Nghiên cứu nhân giống thông caribê pinus caibaea morlet bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

1

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP
------------------

NGUYỄN VĂN PHONG

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG THÔNG CARIBÊ ( Pinus caribaea
Morelet ) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP

HÀ NỘI - 2009


2

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP
-------------------

NGUYỄN VĂN PHONG

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG THÔNG CARIBÊ ( Pinus caribaea

Morelet ) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO

Chuyên ngành: Lâm học
Mã số: 60. 62. 60

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. CHU HOÀNG HÀ

HÀ NỘI - 2009


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Việc nâng cao chất lượng rừng, sử dụng các lồi cây có giá trị về kinh tế
và mơi trường, sinh trưởng nhanh, thích ứng được nhiều điều kiện sinh thái,
lập địa không tốt là chiến lược phát triển của ngành Lâm nghiệp từ năm 2010
đến 2020. Bên cạnh việc lựa chọn các loài cây bản địa cho trồng mới, khoanh
nuôi làm giàu rừng, công tác nghiên cứu, khảo nghiệm trồng thử các lồi cây
ngoại lai đóng vai trị rất quan trọng (Quyết định số 18/2007/QĐ-TTg ngày 5
tháng 2 năm 2007 của thủ tướng chính phủ) [1]. Hiện nay, Thơng caribê
(Pinus caribaea Morelet), là một trong những lồi cây lâm nghiệp đang được
quan tâm phát triển [11], [19].
Thông caribê thuộc họ thông (Pinaceae) với 3 biến chủng là: Pinus
caribaea var caribaea, Pinus caribaea var hondurensis và Pinus caribaea var
bahamensis có phân bố tự nhiên ở vùng Trung Mỹ. Thơng caribê đã được du
nhập vào nhiều nước khác nhau, chủ yếu là các nước thuộc vùng nhiệt đới và
á nhiệt đới. Ở Việt Nam, Thông caribê được đưa vào trồng khảo nghiệm từ

năm 1963 tại vùng Đà Lạt (Lê Đình Khả, 2003). Đây là loài cây lá kim sinh
trưởng nhanh, thẳng đẹp, cành nhánh nhỏ hơn Thông Ba lá, Thông Mã vĩ và
Thơng nhựa, gỗ có thớ thẳng mịn, độ bóng vừa phải, thường được sử dụng
làm ván ép (Bredenkamp và Van Vuuen, 1987). Ngồi ra Thơng caribê cịn
được sử dụng làm gỗ xây dựng, gỗ trụ mỏ, ván dăm, ván ép, bột sợi giấy dai,
gỗ đóng tàu thuyền, gỗ đóng Contenơ, gỗ đóng nội thất, lấy nhựa… Thơng
caribê cịn có một lợi thế khác là có khả năng thích ứng với nhiều vùng sinh
thái khác nhau của nước ta [3], [9], [11], [19].
Khả năng gây trồng Thông cairibê ở nước ta đã được công bố trong tiêu
chuẩn ngành (04TCN 68 - 2004). Theo quyết định số 62/2006 QĐ-BNN, ngày
16/8/2006 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp & PTNT về chiến lược phát triển
giống cây lâm nghiệp giai đoạn 2006 - 2020, nhu cầu lượng cây giống Thông


2

caribê cần hàng năm trong giai đoạn 2006 – 2015 là 14.000.000 cây/năm. Đây
là số lượng cây giống cần rất lớn, hiện nay Thông caribê hiện được trồng bằng
hạt sinh trưởng khá nhanh. Tuy vậy, việc nhân giống sinh dưỡng, đặc biệt là
nhân giống bằng hom và nuôi cấy mô là cơ sở để tạo nguồn giống có chất
lượng di truyền đồng đều, giữ được đặc điểm di truyền của cây lấy mẫu, làm
cơ sở cho công tác khảo nghiệm dịng vơ tính của những cây trội được chọn
lọc. Nhân cây vơ tính dễ dàng chủ động được nguồn giống, không bị ảnh
hưởng bởi mùa vụ và thời tiết.
Nhân giống sinh dưỡng Thông caribê đã và đang được nhiều nhà khoa học
trong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu và bước đầu thu được một số kết
quả khả quan như: nhân giống bằng hom đã tạo được lượng lớn cây giống với
tỉ lệ hom ra rễ 93,3%…. Ở Việt Nam, nghiên cứu thăm dị nhân giống in vitro
Thơng caribê đã được một số nơi nghiên cứu [7], [23] nhưng đạt hệ số nhân
chồi thấp 1,7 lần (Phạm Thị Kim Thanh, 2007) và chưa xây dựng được quy

trình để có thể ứng dụng trong sản xuất.
Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu
nhân giống Thông caribê (Pinus caribaea Morelet) bằng phương pháp nuôi
cấy in vitro”.
Với mục tiêu nghiên cứu như sau:
+ Tạo được nguồn mẫu sạch đủ lớn từ 2 loại nguyên liệu (hạt chín, chồi
cành từ thực địa).
+ Phát triển quy trình nhân nhanh chồi in vitro hiệu quả, hệ số nhân
chồi cao.
Nội dung nghiên cứu chính
+ Tạo mẫu sạch từ hạt và chồi cành của cây Thông caribê.
+ Tạo đa chồi trong điều kiện nuôi cấy in vitro.
+ Thử nghiệm khả năng tạo rễ in vitro cây Thông caribê.


3

Chương 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
1.1. Giới thiệu cây Thông caribê
1.1.1. Nguồn gốc, phân loại và phân bố
Thông caribê (Pinus caribaea Morelet) là lồi cây nhiệt đới, họ thơng
(Pinaceae) và nằm trong bộ thông (Coniferales) ngành hạt trần (Gynospermae) [3].
Thông caribê là lồi thơng bản địa ở vùng Trung Mỹ. Dựa vào sự phân
bố tự nhiên của loài ở các vùng địa lý khác nhau, Thông caribê được chia
thành 3 biến chủng (Luckhof, 1964; Lamb, 1973) như sau:
- Pinus caribaea var hondurensis (PCH) phân bố dọc bờ biển Đại Tây
Dương vùng Trung Mỹ, từ Belize tới bắc Nicaragua, từ 120 đến 180 vĩ độ Bắc,
từ 83030’ tới 89025’ kinh độ Tây. PCH mọc tự nhiên ở Belize, Guatemala,
Honduras và Nicaragua ở độ cao dưới 1000m so với mặt nước biển. Cây
trưởng thành có thể cao tới 35 - 40m, sinh khối đạt khoảng 10 - 40m3/ha/năm.

