(Luận án tiến sĩ) nghiên cứu nuôi thành thục trứng và tạo phôi lợn bản địa việt nam bằng kĩ thuật in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

NGUYỄN THỊ NHUNG

NGHIÊN CỨU NUÔI THÀNH THỤC TRỨNG VÀ
TẠO PHÔI LỢN BẢN ĐỊA VIỆT NAM
BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội, 2021


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

NGUYỄN THỊ NHUNG

NGHIÊN CỨU NUÔI THÀNH THỤC TRỨNG VÀ
TẠO PHÔI LỢN BẢN ĐỊA VIỆT NAM

BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 9 42 02 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. TS. Bùi Xuân Nguyên
2. TS. Nguyễn Việt Linh

Hà Nội, 2021


i
LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến TS. Bùi Xn Ngun, Ngun Trưởng
Phịng Cơng nghệ Phôi, Viện Công nghệ sinh học và TS. Nguyễn Việt Linh, Phó Trưởng
Phịng Cơng nghệ Phơi, Viện Cơng nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, hỗ trợ kĩ
thuật và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tơi thực hiện và hồn thành luận án này.
Tơi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công
nghệ, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tơi được
học tập, nghiên cứu và hồn thành luận án này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn ơn các thầy cô giáo, các cán bộ Học viện Khoa học và Công
nghệ đã chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tơi trong q trình học tập nghiên cứu và hồn
thành các thủ tục liên quan đến luận án.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc TS. Nguyễn Thị Ước, Phịng cơng nghệ Phơi,
Viện cơng nghệ sinh học đã chỉ bảo, hướng dẫn kĩ thuật và giúp đỡ tôi từ những ngày
đầu làm việc cho đến nay, sự giúp đỡ của TS. Nguyễn Thị Ước đã góp một phần rất
lớn không chỉ trong kết quả của luận án này mà cịn trong suốt thời gian làm việc của
tơi.
Tơi xin chân thành cảm ơn Tiến sỹ-Bác sỹ thú y Kazuhiro Kikuchi, trưởng nhóm

nghiên cứu Đơn vị sinh học sinh sản, Khoa Khoa học động vật, Viện khoa học sinh
học, tổ chức nghiên cứu nông nghiệp và thực phẩm quốc gia-Nhật Bản (NARO); Tiến
sỹ Tamas Somfai, nghiên cứu viên chính Phịng nghiên cứu sinh sản và chăn nuôi,
Viện chăn nuôi và khoa học đồng cỏ (NILGS), Tổ chức nghiên cứu nông nghiệp và
thực phẩm quốc gia Nhật Bản (NARO); Giáo sư, tiến sỹ Takeshige Otoi, Tiến sỹ Đỗ
Thị Kim Lành, Phòng sinh sản động vật, đại học Tokushima, Nhật Bản đã hướng dẫn
kĩ thuật, chia sẻ tài liệu, kinh nghiệm, tận tình giúp đỡ tôi để thực hiện luận án.
Tôi xin cảm ơn TS. Nguyễn Văn Hạnh, Trưởng Phịng Cơng nghệ Phơi, Viện Cơng
nghệ sinh học cùng các cán bộ Phịng cơng nghệ Phơi, Viện cơng nghệ sinh học đã có
những góp ý để tơi hồn chỉnh luận án.
Tơi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của Ban phụ trách đào tạo Học viện Khoa
học và Công nghệ, Ban phụ trách đào tạo Viện Cơng nghệ sinh đã tận tình hướng dẫn


ii
tơi hồn thành mọi thủ tục trong suốt q trình học tập và làm nghiên cứu sinh tại học
viện.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình, bố mẹ, chồng con đã luôn hỗ trợ và tạo
điểu kiện tốt nhất cho tơi chun tâm làm việc và hồn thành luận án.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn bạn bè và đồng nghiệp đã luôn ủng hộ, cổ vũ và động
viên tơi những lúc khó khăn để hồn thành tốt luận án này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn./.
Hà Nội, ngày 27 tháng 05 năm 2021
Tác giả

NCS. Nguyễn Thị Nhung


iii
LỜI CAM ĐOAN

Tơi xin cam đoan
Đây là cơng trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự
khác;
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được cơng bố
trên các tạp chí khoa học chun ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác
giả;
Phần cịn lại chưa được ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.

Hà Nội, ngày 27 tháng 05 năm 2021
Tác giả

NCS. Nguyễn Thị Nhung


iv
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN.................................................................................................... i
LỜI CAM ĐOAN ĐOAN...............................................................................

iii

MỤC LỤC ....................................................................................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................. vii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ........................................................................

viii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT................................ x
MỞ ĐẦU.......................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU..............................................

4

1.1.

Cấu tạo buồng trứng, sự thành thục trứng, q trình thụ tinh
và phát triển phơi in vivo ở lợn....................................................... 4

1.1.1.

Cấu tạo buồng trứng và sự thành thục in vivo trứng lợn...................

4

1.1.2.

Sự thụ tinh và phát triển phôi lợn in vivo.........................................

9

1.1.3.

Ảnh hưởng của mùa vụ đến hoạt động sinh sản ở lợn....................... 12

1.2.

Tình hình nghiên cứu tạo phôi lợn in vitro...................................

1.2.1.

Nuôi thành thục trứng lợn in vitro, ảnh hưởng của nguồn nguyên

15

liệu trứng và điều kiện nuôi thành thục.............................................

15

Tạo phôi lợn TTON, ảnh hưởng của chất lượng tinh trùng, chế độ
thụ tinh, nuôi và bảo quản phôi....................................

19

1.2.3.

Tạo phôi lợn bằng kĩ thuật NBVT....................................

26

1.3.

Nghiên cứu tạo phôi lợn Bản in vitro.............................................

32

1.3.1.

Một số đặc điểm hình thái và sinh sản của lợn Bản........................... 32

1.3.2.

