Nghiên cứu phân lập chủng vi khuẩn có một số đặc điểm sinh học của vi sinh vật probiotic từ sản phẩm tỏi trắng lên men

LỜI CẢM ƠN
Để nâng cao kỹ thuật của sinh viên ngành Cơng nghệ sinh học Lâm
Nghiệp nói riêng và sinh viên đại học Lâm Nghiệp nói chung, đƣợc sự đồng ý
của lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm Nghiệp và giáo viên hƣớng dẫn em
xin tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phân lập chủng vi khuẩn có một
số đặc điểm sinh học của vi sinh vật probiotic từ sản phẩm tỏi trắng lên men”.
Có đƣợc kết quả hiện tại trƣớc hết em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới cô
giáo Th.S Nguyễn Thị Thu Hằng đã tận tâm hƣớng dẫn, chỉ bảo và truyền đạt
kiến thức cho em trong suốt quá trình nghiên cứu để em có thể hồn thành đƣợc
đề tài này.
Em xin cảm ơn ban lãnh đạo Viện CNSH Lâm Nghiệp, Bộ môn Cơng nghệ
Vi sinh – Hóa sinh. Bên cạnh đó em cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ
nhiệt tình của các thầy, cơ giáo và tồn bộ cán bộ viên chức tại Bộ mơn Cơng
nghệ Vi sinh – Hóa sinh đã tạo điều kiện, giúp đỡ và đóng góp nhiều ý kiến quý
báu cho em để quá trình nghiên cứu đƣợc thuận lợi hơn.
Với những kết quả khả quan em cũng xin tiếp tục đƣợc nghiên cứu tiếp để
đề tài đạt đƣợc kết quả tốt nhất. Với tinh thần luôn cố gắng, chăm chỉ cũng nhƣ
ham học hỏi tuy nhiên với kinh nghiệm còn hạn chế nên trong quá trình nghiên
cứu khơng tránh khỏi những thiếu sót, em mong nhận đƣợc những lời nhận xét,
đóng góp ý kiến của các thầy, cô giáo để đề tài nghiên cứu của em đƣợc hoàn
thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 03 tháng 05năm 2019
Sinh viên thực hiện

VŨ THỊ HỒNG TOAN

i


M CL C

LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................................i
M C

C ...................................................................................................................... ii

DANH M C CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................iv
NH M C ẢNG .......................................................................................................v
NH M C H NH .......................................................................................................vi
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................................1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .................................................2
1.1. Tổng quan về vi sinh vật probiotic .............................................................................2
1.1.1. ƣợc sử nghiên cứu vi sinh vật probiotic .............................................................. 2
1.1.2. Thành phần và đặc điểm vi sinh vật đƣợc sử dụng trong probiotic .......................3
1.1.3. Cơ chế tác động của probiotic ...............................................................................3
1.2. Tổng quan về vi khuẩn Bacillus .................................................................................6
1.2.1. Đặc điểm sinh học của Bacillus .............................................................................6
1.2.2. inh dƣỡng và tăng trƣởng....................................................................................7
1.2.3. Một số loài Bacillus phổ biến trong tự nhiên ......................................................... 8
1.3 Lợi ích của tỏi lên men .............................................................................................. 9
1.4. Cơ sở lựa chọn chủng Bacillus trong sản xuất chếphẩmprobiotic ............................ 12
CHƢƠNG 2: M C TIÊU, NỘI UNG VÀ PHƢƠNG PHÁP ....................................16
NGHIÊN CỨU ..............................................................................................................16
2.1 Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................................ 16
2.2 Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 16
2.3 Vật liệu nghiên cứu..................................................................................................16
2.4 Môi trƣờng nghiên cứu ............................................................................................ 17
2.5 Các phƣơng pháp nghiên cứu ..................................................................................18
2.5.1 Phân lập các chủng Bacillus có khả năng chịu nhiệt ............................................18
2.5.2 Phƣơng pháp nhuộm Gram...................................................................................19
2.5.3 Xác định mật độ tế bào bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc..................................20

2.5.4 Xác định hàm lƣợng axit sinh ra trong môi trƣờng nuôi cấy ............................... 21
2.5.5 Phƣơng pháp xác định khả năng sinh catalase .....................................................21
2.5.6 Khảo sát xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào ............................................22
2.5.7 Xác định khả năng chịu nhiệt ...............................................................................23
2.5.8 Xác định hoạt tính kháng khuẩn ...........................................................................23
2.5.9 Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố đến sinh trƣởng vi khuẩn. ...................... 24
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 26
ii


3.1. Kết quả phân lập phân lập và thuần khiết giống ....................................................26
3.2. Kết quả xác định đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn đã phân lập .............27
3.3. Xác định số lƣợng vi sinh vật tế bào bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc ...............28
3.4 Xác định hàm lƣợng axit sinh ra trong môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn ...................30
3.5. Khảo sát xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào ..............................................30
3.6 Khảo sát khả năng chịu nhiệt...................................................................................32
3.7. Xác định hoạt tính kháng khuẩn .............................................................................34
3.8 Xác định ảnh hƣởng của một số yếu tố đến sinh trƣởng và phát triển của vi khuẩn
.......................................................................................................................................36
3.8.1 Ảnh hƣởng của pH ban đầu trong môi trƣờng nuôi cấy .......................................36
3.8.2 Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy .......................................................................37
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................ 39
4.1 Kết luận....................................................................................................................39
4.2. Kiến nghị ................................................................................................................40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 41

iii


DANH M C CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CFU
TB

Colony Forming Unit
Tế bào

VSV

Vi sinh vật

CMC

Cacborxyl Methy cellulose

VK
G

Vi khuẩn
Gram

G (+)

Gram dƣơng

G (-)

Gram âm

LB

Luria Bertani

NA

Nutrient Agar

NB

Nutrient Broth

iv


DANH M C ẢN
Bảng 2.1 Danh sách hóa chất ........................................................................................ 17
Bảng 2.2 Môi trƣờng Luria Bertani (LB) cho phân lập, nuôi cấy vi khuẩn ..................17
Bảng 2.3 Môi trƣờng xác định hoạt tính enzyme .......................................................... 17
Bảng 3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus từ mẫu tỏi đen ......................................26
Bảng 3.2: Kết quả xác định hình dạng tế bào, hoạt tính calatase và đặc điểm Gram của
các chủng vi khuẩn đã phân lập ..........................................................................27
Bảng 3.3. Kết quả xác định số loại vi sinh vật và số lƣợng tƣơng ứng với từng loại
trong sản phẩm tỏi đen........................................................................................ 29
Bảng 3.4 Khả năng sinh axit trong môi trƣờng nuôi cấy ..............................................30
của các chủng vi khuẩn..................................................................................................30
Bảng 3.5. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn ........................... 31
Bảng 3.6. Tổng hợp hình ảnh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn phân giải
cellulose 1%, tinh bột 1% và casein 1% ............................................................. 31
Bảng 3.7. Khả năng sinh trƣởng phát triển của các chủng vi khuẩn ở nhiệt độ khác
nhau.....................................................................................................................33
Bảng 3.8. Hoạt tính đối kháng vi sinh vật kiểm định của ba chủng vi khuẩn ...............35

