Định lượng một số hợp chất polyphenol và sự biểu hiện của gen mã hóa enzyme tham gia tổng hợp polyphenol ở chè​

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
––––––––––––––––––––

NGUYỄN THANH HUYỀN

ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT POLYPHENOL VÀ
SỰ BIỂU HIỆN CỦA GEN MÃ HÓA ENZYME THAM
GIA TỔNG HỢP POLYPHENOL Ở CHÈ

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN - 2019
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
––––––––––––––––––––

NGUYỄN THANH HUYỀN

ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT POLYPHENOL VÀ
SỰ BIỂU HIỆN CỦA GEN MÃ HÓA ENZYME THAM
GIA TỔNG HỢP POLYPHENOL Ở CHÈ
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 84 20 201

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS. Hồng Thị Thu Yến

THÁI NGUN - 2019
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là
trung thực và chưa được ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào. Mọi kết quả
thu được không chỉnh sửa, sao hoặc chép từ các nghiên cứu khác. Mọi trích
dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc.
Tác giả

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




ii

LỜI CẢM ƠN
Tơi xin tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS. Hoàng Thị Thu Yến đã định
hướng khoa học, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất
trong suốt q trình tơi tiến hành nghiên cứu và hồn thành luận văn này.
Tơi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và cán bộ Khoa Công nghệ Sinh

học, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tận tình dạy dỗ, chỉ
bảo và truyền cho tôi niềm đam mê nghiên cứu khoa học.
Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã
nhiệt tình động viên cho tơi thêm động lực hồn thành tốt q trình học tập và
nghiên cứu khoa học.
Đề tài luận văn nhận được sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp bộ mã số
B2016-TNA-24.
Thái Nguyên, tháng 10 năm 2019
Tác giả

Nguyễn Thanh Huyền

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN.............................................................................................i
LỜI CẢM ƠN.................................................................................................ii
MỤC LỤC.......................................................................................................iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT................................................................v
DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................vi
DANH MỤC CÁC HÌNH.............................................................................vii
MỞ ĐẦU..........................................................................................................1
1. Đặt vấn đề..................................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu..................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu.....................................................................................3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................4
1.1. Tổng quan về cây chè.................................................................................4
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại.......................................................................... 4
1.1.2. Đặc điểm hình thái..................................................................................5
1.1.3. Thành phần hóa học của chè...................................................................6
1.1.4. Tác dụng sinh học của cây chè................................................................7
1.2. Polyphenol ở chè......................................................................................10
1.2.1. Thành phần polyphenol ở chè...............................................................10
1.2.2. Con đường sinh tổng hợp polyphenol ở chè......................................... 15
1.2.3.Thành phần catechins ở chè …………………………………..……....16
1.2.4. Con đường sinh tổng hợp catechins ở chè ………………………...... 19
1.3. Tình hình nghiên cứu polyphenol ở chè………............................................. 21
1.3.1 Tình hình nghiên cứu polyphenol chè trên thế giới............................... 22
1.3.2 Tình hình nghiên cứu polyphenol chè ở Việt Nam................................ 24
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................26
2.1. Vật liệu nghiên cứu..................................................................................26
2.1.1. Nguyên liệu...........................................................................................26
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




iv

2.1.2. Hóa chất, thiết bị................................................................................... 26
2.2. Địa điểm và thời gian...............................................................................28
2.3. Phương pháp nghiên cứu..........................................................................28
2.3.1. Phương pháp thu mẫu lá chè.................................................................28
2.3.2. Phương pháp định lượng một số hợp chất polyphenol ở chè bằng
HPLC.................................................................................................... 28

2.3.3. Phương pháp sinh học phân tử..............................................................32
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...............................................36
3.1. Định lượng một số hợp chất polyphenol ở chè bằng HPLC....................36
3.2. Định lượng sự biểu hiện của gen mã hóa enzyme tham gia tổng hợp
polyphenol ở chè...................................................................................38
3.3. Mối liên quan giữa hàm lượng catechins với sự biểu hiện của gen LAR
và ANR ở chè trung du xanh và chè trung du tím.................................45
KẾT LUẬN....................................................................................................48
KIẾN NGHỊ...................................................................................................48
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................49

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




ABTS:
ANR:
BHA:
BHT:
C:
cDNA:
DNA:
DPPH:
EC:
ECG:
EGC:
EGCG:
GC:
LAR:

RNA:
PAL:
Đtg:
HPLC:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Cơng nghệ thông tin – ĐHTN




vi

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại khoa học của cây chè........................................................5
Bảng 1.2. Thành phần các hợp chất polyphenol trong lá chè xanh...................7
Bảng 2.1. Các mẫu chè nghiên cứu.................................................................26
Bảng 2.2. Các chất chuẩn và pic ion nhận dạng............................................. 29
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA...........................................33
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt thực hiện phản ứng tổng hợp cDNA.....................33
Bảng 2.5. Danh sách và trình tự các mồi được sử dụng trong nghiên cứu
định lượng sự biểu hiện của gen 34
Bảng 3.1. Phương trình đường chuẩn và hệ số tương quan của các chất
tham chiếu 37
Bảng 3.2. Hàm lượng các chất tham chiếu (mg/g)..........................................38
Bảng 3.3. Giá trị chu kì ngưỡng Ct của các gen trên hai mẫu chè chạy lần 1 43
Bảng 3.4. Giá trị chu kì ngưỡng Ct của các gen trên hai mẫu chè chạy lần 2 43
Bảng 3.5. Giá trị ΔCt của các gen ở hai mẫu chè............................................44

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Các nhóm có chức năng chống oxy hóa của các polyphenol............8
Hình 1.2: Cơ chế chống oxy hóa của polyphenol............................................. 9
Hình 1.3. Các con đường sinh tổng hợp polyphenol ở chè.............................16
Hình 1.4. Các dẫn xuất của catechins……………………………………….18
Hình 1.5. Sơ đồ tổng hợp catechin ở chè……………………………………21
Hình 3.1. Sắc ký đồ HPLC tại 280 nm (A) và phổ ESI-MS negative của 5
chất chuẩn C (1), GC (2), EGC (3), EGCG (4), ECG (5) (B-F). 36
Hình 3.2. Sắc ký đồ UV 280nm của 05 chất chuẩn (A) và 08 mẫu thí nghiệm . 37

Hình 3.3. Đồ thị khuếch đại của các gen trong phản ứng real-time................41
Hình 3.4. Biểu đồ đỉnh nóng chảy của sản phẩm khuếch đại trong các ống
phản ứng

43

Hình 3.5. Biểu đồ so sánh sự biểu hiện của hai gen LAR, ANR trong hai
mẫu chè tím và chè xanh. CT: chè tím, CX: chè xanh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN



45

1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cây chè (Camellia sinensis O. Kuntze) là loại cây cơng nghiệp lâu năm,
có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới và Á nhiệt đới, là cây trồng xuất hiện từ lâu
đời, có ảnh hưởng lớn đến cuộc sống nhân loại và có bề dày lịch sử phát triển.
Chè là loại nước uống phổ biến nhất mang tính toàn cầu. Việc uống chè
truyền thống đã giúp cho con người dần dần nhận biết những giá trị đích thực
của chè đối với sức khỏe, những cảm nhận ban đầu của người dùng chè lâu
năm đã từng bước kiểm chứng và khẳng định thơng qua hàng trăm cơng trình
nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới về các hợp chất thiên nhiên có
trong chè. Nước chè có tác dụng giải khát, khắc phục được sự mệt mỏi của cơ
bắp và hệ thần kinh trung ương, kích thích vỏ đại não làm cho tinh thần minh
mẫn sảng khoái, hưng phấn trong những thời gian lao động căng thẳng cả về
trí óc và chân tay, ngăn chặn sự phát triển và tiến triển của bệnh Alzheimer
[30], làm giảm khả năng hình thành sỏi thận [44]. Nhiều nhà nghiên cứu cho
rằng, chè cũng là một loại thuốc, một cây cho kháng sinh tốt mà không độc
đối với cơ thể con người, chữa được một số bệnh đường ruột như kiết lị, tiêu
chảy, lợi tiểu [16]... Hơn nữa, uống chè cịn kích thích tiêu hố mỡ, chống béo
phì [38]; chống viêm [35]; chống sâu răng, hơi miệng và ung thư vịm họng
[28]; phòng ngừa ung thư [18]; phòng ngừa bệnh tăng huyết áp [26]; tiểu
đường [25] và ngăn ngừa cholesteron tăng cao [29]. Ngồi ra, chè cịn có khả
năng bảo vệ da khỏi tác hại của tia cực tím [28]. Chè cũng được cho là ức chế
sự xâm nhiễm và sinh sản của HIV [31]. Hầu hết các đặc tính có lợi cho sức
khỏe được liệt kê ở trên đã được chứng minh là do các hợp chất polyphenol
có trong chè. Ở Việt Nam việc nghiên cứu về hóa học và tác dụng sinh dược
học của các polyphenol khai thác từ chè với mục đích phục vụ y - dược học là
một hướng nghiên cứu mới; mới dừng lại ở kinh nghiệm dân gian đơn giản;

chưa quan tâm khai thác nguồn nguyên liệu giàu các chất polyphenol thiên
nhiên từ chè vào mục đích phịng và chữa bệnh cho con người.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




