơng phân lập đƣợc
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập các chủng nấm tạo Trầm hƣơng từ cây Dó bầu;
- Định danh tên loài các chủng nấm tạo Trầm hƣơng phân lập đƣợc.
2.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất phục vụ nghiên cứu
 Thiết bị
- Tủ cấy vô trùng
- Máy đo PH

- Máy lắc
- Nồi hấp
- Máy xay
 Dụng cụ
- Bình tam giác, bình trụ
- Đĩa petri
- Lam kính
- Que cấy mẫu phân lập (gỗ, bột chế phẩm sinh học kích thích tạo Trầm )
- Pipet, đầu cơn
- Túi nilon bịt miệng bình
- Đèn cồn
- Panh kéo
- Kéo , bơng sạch
- Nồi, dao
 Hóa chất :
15


- Cồn 960 , cồn 700
- Cao nấm men
- Kháng sinh Cefotaxime
- Pepton
- Bột ngô hoặc bắp ngô tƣơi
- Đƣờng sucrose, Glucose
- Agar
- Khoai tây
- NaOH 10% , NaCl 5%
- Dầu soi kính
 Vật liệu nghiên cứu
- Mẫu: mẫu là khúc thân gỗ cây Dó bầu đã có Trầm hƣơng tự nhiên, địa

điểm lấy mẫu đƣợc lấy tại Xã Phúc Trạch huyện Hƣơng Khê tỉnh Hà Tĩnh.
2.4. Phƣơng pháp phân lập nấm tạo trầm hƣơng
2.4.1. Tiến hành xử lý mẫu.
Sau khi đƣa mẫu về phịng thí nghiệm tiến hành bảo quản mẫu ở tủ mát và
tiến hành xử lý. Mẫu là khối thân gõ Dó bầu đã hình thành Trầm trong thân gỗ
vậy nên để phân lập đƣợc thì phải là lộ phần gỗ nhiễm Trầm ra ngoài bằng cách
dùng dao hay cƣa chặt để có thể thấy phần gỗ bị nhiễm Trầm
Khi phần thân cây có Trầm đã lộ ra thì tiếp tục làm vơ trùng để loại bỏ
phần mẫu bị nhiễm bằng cách cạo bỏ lớp gỗ và lớp Trầm hình thành ở bề mặt
mà đã tiếp xúc với vết dao cắt vết cƣa cƣa khi đã lọc sạch lớp vỏ bên ngồi thì
tiến hành lấy mẫu, trƣớc khi lấy mẫu thì lấy bơng tẩm cồn 700 lau vào phần gỗ
mà cần lấy mẫu sau đó dùng dao dùng dao cắt mỏng phần gỗ khoảng 2 - 3 mm
phần có màu nâu sẫm hoặc đen để cấy vào môi trƣờng phân lập nấm.

16


a

b

Hình 2.1 a, Hình thân gỗ Dó bầu, hình2.1.Hình ảnh các điểm lấy mẫu
Hoặc cắt mẫu thành nhiều miếng nhỏ cho bình thủy tinh rửa bằng nƣớc cất
vơ trùng sau đó lại rửa lại bằng cồn 700 một lần nữa rồi tiếp tục rửa lại bằng
nƣớc cất để sạch cồn sau đó lấy mẫu để lên giấy cho khơ rồi đem cấy lên môi
trƣờng phân lập nấm.
2.4.2. Chuẩn bị môi trường phân lập
Tiến hành phân lập nấm trên các môi trƣờng : cơng thức cho 1000ml mơi
trƣờng có bổ xung kháng sinh
- Môi trƣờng P1 :100g khoai tây + 20g đƣờng frurtose + 16g agar

Khoai tây gọt sạch vỏ cắt thành các lát mỏng sau đó đem nấu chín nhừ tách
lấy dịch chiết khoai tây cho thêm vào dung dịch 20g đƣờng khuấy đều cho đến
khi tan hết đƣờng sau đó mang đi chuẩn pH đến pH 6,5 sau khi đã chuẩn pH
xong thì cho vào dung dịch 16g agar khuấy đều.
- Môi trƣờng PT1 : 10g pepton + 5g cao nấm men + 20g đƣờng frurtose +
16g agar
Cân đúng và đủ 10g pepton và 5g cao nấm men , 20g đƣờng đổ chung vào
bình thủy tinh thêm vào đó đủ 1000ml nƣớc dung dịch rồi đem chuẩn chuẩn pH
đến pH 6,5; sau khi đã chuẩn pH xong cho vào dung dich 16g agar và khuấy đều
- Môi trƣờng N1 : 114g ngô tƣơi ( 200ml ngô ) + 20g đƣờng frurtose +
16g agar
17