Bảng 3.9 Ảnh hƣởng pH ban đầu trong môi trƣờng nuôi cấy đến khả năng sinh trƣởng
của các chủng vi khuẩn ....................................................................................... 36
Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến sự tạo thành sinh khối của các
chủng vi khuẩn ....................................................................................................38

v


DANH M C H NH
Hình 1.1. Hình thái tế bào Bacillus subtilis .....................................................................6
Hình 2.1 Sơ đồ hóa q trình nghiên cứu ......................................................................18
Hình 3.1. Hình ảnh khuẩn lạc và sinh khối của các chủng vi khuẩn chịu nhiệt đã phân
lập ..................................................................................................................................26
Hình 3.2. Khả năng chịu nhiệt của chủng B7 ở các nhiệt độ khác nhau ....................... 33
Hình 3.3 Sơ đồ hoạt tính đối kháng với vi sinh vật kiểm định của ba chủng ...............35
Hình 3.4. Hoạt tính đối kháng với vi sinh vật kiểm định của chủng B3 ....................... 35
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của độ pH môi trƣờng đến sinh trƣởng, phát triển của các chủng
vi khuẩn B3, B6, B7 ......................................................................................................37
Hình 3.6. Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến sự sinh trƣởng của các chủng ................38

vi


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, với mục đích bảo vệ sức khỏe cho ngƣời sử dụng, bảo vệ môi
trƣờng sống không bị ơ nhiễm bởi các hố chất độc hại. Do vậy, các nhà khoa
học khuyến cáo nên hạn chế hoặc cấm sử dụng một số loại thuốc, đặc biệt là
thuốc kháng sinh và thay thế thuốc kháng sinh bằng các sản phẩm chức năng có
lợi cho sức khỏe. Từ đó, sản phẩm lên men có lợi cho sức khỏe đƣợc ngƣời tiêu
dùng quan tâm. Các sản phẩm này không những làm phong phú nền văn hóa ẩm

thực mà cịn góp phần cung cấp cho con ngƣời các chất dinh dƣỡng dƣới dạng
hợp chất đơn giản và dễ tiêu thụ, đặc biệt các sản phẩm lên men còn mang lại
cho con ngƣời một cơ thể khỏe mạnh nhờ những thành phần có tác dụng tăng
cƣờng sức khỏe, chống lại bệnh tật và các tác dụng y học khác.
Tỏi đen là sản phẩm của sự lên men từ tỏi trắng, đƣợc sử dụng rộng rãi với vai
trò là thực phẩm chức năng giúp tăng cƣờng sức khỏe. Trong suốt quá trình này,
màu trắng tỏi chuyển sang màu đen là do phản ứng Maillard và Browning. Gần
đây, một loại tỏi đen mới đã đƣợc phát triển ở Nhật ản bằng cách chế biến tỏi
tƣơi thông thƣờng theo con đƣờng của nhiệt độ và độ ẩm.
Sản phẩm tỏi trắng lên men đƣợc tạo thành nhờ lên men tỏi trắng thực hiện bởi
hoạt động vi sinh sinh trong điều kiện nhiệt độ cao.

o vậy, trong sản phẩm tỏi

lên men có khả năng chứa mật độ cao vi sinh vật có khả năng chịu nhiệt, chịu
axit,.. Nhóm vi sinh vật đƣợc sử dụng phổ biến trong công nghệ lên men tỏi:
Bacillus, lactobacillus, nấm men. Với mục tiêu phân lập các vi sinh vật có một
số đặc điểm sinh học probiotic nhƣ khả năng chịu nhiệt độ cao, chịu axit, chịu
muối, sản sinh một số enzym ngoại bào với mật độ cao.
Xuất phát từ tình hình thực tiễn trên, theo xu hƣớng của công nghệ sinh
học trên thế giới hiện nay, cũng nhƣ nguồn lợi vi sinh vật lên men tỏi phong
phú, tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phân lập chủng vi khuẩn có
một số đặc điểm sinh học của vi sinh vật probiotic từ sản phẩm tỏi trắng lên
men”.

1


CHƢƠN

1. TỔN

QUAN VẤN ĐỀ N HIÊN CỨU

1.1. Tổng quan về vi sinh vật probiotic
1.1.1. Lược sử nghiên cứu vi sinh vật probiotic
Lịch sử nghiên cứu về vi sinh vật probiotic bắt đầu từ những năm cuối thế
kỷ 19, khi các nhà vi sinh vật học phát hiện ra sự khác biệt giữa hẹ vi sinh trong
ống tiêu hóa của ngƣời bệnh và ngƣời khỏe mạnh.
Năm 1925, Beach là ngƣời đầu tiên có những nghiên cứu thực nghiệm về
thức ăn có chứa các VK "Lactobacillus acidophilus" [23].
Năm 1965, thuật ngữ probiotic đƣợc đƣa ra đầu tiên bởi Lilly và
Stillwell, nhằm mô tả những VSV có khả năng kích thích sinh trƣởng của một
số vật nuôi [13].
Năm 1968, King đã nghiên cứu thành cơng trong việc kích thích sự tăng
trƣởng của heo bằng thức ăn có bổ sung Lactobacillus acidophilus [22,23].
Năm 1989, Fuller, cùng nhiều nhà khoa học khác nhƣ ee (Singapore),
Nomoto (Nhật), Salminen (Phần an), Gorbach ( nh) (1999) đều thống nhất
trong định nghĩa: "Probiotic là chế phẩm sinh học hay là thức ăn bổ sung có
chứa VSV sống có ảnh hƣởng tốt cho sức khỏe của vật chủ bằng cách cải thiện
sự cân bằng hệ vi sinh đƣờng ruột" [3, 22, 23].
Năm 2001, Schrezenmeir và

eVrese định nghĩa: “Probiotic là lƣợng vi

sinh vật xác định với số lƣợng thích hợp đƣợc chuẩn bị trong các sản phẩm, có
tác dụng biến đổi tích cực hệ vi sinh vật đƣờng ruột và ảnh hƣởng tốt đến sức
khỏe vật chủ”.
Theo định nghĩa của F O/WHO năm 2002: “Probiotic đó là những vi
sinh vật sống đƣợc kiểm sốt chặt chẽ, với lƣợng thích hợp mang lại lợi ích cho

vật chủ” [21].

2


1.1.2. Thành phần và đặc điểm vi sinh vật được sử dụng trong probiotic
Hiện nay, có khoảng gần 20 lồi vi khuẩn (VK) đƣợc sử dụng trong chế
phẩm probiotic. Trong đó các VK lactic và VK Bacillus có lợi giữ vai trị chính
đƣợc sử dụng nhƣ L. acidophilus, Lactobacillus delbrueckii

subs.,

Lactobacillus casei, L. plantarum, L. bulgaricus, Bifidobacterium breve,
Enterococcus faecium,... VK Bacillus và VK lactic có khả năng bám chặt vào
màng nhầy của ruột, ức chế sự bám của vi sinh vật (VSV) gây bệnh. Sản xuất
các acid lactic để làm giảm pH đƣờng ruột, tạo môi trƣờng không thuận lợi cho
VSV có hại phát triển. Ngồi ra, chúng cịn sản xuất chất kháng sinh, sinh
H2O2, sản xuất các enzyme tiêu hóa (amylase, cellulase, lipase, protease), các
vitamin, khử độc tố trong đƣờng ruột [2, 22, 23].
Tham gia vào thành phần vi sinh vật probiotic cịn có nấm men nhƣ
Saccharomyces cerevisiae và Sacharomyces boulardii. Nấm men ngoài khả
năng làm cân bằng hệ VSV trong đƣờng ruột cịn có vai trị tạo ra sinh khối
nhanh, sinh khối giàu acid amin, các vitamin (nhóm