Nghiên cứu nuôi thành thục trứng và tạo phôi lợn Bản tại Việt
Nam.................................................................................................... 33

1.2.2.

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP................................................. 35
2.1.

Vật liệu, hoá chất nghiên cứu.........................................................

35

2.1.1.

Mẫu nghiên cứu.................................................................................

35

2.1.2.

Địa điểm nghiên cứu.......................................................................... 36


v
2.1.3.

Hóa chất và thiết bị............................................................................ 36

2.1.4.

Thiết bị nghiên cứu............................................................................ 36

2.1.5.

Mơi trường thao tác, nuôi cấy, bảo quản...........................................

37

2.2.

Phương pháp nghiên cứu................................................................

37

2.2.1.

Phân loại tháng theo mùa................................................................... 37

2.2.2.

Phương pháp thu, bảo quản buồng trứng........................................... 37

2.2.3.

Phương pháp đo kích thước và khối lượng buồng trứng..................

2.2.4.

Phương pháp phân chia nhóm nang................................................... 37

2.2.5.

Phương pháp thu trứng......................................................................

2.2.6.

Phương pháp phân loại chất lượng trứng........................................... 38

2.2.7.

Phương pháp đo kích thước trứng lợn...............................................

39

2.2.8.

Phương pháp nuôi trứng....................................................................

39

2.2.9.

Phương pháp đánh giá thành thục sau nuôi ......................................

40

2.2.10.

Phương pháp đông lạnh tinh từ mào tinh........................................... 40

2.2.11.

Phương pháp kiểm tra chất lượng tinh trước và sau đông lạnh......... 42

2.2.12.

Phương pháp TTON.....................................................

2.2.13.

Phương pháp đánh giá trạng thái thụ tinh.......................................... 44

2.2.14.

Phương pháp đông lạnh phôi............................................................. 44

2.2.15.

Phương pháp thu, nuôi tế bào sinh dưỡng lợn................................... 45

2.2.16.

Phương pháp nhân nuôi tế bào........................................................... 45

2.2.17.

Phương pháp đông lạnh tế bào........................................................... 46

2.2.18.

Phương pháp NBVT (NBVT) ...........................................

2.2.19.

Phương pháp nuôi phôi...................................................................... 49

2.2.20.

Phương pháp nhuộm Hoechst............................................................ 49

2.2.21.

Phương pháp nhuộm Orcein.............................................................. 50

2.2.22.

Phương pháp phân tích và xử lý số liệu............................................. 50

37

38

43

46


vi

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................. 54
3.1.

Đặc điểm hình thái buồng trứng và tiềm năng khai thác trứng 54
ở lợn Bản theo mùa.........................................................................

3.1.1.

Đặc điểm hình thái, kích thước buồng trứng lợn Bản theo mùa........ 54

3.1.2.

Phân bố nang bề mặt buồng trứng lợn Bản........................................ 56

3.1.3.

Đặc điểm phân loại chất lượng trứng theo mùa và kích thước trứng 59
lợn Bản...............................................................................................

3.2.

Kết quả nghiên cứu nuôi thành thục trứng lợn Bản ...................

3.2.1.

Ảnh hưởng của mùa vụ lên kết quả nuôi thành thục trứng lợn Bản.. 65

3.2.2.

Ảnh hưởng môi trường nuôi trứng lên kết quả nuôi thành thục

65

68

trứng lợn Bản......................................................................................
3.3.

Kết quả tạo phôi lợn Bản bằng TTON...................

72

3.3.1.

Nghiên cứu đông lạnh tinh lợn Bản................................................... 73

3.3.2.

Nghiên cứu chế độ thụ tinh tối ưu.....................................................

3.3.3.

Ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục lên sự thụ tinh và phát 84
triển phôi............................................................................................

3.3.4.

Đông lạnh phôi TTON....................................................................... 89

3.4.

Kết quả nghiên cứu tạo phôi lợn Bản NBVT................................

3.4.1.

Kết quả nghiên cứu khảo sát chất lượng trứng lợn Landrace............ 91

3.4.2.

Kết quả nuôi thành thục trứng lợn Landrace.....................................

3.4.3.

Tạo nguồn tế bào cho nhân trong NBVT........................................... 96

3.4.4.

Kết quả tạo phôi lợn Bản NBVT.......................................................

78

91

94

97

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................................

107

NHỮNG CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN
ĐẾN ĐỀ TÀI...................................................................................................

109

TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................. 110
PHỤ LỤC.......................................................................................................... 1


vii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Kích thước buồng trứng lợn Bản theo mùa ..............................................54
Bảng 3.2. Số lượng nang trung bình theo kích thước ...............................................57
Bảng 3.3. Ảnh hưởng mùa vụ đến chất lượng trứng lợn Bản…………………...…60
Bảng 3.4. Kích thước trứng lợn Bản (µm) ................................................................62
Bảng 3.5. Sự thành thục của trứng lợn Bản ..............................................................66
Bảng 3.6. Kết quả nuôi thành thục trứng lợn Bản ....................................................67
Bảng 3.7. Chất lượng tinh sau khi thu ......................................................................73
Bảng 3.8. Chất lượng tinh lợn Bản sau đông lạnh ....................................................74
Bảng 3.9. Thử nghiệm khả năng tạo phôi của tinh trùng sau đông lạnh ..................77
Bảng 3.10. Đánh giá trạng thái thụ tinh của trứng....................................................79
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của lớp tế bào cận noãn lên trạng thái thụ tinh ở lợn Bản.. .80
Bảng 3.12. Trạng thái thụ tinh của trứng trong môi trường thụ tinh có nồng độ
cafein khác nhau và thời gian thụ tinh khác nhau .................................81
Bảng 3.13. Sự thành thục và khả năng thụ tinh của trứng lợn Bản sau khi nuôi .....85
Bảng 3. 14. Ảnh hưởng của môi trường nuôi trứng lên sự phát triển của phôi lợn
Bản sau thụ tinh .....................................................................................86
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của môi trường nuôi phôi lên sự phát triển của phôi lợn
Bản sau thụ tinh .....................................................................................86

Bảng 3.16. Kết quả đông lạnh phôi TTON ...............................................................89
Bảng 3.17. Phân loại chất lượng trứng lợn Landrace .............................................913
Bảng 3.18. Khả năng thành thục của trứng lợn Landrace trong các loại môi
trường nuôi............................................................................................94
Bảng 3.19. Ảnh hưởng của loại tế bào cấy lên sự phát triển của phôi lợn NBVT... 96
Bảng 3.20. Sự phát triển của phôi lợn Landrae và phôi lợn Bản NBVT trong môi
trường nuôi ............................................................................................97


viii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1.

