Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cây mật nhân eurycuma longifolia jack

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MƠI TRƯỜNG
---------------

ĐỒN THỊ ÁNH TUYẾT

NGHIÊN CỨU HỒN THIỆN QUY TRÌNH
NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY MẬT NHÂN
(EURYCOMA LONGIFOLIA JACK)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đà Nẵng - 2014


1

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MƠI TRƯỜNG
---------------

ĐỒN THỊ ÁNH TUYẾT

NGHIÊN CỨU HỒN THIỆN QUY TRÌNH
NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY MẬT NHÂN
(EURYCOMA LONGIFOLIA JACK)

Ngành: Sinh – Mơi trường

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

Người hướng dẫn: Ths. Võ Châu Tuấn

Đà Nẵng - 2014


2

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực, khách quan và chưa
từng được ai cơng bố trong bất kì cơng trình nào khác.
Đà Nẵng, ngày 23 tháng 5 năm 2014
Sinh viên
Đoàn Thị Ánh Tuyết


LỜI CẢM ƠN
Đề hồn thành khóa luận này em xin chân thành cảm ơn Trường Đại học
Sư phạm, khoa Sinh – Môi trường, bộ môn công nghệ sinh học, cùng q thầy
cơ, gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện thuận lợi cả về vật chất và tinh thần để em
có thể hồn thành đề tài này.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ths. Võ Châu Tuấn, thầy giáo đã
trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo tận tình cho em từ khi nhận đề tài cho đến khi
hồn thành khóa luận.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ths. Bùi Thị Thơ, Ths. Nguyễn Thị
Duy Nhất, những người đã giúp đỡ em rất nhiều trong việc trau dồi kiến thức và
kĩ năng thí nghiệm trong suốt q trình em thực hiện khóa luận.
Xin chân thành cảm ơn !

Đà Nẵng, ngày 23 tháng 05 năm 2014
Sinh viên

Đoàn Thị Ánh Tuyết


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
DANH MỤC CÁC BẢNG
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
1. Đặt vấn đề ...............................................................................................................1
2. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................................2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................................................2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LỆU ........................................................................3
1.1. Nhân giống in vitro ở thực vật ...........................................................................3
1.1.1. Lịch sử hình thành .............................................................................................3
1.1.2. Các giai đoạn của nhân giống in vitro...............................................................3
1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro và nuôi cấy tế bào thực vật .....5
1.1.3.1. Nguồn mẫu vật nuôi cấy ................................................................................5
1.1.3.2. Môi trường nuôi cấy.......................................................................................6
1.1.3.2. Điều kiện nuôi cấy .........................................................................................9
1.2. Sơ lược về nghiên cứu nhân giống in vitro cây dược liệu .............................10
1.2.1. Những nghiên cứu trên thế giới ......................................................................10
1.2.2. Những nghiên cứu tại Việt Nam .....................................................................11
1.3. Giới thiệu về cây mật nhân..............................................................................13
1.3.1. Đặc điểm hình thái ..........................................................................................13
1.3.2. Phân bố ............................................................................................................13

1.3.3. Thành phần hóa học ........................................................................................13
1.3.4. Tác dụng dược lý.............................................................................................14
1.3.5. Một số nghiên cứu liên quan đến cây mật nhân ..............................................15


Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................16
2.1. Đối tượng nghiên cứu.......................................................................................16
2.2. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................16
2.2.1. Phương pháp nhân nhanh chồi in vitro ...........................................................17
2.2.2. Phương pháp hình thành rễ in vitro .................................................................17
2.2.3. Khảo sát sự thích nghi của cây mật nhân in vitro khi đưa ra đất ....................17
2.2.4. Xử lý số liệu ....................................................................................................18
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ...............................................................19
3.1. Ảnh hưởng của các chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây
mật nhân ..................................................................................................................19
3.1.1 Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro ............................19
3.1.2. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro
cây mật nhân .............................................................................................................20
3.1.3. Ảnh hưởng của BA và IBA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro ..............21
3.2. Ảnh hưởng của các chất ĐHST đến khả năng tạo rễ in vitro cây mật nhân .....23
3.2.2. Ảnh hưởng NAA và BA đến khả năng tạo rễ in vitro cây mật nhân ..............24
3.2.3 Ảnh hưởng của NAA và KIN đến khả năng tạo rễ in vitro cây mật nhân .......25
3.3. Đánh giá khả năng sống sót và sinh trưởng của cây mật nhân in vitro khi đưa
trồng ngoài đất...........................................................................................................26
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................28
1. Kết luận .................................................................................................................28
2. Đề nghị ..................................................................................................................28
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................29
PHỤ LỤC HÌNH ẢNH

