Phân lập một số vi khuẩn có hoạt tính kitinaza và xác định một số đặc tính của enzym

Phân lập một số vi khuẩn có hoạt tính kitinaza
và xác định một số đặc tính của enzym


Phạm Thị Xòe


Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn ThS. ngành: Vi sinh vật học; Mã số: 60 42 40
Người hướng dẫn: GS.TS. Nguyễn Đình Quyến
Năm bảo vệ: 2012


Abstract. Tổng quan về Kitin và Kitinaza. Tiến hành nghiên cứu phân lập một số vi
khuẩn có hoạt tính Kitinaza và một số đặc tính của Enzim. Trình bày các kết quả
nghiên cứu đạt được: Từ mẫu đất làm giàu, đã phân lập được 35 chủng vi khuẩn.
Tiến hành thử hoạt tính có 11 chủng có hoạt tính kitinaza; Chọn lọc 2 chủng sinh
kitinaza cao nhất xác định được nhiệt độ tối ưu của chủng HD1 là 400C, chủng HD5
là350 C; PH tối ưu của chủng HD1 là7,0 - chủng HD5 là7,5 và nồng độ cơ chất tối
ưu của cả hai chủng HD1 và HD5 là 15‰; Thử hoạt tính kitinaza 2 chủng trên cả
kitin thô và kitin tinh chế thấy nhiệt độ, pH và nồng độ cơ chất tối ưu là không đổi;
Hoạt tính enzym tương đối ổn định sau 4 tuần bảo quản tại 40C; Nếu trong điều kiện
không có kitin tinh chế có thể sử dụng kitin thô độ chính xác vẫn đảm bảo; Cả 2
chủng trên đều có hoạt tính kháng nấm; Có thể khẳng định cả 2 chủng trên đều thuộc
chi Bacillus.

Keywords. Vi sinh vật học; Hoạt tính Kitinaza; Enzim; Vi khuẩn



Content

MỞ ĐẦU
Kitinaza là công nghệ sinh học lớn đang rất được giới khoa học quan tâm bởi các lý do: thứ
nhất, các enzym này có thể được sử dụng để chuyển đổi phế liệu giàu kitin thành các sản phẩm
hữu ích; thứ hai, có thể khai thác kitinaza dùng cho sự kiểm soát của mầm bệnh nấm và côn trùng;
thứ ba, kitinaza chất ức chế khả năng tăng trưởng có chứa kitin (thực vật) mầm bệnh và côn trùng
bệnh dịch hạch cần kitinaza cho sự phát triển bình thường. [ 20, 22, 26]
Với ý nghĩa thực tiễn đó chúng tôi đã thực hiện đề tài “ Phân lập vi khuẩn có hoạt tính
kitinaza và xác định một số đặc tính của enzym” nhằm góp phần cung cấp thêm vào bảo tàng
giống một số chủng vi khuẩn có hoạt tính kitinaza cao, nghiên cứu một số đặc tính của chúng để
có thể ứng dụng vào thực tiễn sản xuất tạo ra các chế phẩm vi sinh có hiệu quả cao mang lại lợi ích
cho con người.




Chƣơng I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 SƠ LƢỢC VỀ KITIN
1.1.1 Nguồn gốc và sự tồn tại của kitin trong tự nhiên
Kitin là một polysaccarit tồn tại trong tự nhiên với sản lượng rất lớn (đứng thứ 2 sau
xenlulôzơ). Kitin rất phổ biến trong tự nhiên và nó được tìm thấy như một vật liệu cấu trúc của các
loài sinh vật sống hiện nay.
1.1.2 Cấu trúc và đặc tính của kitin.
1.1.2.1. Cấu trúc của kitin.
Qua nghiên cứu sự thuỷ phân kitin bằng enzym hay HCl đậm đặc người ta thấy kitin là
một chuỗi polysaccarit của N- acetyl-D- glucozamin được tạo lên bởi mối liên kết β (1-4)
glicozit với công thức tổng quát (C
8
H
15