Cấu trúc buồng trứng và sự phát triển nang, trứng ở động vật
có vú............................................................................................... 5

Hình 1.2.

Sự phát triển của nang, tế bào trứng lợn thông qua quá trình
giảm phân...................................................................................... 6

Hình 1.3.

Quá trình thành thục của trứng lợn. .............................................. 7

Hình 1.4.

Trứng lợn sau thụ tinh được quan sát dưới kính hiển vi với

nhiều tinh trùng ở cả trong vùng giữa và trên màng sáng............

10

Hình 1.5.

Các giai đoạn phát triển của phơi lợn...........................................

11

Hình 1.6.

Sự phát triển của phơi lợn từ ngày 1 đến ngày 10.........................

12

Hình 1.7.

Sự phát triển của nang, sự phát triển của tế bào cận nỗn và sự
thành thục của trứng động vật có vú............................................. 19

Hình 1.8

Thụ tinh bình thường so với polyspermic...................................... 24

Hình 1.9

Kĩ thuật NBVT..............................................................

27

Hình 2.1

Buồng đếm tinh trùng....................................................................

43

Hình 2.2

Bố trí dầu trong kim......................................................................

47

Hình 2.3

Đĩa mơi trương thao tác loại nhân tế bào trứng............................. 47

Hình 2.4

Micro pipet và trứng trong thao tác hút và cấy nhân....................

47

Hình 2.5

Đĩa mơi trường thao tác cấy nhân tế bào vào trứng......................

48

Hình 2.6

Xung điện trứng sau cấy nhân......................................................

49

Hình 3.1

Kích thước và khối lượng buồng trứng lợn Bản: ........................

55

Hình 3.2

Phân bố nang bề mặt theo kích thước buồng trứng lợn Bản
theo mùa......................................................................................... 57

Hình 3.3

Trứng lợn Bản sau khi thu phân loại A,B,C..................................

59

Hình 3.4

Trứng lợn Bản sau thu và tách tế bào cận nỗn............................. 62

Hình 3.5

Mối tương quan giữa số lượng nang > 2 mm và số trứng

64


ix
A+B của lợn Bản thu được trong 4 mùa........................................
Hình 3.6

Các giai đoạn phát triển của trứng lợn Bản trong hệ thống
Ni IVM...................................................................................... 67

Hình 3.7

Trứng lợn Bản sau ni thành thục trong các mơi trường............. 72

Hình 3.8

Đơng lạnh tinh dịch lợn Bản. ........................................................ 77

Hình 3.9

Các giai đoạn phát triển của phơi sau thụ tinh. ............................. 91

Hình 3.10

Trung bình số trứng A+B thu được/BT trong 4 mùa của lợn
Landrace......................................................................................... 94

Hình 3.11

Tỷ lệ thành thục của trứng lợn Bản và lợn Landrace nuôi

trong TCM-199+10% pFF và trong POM ..................................... 95

Hình 3.12

Độ ổn định của 2 loại tế bào qua các lần cấy chuyển.................... 96

Hình 3.13

Các giai đoạn NBVT lợn Bản và lợn Landrace.............

Hình 3.14

Tỷ lệ tạo phôi và chất lượng phội TTON, NBVT.......................... 102

Hình 3.15

Phơi nang lợn ngày 7 được nhuộm cho thấy sự khác biệt lớn

101

giữa phôi trong ống nghiệm và phôi phát triển tự nhiên trong
cơ thể lợn cái.................................................................................. 104