- Pinus caribaea var bahamensis (PCB) phân bố ở quần đảo Bahamas
và Caicos (240 - 270 vĩ độ Bắc, 71040’ - 790 kinh độ Tây). Cây mọc ở độ cao
gần 12m so với mặt nước biển, cây trưởng thành cao khoảng 15 - 20m.
- Pinus caribaea var caribaea (PCC) phân bố ở phía tây Cuba và trên
đảo thông (220 - 230 vĩ độ Bắc, 82020’ - 84015’ kinh độ Tây). Cây mọc tự
nhiên ở độ cao dưới 280m so với mặt nước biển.
Vùng phân bố tự nhiên của PCH từ bờ biển vào sâu trong lục địa nên
sự biến động của các yếu tố khí hậu là khá lớn. Ví dụ nhiệt độ mùa đơng ở nội
địa của Belize có thể xuống tới 50C, trong khi mùa hè có thể nóng tới 370C.
Tuy nhiên, nhiệt độ khơng bao giờ xuống tới mức đóng băng. Lượng mưa
phân bố không đều giữa các vùng, biến động từ 1.500mm/năm ở núi thông
(Belize) tới 3.900 mm/năm ở Bluefields (Nicaragua). Những lâm phần thơng
ở sâu trong lục địa có lượng mưa thấp hơn so với ven biển. Lượng mưa hàng
năm ở thung lũng sơng Choluteca ở Hunduras có thể xuống tới 660mm với 6


4

tháng lượng mưa khơng vượt q 40mm/tháng. Vì phân bố ở vùng Trung Mỹ,
PCH thích hợp với nhiều loại đất, từ đất cát xốp, thoát nước tốt, đất phù sa
dọc bờ biển Đại Tây Dương tới các loại đất trong lục địa được hình thành từ
các loại đá mẹ phiến thạch, granite, schist và đá cát với độ PH từ 4 đến 5, tầng
đất từ dày tới mỏng. Đất sét chặt bí, thốt nước khơng tốt khơng thích hợp với
Thơng caribê [6].
Quần đảo Bahamas và Caicos, nơi PCB mọc tự nhiên có khí hậu ấm áp,
mùa đơng khơ và khơng có sương muối. Biến động về nhiệt độ khơng q lớn
giữa các mùa trong năm. Nhiệt độ trung bình dao động từ khoảng 220C ở
tháng lạnh nhất tới 280C ở tháng nóng nhất. Lượng mưa trung bình năm là
1.185mm và tập trung chủ yếu ở các tháng 9 và 10. Lượng mưa biến động từ
khoảng 177mm ở tháng có lượng mưa nhiều nhất tới 32mm ở tháng khô nhất.

Mùa khô từ tháng 11 tới tháng 4 năm sau. PCB nơi ngun sản mọc tốt trên
đất phong hố từ đá vơi san hơ, thốt nước tốt. Loại đất này khá nơng, nghèo
dinh dưỡng và chứa đựng nhiều ơxít sắt bị rửa trơi từ tầng đá vơi. Vì được
hình thành từ đá vơi nên có tính kiềm cao, độ PH = 8,4 hoặc có thể cao hơn.
Tuy nhiên, nấm cộng sinh ở rễ của PCB phát triển tốt ở đất có tính kiềm cao
và có thể sẽ là nguyên nhân chủng này khơng được gây trồng nhiều ở ngồi
nơi phân bố tự nhiên của chúng.
PCC sinh trưởng ở điều kiện biến động lớn về nhiệt độ thì phát triển
kém. Nhiệt độ thấp nhất và cao nhất ở Cuba có thể là từ 120C tới 340C. Lượng
mưa biến động từ 1.060mm/năm ở bờ biển phía Nam tới 1.794mm/năm ở đảo
thơng. Vùng phân bố của PCC cũng có một mùa đơng khơ và lượng mưa tập
trung vào một số tháng mùa hè. PCC nơi nguyên sản thích hợp với đất phát
triển trên đá mẹ phiến thạch hoặc đá cát, thoát nước tốt, độ PH < 5. PCC không
sinh trưởng trên đất đá vôi mặc dù dạng đất này có rất nhiều ở Cuba [10].


5

1.1.2. Đặc điểm sinh học và sinh thái học
Thông caribê cao 15 - 40m, đường kính có thể trên 100cm. Thân thẳng
tán hình tháp. Cành nghiêng sau xoè rộng. Vỏ màu nâu nhạt, nứt dọc sau bong
từng mảng dài. Chồi hình trụ trịn màu nâu thẫm. Lá hình kim mọc cụm trên
đầu cành ngắn, mỗi cụm 3 lá ít khi 4 hoặc 5 lá. Lá dài 15 - 25cm đường kính
1,5mm màu xanh vàng, hai mặt trên có dải phấn trắng, mép có răng cưa nhỏ.
Bẹ bao quanh gốc cụm lá dài 10 - 20mm màu nâu nhạt gồm nhiều lá hình vẩy
trong suốt, sống lâu.
Nón đực hình trụ, dài 1,3 - 3,2cm. Nón cái trên đầu cành non hình viên
chuỳ dài 5 - 10cm, đường kính 2,5 - 3,8cm. Nón cái chín trong 2 năm, lúc đầu
màu tím hồng sau màu xanh, khi chín hố gỗ màu nâu. Nón có cuống ngắn
thuờng vẹo và quặp về phía cành. Vẩy nón hình thoi, mặt vẩy mỏng hơi lồi,

giữa có một gai nhọn gần 1mm. Hạt hình trứng dài 6mm, đường kính 3mm.
Vỏ hạt nâu có nhiều chấm trịn. Hạt có cánh mỏng dài 2 - 2,5cm.
Hệ rễ hỗn hợp, nơi tầng đất dày rễ cọc ăn sâu, nơi tầng đất mỏng hệ rễ
bên rất phát triển.
Là cây ưa sáng, nhạy cảm với sương giá và lửa, là một trong những loài
cây lá kim mọc nhanh trên thế giới, ở lập địa thích hợp cây 15 tuổi tăng
trưởng bình qn năm có thể đạt 1,5m chiều cao và 2,5cm đường kính. Ra
nón tháng 3 - 4. Nón chín tháng 7 - 8 năm sau.
1.1.3. Giá trị sử dụng
Gỗ màu vàng nhạt, lõi màu đỏ, có thớ thẳng mịn, độ bóng vừa phải,
thường được dùng làm ván ép. Thân thẳng, dễ cưa xẻ nhưng phụ thuộc nhiều
vào độ tuổi tương đối cứng tỉ trọng 0,5 - 0,7. Có thể dùng trong xây dựng, làm
trụ mỏ, tiện khắc và bột sợi giấy dai, gỗ đóng tàu thuyền, gỗ đóng Contenơ,
gỗ đóng đồ nội thất…và cho nhiều nhựa chất lượng cao [3].


