Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số dòng song mật thu thập từ các tỉnh phía bắc sử dụng kỹ thuật RAPD

ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nên tài nguyên thực vật rất
dồi dào, với diện tích rừng của Việt Nam chúng ta thấy được sự đa dạng các
loài trong hệ sinh thái thực vật là vô cùng phong phú. Với mục tiêu trồng rừng
phát triển kinh tế, tạo nguồn nguyên liệu cho các ngành công nghiệp cũng như
các làng nghề thì sản phNm từ rừng của chúng ta phải ngày càng được nâng
cao cả về chất lượng và sản lượng.
Song mật (Calamus platyacanthus Warb. Ex Becc) là một trong những
lồi lâm sản ngồi gỗ có giá trị kinh tế cao. Song mật có đường kính lớn, dài,
bền, dẻo, dễ uốn và chịu lực tốt nên đây là nguyên liệu sử dụng trong các làng
nghề mây tre đan trên cả nước.
Với sự quan tâm đầu tư của nhà nước cho các cơ sở sản xuất tiểu thủ
cơng nghiệp thì số lượng sản phNm từ các làng nghề mây tre đan ngày càng
tăng nhưng tỷ lệ nghịch với sự gia tăng này chính là sự giảm sút nghiêm trọng
của nguyên liệu đầu vào. Theo thống kê, khoảng 35 – 42% các cơ sở mây tre
đan đang phải sản xuất cầm chừng và có nguy cơ đóng cửa vì thiếu và khơng
chủ động được ngun liệu. Việc thiết lập những vùng nguyên liệu chuyên
canh tập trung Song mật là một nhu cầu bức bách đối với nước ta hiện nay.
Trên cả nước đã có nhiều tỉnh triển khai việc nhân giống Song mật
nhưng công tác nhân giống chỉ mang tính gây trồng và bằng hình thức gieo
ươm hạt tạo cây con rồi đưa vào trồng rừng sản xuất nhưng với song mây
trong giai đoạn phát triển của chúng luôn phải trải qua giai đoạn cỏ. Đây là
giai đoạn mà cây con tạo nhiều chồi, thời gian để các chồi phát triển là rất lâu,
điều này kéo theo sự chậm phát triển của cây trồng. Để khắc phục giai đoạn
cỏ này hiện nay chỉ có thể bằng các phương pháp nuôi cấy invitro.
Giải quyết vấn đề thiếu nguồn nguyên liệu và suy giảm nhanh chóng
nguồn tài nguyên thực vật này ngày 12 tháng 5 năm 2008 Bộ trưởng Bộ Nông
nghiệp và Phát triển nông thôn đã ra quyết định số 1462/QĐ/BNN-KHCN về
việc: “Nghiên cứu tạo cây con Song mật bằng kỹ thuật nuôi cấy invitro”
1

phục vụ công tác bảo tồn nguồn gen và nhân giống Song mật đưa nhanh vào
trồng rừng sản xuất.
Nhận thức được tầm quan trọng của nguồn nguyên liệu đưa vào nhân
giống sản xuất. Để có nguồn nguyên liệu tốt cho cơng tác nhân giống thì việc
đánh giá, kiểm tra chất lượng nguồn giống là vô cùng quan trọng. Một trong
những phương pháp đem lại hiệu quả, độ chính xác cao, rút ngắn được thời
gian và công sức là dùng các chỉ thị phân tử để nghiên cứu sự đa dạng di
truyền bởi nó cho chúng ta biết về thành phần gen giữa các cá thể trong cùng
1 loài và giữa các loài khác nhau. Đến nay các nghiên cứu về tính đa hình
cũng như tính đa dạng di truyền của Song mật để phục vụ công tác chọn
giống ở Việt Nam vẫn cịn bỏ ngỏ.
Vì vậy, tơi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của
một số dịng Song mật thu thập từ các tỉnh phía Bắc sử dụng kỹ thuật
RAPD.”
Đề tài đặt mục tiêu là đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các mẫu
nghiên cứu từ đó làm cơ sở cho việc xác định xuất xứ, giúp các nhà chọn
giống có kết luận chính xác về tính di truyền của các tính trạng mang phNm
chất tốt của đối tượng. Phục vụ cho công tác tuyển chọn và nhân giống các
dịng Song mật có thời gian nuôi trồng ngắn, phNm chất tốt, sản lượng cao đáp
ứng nhu cầu sản xuất và chất lượng sản phNm đầu ra.

2


Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU
1.1. Vấn đề chung về sinh học phân tử trong phân tích đa dạng di truyền
Sự ra đời và phát triển của sinh học hiện đại đã cung cấp những cơng
cụ thích hợp cho phân tích, nghiên cứu di truyền một cách nhanh chóng và

hiệu quả. Đánh dấu bằng sự ra đời của các kỹ thuật sinh học phân tử, nhờ đó
mà sự biến đổi di truyền được nghiên cứu trực tiếp ở cấp độ ADN và có thể
phát hiện ra lượng lớn tính đa hình tạo ra do đột biến. Vì vậy, làm cho kết quả
của việc sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử phong phú, chính xác hơn so với
chỉ thị hình thái.
Một số kỹ thuật ADN hiện đang được sử dụng phổ biến là đa hình độ
dài các đoạn cắt hạn chế (Restriction Fragment Length Polymorphism –
RFLP) và các kỹ thuật dựa vào chuỗi phản ứng Polymerase Chain Reaction
(PCR) như: đa hình các đoạn ADN nhân ngẫu nhiên (Random Amplified
Polymorphism ADN – RAPD); Microsatellite hay cịn gọi là đa hình các đoạn
lặp lại đơn giản (Simple Sequence Repeat – SSR); Đa hình độ dài các đoạn
nhân chọn lọc (Amplified Fragment Length Polymorphism – AFLP); . . .
Tuy nhiên, khơng có kỹ thuật sinh học phân tử lý tưởng nào đáp ứng
được tất cả các chỉ tiêu, mỗi loại đều có những thế mạnh và hạn chế riêng.
1.1.1. Đa hình độ dài các đoạn cắt hạn chế (Restriction Fragment Length
Polymorphism – RFLP)
Kỹ thuật RFLP (Bot Stein, et al., 1980), dùng các cADN hoặc ADN
ngẫu nhiên trong hệ gen như các mẫu dị, các mẫu dị này được đánh dấu bằng
phóng xạ hoặc enzyme tiếp hợp để phát hiện các đoạn ADN có độ dài khác
nhau được tạo ra khi sử dụng các enzyme hạn chế để cắt ADN hệ gen và phân
tách bằng phương pháp điện di trên gel [26]. Nếu trình tự nhận biết có mặt ở
một vị trí trên hệ gen của một cá thể nhưng khơng có mặt ở cá thể khác,
enzyme sẽ tạo ra các đoạn hạn chế có kích thước khác nhau ở vị trí này. Kết
quả làm phát sinh hàng ngàn đoạn ADN có kích thước khác nhau.
3