x
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

TỪ VIẾT
TẮT

TIẾNG ANH

TIẾNG VIỆT

BSA

Bovine serum albumin

Huyết thanh thai bò

COCs

Cumulus-Oocytes Complexes

Tổ hợp trứng và tế bào cận nỗn

CO2

Cacbon dioxit

CNSHSS
DMEM

Cơng nghệ sinh học sinh sản
Dubelcco′s

modified

Eagle

medium
ADN

Deoxyribonucleic acid

dbc-AMP

Dibutyryl-cAMP

DPBS

Dulbecco′s phosphate buffered
saline

EGF

Epidermal growth factor

Yếu tố tăng trưởng biểu bì

FF

Follicular fluid

Dịch nang trứng

FBS

Fetal bovine serum

Huyết thanh thai bị

FCs

Follicular cells

Tế bào nang

FPN

Female Pronuclear

Tiền nhân cái

FSH

Follicle Stimulating Hormone

Hocmon kích thích nang trứng

GV

Germinal vesicle

Bóng mầm

GVBD

Germinal vesicle breakdown

Phá vỡ bóng mầm

hCG

Chorionic gonadotropin human

Hocmon nhau thai người

ICSI

Intracytoplasmic sperm injection

Tiêm tinh vào trứng

IVC

In vitro Culture

Nuôi cấy trong ống nghiệm

IVM

In vitro maturation

Nuôi thành thục trong ống
nghiệm

IVP

In vitro Production

Sản xuất trong ống nghiệm


xi
LH

Luteinizing hormone

Hocmon thể vàng hóa

MPN

Male Pronuclear

Tiền nhân đực

MI

Metaphase I

Kỳ giữa I

MII

Metaphase II

Kỳ giữa II

NCSU-37

North Carolina State University 37

NSCU-23

North Carolina State University
Medium-23

NBVT

Nhân bản vơ tính

N2

Liquid nitrogen

Ni tơ lỏng

O2

Oxygen

Ơxy

pFF

Porcine follicular fluid

Dịch nang trứng lợn

Pig FM

Pig Fertilization Medium

Môi trường thụ tinh lợn

PZM-3

Porcine zygote medium

Môi trường hợp tử ở lợn

POM

Porcine oocyte maturation

Môi trường nuôi thành thục
trứng lợn

PERVs

Porcine Endogenous Retroviruses

TALP-

Tyrode's albumin lactate pyruvate-

PVA

Polyvinylalcohol

TCM

Tissue Culture Medium

TT
TCM-199

Virus nội sinh ở lợn

Môi trường nuôi cấy mô
Tinh trùng

Tissue culture medium-199

Mơi trường ni cấy-199

TTON

Thụ tinh ống nghiệm

TB

Trung bình

β-ME

Mercaptoethanol

µm

Micromet


xii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Kích thước buồng trứng lợn Bản theo mùa ..............................................54
Bảng 3.2. Số lượng nang trung bình theo kích thước ...............................................57
Bảng 3.3. Ảnh hưởng mùa vụ đến chất lượng trứng lợn Bản……………………59
Bảng 3.4. Kích thước trứng lợn Bản (µm) ................................................................62
Bảng 3.5. Sự thành thục của trứng lợn Bản ..............................................................66
Bảng 3.6. Kết quả nuôi thành thục trứng lợn Bản ....................................................67
Bảng 3.7. Chất lượng tinh sau khi thu ......................................................................73
Bảng 3.8. Chất lượng tinh lợn Bản sau đông lạnh ....................................................74
Bảng 3.9. Thử nghiệm khả năng tạo phôi của tinh trùng sau đông lạnh ..................76
Bảng 3.10. Đánh giá trạng thái thụ tinh của trứng....................................................78
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của lớp tế bào cận noãn lên trạng thái thụ tinh ở lợn Bản.. .79
Bảng 3.12. Trạng thái thụ tinh của trứng trong môi trường thụ tinh có nồng độ
cafein khác nhau và thời gian thụ tinh khác nhau .................................81
Bảng 3.13. Sự thành thục và khả năng thụ tinh của trứng lợn Bản sau khi nuôi .....84
Bảng 3. 14. Ảnh hưởng của môi trường nuôi trứng lên sự phát triển của phôi lợn
Bản sau thụ tinh .....................................................................................83
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của môi trường nuôi phôi lên sự phát triển của phôi lợn
Bản sau thụ tinh .....................................................................................86
Bảng 3.16. Kết quả đông lạnh phôi TTON ...............................................................89
Bảng 3.17. Phân loại chất lượng trứng lợn Landrace ...............................................91
Bảng 3.18. Khả năng thành thục của trứng lợn Landrace trong các loại môi
trường nuôi............................................................................................94
Bảng 3.19. Ảnh hưởng của loại tế bào cấy lên sự phát triển của phôi lợn NBVT... 96
Bảng 3.20. Sự phát triển của phôi lợn Landrae và phôi lợn Bản NBVT trong môi

trường nuôi ............................................................................................97


xiii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1.

Cấu trúc buồng trứng và sự phát triển nang, trứng ở động vật
có vú............................................................................................... 5

Hình 1.2.

Sự phát triển của nang, tế bào trứng lợn thông qua quá trình
giảm phân...................................................................................... 6

Hình 1.3.

Quá trình thành thục của trứng lợn. .............................................. 7

Hình 1.4.

Trứng lợn sau thụ tinh được quan sát dưới kính hiển vi với
nhiều tinh trùng ở cả trong vùng giữa và trên màng sáng............

10

Hình 1.5.

Các giai đoạn phát triển của phơi lợn...........................................

11

Hình 1.6.

Sự phát triển của phơi lợn từ ngày 1 đến ngày 10.........................

12

Hình 1.7.

Sự phát triển của nang, sự phát triển của tế bào cận nỗn và sự
thành thục của trứng động vật có vú............................................. 19

Hình 1.8

Thụ tinh bình thường so với polyspermic...................................... 24

Hình 1.9

Kĩ thuật NBVT..............................................................

27

Hình 2.1

Buồng đếm tinh trùng....................................................................

43

Hình 2.2

Bố trí dầu trong kim......................................................................

47

Hình 2.3

Đĩa mơi trương thao tác loại nhân tế bào trứng............................. 47

Hình 2.4

Micro pipet và trứng trong thao tác hút và cấy nhân....................

47

Hình 2.5

Đĩa mơi trường thao tác cấy nhân tế bào vào trứng......................

48

Hình 2.6

Xung điện trứng sau cấy nhân......................................................

49

Hình 3.1

Kích thước và khối lượng buồng trứng lợn Bản: ........................

54

Hình 3.2

Phân bố nang bề mặt theo kích thước buồng trứng lợn Bản
theo mùa......................................................................................... 56

Hình 3.3

Trứng lợn Bản sau khi thu phân loại A,B,C..................................

58

Hình 3.4

Trứng lợn Bản sau thu và tách tế bào cận nỗn............................. 61

Hình 3.5

Mối tương quan giữa số lượng nang > 2 mm và số trứng

63


xiv
A+B của lợn Bản thu được trong 4 mùa........................................
Hình 3.6

Các giai đoạn phát triển của trứng lợn Bản trong hệ thống
Ni IVM...................................................................................... 66

Hình 3.7

Trứng lợn Bản sau ni thành thục trong các mơi trường............. 71

Hình 3.8

Đơng lạnh tinh dịch lợn Bản. ........................................................ 76

Hình 3.9

Các giai đoạn phát triển của phơi sau thụ tinh. ............................. 90

Hình 3.10

Trung bình số trứng A+B thu được/BT trong 4 mùa của lợn
Landrace......................................................................................... 93

Hình 3.11

Tỷ lệ thành thục của trứng lợn Bản và lợn Landrace nuôi
trong TCM-199+10% pFF và trong POM ..................................... 94

Hình 3.12

Độ ổn định của 2 loại tế bào qua các lần cấy chuyển.................... 95

Hình 3.13

Các giai đoạn NBVT lợn Bản và lợn Landrace.............