6

Với tốc độ sinh trưởng nhanh và khả năng thích ứng rộng với các vùng
sinh thái khác nhau trên thế giới, đáp ứng được nhiều mục tiêu kinh tế. Vì thế
Thơng caribê là lồi cây rừng đặc biệt để trồng rừng công nghiệp, được rất
nhiều nước nhập giống gây trồng, chủ yếu là các nước thuộc vùng nhiệt đới
và á nhiệt đới. Việt Nam là một nước nhiệt đới có các điều kiện địa lý khá
tương đồng với sự phân bố tự nhiên của Thơng caribê. Do vậy mà lồi Thông
caribê được đưa vào trồng khảo nghiệm ở nước ta từ năm 1963 và đã có
những thành cơng nhất định [10], [19].
1.1.4. Tình hình sản xuất, gây trồng trong và ngồi nước
* Ở ngồi nước: Thơng caribê đã được dẫn nhập và gây trồng ở trên 65
nước trên thế giới. Giới hạn vĩ độ vùng trồng được mở rộng đáng kể so với
nơi nguyên sản, từ vĩ độ 550 nam ở Argentina tới 330 vĩ độ bắc ở Ấn độ. Giới

hạn kinh độ cũng được mở rộng từ 1800 kinh độ Đông ở fiji tới 1580 kinh độ
Tây ở Hawaii. Độ cao vùng trồng biến động từ mặt nước biển tới 1200m ở
Zaire, 1220m ở Nigeria, trên 1820m ở Uganda và 2400m ở Kenya [11].
Như vậy, Thông caribê đã được gây trồng trên tất cả các dạng khí hậu
của các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới. Vùng phân bố rừng trồng của loài đã
được mở rộng cả về độ vĩ và độ kinh, cả từ vùng có khí hậu miền núi tới khí
hậu cận miền núi và vùng ven biển.
Ở Malaysia, Thơng caribê được trồng trên diện tích lớn và cho sinh
khối bình quân khoảng 17m3/ha/năm. Ở Đặc khu miền Bắc Australia, các xuất
xứ tốt nhất của PCH sau 10 năm sinh trưởng rất nhanh, cho sinh khối bình
quân 22m3/ha/năm. Ở bang Queensland (cũng thuộc Australia), ở 9,5 tuổi,
PCH đạt 16 - 18m3/ha/năm trong khi biến chủng PCB đạt khoảng
14,8m3/ha/năm [38].
* Ở trong nước: Thông caribê được dẫn nhập đầu tiên vào nước ta năm
1963 để trồng thử nghiệm tại Lang Hanh và Lang Linh thuộc tỉnh Lâm Đồng


7

(Lê Đình Khả, 1990; Phí Quang Điện, 2001). Lồi thơng này đã được trồng
thử ở Vĩnh Yên, Phú Thọ, Ninh Bình, Hà Giang, Tuyên Quang, Quảng Ninh,
Bắc Giang, Quảng Nam, Đà Nẵng, gần đây trồng ở Đông Nam bộ và Tây
Nguyên. Kết quả bước đầu cho thấy có thể gây trồng và cho hiệu quả kinh tế
ở một số địa phương. Sau đó Trung tâm nghiên cứu Giống cây rừng (Viện
Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam), Trung tâm nghiên cứu cây nguyên liệu giấy
Phù Ninh phối hợp với nhiều cơ quan bố trí khảo nghiệm Thơng caribê ở
nhiều vùng sinh thái khác nhau trong cả nước, như: Đại Lải (Vĩnh Phúc), Ba
Vì (Hà Nội), Yên Thế (Bắc Giang), Yên lập (Quảng Ninh), Đại Huệ (Nghệ
An), Đông Hà (Quảng Trị), Tiền Giang (Thừa Thiên Huế), Sông Mây (Đồng
Nai), Hàm Thuận Nam (Bình Thuận)…

Các kết quả bước đầu cho thấy đây là lồi cây sinh trưởng nhanh, thích
nghi sinh thái rộng, có nhiều triển vọng để gây trồng trên nhiều dạng lập địa
của nước ta, đặc biệt là biến chủng PCH (Stahl, 1984; Phí Quang Điện, 1989,
2001). Ví dụ, trên lập địa nghèo kiệt ở Yên Lập (Quảng Ninh) Thông caribê
cho năng suất khoảng 8 - 10m3/ha/năm. Ở Đại Lải (Vĩnh Phúc), chủng PCH
trồng trên đất feralít tầng trung bình, phát triển trên đá mẹ phiến thạch sét,
thoát nước tốt, ở tuổi 15 đạt 16 - 18m3/ha/năm. Thông caribê biến chủng PCH
trồng năm 1984 tại Đông Hà (Quảng Trị) cho sinh trưởng bình quân là
2m/năm về chiều cao và 2,7cm/năm về đường kính.
Có nhiều nơi, Thơng caribê khơng những sinh trưởng tốt mà còn ra hoa
kết hạt chắc từ tuổi 14 - 15 trở đi, có thể thu hái, gieo ươm tạo cây con như ở
Đại Lải (Vĩnh Phúc), Tiền Phong (Thừa Thiên Huế), Đơng Hà (Quảng Trị)…
Ví dụ, hạt giống PCH tại Đại Lải đạt tỉ lệ nảy mầm tới 90%, cây con tạo từ
nguồn hạt này sinh trưởng tốt, ít sâu bệnh. Cây con 1 tuổi ở rừng trồng đạt
chiều cao trung bình là 1,17m, đường kính gốc đạt 1,8cm. Từ 3 đến 8 tuổi,
cây sinh trưởng nhanh hơn đạt chiều cao trung bình khoảng 1,8 - 2m/năm,


8

đường kính D1,3 = 1,6 - 1,8cm/năm. Từ đây chúng ta thấy ở 1 - 2 tuổi cây
sinh trưởng khá tốt trên cả 6 vùng địa lý - lập địa khác nhau, từ tuổi 3 PCH
sinh trưởng vượt PCC, sâu đục ngọn cây bắt đầu xuất hiện (tỉ lệ từ 2,5 - 3%),
ở PCH nhiều hơn PCC. Là một trong những loài cây chủ lực trồng rừng tổ
trên đất nghèo xấu phổ biến ở Việt Nam (Đại Lải và Đông Hà là những khu
vực điển hình), những kinh nghiệm có được cùng với những kết quả nghiên
cứu đã và đang được tiến hành, nghiên cứu của luận văn mong góp phần giúp
các cơ sở trồng rừng sản xuất Thông caribê đạt được kết quả tốt nhất, thiết
thực đóng góp chương trình trồng mới 5 triệu ha rừng của đất nước và kế
hoạch phát triển nghề rừng đến năm 2020 [6].

1.2. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng
Sự biệt hoá và phản biệt hoá cùng với tính tồn năng của tế bào thực
vật là cơ sở lý luận vững chắc để nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy in vitro.
Nuôi cấy in vitro là một phương thức nhân giống dựa trên cơ sở của
phân bào nguyên nhiễm, lối phân bào về cơ bản khơng có sự tổ hợp lại của
thể nhiễm sắc trong quá trình phân chia, vì thế đây là phương thức nhân giống
truyền đạt các biến dị di truyền của cây mẹ cho cây in vitro. Cây in vitro
khơng những giữ được các hình thái giải phẫu của cây mẹ, giữ được các biến
di truyền mong muốn mà còn giữ được các biến dị di truyền về sinh trưởng
nhanh và cho năng suất cao của chúng. Nhân giống in vitro là phương thức
giữ được ưu thế lai đời F1 và khắc phục được hiện tượng phân ly đời F2, nhân
giống in vitro làm rút ngắn chu kỳ sinh sản, rút ngắn thời gian thực hiện
chương trình cải thiện giống cây rừng và là phương thức nhân nhanh các lồi
cây q hiếm đang bị khai thác cạn kiệt. Đây là phương thức góp phần bảo tồn
nguồn gen cây rừng và nhân giống bổ sung cho các lồi cây khó thu hái và
bảo quản hạt [12], [8], đặc biệt là nhân nhanh số lượng lớn nguồn giống tốt
phục vụ chương trình trồng rừng.