O
5
N)
n
. Các chuỗi kitin riêng rẽ có thể dạng xoắn vì
mỗi phân tử đường bị đảo ngược so với những phân tử đường cạnh, dẫn đến sự ổn định về
cấu trúc của chúng.
1.1.2 Cấu trúc và đặc tính của kitin.
1.1.2.1. Cấu trúc của kitin.
Qua nghiên cứu sự thuỷ phân kitin bằng enzym hay HCl đậm đặc người ta thấy kitin là
một chuỗi polysaccarit của N- acetyl-D- glucozamin được tạo lên bởi mối liên kết β (1-4)
glicozit với công thức tổng quát (C
8
H
15
O
5
N)
n
. Các chuỗi kitin riêng rẽ có thể dạng xoắn vì
mỗi phân tử đường bị đảo ngược so với những phân tử đường cạnh, dẫn đến sự ổn định về
cấu trúc của chúng.
1.1.2.2 Đặc tính của kitin.[4]
Kitin có mầu trắng hay trắng phớt hồng, không mùi, không vị, không tan trong nước,
trong môi trường kiềm, axít loãng và các dung môi hữu cơ như rượu, ete,…nhưng tan trong
một số dung dịch kiềm đặc nóng.
1.1.3 Ô nhiễm môi trường có nguồn gốc kitin
1.1.4 Một sốquy trình sản xuất kitin
1.1.5 Một số ứng dụng của kitin.
1.2 SƠ LƢỢC VỀ KITINAZA

1.2.1 Phân loại kitinaza.
* Dựa vào cấu trúc phân tử Henrissat và Bairoch đã phân loại kitinaza vào 2 họ
glycohydrolaza thứ 18 và 19[10]
* Dựa vào trình tự axit amin kitinaza chia thành 5 lớp. [14]
1.2.2 Cơ chế tác động của kitinaza.
1.2.3 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến hoạt tính của kitinaza.
1.2.4 Các nguồn thu nhận kitinaza
Kitin bị phân giải bởi kitinaza. Enzym này gặp ở hầu hết các nhóm sinh vật từ nhân sơ
đến nhân thực thậm chí cả virút.
1.2.4.1 Kitinaza từ động vật
1.2.4.2 Kitinaza từ thực vật
1.2.4.3 Kitinaza từ vi sinh vật
Trong các nguồn thu nhận kitinaza thì kitinaza từ vi sinh vật là nguồn quan trọng nhất
và có nhiều bằng chứng chỉ ra rằng, kitin là nguồn dinh dưỡng của hầu hết vi sinh vật. Phần
lớn các sinh vật nhân sơ, trong đó thuộc vi khuẩn phải kể đến như Bacilli,
Serratia,Chromobacterium, Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio,
Arthrobacter,Beneckea, Aeromonas và Streptomyces. Trong nấm như Trichoderma,
Penicillium, Lecanicillium, Neurospora, Mucor, Beauveria, Lycoperdon, Aspergillus,
Myrothecium, Conidiobolus, Metharhizium,
Stachybotrys và Agaricus (26).
1.2.5 Ứng dụng của kitinaza.
Trong lĩnh vực nông nghiệp, ngoài tạo các chế phẩm vi sinh kitinaza phòng trừ các yếu
tố gây hại, con người đã nhân bản gen có hoạt tính kitinaza và với kỹ thuật chuyển gen để
chuyển nó vào cơ thể thực vật để tăng khả năng kháng các tác nhân gây hại có thành phần
kitin. [28, 37]
…

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Mẫu vật
2.1.2 Hoá chất, dụng cụ
2.1.3 Môi trường
2.1.3.1 Môi trường phân lập
2.1.3.2 Môi trường giữ giống
2.1.3.3 Môi trường xác định hoạt tính enzym
2.1.3.4 Môi trường nuôi cấy lắc
Môi trường 1
Kitin: 5,0g
Pepton: 7,0g
Cao nấm men : 1,0g
Nước cất: 1000ml
pH: 7,0.
Khử trùng 121
0
C trong 30 phút.
Môi trường 2
ZnSO
4
: 1,0 g
(NH
4
)
2
SO
4:
1,0 g
KH
2
PO