,

), tiết các chất có

khả năng hấp thu độc tố và bài thải ra ngồi. Chúng lên men chuyển hóa
glucose thành acid pyruvic là cơ chất cho các VSV có lợi khác trong đƣờng

ruột hoạt động và sinh sản. Nấm men còn tiết các enzyme tiêu hóa nhƣ
amylase, cellulase, protease,... và cịn có khả năng đề kháng lại với tất cả các
kháng sinh (trừ kháng sinh nấm). Chính vì vậy, chúng có thể tồn tại ở bất cứ
nơi nào trong đƣờng ruột của vật ni mà hồn tồn khơng bị kháng sinh
tiêu diệt [2, 7, 22, 23].
Có thể tóm tắt đặc điểm chung của VSV probiotic là: Có khả năng gắn
vào tế bào; loại bỏ hay hạn chế sự gắn của các tác nhân gây hại; tồn tại lâu dài
và sinh sản nhanh; tạo ra các chất chống lại sự phát triển của các tác nhân gây
bệnh; không lan truyền rộng, không gây ung thƣ và không gây bệnh.
1.1.3. Cơ chế tác động của probiotic
Vi sinh vật probiotic khi đƣợc bổ sung vào cơ thể vật chủ, sẽ tác động lên
đƣờng tiêu hóa của vật chủ theo những cơ chế nhƣ cạnh tranh và đối kháng với
3


các vi khuẩn gây bệnh, sản sinh các chất có hoạt tính kháng khuẩn, kích thích
đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ,…
 Cạnh tranh và đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh:
Hệ vi sinh vật ở đƣờng ruột tiêu hóa mất cân bằng do nhiều nguyên nhân
khác nhau, một trong những nguyên nhân chính do việc sử dụng kháng sinh dài
ngày dẫn đến việc tiêu diệt các vi sinh vật có lợi trong ruột. Để khắc phục điều
này, các nhà khoa học thƣờng bổ sung các vi sinh vật có lợi thơng qua sử dụng
probiotic.
Khi cung cấp thƣờng xuyên các VSV có lợi dƣới dạng sữa lên men hoặc
dạng đông khô cho ngƣời và động vật với liều lƣợng thích hợp (1,2 tỉ CFU/kg
thức ăn/ngày), các vi sinh vật này sẽ phát triển, chiếm ƣu thế và cạnh tranh với
các VSV có hại về vị trí bám, về hấp thu chất dinh dƣỡng, về khối lƣợng các
chất sinh ra bởi VSV [11, 83, 14, 22].
 Sản xuất các chất kháng khuẩn:
Tác nhân ức chế VK gây bệnh của VK lactic khơng chỉ là acid lactic mà

cịn bởi những chất ức chế đặc hiệu khác nhƣ acid hữu cơ, ethanol, H2O2,
diacetyl,...[8, 23, 26]. Trong khi các VK lactic lên men đồng hình chủ yếu sản
sinh acid lactic thì nhóm VK lactic lên men dị hình tạo ra cả những acid hữu cơ
khác nhƣ acid acetic, acid formic, acid propionic,…Những sản phẩm này làm
giảm pH của môi trƣờng và khi pH đạt đến một mức nào đó sẽ đủ để loại trừ
những VSV gây hại trong đƣờng ruột. Chẳng hạn nhƣ các VSV gây thối hỏng
thực phẩm (B. subtilis, P. vulgaris, B. mensenterium, Clostridum), các VSV gây
bệnh nhƣ E. coli (gây viêm ruột ở động vật non và trẻ em), Salmonella
typhimurium, Salmonella cholerasuis (gây sốt thƣơng hàn). Một số lồi nhƣ
Lactococcus lactic, Leuconostoc cremoris có thể sản sinh H2O2 khi chuyển từ
mơi trƣờng kị khí sang hiếu khí. H2O2 có khả năng ức chế Staphylococus aureus
một loại tụ cầu vàng gây nhiễm độc thức ăn [2, 8]. Hoạt tính ức chế của
iacetyl tăng lên trong môi trƣờng acid, ức chế mạnh hơn đối với VK gram âm
và nấm mốc, đặc biệt với M. turberculosis (VK gây bệnh lao).
4


 Kháng khuẩn do sinh bacteriocin:
Bacteriocin đƣợc sinh ra bởi nhóm VK Bacillus và VK lactic là các phân
tử protein có khả năng ức chế các VK có quan hệ chủng loại gần với chủng VK
sinh bacteriocin đó. Những nghiên cứu gần đây cho thấy một số bacteriocin có
phổ kháng khuẩn rộng, có khả năng ức chế cả VK gram dƣơng và gram âm. Cơ
chế tác động của bacteriocin có thể tóm tắt nhƣ sau: Bacteriocin đƣợc hút bám
trên màng tế bào VSV nhạy cảm với nó, làm giảm thế năng của màng, gây
những thƣơng tổn không thể khắc phục đƣợc. Sau đó, chúng dễ dàng xâm nhập
vào tế bào, làm thay đổi pH nội bào, dẫn đến phá vỡ hoặc làm suy giảm động
lực proton, đồng thời gây ra sự thốt các acid amin tích tụ và các thành phần
nội chất khác của tế bào ra ngồi mơi trƣờng qua các lỗ thủng trên màng. Cuối
cùng, tế bào chết do mất năng lƣợng [3, 14, 23, 26].
Zymocin là một loại kháng sinh do một số chủng nấm men tiết ra nhằm

chống lại sự cạnh tranh giữa các chủng cùng lồi hoặc chủng thuộc họ gần.
Chúng có bản chất là polipeptit hay glucoprotein.

o tính chọn lọc cao nên

zymocin cịn có tiềm năng chống lại một số bệnh nan y. Theo Nguyễn Kim
Minh Tâm (2001), Saccharomyces boulardii có khả năng tiết ra protease tiêu
giải độc tố của Clostridium difficili (gây viêm ruột kết màng giả), trung hòa nội
độc tố của E. coli, Vibrio cholerae nên đƣợc dùng trị tiêu chảy cấp tính cho
ngƣời. Cân bằng hệ vi khuẩn trong đƣờng ruột: đã có nhiều bằng chứng cho
thấy khả năng phục hồi và duy trì sự cân bằng hệ VSV đƣờng ruột nhờ chế
phẩm probiotic có VK lactic hoặc có nấm men. Khi cho bệnh nhân bị chứng rối
loạn dạ dày hay đƣờng ruột sử dụng L. acidophilus, B. biyridum và B. breve sẽ
làm gia tăng số lƣợng của Lactobacillus và giảm số lƣợng của E. coli trong
ruột. ệnh nhân sử dụng thuốc trị bệnh bạch cầu sẽ làm chết một số VSV có lợi
trong đƣờng ruột nên ngƣời ta thƣờng dùng chế phẩm có Bifidobacterium sp.
và L. acidophilus để phục hồi hệ VK đƣờng ruột cho những bệnh nhân này.
 Tăng cƣờng hoạt động chuyển hóa của vi khuẩn đƣờng ruột
Một số chủng vi sinh vật probiotic khi đƣợc bổ sung vào đƣờng tiêu hóa
có vai trị tăng cƣờng hoạt động chuyển hóa của một số chủng vi khuẩn đƣờng
5


ruột khác.Chẳng hạn nhƣ khi sử dụng Bacillus và L. rhamnosus dƣới dạng sữa
lên men, các vi sinh vật này sẽ kích thích hoạt động enzym và khả năng biến
dƣỡng của vi khuẩn đƣờng ruột [19].
1.2. Tổng quan về vi khuẩn Bacillus
1.2.1. Đặc điểm sinh học của Bacillus
Đặc điểm phân loại: Theo khóa phân loại của

ergey, chi Bacillus là

một chi lớn và đa dạng, đƣợc phân loại nhƣ sau:
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Bacillaceae
Chi: Bacillus