RFLP là chỉ thị đồng hợp trội, các đoạn ADN từ tất cả các nhiễm sắc
thể (NST) đồng dạng đều được phát hiện. Vì vậy, RFLP là chỉ thị rất đáng tin
cậy trong phân tích liên kết và chọn giống. RFLP có thể xác định một đặc

điểm liên kết ở trạng thái đồng hợp tử hay dị hợp tử của một cá thể, đây là
điều đặc biệt lý tưởng đối với các tính trạng lặn. RFLP được ứng dụng có hiệu
quả trong nghiên cứu biến dị di truyền, phân tích liên kết, chọn giống, lập bản
đồ phân tử.
Mặc dù có nhiều ưu điểm nhưng ứng dụng của chỉ thị RFLP lại tốn
kém về kinh tế và thời gian. Phương pháp này cần sử dụng lượng lớn ADN
nên đòi hỏi sự thành thạo về kỹ thuật và các điều kiện phòng thí ngiệm đặc
biệt.
1.1.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên cơ sở phản ứng Polymerase
Chain Reaction (PCR).
Phản ứng PCR được Mullis và cộng sự đưa ra năm 1986. Đây là phản
ứng tổng hợp ADN invitro nhờ ADN polymerase của vi khuNn với một mồi
đặc trưng như một điểm xuất phát cho sự nhân lên của ADN khuôn. Quá trình
tổng hợp diễn ra trên một máy điều chỉnh nhiệt, quy trình chạy PCR gồm 25 –
40 chu kỳ. Sản phNm ADN đặc trưng được nhân lên theo cấp số nhân với
cơng thức tính:

N = (2n – 2n). x

Trong đó:
n: số chu kỳ chạy phản ứng
2n: số phân tử có chiều dài không xác định
x: số phân tử khuôn ban đầu
N: số sợi tổng hợp được trong phản ứng.
2n: số phân tử có chiều dài bằng khoảng cách giữa 2 mồi [3].
Kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên cơ sở là các đoạn nucleotide với kỹ
thuật PCR để phát hiện các locus đơn gen hoặc đa gen trong hệ gen sinh vật,
có thể địi hỏi hoặc khơng địi hỏi khơng trình tự, có thể khác nhau về mức độ
4

tin cậy, mức độ khó khăn và sự chi phí, cũng như bản chất của sự đa hình mà
chúng phát hiện.
Kỹ thuật sinh học phân tử cho phép nghiên cứu những biến đổi trong
vật liệu di truyền của cơ thể sống ở mức ADN. Biến đổi di truyền được
nghiên cứu trực tiếp ở mức độ ADN có thể phát hiện ra một lượng lớn sự đa
hình tạo ra do đột biến, vì vậy làm cho chúng phong phú hơn so với chỉ thị
hình thái. Để phân biệt các xuất xứ khác nhau, có thể dùng nhiều phương
pháp. Một trong những phương pháp đem lại hiệu quả cao, chính xác, rút
ngắn được thời gian và công sức là dùng các chỉ thị phân tử để nghiên cứu sự
đa dạng di truyền bởi nó cho phép chúng ta hiểu biết về thành phần gen giữa
các cá thể trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau làm cơ sở cho việc
xác định xuất xứ [1, 4].
Sự ra đời của PCR đã làm thay đổi lớn trong sinh học phân tử, đánh
dấu sự ra đời của hàng loạt chỉ thị phân tử: RAPD, AFLP, SSR.
1.1.2.1. Đa hình độ dài các đoạn nhân chọn lọc (Amplified Fragment
Length Polymorphism – AFLP).
AFLP được phát triển bởi Zabeau và Vos (1993) [30] và được mô tả
chi tiết bởi Vos và cộng sự (1995) [28]. AFLP là kỹ thuật di truyền mới dựa
trên cơ sở PCR, AFLP đã phối hợp được sự tin cậy của RFLP và sự thuận lợi
của kỹ thuật PCR. Kỹ thuật này gồm ba bước:
(1) : Cắt ADN hệ gen bằng enzym giới hạn và gắn các đoạn
oligonucleotide tiếp hợp (adapter).
(2) : Nhân một cách chọn lọc các đoạn giới hạn.
(3) : Phân tích trên gel các đoạn ADN được nhân lên.
Đây là kỹ thuật có nhiều ưu điểm trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở
nhiều đối tượng khác nhau: đậu tương [24], lập bản đồ hệ gen và định vị các
gen, phát triển chỉ thị chuNn ở khoai tây [8], ở lúa mỳ, xác định các gen kháng
virus ở đậu tương [28], ở khoai tây [11], ở lạc [13].
5

AFLP là một kỹ thuật có độ nhạy cao để phát hiện đa hình trong tồn
bộ hệ gen. AFLP cho phép phân tích nhanh, ổn định, đáng tin cậy, có khả
năng ứng dụng trong lập bản đồ hệ gen và chọn giống có sự trợ giúp của chỉ
thị [10, 21]. Tuy nhiên, phân tích AFLP trước đây có giá thành cao, địi hỏi có
kỹ thuật phịng thí nghiệm thành thạo vì AFLP thường dùng đồng vị phóng xạ
để phát hiện các đoạn ADN được nhân lên trong phản ứng PCR, song điều
này đã được khắc phục khi sử dụng các kỹ thuật nhuộm huỳnh quang và
nhuộm bạc thay cho việc sử dụng đồng vị phóng xạ. Sự thay thế này giúp cho
giá thành khi sử dụng kỹ thuật giảm đi rất nhiều, khơng địi hỏi những thiết bị
q đắt, các thao tác kỹ thuật đơn giản hơn mà vẫn đảm bảo độ nhạy và tính
chính xác của kết quả. Với việc thay thế bằng nhuộm huỳnh quang và nhuộm
bạc AFLP đã trở thành một kỹ thuật được sử dụng phổ biến hiện nay trong
nghiên cứu di truyền và lập bản đồ liên kết phân tử.
1.1.2.2. Trình tự vị trí đánh dấu (STS - Sequence Tagged Sites)
STS được tạo ra đầu tiên bởi Olson và cộng sự (1989) dựa vào một loại
locus đã biết (gen, cADN, hoặc gen tách dòng) được nhân lên bởi mồi PCR
thiết kế dựa vào trình tự đầu cuối của những locus đặc trưng này.
Dựa trên cơ sở PCR nó phát hiện một điểm có trình tự xác định, nó
khơng địi hỏi sự phân lập nhưng địi hỏi trình tự. Mồi có 18 – 20bp được thiết
kế để nhân đoạn ADN ngắn, duy nhất trên ADN đã biết trình tự (có thể là
trình tự của sản phNm PCR với chỉ thị RAPD hoặc RFLP) sự đa hình nói
chung được xác định như sự khác nhau về kích thước của sản phNm PCR trên
gel agarose.
EST (Expressed Sequence Tag) là một chỉ thị dựa trên cơ sở PCR với
mồi dài 18 – 20 nucleotide được thiết kế từ những phần trình tự đã biết trên hệ
gen như các đoạn cADN, nó khơng địi hỏi sự phân lập nhưng địi hỏi trình tự
và phát hiện vùng biểu hiện duy nhất của hệ gen nên thích hợp đối với lập bản
đồ. Sự đa hình nói chung được phát hiện bởi sự khác nhau về kích thước của