2

Mặt khác, chất lượng của sản phẩm chè ngoài phụ thuộc vào cơng nghệ
chế biến cịn chịu ảnh hưởng rất lớn bởi chất lượng nguyên liệu sử dụng. Có
khoảng 120 – 130 hoạt chất khác nhau trong cây chè và chúng sắp xếp thành
các nhóm sau: nhóm đường; nhóm pectin; nhóm tinh dầu; protein và axit
amin; các sắc tố; các chất vô cơ; vitamin; các enzyme; chất nhựa; các chất
hữu cơ; các hợp chất thứ cấp (polyphenol, tannin, cafein….). Trong đó hàm
lượng polyphenol, sẽ quyết định đến chất lượng của sản phẩm chè [6]. Có rất
nhiều các hợp chất polyphenol được tìm thấy ở chè, cả polyphenol đơn giản
và polyphenol phức tạp, trong đó flavonoid là thành phần polyphenol chủ yếu
được tổng hợp từ các polyphenol đơn giản [9]. Các thành phần hàm lượng
polyphenol này lại thay đổi rất lớn theo giống và chất lượng nguyên liệu. Vì
vậy việc nghiên cứu, điều tra tìm ra những vùng chè, giống chè có hàm lượng
và chất lượng polyphenol ưu việt để định hướng khai thác một cách có hiệu
quả nguồn nguyên liệu phong phú này vào mục đích phục vụ sức khỏe cộng
đồng là một hướng nghiên cứu mới, cần thiết và có nhiều triển vọng.
Việt Nam là một trong những quốc gia có diện tích trồng chè lớn, có nhiều
vùng chè với các đặc điểm sinh thái đặc trưng, trồng nhiều giống chè khác
nhau. Trong đó, giống chè Trung du từ lâu đã được coi là khởi thủy của cây
chè Việt Nam, có khả năng chịu bệnh, chịu hạn, sinh trưởng mạnh, giá trị kinh
tế cao, bảo vệ môi trường sinh thái. Tuy nhiên do đã được trồng nhiều năm
nên dần bị thối hóa năng suất và chất lượng thấp [2][10] cần bảo tồn và

nghiên cứu để phục vụ các lợi ích của cây chè đặc biệt là khả năng chữa bệnh.
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Định
lượng một số hợp chất polyphenol và sự biểu hiện của gen mã hóa enzyme
tham gia tổng hợp polyphenol ở chè”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Định lượng một số hợp chất polyphenol ở các giống chè trồng tại Thái
Nguyên và nghiên cứu mối liên quan với sự biểu hiện của gen từ giống chè
Trung du.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




3

3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Chiết xuất và định lượng một số hợp chất polyphenol từ lá
của một số giống chè trồng ở Thái Nguyên.
Nội dung 2: Nghiên cứu định lượng sự biểu hiện ở mức độ phiên mã của
gen LAR và ANR tham gia tổng hợp một số hợp chất catechins ở chè Trung
du.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




4

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về cây chè
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại
Theo Trịnh Xuân Ngọ (2009)[14] cây chè có nguồn gốc từ Đơng Nam
Á

Đây là một loại cây công nghiệp lâu năm, cho hiệu quả kinh tế cao, được

trồng ở hơn 30 quốc gia. Những nước trồng chè phổ biến là: Trung Quốc, ấn
Độ, Srilanca, Nhật Bản, Nga, Đài Loan, Việt Nam….Việt Nam là một trong
những nước có tiềm năng và điều kiện thuận lợi để phát triển sản xuất chè:
diện tích đất theo qui hoạch để trồng chè rất lớn (trên 200.000 ha); điều kiện
khí hậu rất phù hợp cho cây chè phát triển: lắm nắng, mưa nhiều - lượng nước
mưa trung bình 1700 - 2000mm/ năm, độ ẩm khơng khí 80 -85%, - nhiệt độ
trung bình 21 - 22,60C; đất trồng chè gồm hai loại là phiến thạch sét và bazan
màu mỡ … Ngày nay, ở hầu hết các tỉnh có điều kiện thuận lợi đều trồng chè,
song ba vùng trồng nhiều nhất là:
-

Vùng chè thượng du (Hà Giang, Tuyên Quang, Lai Châu, Yên Bái)

chiếm khoảng 25% sản lượng chè miền Bắc.
-

Vùng trung du (Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Bắc Cạn, Thái Nguyên). Đây là

vùng chè chủ yếu chiếm đến 75% sản lượng chè miền Bắc với nhiều nhà máy
sản xuất lớn.
-