Cân đúng đủ 114g ngô tƣơi ( 200ml ngô ), 20g đƣờng frurtose, 16g agar
với ngô ở đây cho 200ml nƣớc cất vào với ngô đem cho vào máy xay , chú ý
không xay quá nhuyễn xay vừa đủ sau đó lọc bã ra lấy phần dịch chiết cho bào
bình rồi cho đƣờng đã cân ở trên vào rồi cho thêm nƣớc cất vừa đủ 1000ml thì
đem chuẩn pH đến pH 6,5. Sau khi đã chuẩn pH xong thì cho 16g agar vào dung
dịch và khuấy đều lên.
- Môi trƣờng PG: cách làm nhƣ môi trƣờng P1 nhƣng thay đƣờng kính bằng
đƣờng Glucose
Khi tất cả mơi trƣờng đã xong thì đổ vào bình thủy tinh đậy nắp mang đi
khử trùng nắp đƣợc đậy bằng túi nilon đƣợc buộc bằng dây nịt , cùng lúc này
chuẩn bị luôn 30 đĩa peptri, banh kéo đem hấp khử trùng, hấp ở 121oC trong 30
phút. Sau khi đã hấp xong đã hấp xong tiến hành đổ môi trƣờng lên đĩa peptri ở
trong điều kiện vô trùng để tránh xâm nhiễm các vi khuẩn xung quanh và chờ
môi trƣờng đông thạch và nguội hẳn rồi cấy
2.4.3. Tiến hành cấy mẫu và theo dõi
Sau khi môi trƣờng đã chuẩn bị xong tiến hành cấy mẫu nhƣ sau: những

mẫu đã đƣợc cắt nhỏ và đƣợc đƣợc xử lý ta tiến hành cấy lên môi trƣờng trên
đĩa peptri. Cấy cho mơi trƣờng đĩa 3-5 mẫu theo hình tam giác hoặc hình chữ
thập cấy nhƣ vậy với tất cả các mẫu khi cấy xong thì bảo quản trong ở nhiệt độ
phịng ở 250C. Sau đó theo dõi hàng ngày các đĩa đã cấy của từng loại mơi
trƣờng.

a

b

Hình 2.3. a, Đĩa môi trường chưa cấy mẫu b, Đĩa môi trường đã cấy mẫu vào đĩa
18


Khi các nấm đã mọc nhiều trên bề mặt đĩa ta cấy chuyển (truyền) ,các đĩa
đã bị nhiễm thì bỏ đi và nấu môi trƣờng cấy lại, cấy cho tới khi giống nấm
thuần.
2.4.4. Phương pháp cấy chuyển (truyền)
Là phƣơng bƣớc trung gian giữa phân lập mẫu và làm thuần các dòng nấm
phân lập đƣợc. Giai đoạn này giúp ta xác định riêng từng dòng nấm đƣợc phân
lập.
 Các bƣớc cấy truyền (cấy chuyển )
- Kiểm tra các đĩa đã cấy và quan sát sự phát triển cảu sợi nấm từ các
miếng mẫu cấy
- Xác đinh xem có nhiều loại nấm mọc lên hay không
- Cấy chuyển ( truyền ) khi sợi nấm đã mọc đƣợc 5mm đến 1cm
Cứ cấy lại chuyển nhiều lần cho tới khi các sợi nấm giống nhau về đặc
điểm hình thái thì thơi cấy và đƣa những mẫu đã thuần bảo quản để tiện cho
nghiên cứu các thí nghiệm sau.
2.5. Phƣơng pháp định danh nấm

2.5.1. Phương pháp sơ bộ định danh thông qua các đặc điểm hình thái nấm
- Quan sát hình thái sợi và màu sắc sợi trên các loại môi trƣờng PG, PT1 và
N1 phân lập và nhân giống.
- Quan sát sự hình thành bào tử và sự biến đổi màu sắc của bào tử nấm
bằng mắt thƣờng.
- Quan sát các hình thái bào tử nấm dƣới kính kiển vi ở vật kính, 40, 100
sau đó
+ Lấy mẫu lên lam kính rồi nhỏ nhuộn bằng xanh metyelen để trong 3 phút
rồi rửa bằng nƣớc
+ Nhuộn tiếp dung dịch lugol trong 1 phút rồi rửa lại bằng nƣớc
+ Rửa mẫu bằng côn trong 30 giây
Soi dƣới kính hiển vi quan sát bắt màu và các bào tử trên kính hiển vi, sau
đó dựa vào khóa phân loại để xác định lồi dựa vào khóa phân loại để phân loại
sơ bộ các chủng đã phân lập
19