6


sản phNm PCR. Tuy nhiên việc thiết kế và chuNn hố mồi có thể địi hỏi sự
đầu tư đáng kể.
Một chỉ thị khác của STS dựa trên kỹ thuật RAPD là SCARs (Sequence
Characterised Amplified Regions). Các chỉ thị này dựa trên việc tách dịng và
đọc trình tự các đoạn RAPD được quan tâm (có thể vì chúng liên kết với gen
được quan tâm), từ trình tự đã biết thiết kế các mồi dài hơn các mồi thường
dùng trong RAPD (24 nucleotide) bổ sung chính xác với trình tự đầu cuối của
đoạn RAPD ban đầu. Khi các mồi này được dùng trong PCR, một locus đơn
được xác định tương ứng với đoạn ADN ban đầu của locus này. SCARs tiến
bộ hơn RAPD là các kết quả có khả năng lặp lại (dùng mồi dài hơn) và là các
chỉ thị đồng trội.
Chỉ thị CAPS hay "Cleaved Amplified Polymorphic Sequences" [15]
cũng là một ví dụ của STS, được tạo ra bằng cách cắt các sản phNm PCR với
một enzym hạn chế. Chỉ thị ADN này vẫn mang những ưu điểm cơ bản của
PCR là chỉ cần một lượng nhỏ nanogram (ng) ADN và phát hiện dễ dàng nhờ
kết quả huỳnh quang. Các mồi PCR dài hơn (15 – 25 nucleotide) dùng cho
CAPS có xu hướng tạo ra những sản phNm ổn định hơn RAPD hoặc các kỹ
thuật mồi ngẫu nhiên khác.
Tuy nhiên, CAPS cũng có mặt hạn chế là các cá thể có liên hệ gần gũi
thường chứa các alen giống nhau. Điều này gây trở ngại nghiêm trọng trong
việc tạo cặp lai giữa các dạng khác nhau.
1.1.2.3. Chỉ thị đoạn lặp đơn giản (Simple sequence reapeats – SSR)
SSR còn gọi là Microsatillite được Litt và Luty (1989) [20] phát triển
thành một kỹ thuật chỉ thị phân tử. Microsatellite là đơn vị lặp lại rất ngắn 1 –
5bp, chúng xuất hiện và phân bố ở gần tâm động hoặc đầu mút của các NST,
có vai trị giữ tính ổn định của bộ NST ở các quá trình phân bào trong hệ gen

của tất cả sinh vật nhân thực [5, 26].
Kỹ thuật SSR dựa trên nguyên lý PCR dùng các cặp mồi đặc hiệu để
nhân các đoạn trình tự SSR. Sự khác nhau trong cấu trúc đơn vị lặp lại dẫn
7


đến thay đổi độ dài đoạn lặp lại được nhân lên và xác định khi chạy điện di
trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide.
Đa hình về độ dài các đoạn microsatellite cũng có thể được phát hiện
khi lai với ADN trên gel hoặc có thể được nhân bằng PCR để tách dịng, đọc
trình tự với mồi là các đoạn oligonucleotide phụ cận. Các vị trí microsatellite
là các chỉ thị đồng trội vì vậy chứa đựng thơng tin cao. Microsatellite cũng là
một chỉ thị trong lập bản đồ và xác định chỉ thị chuNn.
Ở động vật microsatelllite với trình tự CA/GT lặp lại là phổ biến nhất,
trình tự này ít thấy ở nhiều thực vật vì ở thực vật trình tự lặp lại AT/TA phổ
biến hơn nhiều, tiếp đó là trình tự GA/CT. Trong hệ gen lúa (GA)n lặp lại cứ
225kb một lần và (GT)n lặp lại cứ 480kb một lần.
Sự phân tích trình tự lặp lại là hết sức quan trọng đối với phân tích hệ
gen thực vật vì trình tự lặp lại đặc trưng cho ADN hệ gen của cá thể. Perry
Creengam đã sử dụng kỹ thuật SSR để phát hiện ra sự khác nhau giữa các thứ
đỗ mà không phân biệt được bằng kỹ thuật RADP.
Hầu hết các locus SSR ở thực vật có sự đa hình cao hơn các chỉ thị
khác. Trong phân tích SSR khơng dùng phóng xạ, sử dụng một lượng ADN
và ít tốn thời gian vì vậy kỹ thuật SSR có nhiều ứng dụng trong việc lập bản
đồ phân tử. Kochert đã sử dụng chỉ thị SSR để lập bản đồ liên kết di truyền ở
lúa [29]. Đánh dấu các gen quan trọng, sử dụng trong nghiên cứu ở một vài
thực vật bao gồm: Lúa [29] và đậu tương [7], kỹ thuật in dấu ADN và được
dùng cho xác định các dòng lai từ các loài hoang dại trong cải biến giống cây
trồng.
Hạn chế của các chỉ thị SSR là tốn kém về tiền của và công sức trong

việc xây dựng cặp mồi đặc hiệu cho mỗi locus đa hình. Để xây dựng các cặp
mồi đặc hiệu cần tách dịng và đọc trình tự một lượng lớn các đoạn ADN hệ
gen chứa SSR [16]. Tuy nhiên dựa vào các ngân hàng gen đã có hiện nay có
thể thiết kế các tổ hợp mồi cho SSR ở nhiều loài cây khắc phục được phần
nào hạn chế này.
8


1.1.2.4. Đa hình các đoạn ADN nhân ngẫu nhiên (Random Amplified
Polymorphism ADN – RAPD)
1.1.2.4.1. Nguyên lý của kỹ thuật RAPD
Đây là một kỹ thuật phân tử dựa trên cơ sở của phản ứng PCR do
Welsh và Mc ClellADN, 1990; Williams và cộng sự, 1990 đề xuất. Kỹ thuật
RAPD sử dụng các mồi đơn có trình tự nucleotide ngẫu nhiên dài từ 9 – 12
nucleotide các mồi này thường có hơn 60%(G +C) để đạt được liên kết với
mẫu đủ mạnh. Các mồi ngẫu nhiên là ngắn nên khả năng nó tìm được những
điểm gắn theo nguyên tắc bổ sung trên ADN là khơng q khó khăn. Điện di
kết quả nhân gen thu được điện di đồ gồm những băng, vạch ADN ở những vị
trí giống nhau trên bản gel. Khi bộ gen của các mẫu kiểm tra có sự khác nhau
(có đa dạng sinh học) cho kết quả khác nhau trên điện di đồ. Kết quả của phản
ứng RAPD sẽ tạo ra nhiều đoạn ADN khác nhau về độ dài và trình tự. Một
mồi ngẫu nhiên có thể cho kết quả là có băng nhân bản với ADN từ nguồn
này nhưng lại không xuất hiện băng nhân bản với ADN từ nguồn khác [5, 12].
Sản phNm PCR gồm nhiều đoạn ADN có kích thước từ 200bp đến hơn
3kb. Sự khác nhau của các đoạn ADN được phát hiện khi điện di sản phNm
PCR trên gel agarose. Sự khác nhau của các đoạn nói chung là do đột biến ở
vị trí gắn mồi ngăn trở việc bắt cặp của mồi. Các đoạn này được ghi nhận như
các yếu tố di truyền Mendel trội trong một cơ thể lưỡng bội.
1.1.2.4.2. Ưu điểm và hạn chế của kỹ thuật RAPD
RAPD là một phương pháp nhanh để phát hiện đa hình vì kỹ thuật này