9

Vì thế, nhân giống bằng phương pháp ni cấy in vitro là một trong
những cơng cụ có hiệu quả nhất cho chọn giống cây rừng, là phương thức
đang được áp dụng phổ biến để nhân giống các dịng vơ tính có năng suất cao.
Ngày nay cùng với cơng nghệ gen, nuôi cấy mô tế bào là một phần
quan trọng không thể thiếu, thúc đẩy ứng dụng công nghệ sinh học trong cải
thiện cuộc sống của con người. Hai nhiệm vụ lớn của công nghệ sinh học thực
vật ở nước ta từ nay tới năm 2020 là: Tạo ra các giống cây trồng mới bằng
phương pháp công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt là công nghệ gen và nhân
nhanh các giống, dịng ưu việt bằng kỹ thuật ni cấy in vitro [28].

Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực chất là kỹ thuật điều khiển phát triển
sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật một cách có định hướng dựa vào sự
phân hoá và phản phân hoá của tế bào thực vật. Để điều khiển được sự phát
sinh hình thái của tế bào, người ta bổ sung vào mơi trường ni cấy hai nhóm
chất điều hồ sinh trưởng thực vật chính là auxin và cytokinin. Tỉ lệ hàm
lượng của 2 nhóm chất điều hồ sinh trưởng này trong môi trường nuôi cấy
khác nhau sẽ định hướng cho sự phát sinh hình thái (phát sinh chồi, rễ, hoặc
mơ sẹo) của mô nuôi cấy khác nhau. Trong môi trường nuôi cấy, tỉ lệ nồng độ
auxin/cytokinin thấp thì mơ ni cấy phát sinh theo hướng tạo chồi, tỉ lệ này
cao thì mô nuôi cấy sẽ tạo mô sẹo [29], [5].
1.2.1. Phương pháp nhân giống in vitro
Phương pháp nhân giống in vitro đã bổ sung cho các kỹ thuật nhân
giống vơ tính cổ điển như: chiết cành, ghép, giâm hom, tách dòng… Nhân
giống in vitro hay vi nhân giống trong ống nghiệm là một trong bốn lĩnh vực
ứng dụng chính của cơng nghệ tế bào thực vật (bao gồm: làm sạch virus, nhân
nhanh các giống cây quý, sản xuất và chuyển hoá sinh học các hợp chất tự
nhiên và cải biến về mặt di truyền các giống cây rừng) và đã mang lại hiệu
quả kinh tế lớn nhất [2]. Có 3 phương thức để tạo cây in vitro:


10

a. Hoạt hoá chồi nách
Hoạt hoá chồi nách bằng cách phá vỡ hiện tượng ưu thế ngọn khi nuôi
cấy các đỉnh chồi hoặc đoạn thân mang mắt ngủ. Theo phương pháp này thì
sự hoạt hố của chồi nách diễn ra theo hai cách:
- Cách 1: Cây phát triển trực tiếp từ chồi đỉnh hoặc chồi nách (xảy ra khi
nuôi cấy loài cây hai lá mầm như: khoai tây, hoa cúc, cây thuốc lá…)
- Cách 2: Tạo cụm chồi từ đỉnh hoặc chồi nách (xảy ra với cây một lá mầm
như: Cây lúa, cây mía…)

b. Phương pháp tạo chồi bất định
Chồi bất định là chồi được hình thành từ các cơ quan, các bộ phận khác
của cây, không phải là phôi. Ví dụ như: chồi hình thành từ mơ sẹo (callus).
Tạo chồi bất định sử dụng các bộ phận của cây như: đoạn thân, mơ lá,
giẻ hành. Trong q trình này cần thực hiện q trình phản phân hố và tái
sinh tế bào để bắt tế bào sơma hình thành chồi trực tiếp hoặc gián tiếp thông
qua giai đoạn phát triển mơ sẹo.
c. Phương pháp tạo phơi vơ tính
Trong q trình ni cấy in vitro, phơi có thể hình thành từ các tế bào
sơma gọi là phơi vơ tính. Các phơi vơ tính có thể tái sinh thành cây hồn
chỉnh hoặc có thể được sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất hạt giống nhân
tạo. Tương tự như tạo chồi bất định, để tạo phơi vơ tính cũng cần thực hiện
q trình phản phân hố và tái sinh tế bào để tách các tế bào sơma, hình thành
phơi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô sẹo. Sự hình
thành phơi trải qua 2 bước chính sau:
- Bước 1: Sự phân hố các tế bào có khả năng phát sinh phơi. Trong q
trình này cần mơi trường giàu auxin vì auxin giúp cho việc cảm ứng để tạo
các tế bào phơi, đồng thời auxin giúp kích thích cho q trình phát triển số
lượng tế bào thơng qua việc liên tiếp phân chia tế bào. Các tế bào có khả năng


11

phát sinh phôi là các tế bào nhỏ, nhân lớn, nhiều hạch nhân, khơng có khơng
bào, tế bào chất đậm đặc, giàu protêin, ARN thông tin.
- Bước 2: Sự phát triển của phơi mới hình thành. Mơi trường ni cấy của
giai đoạn này phải nghèo hoặc khơng có auxin, với nồng độ auxin cao thì kích
thích sự tạo thành phơi nhưng ức chế cho q trình phân hố và phát triển tiếp
theo của phôi này. Như vậy, với nồng độ chất điều tiết sinh trưởng hợp lý là
rất quan trọng để có các phản hồi thích hợp, nếu nồng độ thấp có thể gây sốc

cho phản ứng và nồng độ cao có thể gây ức chế hoặc gây độc [22].
1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới kết quả nuôi cấy in vitro
- Môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy bao gồm hai loại là mơi trường hố học và mơi
trường vật lý, chúng quyết định đến sự thành bại của quy trình nhân giống in
vitro. Ngồi chức năng làm giá thể cho mẫu cấy, mơi trường ni cấy cịn có
nhiệm vụ chính là cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết để cho mẫu cấy tồn
tại, phân hoá và phát triển. Vấn đề đặt ra ở đây là khi tiến hành ni cấy phải
lựa chọn được mơi trường thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển tối ưu ở
từng giai đoạn của q trình ni cấy và với từng đối tượng ni cấy cụ thể.
- Mơi trường hố học: cung cấp các chất dinh dưỡng cơ bản cần thiết
cho sự sinh trưởng và phân hố của mơ trong suốt q trình ni cấy in vitro.
Thành phần của mơi trường hố học thay đổi theo lồi cây, bộ phận cây, mục
đích ni cấy, nhưng nhìn chung thường gồm các nhóm chất sau [2], [30].
+ Nhóm các nguyên tố đa lượng: Nguyên tố đa lượng là những nguyên
tố muối khoáng được sử dụng ở nồng độ trên 30ppm, bao gồm các nguyên tố
sau: N, P, K, S, Mg và Ca...Các nguyên tố này có chức năng tham gia vào q
trình trao đổi chất của tế bào và có chức năng xây dựng nên thành tế bào. Mơi
trường nhiều nitơ thích hợp cho việc hình thành chồi. Mơi trường nhiều kali
sẽ giúp cho quá trình trao đổi chất diễn ra mạnh.