4
: 1,0g
Kitin: 2 g
KCL: 0,5 g
MgSO
4
. 7H
2
O: 0,5 g
FeSO
4
: 0,01g
H
2
O: 1000ml
pH = 7,0
Khử trùng 121
0
C trong 30 phút.
Môi trường 3
Cao men 0,5 g
(NH
4
)
2
SO
4:
1,0 g
KH
2

PO
4
: 1,36g
Kitin: 10 g
MgSO
4
: 0,3 g
Nước cất: 1000ml
pH = 7,0
Khử trùng 121
0
C trong 30 phút.
=> Chú ý luôn pha song song kitin tinh chế và kitin thô cho mỗi loại môi trường.
2.1.3.5 Môi trường Czapek nuôi cấy nấm mốc
NaNO
3
: 2,0 g
Đường kính
:
30 g
KH
2
PO
4
: 1,0g
FeSO
4
: 0,05g
KCL: 0,5 g
MgSO

4
: 0,5 g
Nước máy: 1000ml
pH = 7,0
2.1.3.6 Các dung dịch hoá chất sử dụng trong nhuộm Gram
2.2 PHƢƠNG PHÁP
2.2.1 Phân lập vi khuẩn
2.2.2 Xác định khả năng sinh kitinaza.
* Phương pháp đặt thỏi thạch.
* Phương pháp nhỏ dịch.
2.2.3 Phương pháp xác định số lượng tế bào
2.2.4 Ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh kitinaza của các chủng
lựa chọn.
Lƣu ý: tiến hành thí nghiệm song song 2 trƣờng hợp tƣơng tự giữa kitin thô và kitin
tinh chế.
2.2.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ.
2.2.4.2 Ảnh hưởng của pH.
2.2.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất.
2.2.4.4 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến hoạt tính enzym.
2.2.5 Xác định khả năng kháng nấm.
Cấy các chủng nấm gây bệnh trong môi trường Czapek thạch, xác định khả năng
kháng nấm của các chủng lựa chọn theo phương pháp nhỏ dịch. Nếu vi khuẩn kháng nấm sẽ
xuất hiện vòng kháng.
2.2.6 Một số đặc tính sinh học của các chủng lựa chọn


Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SINH KITINAZA
Từ mẫu đất thường ở vùng đất trồng Ninh Giang - Hải Dương không bổ sung nguồn

kitin thu được 31 chủng vi khuẩn kí hiệu NG1- NG31. Qua sơ tuyển bằng phương pháp đặt
thỏi thạch với môi trường cơ chất trong cả 2 trường hợp kitin tinh sạch và kitin thô thu được
7 chủng có hoạt tính kitinaza.
Từ mẫu đất được bổ sung nguồn kitin ở vùng đất trồng Ninh Giang - Hải Dương theo
phương pháp làm giàu thu được 35 chủng vi khuẩn trên môi trường phân lập NA. Bằng
phương pháp đặt thỏi thạch với môi trường cơ chất trong cả 2 trường hợp kitin tinh sạch và
kitin thô thu được 11 chủng có hoạt tính kitinaza.
3.2 ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN KHẢ NĂNG SINH KITINAZA CỦA
CÁC CHỦNG LỰA CHỌN
3.2.1 Lựa chọn môi trường nuôi cấy
Tiến hành nuôi cấy lắc cả chủng HD1 và HD5 trên 3 loại môi trường 1,2,3 trong cả hai
trường hợp kitin tinh sạch và kitin thô. Sau 24h kiểm tra hoạt tính kitinaza theo phương pháp
nhỏ dịch nhằm chọn lọc được môi trường nuôi cấy thích hợp nhất. Kết quả thể hiện bảng 3










Bảng 3: Các chủng nghiên cứu nuôi cấy trên các loại môi trường
3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Môi trường
Hoạt tính kitinaza
HD1
HD5
Môi trường 1

Kitin tinh sạch
31
29
Kitin thô
27
26
Môi trường 2

Kitin tinh sạch
19
15
Kitin thô
14
11
Môi trường 3

Kitin tinh sạch
23
21
Kitin thô
21
19
Kết quả thu được thể hiện ở bảng 4
Nhiệt độ
0
C
Hoạt tính enzym (mm)
HD1
HD5