Hình 1.1. Hình thái tế bào Bacillus subtilis
( />VK Bacillus đƣợc Ehrenberg mô tả lần đầu tiên năm 1835 là “Virbrio
subtilis”. Năm 1872, Cohn đặt tên lại là B. subtilis. Họ Bacillaceae đƣợc chia làm
5

chi

gồm:

Bacillus,

Sporolactobacillus,

Clostridium,

Sporosarcina,

Desulfortomaculum, đặc trƣng của họ này là hình thành nội bào tử [16,32]
6

 Đặc điểm hình thái: Tế bào Bacillus hình que, thẳng hoặc gần thẳng,
kích thƣớc 0,3-2,2 x 1,2-7 µm. Các tế bào thƣờng xếp thành cặp hay chuỗi, đầu
tròn hoặc hơi vng. à VK gram dƣơng, hầu hết có catalase dƣơng tính. Chúng
thƣờng di động nhờ roi. Một tế bào chỉ có thể hình thành duy nhất một nội bào
tử, nội bào tử có hình oval hoặc hình trụ. ào tử có khả năng chịu nhiệt, acid, sự
hình thành nội bào tử không bị ngăn cản bởi sự tiếp xúc khơng khí. Các lồi
thuộc chi Bacillus đặc trƣng cho trực khuẩn sinh bào tử mà vẫn giữ nguyên hình
que khi mang bào tử, trong một số trƣờng hợp chỉ hơi phình to lên một chút [10].
Tùy theo lồi, bào tử có thể nằm giữa, gần cuối, hoặc ở cuối [10,16].
 Đặc điểm phân bố: Nhờ khả năng sinh bào tử nên Bacillus có thể tồn
tại trong thời gian rất dài dƣới các điều kiện khác nhau. Chúng rất phổ biến
trong tự nhiên nên có thể phân lập từ nhiều nguồn khác nhau nhƣ đất, nƣớc,
khơng khí, phân, trầm tích biển, thức ăn, sữa, lớp mùn,...chủ yếu là đất nơi mà
đóng vai trò quan trọng trong chu kỳ carbon và nito [1,16].
1.2.2. Dinh dưỡng và tăng trưởng
Hầu hết các loài thuộc chi Bacillus là những sinh vật hóa dị dƣỡng, thu
năng lƣợng nhờ sự oxi hóa các hợp chất hữu cơ nhƣ đƣờng, amino acid, acid
hữu cơ,... Một số VK tự dƣỡng khơng bắt buộc (B. schlegelli) có khả năng phát
triển trong mơi trƣờng chỉ có CO2. Một số lồi Bacillus (B. subtilis) có khả
năng sử dụng các chất vơ cơ, trong khi một số loài khác nhƣ B. sphaericus, B.
cereus cần các hợp chất hữu cơ (vitamin, acid amin) cho sự sinh trƣởng. Đặc
biệt Bacillus gây bệnh cho côn trùng nhƣ B. thuringiensis, B. popllae, B.
lentimorbus, B. cereus, B. anthracis (trong đó B. cereus, B. anthracis gây bệnh
trên ngƣời) có nhu cầu dinh dƣỡng phức tạp, chúng không phát triển đƣợc trong
môi trƣờng VK thông thƣờng nhƣ NA, NB [1, 28,16].
Phần lớn các loài thuộc chi Bacillus là V K hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện,
nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu từ 30-450C, một số VK chịu nhiệt với nhiệt độ sinh
trƣởng tối ƣu lên tới 650C, hoặc ƣa lạnh (50C -250C). Các loài VK thuộc chi
Bacillus sinh trƣởng trong khoảng pH rộng từ 2-11. Trong phịng thí nghiệm,

7


dƣới điều kiện sinh trƣởng tối ƣu, Bacillus có thời gian thế hệ là 25 phút. Nhờ
có phổ chịu đựng pH, nhiệt độ và muối rộng nên Bacillus có thể tồn tại ở điều
kiện bất lợi trong thời gian dài [1, 25]
1.2.3. Một số loài Bacillus phổ biến trong tự nhiên
 B. subtilis (trực khuẩn cỏ khô) đƣợc phát hiện đầu tiên trong phân ngựa
(1941) bởi tổ chức y học Nazi của Đức [13]. úc đầu, loài này đƣợc sử dụng để
phòng bệnh lỵ cho các chiến sĩ Đức chiến đấu ở ắc Phi. Chúng có khuẩn lạc
khơ, khơng màu hoặc có màu xám nhạt, trắng, hơi nhăn hay tạo ra các lớp
màng mịn, lan trên bề mặt thạch. Khuẩn lạc có m p nhăn bám vào mơi trƣờng
thạch. Trực khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, tế bào đứng riêng rẽ hoặc chuỗi. Nhiệt
độ tối ƣu cho sinh trƣởng là 36-500C, tối đa là 600C. ào tử chịu đƣợc nhiệt độ
khá cao, có hình bầu dục, phân bố lệch tâm. Nhờ khả năng sinh một số enzyme
ngoại bào (amylase, cellulase, protease,…) và sinh tổng hợp đƣợc nhiều loại
kháng sinh nhƣ subtilin, subtilosin

, sublancin,…mà B. subtilis đƣợc ứng

dụng rất rộng rãi trong chăn ni, y học, thực phẩm,…[10]
 B. amyloliquefaciens có hình thái khuẩn lạc và tế bào tƣơng tự B.
subtilis. Nhƣng khác nhau về đặc tính sinh hóa, có khả năng lên men đƣờng
lactose nhanh và lên men glucose chậm, thành phần G+C của B. subtilis khoảng
41,5%-43,5% còn trong chủng B. amyloliquefaciens là 43,5-44,9%. Chúng
phân bố phổ biến trong đất, nƣớc.