12

+ Nhóm các nguyên tố vi lượng: Nguyên tố vi lượng là những nguyên
tố khoáng được sử dụng ở nồng độ dưới 30ppm, gồm có: Fe, Cu, Zn, Mo, Co,
Mn, Bo…Tuy chỉ cần một lượng nhỏ trong môi trường nuôi cấy, nhưng
chúng là thành phần không thể thiếu cho sự sinh trưởng và phát triển của mô.
Nếu thiếu Fe quá trình phân chia của tế bào bị rối loạn, thiếu Bo mô nuôi cấy
phát triển mô sẹo rất nhanh, nhưng có hiệu suất tái sinh thấp. Hàm lượng của

các nguyên tố đa lượng và các nguyên tố vi lượng phụ thuộc vào từng môi
trường nuôi cấy và từng đối tượng ni cấy.
+ Nguồn carbon: Mặc dù mẫu cấy vẫn có khả năng quang hợp, nhưng
rất yếu, vì vậy buộc phải bổ sung nguồn carbon để mẫu ni cấy có thể tổng
hợp được các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia. Thông thường nguồn carbon
bổ sung là đường sucrose và glucose với liều lượng 20-30 g/lít. Trong trường
hợp cần thiết có thể thay thế bằng các loại đường khác như: maltose, lactose
hay fructose.
+ Các vitamin: Mô và tế bào thực vật khi ni cấy in vitro vẫn có khả
năng tự tổng hợp được một số vitamin cần thiết nhưng không đáp ứng đủ nhu
cầu sinh trưởng và phát triển nhanh của chúng. Vì vậy, phải bổ sung thêm các
loại vitamin cần thiết vào mơi trường ni cấy để góp phần tạo các coenzyme xúc tác các phản ứng sinh hoá trong tế bào. Các vitamin thường được
sử dụng như: B1 (Thiamin), B2 (Ribofravin), B3 (Axit panthotenic), B5 (Axit
nicotinic), B6 (piridoxin) với nồng độ phổ biến là 0,5 - 1mg/l. Myo - inositol
cũng hay được sử dụng vì nó có vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp thành
tế bào thực vật.
+ Các chất phụ gia hữu cơ: Các chất phụ gia được đưa vào mơi trường
ni cấy nhằm kích thích sự sinh trưởng của mô sẹo và các cơ quan như:
nước dừa, khoai tây, chuối, dịch chiết nấm men. Trong thành phần của nước
dừa chứa các axit amin, axit hữu cơ, đường, Myo - inositol và các chất có


13

hoạt tính auxin, cytokinin. Ngồi ra, Khoai tây và Chuối cũng hay được sử
dụng, vì trong thành phần của chúng có chứa một số vitamin và các kích thích
tố có tác dụng tích cực đến sự sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy.
+ Các chất điều hoà sinh trưởng: Các chất điều hồ sinh trưởng có vai
trị hết sức quan trọng đến kết quả nuôi cấy in vitro, quyết định sự thành cơng
của tồn bộ q trình ni cấy. Nó ảnh hưởng tới sự biệt hoá, phản biệt hoá và

sự sinh trưởng của tế bào, đặc biệt là sự biệt hoá các cơ quan như chồi và rễ.
Nhu cầu về chất điều hịa sinh trưởng đối với từng lồi cây và từng giai đoạn
ni cấy là khác nhau. Vì vậy, để nuôi cấy in vitro thành công cần phải tiến
hành các nghiên cứu cụ thể để tìm ra nồng độ cũng như tỉ lệ các chất điều hoà
sinh trưởng phù hợp. Trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thường sử dụng 3
nhóm chất chính là auxin, cytokinin và gibberellin.
Các chất thuộc nhóm auxin có tác dụng kích thích sự giãn tế bào, sự
hình thành rễ bất định và mơ sẹo. Trong nuôi cấy mô tế bào thường sử dụng
bốn loại auxin là: IAA (Indol acetic acid), IBA (Indol butyric acid), NAA
(Naphthyl acetic acid) và 2.4-D (2,4-Dicloro phenoxy axetic axit). Các loại
auxin thường được sử dụng ở nồng độ từ 0,1-5,0mg/lít tuỳ từng lồi cây, từng
loại chất và từng giai đoạn ni cấy.
Các chất thuộc nhóm cytokinin có tác dụng kích thích sự phân chia tế
bào và hình thành chồi. Các chất thuộc nhóm này thường được sử dụng là:
Kinetin và BAP (Benzyl amino purin). Tỉ lệ giữa auxin và cytokinin quy định
sự biệt hố của mơ, tế bào theo hướng tạo chồi, tạo rễ hoặc hình thành mơ
sẹo. Theo nhiều nghiên cứu cho thấy trong môi trường nuôi cấy nếu tỉ lệ
auxin/cytokinin cao thì mơ sẽ biệt hố theo hướng tạo rễ, nếu thấp mơ sẽ biệt
hố theo hướng tạo chồi, còn nếu tỉ lệ này gần bằng 1 thì mẫu ni cấy sẽ biệt
hố theo hướng tạo mơ sẹo.


14

Các chất thuộc nhóm gibberellin có tác dụng kích thích sự giãn tế bào,
kéo dài lóng, đốt thân, cành cây. Ngồi ra, nó cịn có tác dụng phá tính ngủ
nghỉ ở củ, hạt, ức chế tạo rễ phụ cũng như tạo chồi phụ. Chất thường được sử
dụng nhất trong nhóm này là GA3.
Ngồi ba nhóm chất trên cịn có các chất có tác dụng ức chế sự sinh
trưởng và phát triển khác như ethylen. Chất này cũng gây ảnh hưởng khá rõ

đến sự phát sinh hình thái của một số cây trồng trong nuôi cấy in vitro.
+ Độ pH của mơi trường: là yếu tố quan trọng, nó ảnh hưởng trực tiếp
tới quá trình hấp thụ các chất dinh dưỡng từ môi trường vào mẫu cấy. Thực tế
đã chứng minh khi pH thấp (pH< 4,5) hoặc cao (pH >7) đều gây ra ức chế
sinh trưởng, phát triển của mô và tế bào nuôi cấy. Cụ thể, nếu pH của môi
trường giảm mạnh sẽ làm rối loạn quá trình trao đổi Fe, làm giảm hay ngừng
hẳn quá trình sinh trưởng của mẫu cấy. Thông thường độ pH dao động trong
khoảng từ 5,5 - 6,5 trong nuôi cấy mô - tế bào thực vật.
- Môi trường vật lý: Nhiệt độ và ánh sáng là hai nhân tố vật lý có ảnh
hưởng cơ bản và quan trọng nhất trong nuôi cấy in vitro.
+ Nhiệt độ: là nhân tố vật lý quan trọng ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân
chia tế bào và các q trình trao đổi chất trong mơ cấy, đồng thời nó ảnh
hưởng tới sự hoạt động của auxin do đó nó ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng
ra rễ của cây mô. Nhiệt độ nuôi cấy cần được giữ ổn định ở 25 ± 20C.
+ Ánh sáng: các nghiên cứu đã cho thấy ánh sáng rất cần thiết cho sự
phát triển và phát sinh hình thái của mẫu cấy. Nó phụ thuộc rất nhiều vào thời
gian chiếu sáng, cường độ và chất lượng ánh sáng. Đặc biệt thời gian chiếu
sáng phải phù hợp với đặc tính sinh vật học của lồi cây và bộ phận ni cấy.
Thời gian chiếu sáng thường biến động từ 12 - 16 giờ/ngày. Ánh sáng của đèn
huỳnh quang với cường độ 2000 - 3000 lux, tương đương với khoảng cách 30
cm từ đèn chiếu sáng tới mô nuôi cấy hoặc dùng ánh sáng tự nhiên với cường


15

độ thấp là phù hợp với nuôi cấy in vitro. Ni cấy mơ sẹo có thể khơng cần
ánh sáng. Chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng không nhỏ tới kết quả nuôi
cấy. Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao thân, chồi hơn so với ánh sáng trắng.
Ánh sáng xanh ức chế sự vươn cao, nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sinh
trưởng của mơ sẹo.