Vùng chè Tây Nguyên (Gia Lai, Kon Tum, Lâm Đồng, Đắc Lắc) chủ

yếu trồng giống chè Ấn Độ và chè shan, chè Ô long.
Trong đó vùng chè Thái Nguyên là vùng có sản lượng chè lớn thứ 2
trong cả nước và rất nổi tiếng với sản phẩm chè đặc sản Tân Cương. Thái
Nguyên hiện có 16746 ha chè, trồng chủ yếu là các giống Trung du (TDLX,
LDP1).
Về phân loại khoa học cây chè được thể hiện trong bảng 1.1:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




5

Bảng 1.1. Phân loại khoa học của cây chè [14]

Giới
Ngành
Bộ
Họ
Chi
Loài
1.1.2. Đặc điểm hình thái
Cây chè có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội 2n = 30, thuộc loại thân gỗ hoặc
thân bụi và được trồng để thu lá làm nguyên liệu cho công nghiệp chế biến và
mang một số đặc điểm sinh học sau đây:
- Hình thái:
Thân: thẳng và trịn, phân nhánh liên tục thành một hệ thống cành và
chồi. Trên thân có mấu chia thành nhiều lóng.
Cành: do mầm dinh dưỡng biến đổi thành. Trên cành chia ra làm nhiều

đốt, chiều dài đốt cành biến đổi từ 1 – 10 cm tùy theo giống và điều kiện sinh
trưởng.
Chồi: mọc ra từ nách lá, chia theo sự biệt hóa của chồi có chồi dinh
dưỡng mọc ra lá và chồi sinh thực mọc ra nụ, hoa, quả.
Lá: lá chè là loại lá hình đơn ngun, có hệ gân lá rất rõ, rìa lá có răng
cưa, chiều dài từ 4 – 15 cm, rộng từ 2 – 5 cm.
Hoa: hoa chè là loại hoa lưỡng tính, trong hoa có 5 - 8 cánh màu trắng,
có khi lại hơi phớt hồng.
Quả: quả chè là một loại quả nang có từ 1 - 4 hạt. Quả chè có dạng hình
trịn, tam giác, vng tùy theo số hạt.
Hạt: hình cầu, bán cầu, tam giác tùy giống chè; vỏ sành thường màu
nâu, cứng, bên trong là lớp vỏ mỏng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Cơng nghệ thông tin – ĐHTN




6

Hệ rễ: gồm rễ cọc (trụ), rễ dẫn (hay rễ nhánh, rễ bên) màu nâu hay nâu
đỏ và rễ hút hay rễ hấp thụ màu vàng ngà [2].
-

Đặc tính sinh lý, sinh thái của cây chè: Nhiệt độ khơng khí thuận lợi cho sự

sinh trưởng và phát triển của chè là 22 - 28 oC, độ ẩm khơng khí tương đối
thích hợp là 80 - 85 %. Hàm lượng nước cần thiết cho cây chè biến động tùy
từng giống chè. Loại đất thích hợp cho trồng chè dày 60 - 100 cm; mực nước
ngầm dưới 100 cm; độ chua pH: 4,5 - 5,5; tỷ lệ mùn 3 - 4 %[3].
-

Sinh trưởng và phát triển của cây chè: Sự phát triển của cây chè chia làm

hai chu kỳ: chu kì phát triển lớn gồm suốt đời sống cây chè từ khi hạt nảy
mầm đến khi cây chết và chu kì phát triển nhỏ bao gồm các giai đoạn sinh
trưởng, phát triển lặp lại nhiều lần trong một năm[2][3].
1.1.3. Thành phần hóa học của chè
Thành phần chính của lá chè là nước chiếm 75-82%, có liên quan đến
q trình biến đổi sinh hóa trong búp chè và đến sự hoạt động của các
enzyme, là chất quan trọng không thể thiếu được duy trì sự sống của cây [7].
Bên cạnh thành phần chính là nước thì thành phần và hàm lượng các chất
hịa tan trong chè là một trong mối quan tâm hàng đầu đối với các nghiên cứu
về chè xanh [6][3].Trong đó, nhóm chất tannin được xem như thành phần
chính, chiếm khoảng 27- 34% chất khô trong chè. Tanin gọi chung là hợp chất
phenol thực vật bao gồm các phonyphenol đơn giản và các polyphenol đa
phân tử, bên cạnh đó chúng cịn kèm theo các hợp chất phenol thực vật phi
tannin có màu và vị rất đắng. Tỷ lệ các chất trong thành phần hỗn hợp của
tannin chè không giống nhau và tùy theo từng giống chè mà thay đổi. Tuy
nhiên, người ta đã xác định được trong chè tannin gồm 3 nhóm chủ yếu là
catechins, flavonol và glycoside, anthocyanidin và leucoanthocyanidin. Theo
Chi - Tang Ho (2008) trong lá chè chứa hàm lượng polyphenol tương đối cao,
thành phần chính của polyphenol trong lá chè được trình bày trong bảng 1.2 :