o có khả năng sinh tổng hợp mạnh các

enzyme nhƣ amylase, protease [22], lipase [32], phytase, xenlulase và xylanase

[58] nên đƣợc ứng dụng nhiều trong công nghiệp sản xuất enzyme, công nghiệp
thuộc da [38]. Ngồi ra, B. amyloliquefaciens cịn đƣợc ứng dụng trong các lĩnh
vực khác nhƣ nông nghiệp, y học bởi khả năng sinh các chất chuyển hóa nhƣ
vitamin, nucleoside purine (inosine, guanosine) [23, 28], chất kháng khuẩn
(bacteriocin), chất kháng nấm (bacimin), hoocmon tăng trƣởng thực vật I
[22, 25, 20, 24]. Đặc biệt, nhiều nghiên cứu cho thấy các chế phẩm probiotic từ
Bacillus amyloliquefaciens đã góp phần cải thiện chất lƣợng môi trƣờng nƣớc,
tăng cƣờng các phản ứng miễn dịch, kiểm soát sự phát triển quá mức của VSV
8


gây bệnh cho tôm, cá,…
 B. licheniformis là VK hoại sinh, bào tử hình oval, phát tán chủ yếu
trong đất, kể cả đất ngh o dinh dƣỡng nhƣ đất hoang hay sa mạc. Khuẩn lạc
nhỏ, màu trắng đục, bề mặt nhăn nheo. Tế bào chuyển động nhờ tiêm mao và
loài này kị khí khơng bắt buộc.
 B. pumilus phát tán rộng khắp nơi, thƣờng có mặt trong đất nhiều hơn
B. subtilis. Khuẩn lạc nhỏ, xung quanh viền mờ không ranh giới. Tế bào của nó
gần giống tế bào B. subtilis.
 B. megaterium có khuẩn lạc hình trịn đều, khơng có thùy, khơng có nếp,
m p trịn hoặc hơi lƣợn sóng, màu trắng kem, trông giống nhƣ giọt bạch lạp
(nến trắng), thƣờng có vịng hoặc các vịng đồng tâm trên mặt. Tế bào dài, đứng
riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi. Bào tử hình elip, nằm lệch tâm. B. megaterium
đƣợc sử dụng trong sản xuất penicillin nhờ khả năng tổng hợp penicillin
amidase.

ên cạnh đó, chúng cịn có thể sản sinh các enzyme phân hủy sinh

học, sản sinh vitamin 12, oxetanocin, cytochromes P450 và một số acid amin
khác [26].

 B. polymyxa có khuẩn lạc không màu, phẳng, lồi, trơn, lan dần ra xung
quanh, m p đơi khi có thùy. Tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành đơi, chuỗi
ngắn.

ào tử hình bầu dục k o dài.

oại VK này làm giảm pectin và

polysaccarit trong cây. Ngồi ra, chúng cịn có khả năng cố định đạm. Đây là
một VK rất phổ biến trong đất.
 B. cereus có khuẩn lạc phẳng, khá khuếch tán, hơi l m, trắng đục. Tế
bào đứng riêng rẽ hay xếp thành chuỗi. Bào tử có hình bầu dục, nằm lệch tâm, tế
bào chất có chứa các hạt và khơng bào nhỏ. Chúng thƣờng phát tán khắp nơi,
sinh sôi, nảy nở trên thực phẩm và có thể sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm.
1.3 Lợi ích của tỏi lên men
Tỏi đen đƣợc sử dụng rộng rãi với vai trò là thực phẩm chức năng giúp tăng
cƣờng sức khỏe [27]. Ngoài ra tỏi đen cịn đƣợc chứng minh có nhiều tác dụng có lợi
đối với sức khỏe con ngƣời, nhƣ: phục hồi các tổn thƣởng ở gan do uống rƣợu [22],
giảm b o phì và tăng mỡ máu [27], ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh [4].
9


Tuy nhiên, nhƣợc điểm của tỏi là mùi khó chịu do các hợp chất sun- fua gây ra. Để
khắc phục nhƣợc điểm này, các nhà khoa học Nhật ản, Hàn Quốc đã nghiên cứu lên
men tự nhiên tỏi tƣơi để tạo ra tỏi đen. Kết quả lên tỏi đen thành cơng lớn, vừa khắc
phục đƣợc mùi khó chịu của tỏi, vừa làm tăng tác dụng chống oxy hóa của tỏi đen lên
rất nhiều lần so với tỏi tƣơi, khiến cho tỏi đen có tác dụng nhƣ vị thuốc đặc trị chống
oxy hóa, chống lão hóa, phịng chống bệnh ung thƣ, các bệnh nan y [8].

 Nạp chất chống oxy hóa

Chất chống oxy hóa là các hợp chất có thể có tác dụng mạnh mẽ đối với
sức khỏe. Chúng hoạt động bằng cách trung hịa các gốc tự do có hại để ngăn
chặn stress oxy hóa và làm hỏng các tế bào. Không chỉ vậy, nhƣng nghiên cứu
cho thấy các chất chống oxy hóa có thể làm giảm nguy cơ phát triển một số loại
bệnh mãn tính, bao gồm bệnh tim mạch vành, ung thƣ và tiểu đƣờng.
Tỏi đƣợc đóng gói với các chất chống oxy hóa chống lại bệnh tật , tuy
nhiên một số nghiên cứu cho thấy tỏi đen có thể chứa nhiều hơn. Theo một
nghiên cứu ở Hàn Quốc, cho ph p tỏi già đi trong khoảng thời gian 35 ngày để
hình thành tỏi đen gây ra sự gia tăng đáng kể hàm lƣợng chất chống oxy hóa, đạt
mức độ chống oxy hóa cao nhất vào ngày 21 của lão hóa.
 Giúp chống ung thƣ tăng trƣởng
Các chất chống oxy hóa có trong tỏi đen có thể có một số tác dụng có lợi
cho sức khỏe, đặc biệt là khi ngăn ngừa sự phát triển của các bệnh mãn tính nhƣ
ung thƣ. Những chất chống oxy hóa này giúp ngăn chặn sự tích tụ của các gốc tự
do để ức chế sự phát triển và lan rộng của các tế bào ung thƣ trong cơ thể.
Một nghiên cứu in vitro năm 2014 cho thấy chiết xuất tỏi đen lâu năm có
thể tiêu diệt hiệu quả và làm giảm sự phát triển của các tế bào ung thƣ ruột kết.
Tƣơng tự, một nghiên cứu in vitro khác đƣợc công bố trên tạp chí Thực hành
dinh dƣỡng và nghiên cứu báo cáo rằng chiết xuất tỏi đen lâu năm cũng làm
giảm sự phát triển và lan rộng của các tế bào ung thƣ bạch cầu. Mặc dù nghiên
cứu ở ngƣời còn hạn chế, các nghiên cứu trên động vật và ống nghiệm khác cho
thấy tỏi đen cũng có thể có tác dụng chữa bệnh ung thƣ phổi và ung thƣ dạ dày.

10


Điều này sẽ khơng gây ngạc nhiên vì tỏi và các loại thảo mộc khác là một
trong những thực phẩm chống ung thƣ hàng đầu xung quanh.
 Tăng cƣờng sức khỏe tim mạch
Một trong những lợi ích tỏi nổi tiếng nhất là khả năng bảo vệ và cải thiện

sức khỏe của trái tim. Tỏi đen cũng có thể giúp tăng cƣờng sức khỏe của tim,
với một số nghiên cứu thậm chí cho thấy rằng nó có thể hiệu quả nhƣ tỏi sống.
Một mơ hình động vật năm 2018 đã so sánh tác động của tỏi đen và tỏi
sống đối với sự phục hồi sức khỏe của tim sau tổn thƣơng do thiếu máu cục bộ
hoặc thiếu máu cung cấp cho cơ tim. Điều thú vị là các nhà nghiên cứu phát hiện
ra rằng cả tỏi sống và tỏi đen đều có tác dụng bảo vệ tim mạch và có hiệu quả
nhƣ nhau trong việc giảm thiểu thiệt hại cho tim. Một mơ hình động vật khác
đƣợc thực hiện tại Đại học