1.2.3 Các bước chính trong nhân giống in vitro
Theo George (1993) [22], quá trình nhân giống in vitro bao gồm các
bước sau:
Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây
mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt
là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong
điều kiện thích hợp với chế độ chăm sóc và phịng trừ sâu bệnh hiệu quả trước
khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỉ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh
trưởng của mẫu cấy in vitro.
Mục tiêu của các chương trình cải thiện giống là thu nhận được một lượng
đáng kể tăng thu di truyền càng nhanh càng tốt, đồng thời duy trì được một vốn
di truyền phong phú để đảm bảo tăng thu trong tương lai. Để nhận được những
tăng thu như vậy phải dựa trên các phương pháp chọn lọc nhằm chọn ra những
cá thể đáp ứng tốt nhất những yêu cầu của nhà chọn giống để dùng như những
cây bố mẹ trong các chương trình chọn giống và sản xuất hạt.
Sau khi đã chọn được loài và xuất xứ đáp ứng mục tiêu kinh tế và phù
hợp với mỗi vùng thì chọn lọc cây trội là phần then chốt của bất kỳ một
chương trình nào về cải thiện giống cây rừng. Có cây trội được chọn lọc cẩn
thận, được khảo nghiệm hậu thế để đánh giá từ đó xây dựng các vườn giống
để cung cấp giống thì năng suất rừng mới từng bước được nâng cao, đáp ứng
yêu cầu ngày càng tăng của sản xuất xã hội. Cây trội là nền tảng của một
chương trình chọn giống [8].


16

Chọn cây trội là phương pháp lợi dụng biến dị cá thể tự nhiên trong quần
thể để nâng cao sản lượng đời sau so với giống đại trà. Tăng thu di truyền khi
chọn lọc cá thể có thể đạt 25 - 50%, mức độ biến động giữa các cá thể trong

quần thể càng lớn thì tăng thu di truyền đạt được càng cao.
Các cây trội đã chọn có thể được dùng để lấy giống phát triển trực tiếp vào
sản xuất. Còn nếu biết phối hợp với các phương pháp chọn giống khác như lai
giống, gây đột biến… sẽ mang hiệu quả cao hơn.
Bước 2: Nuôi cấy khởi động
Là giai đoạn khử trùng mẫu cấy in vitro. Trong giai đoạn này cần đảm
bảo các yêu cầu như tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng
tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây.
Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách và sau đó là hoa và cuối
cùng là đoạn thân, mảnh lá chồi ngọn, chồi nách được sử dụng để nhân nhanh
một số cây như măng tây, dứa khoai tây, thuốc lá, hoa cúc…
Bước 3: Nhân nhanh
Là giai đoạn kích thích mơ ni cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh
số lượng thơng qua các con đường: hoạt hố chồi nách, tạo chồi bất định, tạo
phơi vơ tính.
Vấn đề đặt ra là cần xác định được mơi trường và điều kiện ngoại cảnh
thích hợp để có hiệu quả cao nhất. Theo nguyên tắc chung, môi trường có
nhiều cytokinin sẽ kích thích tạo chồi. Chế độ ni cấy thường là 25 - 270C và
12 - 16h chiếu sáng/ngày, cường độ chiếu sáng 2000 - 4000 lux. Tuy nhiên
đối với mỗi loại đối tượng ni cấy địi hỏi có chế độ ni cấy khác nhau.
Bước 4: Tạo cây hoàn chỉnh
Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh
sang môi trường tạo rễ. Môi trường tạo rễ thường được bổ sung một lượng
nhỏ auxin. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường


17

khơng chứa chất kích thích sinh trưởng. Sau đó cây được ra ngồi vườn ươm
phát triển tốt thì cây phải đảm bảo một số yêu cầu:

+ Cây đảm bảo về các yêu cầu chiều cao, rễ, lá…
+ Giá thể phải tơi xốp, sạch sẽ, thoát nước tốt
+ Phải điều chỉnh độ ẩm, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng như có chế
độ dinh dưỡng thích hợp [22].
1.3. Thành tựu về nuôi cấy in vitro
1.3.1. Thành tựu chung về nuôi cấy mơ, tế bào thực vật trong và ngồi nước
Nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật
đã và đang có nhiều ứng dụng trong thực tiễn sản xuất và trong nghiên cứu
phát triển khoa học cơng nghệ trên thế giới và Việt Nam.
* Ngồi nước
Hiện nay nuôi cấy in vitro đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong sản
xuất thương mại cây lâm nghiệp ở nhiều nước trên thế giới, hàng trăm loài cây lá
rộng và hàng chục loài cây lá kim đã được nuôi cấy mô thành công. Cho tới năm
1991, Thái Lan đã nhân giống in vitro thành cơng cho 55 lồi trong tổng số 67
lồi tre - trúc thử nghiệm. Cơng nghệ này cho phép nhân nhanh loài
Dendrocalamus asper với số lượng khoảng 1 triệu cây mỗi năm đáp ứng được
nhu cầu cây con phục vụ cho trồng rừng.
Số lượng các loài Bạch đàn đã được nhân giống bằng phương pháp nuôi
cấy in vitro ngày càng tăng: đến năm 1987 đã có trên 20 lồi Bạch đàn khác
nhau được ni cấy thành công.
Trung Quốc là nước thành công trong trong việc tạo cây in vitro cho các
loài cây thân gỗ. Đến nay đã có hơn 100 lồi cây thân gỗ được ni cấy như:
Dương, Bạch đàn, Tếch, Bao đồng…
Nhiều lồi cây lá rộng Châu Âu đã được thử nghiệm nhân giống thành
công bằng phương pháp nuôi cấy mô như: Acer, Beluta, Fagus, Quercus,