Hình 3.14

Tỷ lệ tạo phôi và chất lượng phội TTON, NBVT.......................... 101

Hình 3.15

Phơi nang lợn ngày 7 được nhuộm cho thấy sự khác biệt lớn

100

giữa phôi trong ống nghiệm và phôi phát triển tự nhiên trong
cơ thể lợn cái.................................................................................. 103


1
MỞ ĐẦU
Phát triển công nghệ sinh học sinh sản với sự bùng nổ các thành tựu mới về cấy
chuyển phôi, thụ tinh ống nghiệm (TTON), nhân bản vơ tính (NBVT), bảo quản lạnh
tế bào sinh sản và phôi, sự giao thoa giữa công nghệ sinh sản và các liệu pháp công
nghệ di truyền trên tế bào sinh sản đã và đang mở ra những tiềm năng ứng dụng to lớn
trong các lĩnh vực cải tiến năng suất vật nuôi, đảm bảo an ninh lương thực, bảo tồn và
khai thác đa dạng sinh học (ĐDSH), cân bằng sinh thái và phát triển công nghệ y dược
hiện đại.
Lợn là một trong các đối tượng quan trọng nhất của công nghệ sinh học. Ngồi
mục đích cung cấp thực phẩm cho con người, lợn còn là một trong những nhân tố trong
hệ thống bảo tồn đa dạng sinh học và có triển vọng ứng dụng lớn trong y học. Lợn

cũng là loài động vật có kích thước các cơ quan nội tạng tương đồng với các cơ quan
của người, có hệ gen, q trình sinh lý học, thể chất và hệ miễn dịch gần giống với
người, vì vậy lợn được xem là đối tượng khả thi nhất được lựa chọn cho hướng nghiên
cứu cấy ghép tạng khác loài (xenotransplantation). Năm 2009, các nhà khoa học đã tạo
ra các tế bào gốc cảm ứng đa năng ở lợn (induced pluripotent stem cell-iPS) với hầu
hết các đặc điểm giống với tế bào gốc phôi người và tế bào iPS của người. Năm 2018,
các nhà nghiên cứu của đại học Missouri cũng cho biết đã tạo được các cá thể lợn có
hệ miễn dịch suy yếu làm mơ hình cấy ghép tế bào gốc khơng bị đào thải. Kết quả này
giúp cho các nghiên cứu liệu pháp tế bào gốc tiến về phía trước nhanh hơn.
Việt Nam là nơi có nhiều giống lợn bản địa như lợn Ỉ, Bản, Cỏ, Mẹo, Mường
Khương … ít bị ảnh hưởng bởi quá trình lai tạo giống do được chăn thả tự nhiên ở các
vùng núi cao. Do khả năng tồn tại các cá thể không mang bản sao PERVs (Porcine
Endogenous Retroviruses-là virus nội sinh có sẵn trong bộ gen lợn từ thời cổ xưa. Các
virus này được tìm thấy trong DNA của lợn, mặc dù ở trạng thái bất hoạt, chúng có thể
hoạt động trở lại khi lây nhiễm sang loài khác) lợn Bản đang được đánh giá là đối
tượng tiềm năng quan trọng đối với công nghệ cấy ghép mơ tạng khác lồi
(xenotranspantation), là nguồn gen q cần được bảo tồn và phát triển [1] [2].
Tuy nhiên, cho đến nay các nghiên cứu và ứng dụng tiến bộ công nghệ sinh học
sinh sản vẫn chỉ được tiến hành chủ yếu trên các giống lợn ngoại, các nghiên cứu tương
tự vẫn chỉ mới được bắt đầu trên các giống lợn bản địa.
Các kết quả nghiên cứu tạo phôi các giống lợn mini bản địa tại Việt Nam đã được


2
một số tác giả công bố cho thấy một thực tế chưa được khắc phục đó là sự phát triển
phơi in vitro ở lợn bản địa vẫn còn thấp hơn rất nhiều so với các kết quả thu được trên
các giống lợn ngoại. Sự thành thục chưa hoàn toàn của trứng, môi trường nuôi trứng
và phôi chưa tối ưu cùng những tác động khác trong quá trình thụ tinh và nhân bản
được cho là nguyên nhân cơ bản làm chohiệu suất tạo phơi in vitro ở lợn nói chung,
lợn bản địa nói riêng cịn thấp.

Vì vậy chúng tơi đề xuất đề tài: “Nghiên cứu nuôi thành thục trứng và tạo
phôi lợn bản địa Việt Nam bằng kĩ thuật in vitro”.
Mục tiêu:
Nghiên cứu được tiến hành trên mơ hình lợn Bản là giống lợn bản địa được đánh
giá có ưu việt về số lượng bản sao PERV thấp với các mục tiêu:
1.

Xác định được tiềm năng khai thác trứng của buồng trứng lợn Bản.

2.

Xác định được các điều kiện nuôi thành thục trứng lợn Bản.

3.

Thiết lập thành công hệ thống tạo phơi lợn Bản có hiệu quả cao bằng cơng

nghệ TTON và NBVT
Dựa trên các nội dung nghiên cứu
1.

Nghiên cứu đặc điểm hình thái buồng trứng và tiềm năng khai thác trứng ở

lợn Bản theo mùa.
2.

Nghiên cứu nuôi thành thục trứng lợn Bản bằng phương pháp chuẩn hóa

mơi trường ni.
3.

Nghiên cứu nâng cao hiệu quả hệ thống tạo phôi lợn Bản TTON thông qua

môi trường thụ tinh, điều kiện thụ tinh và ni phơi.
4.

Nghiên cứu hồn thiện hệ thống tạo phơi lợn Bản NBVT.