khơng địi hỏi việc phân lập và đọc trình tự, có thể phát hiện nhiều locus cùng
một lúc.
Đây là một kỹ thuật có giá thành thấp, đơn giản, sử dụng lượng nhỏ
ADN khuôn, không dùng kỹ thuật lai và mẫu dị phóng xạ nên khơng địi hỏi
kỹ thuật phức tạp. Vì vậy, trong những năm gần đây phân tích RAPD trở
thành phương pháp phổ biến để đánh giá đa dạng di truyền và phân loại thực
vật, xác định các đặc điểm quan trọng và nguồn gốc.
9


Mỗi mồi cung cấp số liệu từ nhiều vị trí trong hệ gen vì vậy những đa
hình hiếm giữa các mẫu có quan hệ gần gũi có thể được phát hiện nhanh hơn
với phân tích locus đơn.
Tuy vậy, RAPD là chỉ thị trội nên không phân biệt được cá thể đồng
hợp và dị hợp nên RAPD không được sử dụng rộng rãi trong xây dựng bản đồ
và do mồi ngắn (10 nucleotide) nên khi chạy phản ứng PCR sẽ chịu nhiều ảnh
hưởng của các yếu tố [6]. Mồi ngắn dễ dàng bị ảnh hưởng của điều kiện gắn
mồi nên kết quả có hệ số an tồn khơng cao, sự nhạy cảm cao với điều kiện
phản ứng như: chất lượng, nồng độ ADN khuôn; nồng độ dung dịch đệm (đặc
biệt là Mg2+); nồng độ ADN polymerase; nồng độ nucleotide (dNTP: A, U, G,
C) là những hạn chế chính của kỹ thuật. Do thiếu sự ổn định, kỹ thuật RAPD
bị hạn chế sử dụng trong lập bản đồ QTL các quần thể lai và ít được dùng
trong những trường hợp lập bản đồ so sánh.
Bên cạnh đó là sự phát sinh đa hình giả ảnh hưởng đến sự thể hiện của
các đoạn RAPD do khơng chắc chắn các đoạn cùng kích thước từ hai mẫu
ADN khác nhau có thực sự được tạo ra từ cùng một vị trí trên hệ gen hay
khơng.
Tuy nhiên, kỹ thuật với mồi ngẫu nhiên có nhiều ứng dụng trong các
thí nghiệm địi hỏi một số lượng lớn bản sao để kiểm tra độ tin cậy nên kỹ
thuật RAPD vẫn là lựa chọn thích hợp cho cơng tác đánh giá đa dạng di

truyền.
1.1.2.4.3. Ứng dụng của kỹ thuật RAPD
RAPD thường được dùng trong nghiên cứu phát sinh loài và dùng trong
phân tích sự phân ly các dịng gần đồng gen (near isogenic lines - NIL) [22],
RAPD được dùng nhiều nhất trong xác định các trạng thái khác nhau, xác
định quan hệ di truyền và nghiên cứu đa dạng di truyền ở nhiều loài cây như
lúa, đậu tương, lúa mạch đen, kiều mạch, đậu Hà Lan, hoa hồng... [23, 18, 24,
25]. Cùng với RFLP hoặc SSR, RAPD được dùng để xây dựng bản đồ liên

10


kết di truyền (bản đồ có mật độ cao trong nhiều trường hợp) ở nhiều loài cây:
rau diếp, củ cải đường, lúa mạch... [17, 27, 29].
Trong một số ít trường hợp RAPD được dùng trong xác định QTL của
nhiều đặc điểm nông học như: các đặc điểm về năng suất ở lúa mạch và lúa,
trong xác định gen điều khiển các đặc điểm đơn gen ở cà, rau diếp [14, 17].
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra RAPD là một phương pháp hữu hiệu để xác
định kiểu gen, phân tích quần thể và phả hệ, nghiên cứu phát sinh loài (hệ
thống phát sinh) và lập bản đồ di truyền.
1.2. Tình hình nghiên cứu về Song mật
Song mật (Calamus platyacanthus Warb. Ex Becc) thuộc họ cau
(Arecaceae), nằm trong nhóm gỗ trung bình. Với giá trị sử dụng cao và được
người dân sử dụng từ rất lâu nên đã có nhiều nghiên cứu về Song mật.
1.2.1. Phân bố, đặc điểm hình thái Song mật
Song mật là lồi cây ưa sáng và Nm, ln vươn lên tầng cao nhất của
tán rừng. Mọc trên đất feralit vàng, trên núi đá và các loại đất phong hóa trên
phiến thạch, sa thạch, granit hoặc đá vơi. Cây thường mọc ven thung lũng núi,
chân và sườn núi đá, ven và dọc các khe Nm. Nơi có độ dốc 30 – 50o cũng
thấy Song mật. Song mật mọc xen lẫn rừng Tre, Vầu ở độ cao 100 – 1,500m,

tập trung nhiều ở độ cao 400 – 900m. Trên thế giới, Song mật chủ yếu tập
trung nhiều ở Trung Quốc, Việt Nam và một số nước khác. Ở Trung Quốc
Song mật chủ yếu phân bố ở tỉnh Vân Nam, mọc trên núi cao hơn 900m thành
từng cụm lớn. Ở Việt Nam đây là loài cây cận đặc hữu thường gặp ở ở các
tỉnh từ Đồng Nai (Nam Cát Tiên) trở ra nhưng tập trung nhất ở các tỉnh:
Quảng Nam, Quảng Bình, Hà Tĩnh, Nghệ An, Thanh Hố, Ninh Bình, Hịa
Bình, Hà Nội, Phú Thọ, Yên Bái, Lào Cai,Tuyên Quang, Bắc Kạn, Lai Châu
[2].
Cây Song mật có thân ngầm là phần phình lên của gốc thân khí sinh, có
dạng giống như củ hành ta và được bao bọc bởi nhiều bẹ lá dày, màu trắng
hay vàng nhạt. Các bẹ lá ngoài cùng chết dần và có màu nâu, phía giữa thân
11