ankook, Hàn Quốc cũng cho thấy tỏi đen có khả

năng làm giảm mức cholesterol và chất b o trung tính cao để giảm nguy cơ mắc
bệnh tim.
 ảo tồn chức năng nhận thức
Giống nhƣ tỏi thơng thƣờng, tỏi đen có thể có tác dụng mạnh mẽ đối với
sức khỏe của não. ởi vì nó giàu chất chống oxy hóa, nó có thể làm giảm viêm
và có thể giúp ngăn ngừa các điều kiện nhận thức nhƣ chứng mất trí, bệnh
Alzheimer và bệnh Parkinson.
Một mơ hình động vật gần đây đƣợc công bố trên Nutrients cho thấy chiết
xuất tỏi lâu năm giúp cải thiện trí nhớ ở những con chuột bị suy giảm nhận thức,
cộng với việc giúp giảm viêm trong não. Một nghiên cứu khác trên động vật ở
Indonesia cũng cho thấy tỏi đen bảo vệ chống lại stress oxy hóa và ngăn ngừa
suy giảm trí nhớ sau khi dùng monosodium glutamate, trên chuột.
 Ổn định lượng đường trong máu
uy trì lƣợng đƣờng trong máu cao có thể đi k m với một loạt các tác
động tiêu cực đến sức khỏe. Trong ngắn hạn, nó có thể gây ra các triệu chứng
tiểu đƣờng nhƣ đi tiểu thƣờng xuyên và mệt mỏi. Về lâu dài, nó thậm chí có thể
gây rối loạn chức năng thận, nhiễm trùng da và nguy cơ mắc bệnh tim cao hơn.
11

Thêm tỏi đen vào chế độ ăn uống lành mạnh và cân bằng là cách đơn giản
để giúp duy trì lƣợng đƣờng trong máu bình thƣờng. Mơ hình động vật của Đại
học

ankook ở Hàn Quốc đã đề cập ở trên cho thấy rằng chiết xuất tỏi đen

khơng chỉ có hiệu quả trong việc làm giảm mức cholesterol trong máu và chất
b o trung tính ở chuột đƣợc cho ăn chế độ ăn nhiều chất b o, mà cịn có thể làm
giảm lƣợng đƣờng trong máu. Trong khi đó, một nghiên cứu trên động vật đƣợc
công bố trên Research and Practice đã báo cáo rằng hàm lƣợng chất chống oxy
hóa cao trong tỏi đen cũng có thể hữu ích trong việc ngăn ngừa các biến chứng
tiểu đƣờng.
 Tăng khả năng miễn dịch
Hệ thống miễn dịch của bạn đóng một vai trị quan trọng trong sức khỏe
tổng thể của bạn. Nó tránh đƣợc bệnh tật và nhiễm trùng và thậm chí có thể giúp
ngăn ngừa các bệnh mãn tính. Các chất chống oxy hóa có trong tỏi đen tăng
cƣờng khả năng miễn dịch bằng cách chống lại các gốc tự do, giảm viêm và
ngăn ngừa tổn thƣơng oxy hóa cho các tế bào của bạn.
Một nghiên cứu in vitro năm 2012 đã đánh giá sự khác biệt giữa tỏi đen
và tỏi sống và tác dụng của chúng đối với chức năng miễn dịch. Tỏi đen khơng
chỉ thể hiện các đặc tính chống ung thƣ và chống oxy hóa mạnh nhất mà cịn có
tác dụng mạnh mẽ hơn trong việc kích thích miễn dịch. Những lợi ích tăng
cƣờng miễn dịch này có thể có tác dụng sâu rộng trên một số khía cạnh của sức
khỏe và có thể hỗ trợ điều trị mọi thứ, từ dị ứng đến rối loạn tự miễn và nhiễm
trùng cấp tính.
1.4. Cơ sở lựa chọn chủng Bacillus trong sản xuất chếphẩmprobiotic
Ngồi đặc điểm dễ ni cấy, tốc độ phát triển nhanh, phân bố rộng rãi
trong tự nhiên, Bacillus cịn có nhiều đặc tính phù hợp để tạo chế phẩm sinh
học nhƣ:

 Nghiên cứu về khả năng sinh bào tử của bacillus: Đặc điểm quan
trọng của Bacillus là khả năng sinh bào tử.

ào tử đƣợc mô tả đầu tiên bởi

Cohn (1872) khi nghiên cứu về B. subtilis và sau đó đƣợc Koch (1875) mơ tả
12


khi nghiên cứu về B. anthracis. Một số loài Bacillus thƣờng có khả năng hình
thành bào tử trong chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi gặp điều kiện bất lợi
nhƣ: nhiệt độ cao, môi trƣờng ngh o dinh dƣỡng, pH khơng thích hợp, mơi
trƣờng tích lũy nhiều sản phẩm trao đổi chất bất lợi,…Khi gặp điều kiện thuận
lợi, bào tử sẽ nảy mầm và phát triển thành một tế bào mới có sức sống mạnh mẽ
hơn. Vì vậy, nội bào tử đƣợc sinh ra không phải để sinh sôi nảy nở mà là cơ chế
đảm bảo cho sự sống còn của VK khi trải qua các điều kiện khắc nghiệt [25]. Ở
phần lớn VK, trong một, tế bào chỉ có 1 bào tử và sau khi trƣởng thành bào tử
đƣợc phóng thích ra khỏi tế bào. Ở bào tử trƣởng thành khơng diễn ra q trình
trao đổi chất (đƣợc xem nhƣ trạng thái tiềm sinh).

ào tử Bacillus phát triển

theo chu kì, trong trạng thái tiềm ẩn, chúng có thể tồn tại trong thời gian rất dài,
đến hàng tỷ năm. Ví dụ, bào tử của B. subtilis có thể duy trì khả năng sống đến
200-300 năm [19]. Bên cạnh đó, bào tử Bacillus cịn có tính ổn định cao với
nhiệt độ và sự khô hạn. Cụ thể ở nhiệt độ 1000C bào tử B. cereus có khả năng
chịu đƣợc 2 phút, B. subtilis chịu đƣợc 180 phút, B. mesentericus chịu đƣợc
380 phút [15]. Bên cạnh đó, khả năng đề kháng với tia phóng xạ của bào tử B.
mesentericus gấp 36 lần so với tế bào dinh dƣỡng của E. coli, bào tử và tinh thể
của B. thuringensis có độc tố ức chế nhiều loại côn trùng và bệnh than [11]. Các

nhà VSV nhanh chóng nhận ra tầm quan trọng của bào tử nhƣ là đặc điểm phân
loại nổi bật, là cách xác định đơn giản họ Bacillaceae. Có thể nói, đây là đặc
điểm rất quan trọng và có liên quan đến việc sản xuất các chế phẩm sinh học
probiotic [23].
 Nghiên cứu về khả năng sinh enzyme phân hủy chất hữu cơ: trong
quá trình sống Bacillus thƣờng sản sinh những chất có hoạt tính sinh học cần
thiết để thích ứng với nhiều hồn cảnh và điều kiện mơi trƣờng sống. Trong đó,
khả năng sinh các loại enzyme ngoại bào nhƣ protease, amylase, cellulase,
alkaline

phosohatase,

cyclodextran,

glucanotransferase,

galactosidase,

chitinase, glucose isomerase, glucanase, lipase, urease,...là một đặc tính nổi bật
của các lồi Bacillus. Protease hay peptide hydrolase là những enzyme thuỷ
phân liên kết peptide (-CO–NH-) trong phân tử protein và các polypeptide. Sản
13