25
Kitin tinh sạch
26
23
Kitin thô
19
15
30
Kitin tinh sạch
27
25
Kitin thô
21
21
35
Kitin tinh sạch
29
27
Kitin thô
23
22
40
Kitin tinh sạch
31
21
Kitin thô
26
18
45
Kitin tinh sạch

25
21
Kitin thô
21
17
50
Kitin tinh sạch
19
17
Kitin thô
15
13

Bảng 4: Hoạt tính phân giải kitin của chủng HD1 và HD5 dưới ảnh hưởng
của nhiệt độ
Xác định số lượng tế bào của 2 chủng HD1 và HD5. Kết quả thu được ở bảng phụ 01
và hình 7
Hình 7: Khả năng sinh trưởng của các chủng lựa chọn.



3.2.3 Ảnh hưởng của pH
Nuôi cấy 2 chủng lựa chọn tại 35
0
C ở các pH khác nhau 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0.
Bằng phương pháp nhỏ dịch xác định hoạt tính phân giải kitin của 2 chủng HD1 và HD5 với
cơ chất kitin tinh sạch và kitin thô. Kết quả thu được thể hiện ở bảng 5.

Số lượng tế bào( x 10
8

CFU/ ml)
pH
Hoạt tính enzym (mm)
HD1
HD5
5,5
Kitin tinh sạch
21
19
Kitin thô
15
15
6,0
Kitin tinh sạch
23
20
Kitin thô
16
16
6,5
Kitin tinh sạch
27
23
Kitin thô
20
22
7,0
Kitin tinh sạch
29
27

Kitin thô
23
22
7,5
Kitin tinh sạch
25
28
Kitin thô
21
24
8,0
Kitin tinh sạch
19
16
Kitin thô
27
17

Bảng 5: Hoạt tính phân giải kitin của chủng HD1 và HD5
dưới ảnh hưởng của pH
Cũng trên các pH khác nhau, tôi tiến hành xác định khả năng sinh trưởng của 2 chủng
trên 2 loại cơ chất trong môi trường số 1. Với phương pháp xác định số lượng tế bào , kết quả
thu được thể hiện phụ lục 02 và hình 8

Hình 8: Khả năng sinh trưởng của các chủng lựa chọn

3.2.4 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Bằng phương pháp nhỏ dịch, các chủng lựa chọn được nuôi cấy tại các nồng độ cơ
chất khác nhau 5‰, 10‰, 15‰, 20‰, 25‰ trong 24 giờ. Kết quả thu được thể hiện bảng 6.
Nồng độ cơ chất (%)

Hoạt tính enzym (mm)
HD1
HD5
5‰
Kitin tinh sạch
29
27
Kitin thô
23
22
10‰
Kitin tinh sạch
32
30
Kitin thô
25
24
15‰
Kitin tinh sạch
35
34
Kitin thô
29
27
20‰
Kitin tinh sạch
33
34
Kitin thô
28

27
25‰
Kitin tinh sạch
34
33
Kitin thô
29
26

Bảng 6: Hoạt tính phân giải kitin của chủng HD1 và HD5 dưới ảnh hưởng
của nồng độ cơ chất
Theo phương pháp xác định số lượng tế bào, 2 chủng nghiên cứu được nuôi cấy trong
các nồng độ khác nhau từ 5%- 25%. Kết quả thu được phụ lục 03 và hình 9.