ngầm là đỉnh sinh trưởng, mềm màu trắng. Ở cây non, thân được bao bọc bởi
bẹ lá hình ống, màu xanh lá cây, trên mặt có nhiều gai dẹt màu vàng. Khi già,
bẹ ở gốc thân chuyển thành màu vàng, màu nâu rồi rụng đi, để lộ thân khí
sinh màu xanh rêu. Cây một năm tuổi đường kính thân ngầm đạt 1cm, cây
trưởng thành đường kính thân ngầm tới 4 – 6cm hay hơn. Thân khí sinh mọc
thành bụi nhưng thường rất thưa. Ở cây trên ba tuổi giữa các gốc rễ lớn xuất
hiện chồi mầm đầu tiên, chồi cong và hướng lên phía trên sát với thân cây mẹ;
quanh gốc thân ngầm mọc ra các rễ dài, cứng; đôi khi ta gặp bụi Song mật chỉ
có một thân khí sinh. Thân cây trưởng thành rất dài, có thể đến 40m, trong
rừng già có thể đạt 100m. Thân non màu trắng ngà, sau chuyển sang màu
xanh; lóng dài 8 – 25cm, đốt hơi nổi, đường kính trung bình đạt 2,3 – 2,8cm;
cây to đạt 4 – 5cm. Nếu tính cả bẹ lá bao bọc, đường kính thân phần ngọn đạt
8 – 10cm [2].
Lá Song mật là dạng lá đơn, xẻ gân lông chim, gần giống lá Dừa, gồm:
bẹ lá, cuống lá, phiến là và thìa lìa nằm giữa bẹ và cuống lá. Bẹ lá rất dài, bao
bọc kín thân khí sinh.Trên bẹ lá có nhiều gai dẹt, dài 8 – 10cm, gai mọc lật

ngược về phía gốc; Thường khi cây cao 2 – 3m, từ lá thứ 6 – 7 trở lên xuất
hiện roi (flagelle) trên đỉnh cuống lá; roi dài 1,5m hay hơn [2].
Hoa đơn tính khác gốc. Cụm hoa hình bơng mo, dài hơn 1m, mọc ở gần
nách các lá phía ngọn; mỗi thân thường mang 5 – 10 bông mo. Mỗi bông mo
mang nhiều bông nhỏ dài 2 – 2,5cm với 14 – 17 hoa. Hoa đực xếp sát nhau
thành 2 dãy, lá đài 3, cánh hoa 3, nhị 6. Hoa cái tập trung 14 – 32 hoa trong
một bông nhỏ. Thường chỉ 17 – 20 hoa cái phát triển thành quả. Chồi hoa
xuất hiện vào tháng 9 – 10, hoa nở vào tháng 4 – 5 năm sau. Quả chín tháng
10 – 11 dương lịch. Thời gian chín của quả kéo dài khoảng một tháng [2].
Quả hình trứng, dài 15 – 22mm, rộng 9 – 14mm, cuống mập màu xanh
vàng, dài 6mm, đỉnh có mũi hình nón dài 4mm; vỏ quả mang 18 hàng vảy
dọc, mỗi hàng 8 vảy dẹp, có rãnh kích thước 3 × 3,5mm mép màu nâu. Khi

12


non quả màu xanh lá cây, khi già màu vàng nhạt. Cùi quả màu trắng nhạt,
mọng nước, dài 1mm, dễ dóc khỏi hạt, cùi có vị chua [2].
Hạt hình trái xoan hay bầu dục, khi non màu trắng ngà, khi già màu nâu
đen. Vỏ ngoài hạt rất cứng, nhăn nheo, màu trắng đục, phía bụng là rốn hạt,
phía đầu to có lỗ với nắp đậy, qua đó phơi sẽ xuất hiện khi nảy mầm. Hạt
chứa nội nhũ, sừng rất cứng, phơi nằm lệch về một phía.
1.2.2. Giá trị và hiện trạng khai thác Song mật trên cả nước.
Thân Song mật dài, rất dẻo, chịu uốn và bền, nên được dùng làm bàn
ghế, hàng mây tre đan và cuốn bè. Hiện nay, Song mật là loại nguyên liệu
quan trọng trong nhiều cơ sở sản xuất mây tre đan ở các tỉnh phía Bắc. Trên
thị trường giá Song mật đắt hơn giá các loài song mây khác từ 2 – 3 lần. Hiện
nguồn Song mật dùng cho chế biến, sử dụng vẫn chủ yếu dựa vào việc khai
thác từ rừng tự nhiên.
Theo đánh giá của các chuyên gia lâm nghiệp, từ những năm 1985

Song mật đã bị khai thác mạnh để làm hàng xuất khNu khiến cho nhiều khu
phân bố thu hẹp dần số cá thể và có nguy cơ bị mất nguồn giống. Nguồn tài
nguyên Song mật đang cạn kiệt, vì vậy trên cả nước cần xây dựng những rừng
giống và khoanh vùng một số khu vực còn nhiều cá thể để khai thác hợp lý,
đảm bảo sản lượng ổn định, lâu dài. Song mật rất thích hợp phát triển trong
các rừng của Việt Nam nên phải có kế hoạch bảo vệ, khai thác, đNy mạnh
công tác gieo trồng và sử dụng bền vững. Trước tiên cần có kế hoạch tích cực
bảo vệ cây Song mật trong các khu bảo tồn để làm nguồn giống; đặc biệt cần
bảo vệ các cây Song mật đã được trồng ở Trạm nghiên cứu Lâm nghiệp Bình
Thanh, tỉnh Hồ Bình và vườn quốc gia Xn Sơn, tỉnh Phú Thọ để lấy giống
nghiên cứu và phát triển trong giai đoạn đầu. Sớm đưa Song mật vào gây
trồng trong các rừng đặc dụng và rừng đầu nguồn.
1.2.3. Những nghiên cứu về Song mật trên Thế giới và Việt Nam
Đối với các đối tượng nghiên cứu khác như: mây nếp, xoan, bơng, dâu
tằm. . . và các lồi cây trồng nông nghiệp: đậu tương, đậu xanh, . . . Với kỹ
13


thuật sinh học phân tử, các cơ sở nghiên cứu đã đánh giá được tính đa dạng di
truyền ở nhiều đối tượng trên quy mô cả nước cũng như trên thế giới, phục vụ
công tác tuyển chọn giống cây nông lâm nghiệp để có nguồn giống chất lượng
(kháng sâu, bệnh hại; chịu hạn . . .) và năng suất cao đưa vào sản xuất.
Nhận thức rõ vai trò quan trọng của lồi cây có giá trị kinh tế cao này,
tại nhiều quốc gia trên thế giới, đặc biệt các nước trong khu vực Đông Nam Á
đã tiến hành nghiên cứu: phân loại, kỹ thuật gây trồng, phân tích lợi ích kinh
tế của việc gây trồng Song mật (Yin Guangtian, et al., 1998). Các nghiên cứu
về nguồn tài nguyên di truyền, xác định những lồi có giá trị thương mại đã
được tiến hành ở: Bangladesh, Trung Quốc, ấn Độ, Indonesia, Lào, Malaysia,
Myanma, Nepal, Philippines và Thái Lan (Ramanatha Rao, et al., 1999) nhằm
mục đích xác định số lượng, khu vực phân bố, vùng gây trồng phù hợp. Ngồi