Tính mới của luận án
1.

Luận án đã cung cấp các thông tin mới về ảnh hưởng của mùa vụ, môi

trường nuôi thành thục trứng, môi trường và chế độ thụ tinh, nuôi phôi và bảo quản
lạnh phôi TTON tạo phôi NBVT bằng cấy nhân khác giống làm cơ sở thiết lập thành
công hệ thống tạo phôi lợn Bản có hiệu quả cao, có thể phát triển nhằm mục đích bảo
tồn đa dạng sinh học.
2.

Là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam về sử dụng hệ thống Piezo để tạo phôi


3
NBVT trên đối tượng lợn.
Hiện nay các giống lợn địa phương đang đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng, số
lượng lợn bản địa thuần đã bị giảm đi nghiêm trọng và có nguy cơ mất giống do sự lai
tạp giao thoa với các giống lợn khác và nguy cơ gia tăng nhanh tỷ lệ đồng huyết do tự
phối giống trong cùng bầy đàn. Hơn nữa phương thức chăn nuôi lạc hậu, khơng kiểm
sốt được những đe dọa về dịch bệnh, đã góp phần làm giảm số lượng cá thể các giống
lợn này.

Việc xây dựng thành công hệ thống nuôi trứng và tạo phôi trên giống lợn bản địa
tại Việt Nam sẽ góp phần hỗ trợ nhiệm vụ bảo tồn đa dạng sinh học, nâng cao hiệu quả
chăn nuôi và khai thác giá trị nguồn gen các giống lợn này phục vụ các nghiên cứu ysinh học.


4
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
1.1.

Cấu tạo buồng trứng, sự thành thục trứng, q trình thụ tinh và phát triển

phơi in vivo ở lợn
1.1.1. Cấu tạo buồng trứng và sự thành thục in vivo trứng lợn
Buồng trứng là một bộ phận của cơ quan sinh dục cái, có chức năng tạo tế bào
trứng (giao tử cái-nỗn bào). Khơng giống như tinh hoàn, buồng trứng nằm trong xoang
bụng, sau thận, dưới đỉnh và trước khung xương chậu. Buồng trứng ở các loài gia súc
là một tổ chức kép, mỗi cá thể cái có hai buồng trứng gắn với hai đầu sừng tử cung
(buồng trứng phải và buồng trứng trái).
Buồng trứng của phần lớn động vật có vú gồm có hai miền, miền tủy bên trong
và miền vỏ bên ngồi. Miền tủy có nhiều mạch máu, thần kinh và mô liên kết. Miền
vỏ gồm các tế bào và các lớp mơ có chức năng tạo tế bào trứng, tổng hợp các hormone
progesterone và estrogen. Phía ngồi cùng của miền vỏ là một lớp tế bào lập phương
tạo thành lớp biểu mô bao phủ toàn bộ bề mặt buồng trứng. Ngay bên dưới biểu mô bề
mặt là một lớp mỏng, dày đặc các mô kiên kết. Phía dưới lớp này là nhu mơ chứa các
nang trứng và các tế bào chức năng khác [3].
Miền vỏ buồng trứng chứa nang ở các giai đoạn phát triển khác nhau gồm nang
nguyên thủy, nang sơ cấp, nang thứ cấp và nang trứng thành thục (hình 1.1). Nang
trứng là đơn vị cấu trúc cơ bản của buồng trứng, có chức năng duy trì q trình phát
triển trứng (oogenesis), bảo đảm khả năng thụ tinh và hình thành phơi của chúng [3].

Trong quá trình phát triển nang (folliculogenesis), nang khơng có xoang di
chuyển từ ngoại vi vào trung tâm buồng trứng, tạo thành nang có xoang, phát triển tiếp
thành nang trứng thành thục và di chuyển lại bề mặt buồng trứng để chuẩn bị cho sự
rụng trứng. Tế bào cận noãn của trứng trong các nang thứ cấp tiết ra dịch, phát triển và
tách rời, từ đó hình thành nang có xoang. Tế bào trứng tiếp tục phát triển cho đến khi
thành thục và được giải phóng khỏi buồng trứng (sự rụng trứng). Các hoạt động tổng
hợp các thành phần của tế bào chất, sắp xếp và giảm số lượng nhiễm sắc thể liên kết
chặt chẽ với nhau trong q trình này để đảm bảo sự tích hợp đồng thời sự thành thục
nhân và thành thục tế bào chất [4].


5

Trứng sơ cấp
Mạch
máu

Nang phát triển

Nang sơ cấp

Trứng thứ cấp
Nang
nguyên thủy

Nang
thành
thục

Bạch thể

Nang
vỡ

Thể vàng

Thể vàng giai
đoạn sớm

Giải
phóng
trứng

Hình 1.1. Cấu trúc buồng trứng và sự phát triển nang, trứng ở động vật có vú [5].
Ở lợn, các tế bào mầm nguyên thủy xuất hiện vào ngày 18 sau thụ tinh và tuyến
sinh dục bắt đầu hình thành vào giai đoạn phơi 24-26 ngày tuổi. Sau khi sinh, mỗi cá
thể lợn cái có khoảng 500.000 nang nguyên thủy gồm một tế bào trứng được bao quanh
bởi một lớp tế bào cận noãn [6]. Ước tính thời gian để nang nguyên thủy phát triển
thành nang thứ cấp là 84 ngày và sau đó cần thêm 19 ngày để đạt được đến giai đoạn
nang thành thục [7]; [8].
Các giai đoạn phát triển của nang liên quan chặt chẽ với sự gia tăng kích thước
và sự thành thục của trứng (Hình 1.2). Trong giai đoạn đầu, kích thước của nang và
của tế bào trứng có sự biến đổi song song và tuyến tính. Ở các giai đoạn tiếp sau, tế
bào trứng bước vào quá trình phân chia giảm phân và đạt kích thước gần như tối đa,
kích thước của trứng khơng đổi nhưng kích thước nang tiếp tục tăng trưởng [9]. Đường
kính tế bào trứng tăng từ khoảng 30 µm đến 120 µm và trứng hồn thành quá trình
tăng trưởng trong các nang 1,8 mm. Trứng lợn ở giai đoạn này có hình cầu, đường kính
trứng khơng màng sáng dao động trong khoảng 120-170 µm [10].