18

Carpinus… Nuôi cấy in vitro cũng là một biện pháp nhân giống được áp dụng

nhiều ở các loài cây lá kim nhằm phục vụ cho các chương trình trồng rừng
dịng vơ tính…Có tới 30 lồi trong số các lồi cây lá kim được nghiên cứu
nuôi cấy mô đã đạt được những thành cơng bước đầu, trong đó phải kể đến
các loài Bách tán (Araucaria), Liễu sam (Cryptomeria japonica), Bách xanh
[10]...Một số lồi Thơng đã được ni cấy thành cơng đó là Pinus nigra, P.
pinaster của các tác giả như: Shakya và cộng sự (1989) [42], Thorpe và Harry
(1991) [47], Okamura và Kondo (1995) [39].
Shakya và cộng sự (1989) đã thành công trong nghiên cứu nhân giống
P. wallichiana bằng kỹ thuật ni cấy phơi có định hướng. Phơi tách ra được
ni cấy trên môi trường Aiken - Christie (LP - 1984) bổ sung BAP ở các
nồng độ từ 0 - 88µM trong 10; 14; 21 ngày. Kết quả đạt ít nhất 40 chồi/phôi
trong một chu kỳ cấy chuyển 4 tháng [42]
Thorpe và Harry (1991) đã nghiên cứu nuôi cấy thông Pinus
canariensis với nguồn vật liệu sử dụng chủ yếu từ lá mầm của cây con mới
nảy mầm vô trùng, tác giả đã sử dụng hai loại mơi trường ni cấy chính là
mơi trường SH (1972) và mơi trường MCM (1983) có bổ sung 5 - 10 µM
BAP. Kết quả nghiên cứu đã xác định được môi trường MCM với nồng độ
BAP tối ưu trong giai đoạn tái sinh chồi là 10 µM, xác định được tổ hợp
phytohormon là BAP/2iP (tỉ lệ 1:1) là 5/5 µM cho kết quả tái sinh chồi tốt
hơn mơi trường chỉ có BAP, xác định được giá thể ra rễ là hỗn hợp vô trùng
than bùn/vermiculate (tỉ lệ 1:1) chứa ¼ khống MCM, xử lý chồi ra rễ bằng
IBA 1µM trong 4 giờ. Kết quả đã đưa cây invitro vào giá thể trong bầu PVC
ở điều kiện nhà kính [47].
Năm 1995, Okamura và Kondo cơng bố “Hướng dẫn nuôi cấy mô cây
thông” giới thiệu tạo cây con thông Pinus thunbergi trong ống nghiệm từ nuôi
cấy phôi và lá mầm. Trong hướng dẫn này dùng môi trường GD (1972) và


19

môi trường AE để nuôi cấy giai đoạn nhân chồi. Giai đoạn nuôi cấy ban đầu
bổ sung 5 - 10 µM BAP và 3% đường. Giai đoạn ra rễ dùng mơi trường
Risser and White có bổ sung 10 µM IBA và đã tạo thành công cây con trong
ống nghiệm [39].
Theo Aronen và cộng sự (2008), trong nghiên cứu tạo mô sẹo từ phơi
hạt của lồi Pinus silvestris L cho thấy kết quả tái sinh từ mô sẹo rất cao (trên
90% ) [48].
Trong cơng trình nghiên cứu của mình Yiqun Lin và Michael R. Wagner
đã đưa ra kết luận: trên môi trường cơ bản MS bổ sung 0,5mg/l BAP và 1mg/l
2,4-D là mơi trường tạo mơ sẹo tốt nhất cho lồi Pinus pondorosa [50].
Các thành tựu trên đã cho thấy kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô, tế
bào đã và đang đóng góp quan trọng trong việc nhân nhanh, chọn tạo và cải
thiện giống cây trồng nông - lâm nghiệp. Nhiều giống cây trồng có giá trị
đang được ứng dụng vào thực tiễn sản xuất và mang lại hiệu quả kinh tế cao
cho người dân, các công ty ở nhiều quốc gia. Trong tương lai gần, nhiều
giống cây trồng chất lượng cao được sản xuất bằng phương pháp nuôi cây
mô, tế bào sẽ thay thế dần các cây giống sản xuất từ phôi hạt, đặc biệt là các
cây lâm nghiệp.
* Trong nước
Ở nước ta, các nghiên cứu nuôi cấy mô, tế bào phát triển mạnh từ năm
1995 trở lại đây, nhưng đã gặt hái được nhiều thành tựu trong nhân giống và
chọn giống cây trồng. Kỹ thuật nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô, tế
bào thực vật đã trở thành một phương thức nhân giống phổ biến ở hầu hết các
tỉnh thành trong cả nước. Đã có rất nhiều loài cây trồng được nhân nhanh
bằng phương pháp này và đã được ứng dụng trong thực tiễn sản xuất.
Hiện nay, nước ta đã có rất nhiều cơ sở nhân giống bằng ni cấy mơ ở
qui mơ lớn, trong đó có những cơ sở nhân giống cây rừng như: Trung tâm


20

nghiên cứu giống cây rừng, Viện nghiên cứu nguyên liệu giấy Phù Ninh,
Cơng ty giống lâm nghiệp Trung Ương, Xí nghiệp giống thành phố Hồ Chí
Minh, Trường Đại học Lâm nghiệp…
Nuôi cấy mô ở nước ta đã áp dụng rộng rãi trong công tác nhân giống
một số giống Bạch đàn nhập nội, các dịng vơ tính Bạch đàn và Keo lai có
năng suất cao. Cùng với những kết quả về cải thiện giống Trung tâm nghiên
cứu giống cây rừng đã nghiên cứu thành công kỹ thuật nuôi cấy in vitro cho
Keo lai, Bạch đàn và một số giống cây rừng khác [11], [12], [14].
Thời gian gần đây có khá nhiều nghên cứu nhân giống in vitro cây rừng như:
Đoàn Thị Mai và cộng sự (2000) đã nghiên cứu nuôi cấy mô thành công cho
giống Bạch đàn lai U29C3. Kết quả cho thấy thời kỳ mẫu nhiễm ít nhất và có tỉ lệ
bật chồi cao nhất là từ tháng 5 đến tháng 8. Mơi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l
BAP cho số chồi trung bình trong mỗi cụm cao nhất (16,6 chồi/cụm). Mơi trường
ra rễ thích hợp là mơi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l IBA cho tỉ lệ ra rễ tới 83,8%
[14].
Dương Thị Thảo Trang và cộng sự (2006) đã đưa ra mơi trường thích
hợp nhất tạo nguồn cây Bời lời con in vitro sạch bệnh ban đầu là MS có bổ
sung 5,0 mg/l BAP, ở nồng độ 1,5 mg/l thích hợp nhất với q trình tái sinh
chồi, ở nồng độ 1,2 mg/l cho kết quả tạo rễ tốt nhất.
Tạ Minh Hoà và cộng sự (2006) đã nghiên cứu khả năng tái sinh chồi in
vitro ở cây Dó trầm và đưa ra kết luận: có thể tạo ra một bộ sưu tập Dó trầm in
vitro thơng qua việc nuôi cấy chồi nách của cây nhiều năm tuổi. Đoạn thân chồi
nách là phần có khả năng tái sinh mạnh nhất so với các chồi khác trong nuôi
cấy in vitro. Cụm chồi xuất hiện sự tăng trưởng chồi nách hiện sẵn rong chồi
ngọn in vitro, chồi nách tạo mới trong q trình kéo dài ngọn chồi in vitro trên
mơi trường MS có bổ sung 0,2 mg/lBA, 0,2 mg/l Kinetin, 0,1 mg/l adenin.