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




7

Bảng 1.2. Thành phần các hợp chất polyphenol trong lá chè xanh[21]
Thành phần
Tổng số
Flavan-3-ols (Catechin)
Flavonol và glycosides
Anthocyanins và Leucoanthocyanidin
Phenolic
1.1.4. Tác dụng sinh học của cây chè
Nghiên cứu của các nhà khoa học trong và ngoài nước, cho thấy chè
xanh mang lại nhiều tác dụng nhờ thành phần hóa học đa dạng với các chất hỗ
trợ sức khỏe và phòng chống bệnh tật.
Theo Ts. Ngô Đức Phương, nguyên cán bộ Khoa Tài nguyên- Dược liệu,
viện Dược liệu đã đưa ra kết quả. Về dược lý học chè có vị đắng chát, tính
mát, có tác dụng thanh nhiệt giải khát, tiêu cơm, lợi tiểu, da thịt mát mẻ, bớt
mụn nhọt và cầm tả lị. Do có cafein và theophyllin, chè xanh được xem là một
chất kích thích não, làm tăng hơ hấp, tăng cường và điều hoà nhịp đập của
tim[16].
Thành phần catechins có trong chè xanh đã được nghiên cứu chứng minh
có tác dụng giảm nguy cơ gây ung thư, giảm kích thước khối u, diệt khuẩn...
Ngoài ra, các nghiên cứu trên thế giới cũng cho thấy tác dụng chống phóng xạ
của chè xanh. Các flavonol và polyphenol làm cho chè có tính chất của
vitamin P[11].
Những chất polyphenol có trong chè xanh có vai trị quan trọng trong
việc phịng chống bệnh ung thư. So với chè đen thì chè xanh có hàm lượng
polyphenol cao hơn vì khơng bị biến đổi thành phần hóa học trong các phản
ứng sinh hóa[7]. Đặc biệt, EGCG là loại polyphenol chủ yếu tạo nên dược
tính của chè xanh, nó có cơng dụng ngăn ngừa các enzyme kích hoạt sự sao
chép và q trình phân bào[13].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

8

TS. Ngơ Đức Phương phân tích thêm, các thành phần vitamin trong chè
cũng có tác dụng tích cực đối với sức khỏe, ví dụ như vitamin C giúp làm tăng
sức đề kháng và chống bệnh cúm; vitamin nhóm B trợ giúp cho quá trình trao
đổi carbon hydrat; vitamin E tác dụng chống oxy hóa và hạn chế lão hóa [16].
1.1.4.1. Hoạt tính chống oxy hóa
Có nhiều nghiên cứu đã khẳng định hoạt tính chống oxy hóa chính của
chè là do hoạt tính của các polyphenol. Nghiên cứu của Mai Tuyên, Vũ Bích
Lan và Ngơ Đại Quang chỉ ra hoạt tính chống oxy hóa của polyphenol tách
chiết từ lá chè xanh để bảo quản hạt dầu cải đã đưa ra kết luận polyphenol
chiết xuất từ lá chè xanh thứ phẩm có tác dụng kháng oxy hóa rất rõ rệt và
mạnh hơn nhiều so với ascorbic acid và tocopherol . Tác dụng sinh học của
các polyphenol chè hay của dịch chiết lá chè xanh được giải thích là do chúng
có tác dụng khử các gốc tự do, giống như tác dụng của các chất antioxidant.

Hình 1.1. Các nhóm có chức năng chống oxy hóa của các polyphenol[11]
Cơ chế chống oxy hóa của chè thuộc cơ chế chống oxy hóa của các hợp
chất phenol. Tính chống oxy hóa của các ankylphenol thể hiện ở chỗ chúng có
khả năng vơ hiệu hóa các gốc peroxyt, do đó nó có thể cắt mạch oxy hóa. Sản
phẩm đầu tiên xuất hiện là các gốc phenol tạo thành do nguyên tử hydro của
nhóm hydroxyl được nhường cho gốc peroxyt:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Cơng nghệ thông tin – ĐHTN

9

Hình 1.2: Cơ chế chống oxy hóa của polyphenol[11]
Các gốc phenol rất ổn định, kém hoạt tính, nhờ vậy chúng khơng có khả
năng sinh mạch oxy hóa tiếp theo. Hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất
ankylphenol được tăng lên bằng cách hydroxyl hóa và phân tử phenol, vì các
hợp chất polyphenol có hoạt tính tốt hơn monophenol. Chúng có một số tính
chất sau:
Dạng khử của chúng có thể phản ứng với gốc tự do, chuyển thành dạng
oxy hóa:

Dạng oxy hóa của chúng có thể chuyển thành dạng lưỡng gốc và như vậy
chúng có khả năng phản ứng với hai gốc tự do nữa:

Đặc biệt dạng oxy hóa và dạng khử của chúng có thể tương tác với nhau
thuận nghịch tạo gốc Semiquinon:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




10

Ngồi ra các hợp chất catechin trong chè có khả năng tạo phức kim loại
chủ yếu Fe, Cu, đây là những chất xúc tác để tạo ra gốc tự do. Tỷ lệ EGC,
EGCG và EC tạo phức kim loại là 3:2, 2:1, 2:1, 3:1 [21].
1.1.4.2. Hoạt tính kháng khuẩn
Tháng 8/1996, Shimaura công tác tại trường Đại học y khoa Showa
(Nhật Bản) đã có cơng trình diễn thuyết “về tác động diệt khuẩn E.coli - 157”

tại hội thảo chuyên đề diệt khuẩn của chè xanh. Ông đã khẳng định rằng
catechin trong chè xanh có khả năng tiêu diệt các loại vi khuẩn làm hư hỏng
thực phẩm và loại bỏ các độc tố do chúng gây ra. Cơ chế hoạt động của các
catechin là phá hủy màng tế bào bên ngoài của vi khuẩn [25].
EGCG và EGC là catechin có khả năng kháng khuẩn mạnh nhất.
Catechin là polyphenol có thể gây ra hiện tượng ngưng kết bằng cách tạo liên
kết trực tiếp với protein. Đây là tính chất đặc trưng của catechin chịu trách
nhiệm cho hoạt tính kháng khuẩn [36].
1.2. Polyphenol ở chè
1.2.1. Thành phần polyphenol ở chè
Hợp chất phenol là các nhóm chất khác nhau rất phổ biến trong thế giới
thực vật, chúng thường tồn tại dưới dạng glycozit dễ tan trong nước và thường
tập trung ở các không bào của tế bào thực vật [11].
Đặc điểm chung của chúng là trong phân tử có vịng thơm (vịng benzen)
mang một hay hai, ba ...hoặc nhiều nhóm hydroxyl (OH) gắn trực tiếp vào
vịng benzen. Tuỳ thuộc vào số lượng và vị trí tương hỗ của các nhóm này mà
các tính chất lý hố học hoặc hoạt tính sinh học thay đổi. Dựa theo số lượng
nhóm hydroxyl mà người ta phân biệt phenol thành các nhóm sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




11

Nhóm phenol đơn giản: gồm các chất được cấu tạo từ 1 vịng benzen và
1 hay nhiều nhóm OH, được phân thành các: mono phenol; di phenol
(pyrocatechin, rezoxyn...); tri phenol (pyrogalon, oxy hydroquinon...).
Nhóm hợp chất phenol phức tạp (polyphenol): trong thành phần cấu tạo,
ngồi vịng benzen cịn có dị vịng mạch nhánh, được phân thành các nhóm:

monome và polymer .
-

Monome (hay polyphenol đơn giản) được chia thành:

+ Nhóm C6 - C1 (axit phenol cacbonic): trong cấu trúc phân tử có thêm
nhóm cacbonyl, thường gặp ở hạt nảy mầm.
+

Nhóm C6 - C3 (axit cumaric, axit cafeic): có gốc cacbonyl được nối với

nhân benzen qua hai nguyên tử cacbon, thường gặp ở thực vật bậc cao.
+

Nhóm C6 - C3 - C6: gọi là các Flavonoid và được chia thành các nhóm

phụ như flavon, flavonol (sắc tố vàng), anthocyanidin (sắc tố xanh, đỏvà tím),
catechin (khơng màu)...
- Nhóm hợp chất polyphenol polymer: được chia thành các nhóm phụ
như Tanin, Lignin, Axit Humic….[15].
Các hợp chất polyphenol chiếm một vị trí quan trọng trong đời sống thực
vật, chúng tham gia vào nhiều quá trình sinh lý và sinh hố quan trọng; vào
các q trình trao đổi chất dưới nhiều hình thức khác nhau như quá trình hơ
hấp tế bào (vận chuyển H

+

trong q trình phosphoryl hố oxy hố ...), q

trình quang hợp, điều hịa sinh trưởng phát triển của thực vật…[4].