Hình 9: Khả năng sinh trưởng của các chủng lựa chọn
3.2.5 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản
Sau 1 ngày nuôi cấy lắc, đem li tâm thu dịch enzym bảo quản ở 4
0
C. Cứ sau 1 tuần tiến
hành thử hoạt tính enzym theo phương pháp nhỏ dịch. Kết quả thu được ở bảng 8.
Thời gian
Hoạt tính kitinaza ( mm)
HD1
HD5
1 tuần
Kitin tinh sạch
24
25
Kitin thô
20

21
2 tuần
Kitin tinh sạch
23
24
Kitin thô
20
21
3 tuần
Kitin tinh sạch
22
22
Kitin thô
19
19
4 tuần
Kitin tinh sạch
22
21
Kitin thô
19
18
Bảng 7: Hoạt tính phân giải kitin của chủng HD1 và HD5 dưới ảnh hưởng
của thời gian bảo quản

3.3 HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM CỦA CHỦNG NGHIÊN CỨU
Số lượng tế bào ( x 10
8
CFU/
ml)

Từ chủng nấm được tách trên cơ thể bọ xít ( phụ lục 04 ), tiến hành nghiên cứu khả
năng kháng loại nấm đó của 2 chủng HD1 và HD5. Khả năng kháng nấm được xác định bằng
phương pháp nhỏ dịch trên môi trường Czapek có bổ sung 18 g thạch và xác định hoạt tính
bằng cách đo đường kính vòng phân giải. Kết quả thu được bảng 8.
Môi trường
Hoạt tính kháng nấm ( mm)
HD1
HD5
Kitin tinh sạch
25
28
Kitin thô
19
20
Bảng 8: Hoạt tính phân giải kitin của chủng HD1 và HD5

3.4 ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CHỦNG NGHIÊN CỨU
Các chủng nghiên cứu được tiến hành kiểm tra các đặc điểm sinh học để bước đầu
phân loại theo phương pháp vi sinh thông thường. Kết quả ở bảng 9.
Nội dung
HD1
HD5
Hình dạng khuẩn lạc
Tròn, nhẵn bóng, trắng đục,
nhầy.
Tròn, không bóng, trắng
đục, mép nhăn.
Hình thái tế bào
Que, ngắn, rời rạc hoặc xếp
chuỗi ngắn

Que, ngắn, rời rạc hoặc xếp
chuỗi ngắn
Nhuộm Gram
Gram dương
Gram dương
Hình thành nội bào tử
Có
Có

Bảng 9: Một số đặc tính sinh học của các chủng nghiên cứu
Căn cứ các đặc điểm trên và đối chiếu với bảng phân loại của Bergeycó thể khẳng định
rằng các chủng nghiên cứu trên có khả năng thuộc chi Bacillus.


KẾT LUẬN

1. Từ mẫu đất nghiên cứu, chúng tôi đã phân lập được 35 chủng vi khuẩn. Tiến hành thử
hoạt tính có 11 chủng có hoạt tính kitinaza.
2. Chọn lọc 2 chủng sinh kitinaza cao nhất xác định được nhiệt độ tối ưu của chủng HD1
là 40
0
C, chủng HD5 là 35
0
C. PH tối ưu của chủng HD1 là7,0; chủng HD5 là7,5 và nồng
độ cơ chất tối ưu của cả hai chủng HD1 và HD5 là 15‰.
4. Thử hoạt tính kitinaza 2 chủng trên cả kitin thô và kitin tinh chế thấy nhiệt độ, pH và
nồng độ cơ chất tối ưu là không đổi.
5. Hoạt tính enzym tương đối ổn định sau 4 tuần bảo quản tại 4
0
C.

6. Nếu trong điều kiện không có kitin tinh chế có thể sử dụng kitin thô độ chính xác vẫn
đảm bảo.
7. Cả 2 chủng trên đều có hoạt tính kháng nấm.
8. Có thể khẳng định cả 2 chủng trên đều thuộc chi Bacillus.


KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục nghiên cứu tạo chế phẩm kitinaza sinh học ứng dụng vào sản xuất
góp phần giản ô nhiễm môi trường từ nguồn phế liệu giàu kitin.
2. Tiếp tục nghiên cứu ứng dụng công nghệ chuyển gen có hoạt tính kitinaza để
tăng các loài sinh vật có khả năng phòng trừ nấm hại.
3. Nghiên cứu ứng dụng sản phẩm kitin thô trong bảo vệ thực vật.