2.5.2. Phương pháp định danh tên lồi bằng phân tích phân tử
a) Phương pháp tách DNA tổng số
1. Ngiền nhanh 0,2 g mẫu bằng cối chầy sứ trong nitơ lỏng cho đến khi tạo
thành bột thật mịn, sau đó chuyển ngay vào ống eppendorf 2ml, giữ trong đá.
2. Bổ sung 800 l đệm chiết, lắc đều và ủ ở 65oC trong 1 giờ (cứ 15 phút
đảo đều 1 lần).
3. Giữ mẫu ở nhiệt độ phòng trong thời gian 10 phút.
4. Bổ sung 800 l Chloroform/isoamyl alcohol (24:1) vào mẫu, lắc đều và
giữ ở nhiệt độ phòng trong thời gian 10 phút.
5. Ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong thời gian 15 phút ở 4oC.
6. Dùng pipet hút chuyển dịch nổi sang ống eppendorf 1,5 ml.
7. Bổ sung một thể tích tƣơng đƣơng Isopropanol tuyệt đối (lạnh) và đảo
nhẹ, giữ mẫu trong đá 30 phút.

8. Ly tâm 12000 vòng/phút trong thời gian 15 phút ở 4oC.
9. Loại dịch nổi, rửa DNA bằng cách thêm 500 l cồn 70%, ly tâm 12000
vịng/phút trong thời gian 4 phút ở 4oC sau đó nhẹ nhàng loại bỏ ethanol
10. Làm khô DNA bằng quạt gió, máy hút chân khơng
11. Hồ tan trong 100 l H2O khử ion.
12. Sau khi DNA đƣợc hoà tan hoàn tồn thì bổ sung 3 l RNase
(10mg/ml). Giữ sản phẩm ở 37oC trong thời gian 1 giờ.
13. Điện di kiểm tra DNA tổng số trên gel agarose 0,8%.
- Cặp mồi dùng để xác định lồi nấm bằng phản ứng PCR
Trình tự (5’-3’)

Tên mồi
ITS1
ITS4
16sF
16sR

TCCGTAGGTGAACCTGCGG
TCCTCCGCTTATTGATATGC
GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG
GGTTACCTTGTTACGACTT

b) Phương pháp PCR

20

Kích thƣớc sản phẩm
PCR
~700 bp
~1400 bp

Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR
STT
1
2
3
4
5
Tổng

Thành phần
Nƣớc deion khử trùng
Maste mix
Template (100ng/µl)
Mồi F 10pmol
Mồi R 10pmol

Thể tích (µl)
6
10
2
1
1
20

Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR
Bƣớc Phản ứng
Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ
1

Biến tính
94
3 phút
1
2
Biến tính
94
30 giây
3
Gắn mồi
55
30 giây
4
Kéo dài chuỗi
72
30 giây
30
5
Hoàn tất kéo dài 72
7 phút
1
6
Kết thúc phản
4
∞
ứng
c) Phương pháp giải trình tự và hiệu chỉnh trình tự:
Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose 0,8% và tinh sạch bằng
QiAquick gel extraction kit (Qiagen, Đức). Sản phẩm này đƣợc sử dụng làm
khuôn cho phản ứng giải trình tự trực tiếp hai chiều (mồi xi và mồi ngƣợc)

với mồi NL1/NL4, sử dụng BigDye terminator cycler v3.1 và đọc kết quả trên
hệ thống ABI 3500 XL (Applied Biosystems, Mỹ). Trình tự nucleotide của các
chủng nấm đƣợc so sánh với các trình tự đã có trên Genbank, sử dụng phần mền
BLAST trong NCBI (website http:www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Trình tự
DNA sau khi đọc đƣợc hiệu chỉnh bằng mắt với sự trợ giúp của phần mềm
ChromasPro1.7.6 (Technelysium, 2013) để loại bỏ các vùng tín hiệu nhiễu. Các
trình tự phân tích đƣợc sắp xếp thẳng hàng bằng phần mềm Bioedit v7.0.5.2
(Hall, 1999), Clustal W (Thompson et al., 1997), geneDoc 2.7 (Nicholas et al.,
1997). Các vùng khơng có khả năng sắp xếp bị loại bỏ trƣớc khi phân tích

21