ra, cịn có một số nghiên cứu ở Thái Lan về phân tích đa dạng di truyền bằng
các phương pháp phân tích phân tử (isozyme, RAPD, RFLP, AFLP ... (L.T.
Hong, et al., 2002).
Với nguy cơ đang mất đi một nguồn gen quý cũng như mất dần nguồn
liệu trong sản xuất nên trong những năm qua Bộ Nông nghiệp và Phát triển
nông thôn cùng các tỉnh đã và đang xây dựng nhiều dự án trồng, bảo vệ Song
mật trong tự nhiên; nhiều dự án trồng vùng nguyên liệu sản xuất và vùng bảo
tồn nguồn gen tự nhiên ở nhiều tỉnh.
Nguồn giống trong công tác trồng vùng nguyên liệu và bảo tồn nguồn
gen trong tự nhiên ở nước ta hiện nay chủ yếu dựa vào hình thái và rất xô bồ,
chưa được quan tâm đúng mức. Nhận thấy những tồn tại đó đề tài: “Nghiên
cứu tạo cây con Song mật bằng kỹ thuật nuôi cấy invitro” đã đặt công tác
đánh giá chất lượng nguồn giống nuôi trồng là giai đoạn đầu tiên để kết quả,
chất lượng đề tài cũng như nguồn giống đạt được là cao nhất. Đối với công
tác nhân giống ở Việt Nam, đặc biệt với đối tượng là Song mật thì đây là vấn
đề đang được khuyến khích và triển khai trên mọi đối tượng là cây trồng sản
xuất cũng như trong bảo tồn nguồn gen thực vật trên cả nước.
14


trong tự nhiên (nguồn Internet).

của Song mật (nguồn Internet).

15

Hình 1.2. Ngọn và roi (flagelle) của Song mật

Hình 1.1. Các bộ phận: thân, bẹ, đốt, gai, hoa, quả

Chương 2
MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu nghiên cứu
˗ Xác định mối quan hệ di truyền giữa các xuất xứ Song mật thu thập
tại 4 tỉnh phía Bắc.
˗ Cơ sở phân tử cho cơng tác chọn tạo, nhân giống và bảo tồn các giống
Song mật quý, có giá trị cao trong sản xuất kinh tế.
2.2. Nội dung nghiên cứu
˗ Tách chiết ADN tổng số của các dòng Song mật ở 4 xuất xứ khác
nhau.
˗ Sử dụng kỹ thuật RAPD phân tích các mẫu ADN tổng số thu được với
20 đoạn mồi ngẫu nhiên.
˗ Xây dựng biểu đồ biểu diễn mối tương quan di truyền của Song mật
với các xuất xứ bằng phần mềm NTSYSpc version 2.02h (Applied
Biostatistics Inc., USA., 1998)
2.3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Vật liệu nghiên cứu
* Vật liệu thực vật:
Mẫu nghiên cứu là lá Song mật sạch bệnh, thu thập từ 4 tỉnh phía Bắc:
Hịa Bình, Bắc Giang, Tun Quang, Hà Giang.
Gồm 15 mẫu Song mật, theo đánh giá của cán bộ điều tra thì đây là 15
cá thể trội trong số 4 xuất xứ được thu thập (bảng 2.1) do Trung tâm Giống và
Công nghệ Sinh học Trường Đại học Lâm nghiệp cung cấp.

16


Bảng 2.1. Ký hiệu các mẫu Song mật sử dụng nghiên cứu
Ký hiệu

Giống Song mật

Ký hiệu

Giống Song mật

S1

Hồ Bình 1

S9

Tun Quang 2

S2

Hồ Bình 2

S10

Tun Quang 3

S3

Hồ Bình 2’

S11

Hà Giang 1

S4

Hồ Bình 3

S12

Hà Giang 2

S5

Hồ Bình 4

S13

Hà Giang 3

S6

Hồ Bình 5

S14

Bắc Giang 1

S7

Hồ Bình 6

S15

Bắc Giang 2

S8

Tun Quang 1

* Hóa chất:
˗ Trình tự mồi RAPD được tham khảo trên ngân hàng Gen thế giới
(NCBI) và đặt mua từ hãng OPERON (Mỹ) gồm các mồi có trình tự trong
bảng 2.2.
Bảng 2.2. Tên và trình tự 20 mồi RAPD sử dụng nghiên cứu
TT

Tên
mồi

Trình tự nucleotide

TT

Tên
mồi

Trình tự nucleotide

1

PC01

5’-GGACTGGAGT

11

PC11

5’-AACCGACGGG

2

PC02

5’-TGCTCTGCCC

12

PC12

5’-GGGGGTCGTT

3

PC03

5’-GGTGACGCAG

13

PC13

5’-TACCACCCCG

4

PC04

5’-TGGGGGACTC

14

PC14

5’-GGCGGACTGT

5

PC05

5’-GTAGACCCGT

15

PC15

5’-CCAGACCCTG

6

PC06

5’-TTCCCCCGCT

16

PC16

5’-CAATCGCCGT

7

PC07

5’-GGACCCTTAC

17

PC17

5’-TCGGCGATAG

8

PC08

5’-TGGACCGGTG

18

PC18

5’-GTCCACACGG

9

PC09

5’-AAGCCTCGTC

19

PC19

5’-CAGCACCCAC

10

PC10

5’-ACTTCGCCAC

20

PC20

5’-GGGAAGGACA

17


˗ Hóa chất tách chiết ADN tổng số được mua từ hãng Sigma:

+ Đệm ( dung dịch) Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB)
100ml gồm: 1g CTAB; 40ml H2O; 10ml Hydroxymethyl aminomethane
Hydrochloride (Tris – HCl) 1M, pH 8.0; 28ml Clorua natri (NaCl) 5M; 4ml
Ethylene diamine tetra acetate (EDTA) 0.5M, pH 8.0; 1g Polyvilyn polydon
(PVP).
+ Đệm TE 10ml gồm: 10mM Tris - HCl pH 8.0; 1mM EDTA 8.0.
+ Isopropanol.
+ Hỗn hợp Phenol/ Chlorofom/ isoamylalcohol (25:24:1).
+ Agarose.
+ Ethidium Bromide (EtBr).
+ Loading buffer 6X (Bromophenol blue 10%; Glycerin 100%; H2O).
+ Đệm TAE (Tris acetate EDTA) 1X (Tris – acetate; EDTA pH 8.3;
H2O).
+ Cồn 96o.
- Hóa chất dùng cho phản ứng PCR được mua từ hãng Invitrogen gồm:
dNTPs, Taq polymerase, MgCl2, đệm PCR.
* Máy móc thiết bị:
- Các thiết bị sử dụng để tách chiết ADN và chạy phản ứng PCR gồm:
+ Nồi khử trùng: auto clever, HVE – 50 hãng Hirayama, Japan.
+ Cân phân tích: TE 612 của hãng Satorius, Mỹ.
+ Pipetman: 1000µl, 200µl, 100µl, 20µl, 10µl hãng Biotit.
+ Tủ lạnh -20oC, 4oC của hãng Sanyo, Toshiba – Japan.
+ Máy ổn nhiệt: BW – 05G của Lab. Companion, Korea.
+ Máy PCR: 9800 Fast Thermal Cycler hãng Applied Biosystems, USA
+ Máy chạy điện di: Fill line, Power station 300 hãng CLP.
+ Máy soi, chụp gel: Dolphin – doc hãng Wealtec.
18


+ Máy đo quang phổ: 8452 Hewllet – Packart hãng Hp, USA

+ Máy hút chân không: Centrifuge for vancuum Modulspin – Bistron.
+ Máy ly tâm lạnh: Mikro 22R Hettich zentrifugen.
2.3.2. Phương pháp phân tích RAPD
2.3.2.1. Phương pháp tách ADN hệ gen
Trong nghiên cứu này tôi sử dụng phương pháp tách chiết ADN của
Shagai Maroof và cộng sự (1984) có cải tiến cho phù hợp với việc tách chiết
ADN hệ gen của các dịng Song mật. Quy trình bao gồm các bước:
Bước 1: Nghiền 0,2g lá Song mật trong nitơ lỏng bằng chày cối sứ. Bột đã
nghiền cho vào ống ly tâm 1,5ml. Thêm 1ml đệm CTAB đã làm ấm ở 65oC
trong 10 phút.
Bước 2: Ủ các ống ở điều kiện 65oC trong 60 phút, lắc nhẹ nhàng nhưng dứt
khoát 15 phút một lần để việc tách có hiệu quả.
Bước 3: Chuyển các ống từ tủ ấm ra, để nguội ở nhiệt độ phịng 15 phút. Sau
đó ly tâm trong 10 phút với tốc độ 12.000 vòng/ phút.
Bước 4: Chuyển phần dịch phía trên sang ống ly tâm mới. Thêm 500µl dung
dịch phenol/ Chloroform/ isoamy alcohol (25:24:1). Trộn đều dung dịch bằng
máy Vortex.
Bước 5: Ly tâm 5 phút tốc độ 12.000 vòng/phút ở 4oC
Bước 6: Chuyển lớp trên cùng vào ống ly tâm mới (1,5ml). Thêm 500µl
Chloroform/ isoamy alcohol (24:1), xoay ống nhẹ nhàng 10 phút.
Bước 7: Ly tâm 13.000 vòng / phút trong 5 phút ở nhiệt độ là 4oC.
Bước 8: Dùng Pipetman hút lớp trên cùng (500µl) sang ống ly tâm mới
(1,5ml) thêm 1ml isopropanol lạnh, xoay ống nhẹ vài phút và ủ ở nhiệt độ
20oC trong 60 phút.
Bước 9: Ly tâm 15 phút tốc độ 3.000 vòng/phút ở nhiệt độ 4oC để thu tủa.
Bước 10: Rửa ADN kết tủa bằng 500µl cồn 70%, lắc nhẹ nhàng. Ly tâm 5
phút tốc độ 12.000 vòng/phút.
19

Bước 11: Sau đó đổ cồn ra, úp ống ly tâm trên giấy thấm khơ.
Bước 12: Bổ sung 50µl TE vào ống ly tâm có chứa ADN, bảo quản -20oC.
2.3.2.2. Phương pháp định lượng ADN bằng quang phổ kế.
Nguyên lý:
Dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng ở bước sóng 260nm của các base
purine và pyrimidine, sẽ đo được giá trị mật độ quang ở bước sóng 260nm
(OD260nm – Optical Density 260nm) của các mẫu và cho phép xác định nồng
độ ADN trong mẫu dựa vào tương quan sau: một đơn vị OD260nm tương ứng
với một nồng độ là: 50(µg/ml) cho một dung dịch ADN sợi đơi. Do đó nồng
độ ADN trong mẫu được tính theo cơng thức sau:
CADN (µg/ml) = OD260 nm × 50 × Độ pha lỗng
Để kiểm tra độ sạch của dung dịch, người ta đo thêm giá trị OD ở bước
sóng 280nm (OD280nm). 280nm là bước sóng mà ở đó các protein có mức hấp
thụ cao nhất, nhưng các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260nm
như các axit nucleic và do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ axit nucleic.
Một dung dịch axit nucleic được xem là sạch (không tạp nhiễm protein) khi tỉ
số OD260nm/OD280nm nằm trong khoảng 1,8 – 2,0.
Bước tiến hành:
˗ Lấy 1ml dung mơi hịa tan ADN (TE pH 8.0 hoặc nước deion vô
trùng) cho vào cuvette đo làm đối chứng.
˗ Cho 20µl dung dịch ADN cần định lượng vào 980µl dung mơi hịa tan
ADN (pha lỗng 50 lần). Sau đó cho vào cuvette và đo OD ở bước sóng
260nm và 280nm.
˗ Từ kết quả thu được ta tính nồng độ ADN và độ tinh sạch của ADN
theo công thức trên.
Phương pháp định lượng ADN được đo trên máy quang phổ 8452
Hewllet – Packart và dựa vào nồng độ để pha loãng ADN ra nồng độ
25(ng/ml) bằng nước cất 3 lần để chuNn bị chạy PCR với các mồi RAPD.
20

2.2.2.3. Phương pháp điện di sản ph m PCR trên gel Agarose
Nguyên lý:
Nguyên tắc của phương pháp điện di là dựa vào đặc tính cấu trúc của
các ADN. Ðó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên
khi chịu tác động của một điện trường có hiệu điện thế và cường độ thích hợp,
chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Các đoạn ADN sẽ di
chuyển trong điện trường trên bản gel, với tốc độ tương quan nghịch với kích
thước của chúng. Trong cùng một thời gian nhất định (tùy thí nghiệm) các
đoạn kích thước nhỏ sẽ di chuyển xa hơn các đoạn lớn, từ đó mà ADN được
tách thành các vạch trên bản gel.
Việc chọn nồng độ gel tùy thuộc vào kích thước trung bình của các
đoạn ADN cần phân tách. Ðoạn ADN có kích thước càng nhỏ địi hỏi hàm
lượng agarose trong gel càng lớn và ngược lại. Bảng 2.3 cho thấy mối tương
quan giữa nồng độ agarose cần sử dụng để phân tách các trình tự ADN có
kích thước xác định.
Bảng 2.3. Tương quan nồng độ gel agarose và kích thước ADN phân tách
Hàm lượng agarose trong gel Kích thước các đoạn ADN
cần phân tách (kb)
(%w/v)
0,3