References
Tài liệu tiếng việt
1. Đặng Văn Luyến, “Chitin/Chitosan”. Các bài giảng và báo cáo chuyên đề, tập 2, tr
27-35, 1995
2. Trần Thị Luyến, Huỳnh Nguyễn Duy Bảo và một số cộng sự. “ Hoàn thiện quy trình
sản xuất Chitin-Chitosan và chế biến một số sản phẩm công nghiệp từ phế liệu vỏ
tôm, cua” Báo cáo khoa học, Đề tài cấp bộ. Nha Trang.2000.
3. Isolation and Characterization of Halophilic Alkaliphilic Bacteria Producing Protease
and their Use to Accelerate Fish Sauce Fermentation Nguyễn Văn Lâm1, Nguyễn
Phương Nhuệ2, Trịnh Thị Ngọc.
Tài liệu nƣớc ngoài
4. Anand A, Lei ZT, Sumner LW, Mysore KS, Arakane Y, Bockus WW, Muthukrishnan
S. 2004. Mol Plant Microbe In 17 (12): 1306-1317.
5. Baneriee U.C., Sani R.K.,Azmi W.,Soni R. (1999), “ Thermostable alkaline chitinase

from Bacillus brevis and its characterization as a laundry detergent additive”,
Biochemistry, 35 (1-2), pp. 213-19.
6. Cottrell MT, Moore JA, Kirchman DL. 1999. Appl Environ Microb, 65 (6): 2553-
2557.
7. Davis, B., and Eveleigh , D. E., 1984, Chitosanase: Occurrence, production and
immobilization, in: Chitin, Chitosan and Related Enzymes ( J. P. Zikakis, ed), pp.
161- 179, Academic Press, Orlando.
8. Deshpande, MV 1986. Journal of Scientific and Industrial Research 45:273-281
9. Enzymology, RAA Muzzarelli (ed). Atec Edizioni, Italia. 2:125- 133.
10. Flach. J., Pilet PE, and Jolles P.1992. Experientia 48, pp-701-716.
11. Fergus G.Priest, Extraccellular Enzyme Synthesis in the genus Bacillus,
Bacteriologycal Reviews, 41 (3), p. 711- 753.
12. Fuchs, RL, McPherson, SA and Drahos, DJ1986. Appl. Environ. Microbiol. 51,
504.
13. Gardner, H. H., and Blackwell, J., 1975, Refinement of the structure of β- chitin,
Biopolymers 14: 1581- 1595.
14. Gokul, B Lee, JH Song, KB Rhee, SK Kim, CH Panda, T. 2000, Bioprocess
Eng. 23(6):691-694
15. Gooday, G.W., 1983, The microbial synthesis of cellulose, chitin and chitosan, Pro.
Ind. Microbiol. 18: 85- 127.
16. Goorich, T. D., and Morita, R .Y., 1977a, Incidence and estimation of chitinase
activity associated with marine fish and other estuarine sample, Mar. Biol. 41: 349-
353.
17. Hackman R.H. (1962). Studies on Chitin. 5. Action of Mineral Acids on Chitin
Australian Journal of Biological Sciences 15 (3): 526- 532.
18. Henrissat BI and Bairoch A. 1993. Biochem. J., 293, 781-788.
19. Herrera-Estrella A. & Chet, I. 1999. EXS 87, 171.
20. Hillman, K., Gooday, G. W., and prosser, J. I., 1989, A simple model system for
small scale in vitro study of estuarine sediment ecosystems, Lett. Appl. Microbiol. 8:
41- 44.