21

Hồ Văn Giảng và cộng sự (2006) đã bước đầu xây dựng quy trình nhân
giống cây Dó trầm bằng kỹ thuật ni cấy mơ tế bào. Mơi trường thích hợp nhất
cho nhân chồi là MS cải tiến bổ sung 0,3 mg/l BAP, 20 g/l sucrose và 6 g/l agar
cho hệ số nhân chồi đạt 4,2 chồi/cụm. Môi trường ra rễ thích hợp nhất là WMP +
0,3 mg /l NAA + 20 g/l sucrose + 6 g/l agar tỉ lệ ra rễ đạt 88,7% và cây mô sống
đạt 98% khi đưa ra vườn ươm.
Bùi Văn Vinh và cộng sự (2006) chỉ ra mơi trường ni cấy có bổ sung
BAP 0,2 ppm và Kinetin 0,2 ppm là thích hợp nhất cho sự mọc chồi của cây Khôi.
Môi trường nhân nhanh chồi là MS có bổ sung BAP 1 ppm + Kinetin 0,05 ppm
đạt hiệu quả cao hơn các thí nghiệm khác. Mơi trường MS có bổ sung NAA 0,1
ppm cho kết quả ra rễ đạt 100% .
Nguyễn Văn Phong và cộng sự (2008). Nghiên cứu nhân giống cây Dầu
mè bằng kỹ thuật nuôi cấy invitro phục vụ trồng rừng nguyên liệu sản xuất dầu
diesel sinh học. Môi trường cảm ứng tạo đa chồi tốt nhất (MI = MS + BA
0,1mg/l + IBA 0,01mg/l) với hệ số nhân chồi là 4 lần [20].
Nguyễn Văn Phong và cộng sự (2009) đã nghiên cứu nhân giống Vù
hương bằng phương pháp nuôi cấy in vitro và giâm hom. Tạo được quy trình
hồn chỉnh cho nhân giống loài cây này [21].
Đỗ Tiến Phát (2009), nghiên cứu tái sinh thành công cây Thông nhựa từ
hai loại nguyên liệu phơi hạt chín và thân mầm, đã chọn được mơi trường
M16 trong 4 mơi trường thử nghiệm [18].
Ngồi ra nhân giống cây trồng bằng ni cấy mơ, tế bào cịn được ứng
dụng để tạo ra giống cây sạch bệnh virus như: Khoai tây, Cà chua, Bưởi, Cam
Quýt; ứng dụng trong tạo cây trồng biến đổi gen như: Bông, Lúa, Ngô, Cà
chua, Đu đủ [2], [5], [17], [24], [29].


22

1.3.2. Các nghiên cứu về Thơng caribê
1.3.2.1. Ở nước ngồi
Nhân giống hom Thông caribê đã được tiến hành rất sớm từ những
năm đầu thập kỷ 90 của thế kỷ 20 tại Queensland ở Australia. Hiện nay, tại cơ
sở nhân giống hom ở Gympie hàng năm đã đến 3 triệu cây hom để gây trồng
rừng Thông caribê [10].
Theo Henrique và cộng sự (2006) trong cơng trình nghiên cứu cơng bố
của mình, sử dụng hom với độ dài 4 - 6cm ở nồng độ 4000mg/l IBA với
100mg/l paclobutrazon, sau 60 ngày giâm cho tỉ lệ ra rễ của hom cao nhất
(95,31%) [31], các lồi thơng khác cũng đã được nhiều nhà khoa học quan
tâm nhân giống bằng hom từ sớm như: Stromquist và Hansen (1980) [44],
Silva (1985) [43], Oliveira (1989) [40]…đã công bố kết quả giâm hom trên
lồi cây thơng mình nghiên cứu với hiệu quả cao. Bên cạnh nhân giống bằng
hom, việc nhân giống Thông caribê bằng phương pháp nuôi cấy in vitro cũng
đã và đang được nhiều nhà khoa học ở một số phịng thí nghiệm lớn trên thế
giới quan tâm nghiên cứu và bước đầu thu được một số kết quả khả quan, tạo
tiền đề quan trọng cho nhân giống Thông caribê với số lượng lớn, chất lượng
cao phục vụ trồng rừng sản xuất đang có nhu cầu rất lớn.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là nền tảng của công nghệ sinh học thực
vật, nhân nhanh, tạo mô sẹo, lai đã đóng góp nhiều trong cải thiện giống cây
rừng. Nuôi cấy invitro đã được nhiều nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu
như: Skidmore và cộng sự (1988), Akaneme và cộng sự (1997, 2008), Sturnia
và Nancy (1993), Ozkurt và cộng sự (2008).
Theo Skidmore và cộng sự (1988) đã tiến hành nuôi cấy chồi in vitro
Thông caribê trong môi trường lỏng cho kết quả phát triển nhanh hơn môi
trường rắn sau 4 tuần nuôi cấy [33].


23

Akaneme và cộng sự (2008) đã nghiên cứu ảnh hưởng của 2 loại auxin
và 2 loại cytokinin tới tạo mô sẹo, cho thấy tỉ lệ 1mg/l NAA và 2mg/l BAP
mô sẹo Thông caribê phát triển tốt nhất trên môi trường AE (Arnold ADN
Eriksson, 1997) [48].
Sturnia và Nancy (1993) công tác tại Viện nghiên cứu KHTN, thuộc
đại học Philipin, tạo thành công mô sẹo Thông caribê trên môi trường MSM
bổ sung 8,9µM BA [45].
Ozkurt và cộng sự (2008) nghiên cứu nhân giống invitro lồi thơng
nigra J F. Anrold subsp đã chỉ ra mơi trường Douglas-fir cotyledon revised
(DCR) có bổ sung 13,6 µM 2,4-D và 2,2µM BAP cho kết quả mẫu phôi hạt
tái sinh mô sẹo tốt nhất [52].
Qua các kết quả nghiên cứu về lồi thơng nói chung và Thơng caribê
nói riêng được đưa ra ở trên, trong các môi trường nuôi cấy thường bổ sung
thêm cytokinin (BAP), đôi khi kết hợp với một auxin ở nồng độ nhất định.
Chồi thông sau đó được ra rễ trên mơi trường chứa IBA cho tỉ lệ ra rễ tốt nhất,
lồi Thơng caribê đã được quan tâm nghiên cứu từ sớm ở nhiều nước, không
giống như những đối tượng cây rừng khác, việc tái sinh invitro bằng cách tạo
đa chồi hay tái sinh cây thông qua mô sẹo và phôi soma trên cây thông gặp rất
nhiều khó khăn, các nghiên cứu ở đây chủ yếu đều tạo nguồn vật liệu từ phôi
hạt. Nguyên nhân chủ yếu do tính chất ngủ nghỉ sâu của hạt cũng như khả
năng sinh trưởng rất chậm của loại cây này trong điều kiện in vitro. Nhưng
đến nay, đã có những nghiên cứu thành công nhất định ở rất nhiều nước trên
thế giới, hiện nay các nhà khoa học đã và đang tiếp tục nghiên cứu đưa công
nghệ tạo giống, nhân nhanh giống áp dụng cho Thông caribê.
1.3.2.2.Ở trong nước
Ở Việt Nam, Thơng caribê đã được chọn là lồi cây trồng chủ yếu trong
nghề rừng [4], tuy vậy những nghiên cứu mới chỉ đi sâu về khảo nghiệm và