5 – 60

0,6

1 – 20

0,7

0,8 – 10

0,9

0,5 – 7

1,2

0,4 – 6

1,5

0,2 – 3

2,0

0,1 – 2

(Nguồn: Sambrook J. và cộng sự, 1989)

21


Trong điện di trên gel agarose, các đoạn ADN được hiện hình dưới tia
tử ngoại (UV) nhờ Ethidium bromide (EtBr) có khả năng gắn xen giữa các
base của ADN phát huỳnh quang dưới tác dụng của tia UV. Sau điện di, gel
được chiếu sáng bằng tia UV, các đoạn ADN hiện thành vạch sáng màu trên
bản gel. Để ước lượng kích thước các trình tự ADN trong gel agarose, người
ta dùng “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử” (molecular weight marker –
MWM). Đó là một tập hợp trình tự ADN có kích thước đã biết (thang ADN –

marker).
Buớc tiến hành:
Bước 1: ChuNn bị gel agarose 1% (gel phân tách ADN của phản ứng PCR –
RAPD có nồng độ là 1,2%).
Cân 0,37 g agarose hoà tan trong 37ml dung dịch đệm 1X TAE. Đun
dung dịch này trong lị vi sóng trong khoảng 2 phút cho agarose tan hoàn toàn
(nếu trong quá trình đun bị mất nước thì phải bổ sung thêm nước để đạt thể
tích 37ml). Để dung dịch agarose nguội dần, nhiệt độ đạt 50 – 60oC , đổ vào
khay điện di đã cài sẵn lược, sau đó chờ 20 – 30 phút cho gel agarose đông
cứng. Gỡ khay gel và đặt vào bể điện di, đổ dung dịch đệm 1X TAE ngập gel
độ 0,5cm, tháo lược ra khỏi bản gel.
Bước 2: Tra mẫu ADN
Trộn mẫu ADN cần điện di với dung dịch đệm màu - Loading buffer
theo tỷ lệ: 1 thể tích dịch đệm + 2 thể tích mẫu ADN.
Tra mẫu vào các giếng điện di (chú ý thứ tự mẫu) và thêm thang ADN
chuNn (marker) để giúp xác định độ dài của các băng ADN.
Bước 3: Chạy điện di
Với hiệu điện thế từ 60 – 80V, ADN sẽ di chuyển từ cực âm sang cực
dương của điện trường. Quan sát sự di chuyển bằng vạch màu Bromophenol
blue để ngừng quá trình điện di.

22


Bước 4: Nhuộm mẫu
Khi chạy điện di xong, bản gel agarose được lấy ra và ngâm vào dung
dịch EtBr ở nồng độ 30(µl/l). Để 20 – 30 phút, sau đó rửa bản gel bằng cách
ngâm trong nước 15 – 20 phút. Sau đó đưa bản gel vào máy soi gel bằng tia
UV.
Bước 5: Quan sát và chụp ảnh

Soi gel agarose trên máy UV, dưới ánh sáng tử ngoại có bước sóng 254 –
260nm. Chụp các ảnh bằng máy chuyên dụng Polaroid (Gel - Doc).
2.2.2.4. Kỹ thuật PCR với các mồi RAPD

Kỹ thuật chạy PCR của ADN hệ gen với các mồi RAPD được thực hiện
trên máy PCR 9800 Fast Thermal Cycler Applied Biosystems (Mỹ). Thành
phần phản ứng PCR – RAPD được nêu rõ trong bảng 2.4. Mỗi phản ứng được
thực hiện trong thể tích 25µl (tính cho 16 phản ứng).
Bảng 2.4. Thành phần các chất phản ứng PCR - RAPD
1 phản ứng
TT

16 phản ứng

Hóa chất

Ghi chú
(µl)

(µl)

1

H2O

15

240

2

Buffer 10X PCR

2,5

40

3

Mg2+ (50mM)

2,5

40

4

dNTP (2,5mM)

1

16

5

Primer

1,5

24

6

ADN - template

Mỗi phản ứng 1

2

ADN - template
7

Taq – Polymerase

0,5

8

Trộn đều các hỗn hợp trên rồi chuyển vào máy PCR sau đó chạy theo
chương trình RAPD – CT đã cài đặt sẵn với 45 chu kỳ gồm các bước:
23


1. 94 oC trong 3 phút;

5. 45 chu kỳ (2+3+4);

2. 92 oC trong 1 phút;

6. 72 oC trong 10 phút;

3. 35 oC trong 1 phút;

7. 4oC trong 30 phút.

4. 72 oC trong 1 phút;
to
3 phút
1 phút

94oC
92oC

1 phút

10 phút

72oC

1 phút

35oC

30 phút
4oC
0

tg
Hình 2.1. Chế độ nhiệt và thời gian chạy phản ứng PCR.

2.2.2.5. Phương pháp phân tích số liệu RAPD
Sản phNm PCR với các mồi RAPD sau khi chạy điện di trên gel agarose
1,2% sẽ được nhuộm và chụp ảnh để phân tích số liệu.
Cơng việc đầu tiên là xác định băng đơn hình và đa hình dựa vào sự
xuất hiện hay khơng xuất hiện của băng đó giữa các dịng (mẫu) nghiên cứu.
Nếu một băng ADN (có kích thước cụ thể) xuất hiện ở dịng i nhưng khơng
xuất hiện ở dịng j hoặc đồng thời xuất hiện ở cả i và j nhưng khơng xuất hiện
ở các dịng khác thì băng ADN này gọi là băng đa hình. Ngược lại, nếu băng
ADN này xuất hiện ở tất cả các dòng nghiên cứu thì gọi là băng đơn hình.
Tiếp theo các băng này được mã hoá bằng số tự nhiên 0 và 1. Nếu băng
đa hình xuất hiện ở dịng nào thì tại đó ký hiệu là 1 và ngược lại được ký hiệu
là 0.
Số liệu thu được, được nhập trực tiếp vào phần mềm Excel. Sau đó
được xử lý bằng chương trình NTSYSpc version 2.02h để tính ma trận tương
đồng giữa các đơi mẫu. Việc tính tốn ma trận tương đồng dựa trên công
thức:
24


Jij = a/(n – d)
Trong đó:
a: Số băng ADN có ở hai dịng i và j;
d: Số băng ADN có ở dòng i hoặc dòng j;
n: Tổng số băng thu được;
Jij: Hệ số tương đồng Jaccard giữa hai dòng i và j;
Sau đó số liệu lần lượt được xử lý qua các bước trong NTSYS –
SIMQUAL, SAHN. và cuối cùng là Tree để vẽ biểu đồ phân tích mối tương
quan di truyền giữa các mẫu nghiên cứu.

25