21. Kenneth J.Ryan (2004), Bacillus, Shrris Medical Microbiology
22. Koga D, Hoshika H, Matsushita M, Tanaka A, Ide A, Kono M. 1996. Biosci Biotech
Bioch 60 (2): 194-199.
23. Linden, J., Stoner, R., Knutson, K. Gardner-Hughes, C. "Organic Disease Control
Elicitors". Agro Food Industry Hi-Te .p12-15 Oct 2000.
24. Lorito M, Sheridan I., Woo, Gary EH, Sposato P., Muccifora S. and Scala
F.1996. Genes enconding for chitinolytic enzymes from biocontrol fungi: applications
for plant disease control. In: Chitin Enzymology. RAA Muzzarelli (ed). Atec
Edizioni, Italia.2:95-101.
25. Lutz, MP, Wenger S., Maurhofer, M., Dèfago G., Duffy B. 2004. FEMS
Microbiol Ecol 48:447-455.
26. Mayer RT, McCollam TG, Niedz RP, Hearn CJ, McDonald RE, Berdis E, Doostdar
H. 1996. Planta 200 (3): 289-295.(25cũ)
27. Melchers, LS & Stuiver, MH 2000.Curr. Op. Plant Biol. 3, 147.(26cũ)
28. Minke, R., and Blackwell, J., 1978, The structure of α- chitin, J. Mol. Biol. 120: 167-
181.
29. Mitchen, R., and Alexander, M., 1962, Microbiological processes associated with the
use of chitn for biological control, soil Sci. Soc. Am. Proc. 26: 556- 558.
30. Natural Photonics Group Dr. Peter Vukusic, Roy Sambles University of
Exeter. "Wing scales diffract and scatter light: Morpho butterflies". The Biomimicry
Institute. Retrieved April 8, 2012
31. Patil R, Ghormade V, Deshpande M. 2000. Enzyme Microb Technol, 26:473-
483.37. Adams, DJ 2004. Microbiology, 150:2029-2035.
32. Perez C. and C. Anesini. 1993. In vitro antimicrobial activity of Argentine folk
medicinal plants against Salmonella typhii. Journal of Ethnopharmacology. 44: 41-46
33. Revah-Moiseev, S. and Carroad, PA 1981. Biotechnol Bioeng, 23:1067-1078.
34. Richard Carl Capozza, US. Pat.
N0
4074713
35. Rojas-Avelizapa LI, Cruz-Camarillo R, Guerrero MI, Rodriguez-Vazquez R, Ibarra

JE .1999. World J Microb Biot 15 (2): 299-308.
36. Rudall, K. M., and Kenchington, W , 1973, The chitin system, Biol. Rev. 48: 597-
636.
37. Rudrapatnam N., Tharanathan and Farooqahmed S. Kittur. 2003. Crit Rev Food Sci
Nutr, 43(1):61.87.
38. Sahai, AS and Manocha, MS 1993. FEMS Microbiol. Rev., 11:317-338.
39. Salzer P, Feddermann N, Wiemken A, Boller T, Staehelin C. 2004. Planta 219 (4):
626-638.
40. Simpson, BK; Gagne, N. and Simpson, MV 1994. Bioprocessing of chitin and
chitosan. In: Fisheries Processing: Biotechnological applications. AM Martin
(Ed.). Chapman and Hall. London.155-173.
41. Shirai, K., Guerrero, I. and Hall, GM 1996. La quitina, ocurrencia, propiedades
yaplicaciones. Ciencia 47 (4):317-328.
42. S.Kavi Karunya, D.Reetha, P.Saranraj and D. John Milton. Department of
Microbiology,Annamalai University,Chidambaram – 608 002, India. Received 24
Aug 2011; Revised 26 Oct 2011; Accepted 07 Nov 2011
43. Smucker, R.A., 1984, Biochemistry of the streptomyces spore sheath, in: Biologycal,
Biochemical and Biomedical Aspects of Actinomycetes ( L. Ortiz- Ortiz, L. F.
Bojalib, and V. Yakoleff, eds.), pp. 171- 177, Academic Press, Orlando.
44. Smucker, R.A., and Dawson, R., 1986, products of phytosynthesis by marine
phytoplankton: chitin in CTA „ protein‟ precipitase, J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 104: 397-
408.
45. Sundheim, L., Poplawsky, AR & Ellingboe, AH 1988. Phys. Mol. Plant
Path. 33, 483.
46. S.Kavi Karunya, D.Reetha, P.Saranraj and D. John Milton. Department of
Microbiology,Annamalai University,Chidambaram – 608 002, India. Received 24
Aug 2011; Revised 26 Oct 2011; Accepted 07 Nov 2011
47. Todar‟s online Textbook of bacteriology ( 2008), Gram positive aerotic or faculative
endospore forming bacteria ( formerly, „the genus Bacillus”).