Thành phần polyphenol của lá chè rất đa dạng, nhưng bao gồm chủ yếu
là các flavonoid và tannin. Các polyphenol này chiếm 20 - 35 % trọng lượng
chè khô (ở lá búp non). Trong số các polyphenol thiên nhiên, các hợp chất
flavonoid có ý nghĩa thực tiễn lớn vì chúng phân bố rộng rãi trong thế giới
thực vật, ít độc đối với cơ thể và có nhiều hoạt tính sinh - dược học giá trị.
Các flavonoid không được tổng hợp ở người và động vật; chúng được tìm
thấy ở động vật là do động vật ăn thực vật mà có. Flavonoid được cấu tạo bởi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




12

khung cacbon C6 - C3 - C6, gồm 2 vòng Benzen (vòng A và B) và một vòng
pyron (vòng C); trong đó vịng A kết hợp với vịng C tạo thành khung
Chroman [15]. Trong thực vật flavonoid tồn tại ở 2 dạng: Dạng tự do (gọi là
aglycon) và dạng liên kết với đường (glycozit). Các glycozit khi bị thủy phân
bằng axit hoặc enzyme sẽ giải phóng ra đường và aglycon. Tùy theo mức độ
oxy hóa của mạch 3 cacbon, sự có mặt hay khơng của nối đơi giữa C 2 = C3 và
nhóm Cacbonyl ở C4 mà phân loại các Aglycon của Flavonoid thành các
nhóm phụ sau:
-

Flavon,

Flavonol,

Flavanon,

Flavanonol,

Catechins,

Leucoanthocyanidin, Anthocyanidin, Chalcon, Auron.
-

Catechins là hợp chất Flavonoid phổ biến trong thiên nhiên và có nhiều

trong quả và lá chè.
-

Ngồi ra cịn có các dẫn xuất:

+

IsoFlavonoid (vòng B nối với vòng C ở vị trí C3)

+

NeoFlavonoid (vịng B nối với vịng C ở vị trí C4)

+

BiFlavonoid (2 phân tử Flavonoid liên kết với nhau)[36].

Các cơng trình nghiên cứu đã cho biết thành phần Flavonoid trong lá chè
xanh chủ yếu là:
-

Các dẫn xuất của catechins: catechin, epigallocatechin, gallocatechin,

epigallocatechin gallat, epicatechin, epicatechin gallat…
-

Các chất flavonol: Quercetin, Kaempferol, Myricetin và các dẫn xuất

khác của flavonol
-

Theaflavin và diosmin: Theaflavin sản phẩm của sự oxy hóa đồng thời

epigallocatechingalat và epigallocatechin[23].
Còn các Flavonoid trong chè đen chủ yếu là Theaflavin và Thearubigin.
Thearubigin là nhóm sản phẩm oxy hóa đã bị polymer hóa của catechins và
các hợp chất gallat của nó [31].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Cơng nghệ thông tin – ĐHTN




13

Những năm gần đây, flavonoid là một trong những hợp chất được đặc
biệt quan tâm bởi các kết quả nghiên cứu cho thấy flavonoid có tác dụng to
lớn đối với sức khỏe của con người. Flavonoid là nhóm hợp chất có nhiều tác
dụng sinh học. Có thể chia các hoạt tính sinh học và cơ chế tác dụng đối với
cơ thể người của flavonoid thành các nhóm như sau:
-

Tác dụng chống oxy hóa: Flavonoid được gọi là "Những tác nhân thu

dọn và hủy diệt" các gốc tự do độc hại. Tác dụng chống oxy hóa của
Flavonoid tăng dần khi tăng nồng độ của chúng và tuân theo trật tự: fustin <
catechin < quercetin < rutin = luteolin < kaempferol < morin[22][24].
-

Tác dụng đối với các enzyme sinh học: Các Flavonoid có khả năng tác

động đến hoạt động của nhiều hệ enzym động vật trong các điều kiện in vitro
và in vivo. Do bản thân các chất Flavonoid khi ở trong cơ thể động vật tồn tại
ở

dạng oxy hóa hoặc khử và chịu nhiều biến đổi phức tạp cho nên có thể

trong các điều kiện khác nhau nó sẽ thể hiện hoạt tính sinh học khác nhau:
kìm hãm hoặc kích thích hoạt động enzyme, hoặc kích thích có mức độ và có
điều kiện - theo những cơ chế phức tạp hơn trong những nghiên cứu in
vitro[17].
- Tác dụng đối với chuyển hóa và trên lâm sàng: Chè xanh cho thấy sự
hấp thụ các chất oxy hóa trong chè xanh diễn ra nhanh. Các chất chống oxy
hóa đi vào vịng tuần hồn ngay sau khi uống vào làm cho lượng chất chống
oxy hóa trong huyết tương tăng lên đáng kể. Các Flavonoid có tác động sâu
sắc lên chức năng của các tế bào miễn dịch và tế bào viêm. Trong các nghiên
cứu trên động vật hai este methyl EGCG tách chiết từ Chè ơlong gây kìm hãm
đáng kể lên các phản ứng dị ứng trên chuột. Flavonoid baicalin trong các
nghiên cứu gần đây cho thấy có hoạt tính chống viêm và chống HIV -1 theo
cơ chế gây cản trở sự tương tác giữa các protein vỏ của HIV -1 với các
receptor và ngăn chặn HIV -1 tấn công vào các tế bào đích [31].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Cơng nghệ thông tin – ĐHTN