6

84 ngày

Nang ngun
thủy

19 ngày

14 ngày

Sự hình thành
khoang

Trước khi
rụng trứng

Đường kính
trứng
Đường kính
nang và sự
phát triển

Nang hình
thành

Trước rụng
trứng

8-10mm

rụng trứng

Hình 1.2. Sự phát triển của nang, tế bào trứng lợn thông qua quá trình giảm phân [8].
Quá trình phát triển của trứng (oogeneisis) từ khi hình thành đến khi thành thục,
có khả năng thụ tinh trải qua các giai đoạn biến đổi về hình thái và chức năng, phân
chia giảm nhiễm đặc trưng cho các lồi động vật có vú [11].
Giai đoạn tăng số lượng noãn nguyên thủy diễn ra khi cá thể cái chưa thành thục
về tính, bắt đầu từ ngày thứ 13 sau thụ tinh cho đến ngày thứ 7 sau khi sinh. Noãn
nguyên thủy gồm một tế bào trứng (ovocyt I) được bao bọc bởi lớp tế bào nang mỏng,
dẹt được sinh ra từ biểu mô mầm của bào thai. Số lượng nỗn ngun thủy được tăng
lên do q trình phân chia nguyên phân lặp lại liên tiếp nhiều lần, các nỗn bào được
hình thành ở giai đoạn này đều mang bộ nhiễm sắc thể 2n.
Giai đoạn sinh trưởng với đặc điểm các nỗn ngun thủy tích lũy chất dinh
dưỡng, tăng kích thước và khối lượng, phát triển thành các noãn bào sơ cấp và noãn
bào cấp I. Tất cả các tế bào này đều có bộ nhiễm sắc thể 2n. Noãn sơ cấp của lợn bao
gồm một ovocyt I có đường kính khoảng 30-60 µm, nhân to, có hạt dự trữ Balliani,
bên ngoài được bao bọc bởi một lớp tế bào nang mỏng. Noãn thứ cấp gồm một ovocyt
I đã phát triển lớn hơn và chứa nhiều nỗn hồng. Vỏ của ovocyt I dày lên tạo thành
màng trong suốt, có nhiều lớp tế bào bao quanh. Ovocyt I có đường kính khoảng 120150 µm [12].
Giai đoạn hình thành trứng khi noãn bào cấp I trải qua hai lần phân bào giảm
phân liên tiếp để tạo một trứng và ba cực cầu đều chứa bộ nhiễm sắc thể đơn bội 1n. Ở


7
lần phân bào I, noãn bào cấp I phân chia cho ra noãn bào cấp II (noãn bào thứ cấp) có
khối lượng lớn vì chứa tồn bộ nỗn hồng của nỗn bào cấp I và 1 cực cầu có kích
thước bé (cực cầu thứ nhất). Ở lần phân bào II, nỗn bào cấp II phân chia hình thành
tế bào trứng có kích thước lớn và cực cầu bé thứ hai, cực cầu bé thứ nhất cũng phân
chia thành hai cực cầu bé.
Giai đoạn thành thục trứng xảy ra sau khi các quá trình phân chia giảm phân kết

thúc.

Hình 1.3. Quá trình thành thục của trứng lợn.
a: Phức hợp tế bào cận noãn và noãn chưa thành thục, b: Tế bào cận noãn đang phát
triển xung quanh, c: Tế bào cận nỗn đang giãn nở, d: Trứng thành thục có thể cực
(mũi tên) (100X) [13].
Trứng lợn thành thục khoảng 38-42 giờ sau khi xuất hiện đỉnh LH (luteinizing
hormone). Trứng chứa nhiều nỗn hồng hơn, nhân to, trịn và rõ (Hình 1.3). Bao quanh
tế bào trứng là màng trong suốt, bên ngoài màng trong suốt là vành phóng xạ. Màng
trong suốt bao gồm nhiều tế bào, được sinh ra từ tế bào hình nang, là lớp ni dưỡng
tế bào trứng. Màng tế bào chất là lớp màng mỏng bao bọc lấy tế bào chất và nhân, cịn
được gọi là màng nỗn hồng. Màng này có tác dụng ni dưỡng tế bào trứng đã thụ
tinh. Đĩa trứng hình thành từ các tế bào cận noãn dày lên xung quanh hai bên ovocyt I.
Sự rụng trứng xảy ra khi trứng phân chia đến giai đoạn kỳ giữa II (Metaphase II-M.II)
[7].
Sự thành thục của trứng bao gồm thành thục của nhân và thành thục tế bào chất
là hai quá trình thành thục cần phải cùng được hồn thành trước khi rụng trứng. Thơng
thường tế bào trứng được coi là thành thục khi xuất hiện thể cực thứ nhất (sự thành
thục về nhân) và trứng đang ở giai đoạn M.II. Mặc dù tế bào trứng đã thành thục về