phẩm của q trình thuỷ phân này có thể là các acid amin, các peptide, các
polypeptide chuỗi ngắn [19]. Có thể nói Bacillus là một trong số các VSV có
khả năng sinh protease nhiều nhất, đặc biệt là protease kiềm tính [10]. Amylase
là một trong những enzyme đƣợc quan tâm nghiên cứu sớm và nhiều nhất. Đặc
biệt, so với amylase lấy từ động vật và vi nấm thì amylase từ Bacillus bền hơn
trong môi trƣờng acid của dạ dày. Cellulase là enzyme xúc tác sự phân hủy

cellulose thành sản phẩm trung gian là cellubiose và sản phẩm cuối cùng là
đƣờng glucose. Trong tự nhiên có nhiều nhóm VSV có khả năng phân hủy
cellulose, trong đó vi nấm là nhóm có khả năng phân giải mạnh. Nhiều lồi VK
cũng có khả năng này nhƣng số lƣợng và thành phần các loại enzyme không
đầy đủ, chủ yếu chỉ sinh endoglucanase [23]. Tuy nhiên, Bacillus vẫn là vi sinh
vật là loài sinh cellulase với hoạt độ cao hơn cả, các chủng Bacillus chủ yếu
đƣợc phân lập từ đất vƣờn, nơi có nguồn xác bã hữu cơ (rơm, rạ, mụn dừa,..)
dồi dào. Ví dụ nhƣ, cellulase từ B. subtilis [31], B. pumilus (Christakopoulos),
B. licheniformis, B. circulans AB16 [28], B. polymyxa, B. cereus (Schallmy và
cộng sự, 2004). Tóm lại, nhờ hệ enzyme ngoại bào đa dạng, nhóm VK acillus
này có thể chuyển hóa các chất khó tiêu (cellulose, tinh bột, protein) thành chất
dễ tiêu (amin acid và glucose), góp phần cải thiện dinh dƣỡng, cải thiện nguồn
nƣớc, kích thích tiêu hóa thức ăn và giúp vật ni tăng trọng nhanh. Nhƣ vậy, có
thể nói khả năng sinh enzyme thủy phân các hợp chất hữu cơ là một đặc tính rất
cần thiết trong việc nghiên cứu sử dụng Bacillus để tạo chế phẩm probiotic
trong nuôi trồng thủy sản và xử lý ao nuôi
 Nghiên cứu về khả năng đối kháng: VSV probiotic có khả năng đối
kháng với VSV gây bệnh thông qua khả năng cạnh tranh vị trí bám dính và khả
năng sinh chất có hoạt tính kháng khuẩn cao. Cụ thể, một số chủng Bacillus
thƣờng cạnh tranh với VSV gây bệnh về nguồn thức ăn, năng lƣợng, muối
khống, mơi trƣờng sống,...để làm giảm mật độ VSV gây bệnh và dần dần đẩy
lùi đƣợc dịch bệnh. Ví dụ, chủng B. subtilis QST 713 là VK di động, ƣa khí
đƣợc Cơng ty gra Quest phát hiện và đƣợc Cục bảo vệ môi trƣờng Mỹ (EP )
đánh giá là có hiệu quả đáng kể trong việc phịng chống đƣợc nhiều bệnh do
VK và nấm gây ra. Nhiều dòng B. subtilis đƣợc xác định là có khả năng chế ngự
mầm bào tử của nấm bệnh bằng cách cạnh tranh dinh dƣỡng và muối
14


khống,…[1]. Cịn khả năng sinh kháng sinh của Bacillus đã đƣợc các nhà

khoa học nghiên cứu từ rất lâu. Năm 1907, Nicolle là ngƣời đầu tiên phát hiện
ra hoạt tính kháng khuẩn của B. subtilis. Đến năm 1974,

ahab và Goorani đã

báo cáo có ít nhất 5 loại kháng sinh đƣợc chiết tách từ B. subtilis nhƣ: subtilin,
bacitracin, bacillin, subtenolin và bacilomycin. Ngồi ra, cịn rất nhiều lồi
Bacillus khác có khả năng tổng hợp kháng sinh nhƣ: B. amyloliquefaciens sinh
subtilisin, B. brevis sinh gramicidin, tyrothricin, B. Pumilus sinh pumilin, B.
polymixa sinh colistin, polimycin,... [21]. Đặc biệt, các chất này thƣờng không
đƣợc dùng trong y tế nên không xảy ra hiện tƣợng nhờn thuốc đối với VSV gây
bệnh, riêng bacitracin là chất kháng sinh đƣợc bổ sung vào thức ăn chăn nuôi
để ức chế VK gây bệnh đƣờng ruột và kích thích tiêu hóa cũng nhƣ tăng trọng
của vật ni [20].
 Nghiên cứu khả năng sinh trưởng trong điều kiện bất lợi của môi
trường như nồng độ muối cao, chịu acid, chịu kiềm: Nhiều lồi Bacillus có
khả năng phát triển tốt trong mơi trƣờng có nồng độ muối khá cao nhƣ B.
subtilis, B. licheniformis. Chúng thƣờng tồn tại ở môi trƣờng nƣớc lợ, nƣớc mặn,
trong đƣờng ruột của tôm và đƣợc coi là VK có lợi cho tơm [19]. B.
racemilacticus và B. coagulans có thể chịu đựng đƣợc nồng độ muối mật trên
0,3% [25]; một vài chủng khác nhƣ B. pasteurii, B. seohaeanensis, B.
pantothenticus,…có thể sinh trƣởng ở nồng độ NaCl 10% [11]. Đặc biệt, nhờ khả
năng sinh bào tử mà rất nhiều lồi Bacillus có khả năng sinh trƣởng và sống sót
trong mơi trƣờng acid cũng nhƣ trong mơi trƣờng kiềm. Ví dụ nhƣ chủng B.
cereus NCTC 2599 có thể phát triển ở dải pH khá rộng từ 4-10 (Lindsay et al.,
2004), chủng B. laevolacticus DSM 6475 có thể phát triển đến tận mức pH 2-3
mà bình thƣờng các chủng VK khác không thể phát triển đƣợc [18], B.
coagulans, B. acidocalderius, B. polymyxa có thể sinh trƣởng trong mơi trƣờng
có độ pH khá thấp từ 4-5 [61, 63]. Còn B. alcalophilus và B. pasteurii có thể
sinh trƣởng tốt ở pH 8-11 [17]. Chính nhờ những đặc tính ƣu việt nêu trên cùng

với khả năng dễ bảo quản ở điều kiện thƣờng, Bacillus đƣợc đánh giá là một
trong những đối tƣợng giàu tiềm năng khai thác trong lĩnh vực sản xuất chế
phẩm sinh học [26].
15


CHƢƠN

2: M C TIÊU, NỘI DUN

VÀ PHƢƠN

PHÁP

N HIÊN CỨU
2.1 Mục tiêu nghiên cứu
- Phân lập đƣợc một số chủng vi khuẩn chịu nhiệt và có một số đặc điểm
sinh học của vi khuẩn probiotic từ sản phẩm tỏi trắng lên men.
- Xác định một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn đã phân lập.
2.2 Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu phân lập vi khuẩn chịu nhiệt.
- Nghiên cứu xác định một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn
đã phân lập
+ Hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào, tính chất Gram, khả năng sinh
catalase
+ Khả năng sinh enzyme ngoại bào
+ Khả năng chịu nhiệt
+ Khả năng đối kháng với một số vi sinh vật kiểm định.
- Xác định ảnh hƣởng của một số yếu tố trong môi trƣờng nuôi cấy đến
khả năng sinh trƣởng, phát triển của các chủng vi khuẩn.