14

-

Tác dụng kháng sinh, chống viêm nhiễm: Tác dụng chống viêm nhiễm

và kháng khuẩn của Flavonoid đã được nhiều công trình nghiên cứu trên thế
giới chứng minh. Một số tác giả nghiên cứu tác dụng của 24 anthoxyanin,
leucoanthoxyanin và axit phenolic lên Salmonella (vi khuẩn thương hàn) và
thấy có tác dụng kìm hãm rõ rệt. Hầu hết các chất này đều có khả năng kìm
hãm sự hơ hấp hay phân chia của vi khuẩn khi có mặt glucoza. Tác dụng
kháng virut của Flavonoid cũng đã được khẳng định; Chang-Qi Hu và cộng sự
đã nghiên cứu khả năng ức chế virut HIV ở các tế bào H9 của 35 Flavonoid
chiết xuất từ thực vật và tổng hợp - đã thấy rằng các hợp chất có nối đơi ở vị
trí C2 = C3 và có nhóm OH ở C6 và C4 thể hiện hoạt tính cao hơn các
Orthodiphenol[22][24].
- Tác dụng đối với ung thư: Tác dụng ngăn chặn và chữa trị bệnh ung thư
của chè và các hợp chất catechins được nghiên cứu mạnh mẽ nhất. Khi tiến
hành nghiên cứu in vivo, nhiều cơng trình cơng bố đã cho thấy chè và các chất
trích ly từ chè như EGCG, EGC, ECG… của chè có khả năng tương tác, ngăn
chặn và hạn chế quá trình khơi mào, hình thành và phát triển của tế bào ung
thư. Trong giai đoạn khơi mào, các hợp chất catechins trung hịa các tác nhân
bị kích hoạt bởi cytochrome P450 enzyme, tác nhân này có khả năng tương
tác làm thay đổi cấu trúc của DNA, ngăn chặn sự tạo thành nitrosamine, một
nhóm các hợp chất phát sinh từ khói thuốc lá, các amine dị vịng trong thịt, cá
nấu chín, các tác nhân được cho là có thể gây ung thư. Các thử nghiệm in vivo

cho thấy khả năng tương tác trực tiếp và tăng cường hiệu quả của EGCG, EC
vào hệ thống bảo vệ bằng enzyme của tế bào, hạn chế sự hình thành của các
tác nhân gây biến đổi trong tế bào. Trong giai đoạn bắt đầu của tế bào ung
thư, EGCG có khả năng ức chế AP-1, một chất dẫn truyền khơi mào cho sự
phát triển của tế bào ung thư da, thể hiện khả năng ngăn chặn protein kinase.
Enzyme kích hoạt tế bào trong giai đoạn phát triển của tế bào ung thư, ức chế
hoạt động của telomerase, làm giảm thời gian sống của tế
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN




15

bào ung thư. Trong quá trình ung thư diễn ra, EGCG có thể can thiệp, ức chế
hoạt đơng của urokinase, enzyme đóng vai trị quan trọng trong q trình phát
triển và biến đổi của tế bào ung thư, phá hủy các dạng biến đổi đặc thù của tế
bào gây ra do adevirus, hay ngăn chặn quá trình tổng hợp DNA trong tế bào
ung thư hepatoma, leukemia, và ung thư phổi… [19][20].
1.2.2. Con đường sinh tổng hợp polyphenol ở chè
Vai trò của polyphenol là chất chống oxy hóa được biết đến và đang
được nghiên cứu như các tác nhân có thể làm giảm yếu tố nguy cơ liên quan
đến bệnh ung thư và bệnh tim [19].
Các chất polyphenol chống lại sự tạo thành enzyme Cox-2, tác nhân gây
viêm khớp, vậy chè có thể làm giảm đau viêm khớp. Ở chè xanh chứa cả
polyphenol đơn giản và phức tạp. Hàm lượng catechin (30%) và flavonol
(0,2-5%) là các hợp chất chủ yếu của polyphenol . Hàm lượng polyphenol
quyết định đến màu sắc, độ chát của nước chè và góp phần tạo hương vị của
chè. Hầu hết các đặc tính có lợi cho sức khỏe của chè đã được chứng minh là
do các hợp chất polyphenol [29].

Polyphenol được sinh tổng hợp thông qua con đường sau (Hình 1.3):

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




16

Phenylalanine
PAL

Cinnamic acid
C4H

4-Coumaric acid
4CL

F3’H

Dihydroflavonol

Dihydroquercetin

DFR

Dihydromyricetin

FLS

Flavonol