8
nhân có khả năng thụ tinh với tinh trùng, tuy nhiên sự thành thục về tế bào chất chưa
được hoàn thiện có thể dẫn đến sự thiếu hụt một số chất có ảnh hưởng quan trọng lên
sự phát triển của phơi [14].
Trạng thái nang có ảnh hưởng quan trọng lên kết quả nuôi thành thục trứng lợn
in vitro. Trứng được thu từ các nang có kích thước ≥ 3 mm có khả năng phát triển đến
giai đoạn thành thục hồn tồn trong điều kiện ni in vitro, trong khi trứng được thu
từ nang có kích thước từ 0,8 mm đến 2,9 mm có tỷ lệ thành thục thấp sau khi ni cấy
48 giờ và trứng thu từ các nang có kích thước < 0,7 mm khơng có khả năng hồn thành

quá trình phân chia giảm nhiễm [15], [16].
Quá trình giảm phân của tế bào trứng được diễn ra dưới tác động của cyclin B
p34cdc2 được coi là nhân tố kích thích thành thục (MPF) và mitogen-activated protein
(MAP) kinase (một protein kinase được hoạt hóa bằng mitogen, đặc trưng cho các axit
amin serine và threonine). Đây là hai nhân tố đặc biệt quan trọng kiểm sốt q trình
giảm phân. MPF là một thành phần quan trọng liên quan hoạt động của nhân tố ức chế
quá trình nhân lên của tế bào (CFS). Mức độ hoạt động của MPF được đánh giá thơng
qua phép đo hoạt tính của histone H1 kinase ( một loại enzyme xúc tác hoạt động của
Histone H1-một trong năm họ protein histone chính là thành phần của chất nhiễm sắc
trong các tế bào nhân chuẩn). Q trình kích thích này gây ra một loạt các phản ứng
và kết quả dẫn đến sự phá vỡ màng nhân, nhiễm sắc thể đóng xoắn và gắn vào các thoi
vơ sắc, trứng chuyển sang giai đoạn MII, sẵn sàng cho quá trình thụ tinh và tạo phôi.
Hoạt động của MPF đạt mức cao nhất khi trứng ở giai đoạn MII và giảm xuống khi
trứng được hoạt hóa [17].
Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu tìm hiểu về sự thành thục tế bào chất của trứng
động vật nói chung và trứng lợn nói riêng, nhưng cho đến nay quá trình này vẫn chưa
được hiểu biết đầy đủ. Bên cạnh đó, q trình này được mô tả ở những thay đổi siêu
cấu trúc diễn ra trong tế bào trứng từ giai đoạn GV đến giai đoạn MII. Những thay đổi
siêu cấu trúc trong tế bào chất bao gồm sự phân bố lại các bào quan, sắp xếp lại các vi
ống, hệ phức hợp Golgi, các cơ quan bài tiết, quá trình vận chuyển mRNA đến tế bào
chất [18]. Sự liên kết giữa tế bào cận noãn và tế bào trứng là yếu tố quan trọng điều
hòa các hoạt động bên trong tế bào chất và qua đó ảnh hưởng đến sự thành thục của tế
bào chất. Cysteine, cysteamine, glutamine, gonadotropins, yếu tố kích thích tăng
trưởng biểu bì (EGF), β-mercaptoethanol hoặc dịch nang trứng là các nhân tố cải thiện


9
sự thành thục tế bào chất của trứng [19].
1.1.2. Sự thụ tinh và phát triển phôi lợn in vivo
1.1.2.1. Các giai đoạn thụ tinh

Đến ngày trứng rụng, trứng thành thục sẽ rụng khỏi buồng trứng, di chuyển vào
ống dẫn trứng. Sau khi phối giống, tinh trùng bơi qua vùng chất nhầy của buồng tử
cung, tiến về phía ống dẫn trứng, sự thụ tinh sẽ xảy ra ở vị trí 1/3 ống dẫn trứng.
Tinh dịch lợn là một hỗn hợp bao gồm tinh trùng được sản sinh từ tinh hoàn và
các chất tiết của các tuyến sinh dục phụ như tuyến tinh nang, tuyến hành niệu đạo
(cowper), tuyến tiền liệt và tuyến niệu đạo (urethra). Tinh dịch lợn chứa nhiều tinh
thanh là một hỗn hợp chất lỏng do các tuyến sinh dục phụ bài tiết. Lượng tinh dịch
trung bình trong một lần xuất tinh ở lợn ngoại là 250 ml, dao động từ 50-400 ml, nồng
độ tinh trùng dao động từ 100-300 triệu tinh trùng/ml tinh dịch [20].
Tinh trùng lợn gồm có ba phần chính: (1) Phần đầu: chứa các vật chất di truyền,
có hai phần cơ bản là nhân và acrosome (2) Phẩn cổ thân: Là phần rất ngắn, hơi co lại,
cắm vào hốc ở đáy phía sau của nhân. Phần cổ thân chứa nhiều loại enzym oxy hóa
khử giúp cho các phản ứng trao đổi chất của tinh trùng; (3) Phần đi: Có chức năng
giúp tinh trùng vận động [21].
Cũng như các lồi khác, q trình thụ tinh ở lợn gồm các giai đoạn: Hoạt hóa
tinh, tinh trùng gắn vào màng zona của trứng, phản ứng acrosome, tinh trùng xuyên
qua màng zona, tinh trùng vào tế bào chất của trứng và liên kết với trứng, trứng được
kích hoạt và phản ứng vỏ của nỗn xảy ra.
Q trình hoạt hóa tinh xảy ra khi tinh trùng di chuyển trong buồng tử cung để
tiếp cận vòi trứng. Tử cung tiết các albumin liên kết với lipoproteins, proteolytic,
glycosidasic enzymes hỗ trợ hoạt động hoạt hóa của tinh trùng. Ở lợn, giai đoạn phát
triển nang ảnh hưởng quan trọng đến kết quả hoạt hóa tinh. Phần lớn tinh khơng được
hoạt hóa trong vịi trứng vào thời điểm nang đang ở giai đoạn tiền rụng trứng [22].
Sau khi hoạt hóa, tinh trùng sẽ bám vào bề mặt màng trong suốt và thực hiện phản
ứng acrosome. Vùng trong suốt được cấu tạo chủ yếu bởi các glycoprotein đồng phân
ZP1, ZP2, ZP3. pZP1 hoạt động như một thụ thể liên kết với tinh trùng thông qua hoạt
động của 2 loại protein 55kd proacrosin và 44kd [23]. Phản ứng thể đỉnh được đặc
trưng bởi sự phân giải dần dần màng sinh chất và màng ngoài acrosome của tinh trùng.