+ Ảnh hƣởng của pH trong môi trƣờng nuôi cấy
+ Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy.
2.3 Vật liệu nghiên cứu
Sản phẩm tỏi đen lên men ký hiệu VHLKHVN do Phịng thí nghiệm của
ộ mơn Cơng nghệ Vi sinh – Hóa sinh cung cấp.
Các mẫu thí nghiệm đƣợc thực hiện tại Phịng thí nghiệm của

ộ mơn

cơng nghệ Vi sinh – Hóa sinh, Viện Cơng Nghệ Sinh Học âm Nghiệp, Trƣờng
Đại Học âm Nghiệp.
 Vật liệu nghiên cứu
- Thiết bị: tủ sấy, máy hấp tiệt trùng (autoclave), tủ lạnh, cân điện tử, máy lắc
(vortex), lò vi sóng, kính hiển vi, đ n cực tím,…
- ụng cụ: đĩa petri, ống nghiệm, giá để ống nghiệm, que cấy, đ n cồn, giấy đo
16


pH, bình tam giác, micropipette, đũa khuấy thủy tinh, ống đong, que trang,…
Tất cả các dụng cụ thủy tinh dùng để nuôi cấy vi sinh vật đều đƣợc xử lý sạch,
bao gói và hấp tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút.
 Hóa chất:
ảng 2.1 Danh sách hóa chất
Hóa chất
Acid lactic
Cao nấm men
Cao thịt
Pepton
Glucose
HCl 1N

K2HPO4

Xuất xứ
Trung Quốc
Đức
Đức
Ấn Độ
Trung Quốc
Trung Quốc
Trung Quốc

Hóa chất
MgSO4.H2O
MnSO4.4H2O
NaCl
NaOH
Natri acetat
Thạch
Xanh methylen

Xuất xứ
Trung Quốc
Trung Quốc
Trung Quốc
Trung Quốc
Trung Quốc
Việt Nam
Trung Quốc

2.4 Môi trƣờng nghiên cứu

ảng 2.2 Môi trƣờng Luria ertani (LB) cho phân lập, nuôi cấy vi khuẩn
Thành phần
Pepton
Cao nấm men
NaCl

Khối lƣợng (g/l)
10
5
10
pH = 7 ± 0,2

Môi trƣờng xác định hoạt tính enzyme ngoại bào của vi sinh vật

ảng 0.3 Mơi trƣờng xác định hoạt tính enzyme
Mơi trƣờng định tính enzyme

Thành phần, hàm lƣợng

Amylase

2% gar + 1% Tinh bột

Cellulase

2% Agar + 1% CMC

Protease

2% Agar + 1% Casein

pH = 7 ± 0,2

Ghi chú: Các môi trƣờng nuôi cấy đƣợc hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút.
17


2.5 Các phƣơng pháp nghiên cứu
Các phƣơng pháp nghiên cứu khóa luận đƣợc thực hiện tuần tự theo sơ đồ sau:
Mẫu tỏi đen lên men

Nghiền mẫu, pha lỏng nuôi gia nhiệt
Phân lập trên môi trƣờng LB agar

Xác định đặc điểm hình thái khuẩn lạc,
hình dạng tế bào của các chủng VK

Xác định một số đặc điểm sinh lý, sinh
hóa của VK

Phƣơng

Khả

Xác định

Xác định

Xác định

Xác

pháp

năng

khả năng

khả năng

khả năng

hƣởng của một số

nhuộm

sinh

sinh

chịu

kháng

yếu tố đến sinh

Gram

Catalase

enzyme

nhiệt

VSV

trƣởng

kiểm định

ngoại bào

định

và

ảnh

phát

triển của vi khuẩn

Hình 2.1 Sơ đồ hóa q trình nghiên cứu
2.5.1 Phân lập các chủng Bacillus có khả năng chịu nhiệt
 Phân lập
Nguyên tắc
Tách rời các tế bào vi sinh vật, nuôi cấy các tế bào trên môi trƣờng đặc
trƣng cho khuẩn lạc riêng rẽ, tách biệt nhau [21].
18

Cách tiến hành
Pha loãng mẫu: Cân (5g) tỏi nghiền nát cho khoảng 50ml nƣớc cất đã khử
trùng. Mẫu dịch tỏi đƣợc đặt ở nhiệt độ 800C trong 30 phút. Hút 1ml dịch từ mẫu
tỏi pha loãng theo thang bậc 10, từ nồng độ 10-1-10-6
Cấy phân lập: Hút 50 µl mẫu đã đƣợc pha loãng tƣơng ứng với các nồng
độ pha lỗng từ 10-3 đến 10-6 lên mơi trƣờng

đặc.

Dùng que cấy trang vô trùng trang đều dịch lên bề mặt thạch. Các đĩa sau đó
đƣợc ủ ở 370C. Sau 2 ngày quan sát sự hình thành khuẩn lạc của vi khuẩn.
Tinh sạch khuẩn lạc:
Dùng que cấy vô trùng lấy 1 khuẩn lạc cấy sang môi trƣờng LB khác, cấy
theo đƣờng zichzac nhằm tạo cho các khuẩn lạc mọc tách rời nhau, ủ trong tủ
ấm ở 370C /48 giờ…
Kiểm tra các đĩa cấy sau 48 giờ, quan sát sự xuất hiện của các vịng khuẩn lạc
Sau 48 giờ, dùng que cấy vơ trùng lấy khuẩn lạc mọc riêng rẽ cấy chuyển
sang ống thạch nghiêng chứa môi trƣờng LB agar, ủ trong tủ ấm ở 370C /48 giờ,
sau đó chuyển sang bảo quản 40C.
2.5.2 Phương pháp nhuộm Gram
• Nguyên tắc:
Dựa trên sự nhau về cấu trúc khác của vách tế bào nên trong quá trình
nhuộm Gram, vi khuẩn Gram dƣơng sẽ giữ đƣợc phức hợp tím gentians-iod
khơng bị tẩy màu bởi ancol, trong khi vi khuẩn Gram âm không giữ đƣợc phức
hợp này. Do vậy, kết quả sau khi nhuộm là vi khuẩn Gram dƣơng vẫn giữ đƣợc
màu tím của crystal violet, cịn vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng của Safranine.
Cách tiến hành:
Làm vết bôi vi khuẩn phẩm trên 1 lamen sạch. Để khơ tự nhiên và cố định
bằng cách hơ nóng qua ngọn lửa đ n cồn. Nhỏ vài giọt crystal violet (tím kết
tinh) cho phủ lên bề mặt vết nhuộm và để yên trong vòng 1 phút. Rửa nhanh

bằng nƣớc. Nhỏ vài giọt Lugol cho phủ đều lên trên bề mặt vết nhuộm và để yên
trong vòng 1 phút. Rửa nhanh bằng nƣớc. Tẩy màu bằng cách nghiêng lamen và
nhỏ từ từ ancol (cồn) lên vết nhuộm, khi giọt ancol rời khỏi lamen khơng có màu
19