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
IAA

: indole 3-acetic acid

IBA

: indole 3-butyric acid

NAA

: α-naphthalen acetic acid

2,4-D : diclorophenoxyacetic acid
BA

: 6-γ- γ-dimethyl-aminopurine

BAP

: 6-γ-γ-dimethyl-aminopurine purine

KIN

: kinetin

MS

: Murashige và Skoog

cs

:cộng sự

ĐHST : điều hòa sinh trưởng
NXB

: nhà xuất bản

L

: lít


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình

Tên hình

Trang

2.1

Cây mật nhân ngồi tự nhiên

16

2.2

Gốc thân cây mật nhân in vitro

16

3.1

3.2
3.3

Chồi mật nhân hình thành sau 6 tuần nuôi cấy trên môi
trường bổ sung 0,5 mg/L BA
Rễ mật nhân hình thành sau 6 tuần nuôi cấy trên môi
trường bổ sung 0,5 mg/L NAA
Cây mật nhân in vitro sinh trưởng sau 3 tuần ngoài
vườn ươm

23

26

27


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng
3.1

3.2

3.3

3.4

3.5

3.6

Tên bảng
Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi in
vitro cây mật nhân
Ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng nhân nhanh
chồi in vitro cây mật nhân
Ảnh hưởng của BA và IBA đến khả năng nhân nhanh
chồi in vitro cây mật nhân
Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ in vitro cây
mật nhân
Ảnh hưởng của NAA và BA đến khả năng tạo rễ in vitro
cây mật nhân
Ảnh hưởng của NAA và KIN đến khả năng tạo rễ in
vitro cây mật nhân

Trang
19

20

22

23

24

25

Ảnh hưởng của cơ chất đến khả năng thích nghi, sinh
3.7

trưởng và phát triển của cây mật nhân in vitro ngoài tự
nhiên

27


1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Từ hàng ngàn năm, cây thuốc đã cung cấp một lượng lớn các dược chất quý
dùng trong điều trị bệnh và tăng cường sinh lực cho con người [27]. Theo Tổ
chức Y tế Thế giới (WHO), trên thế giới có đến 80% dân số vẫn dựa vào các
phương pháp truyền thống kết hợp sản phẩm từ thiên nhiên để chăm sóc sức
khỏe và ¼ số thuốc chứa các hợp chất chiết xuất từ thực vật [1]. Việt Nam có khí
hậu nhiệt đới gió mùa ẩm nên nguồn thảo dược đa dạng và phong phú, với hơn
3200 loài [5]. Hiện nay, nạn khai thác bừa bãi, quá mức các loài cây thuốc phục
vụ nhu cầu về dược liệu đã làm suy giảm nhanh chóng cả về số lượng, chất
lượng các loài cây thuốc và đã đẩy rất nhiều loài cây quý, hiếm vào nguy cơ
tuyệt chủng [20].
Trong nhiều thập kỷ qua, sự phát triển mạnh mẽ của lĩnh vực cơng nghệ
sinh học nói chung, ni cấy mơ và tế bào thực vật nói riêng đã mang lại nhiều
thành tựu lớn trong việc nhân giống và cải thiện di truyền của các loài cây, đặc

biệt là các cây thuốc quý. Bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro thực vật, có thể tạo ra
lượng lớn cây giống trong thời gian ngắn với chất lượng tốt và sạch bệnh mà các
phương pháp nhân giống truyền thống không thể thực hiện được [45]. Cây mật
nhân (Eurycoma longifolia Jack) là cây thuốc quý, được sử dụng nhiều ở các
nước Đông Nam Á. Hầu hết các bộ phận của cây được sử dụng làm thuốc để
chữa nhiều loại bệnh, chẳng hạn như bệnh sốt rét, tiểu đường, viêm loét, nhiễm
khuẩn…; đặc biệt có tác dụng rất tốt trong cải thiện sinh lý ở nam giới [56].
Nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học quý của mật nhân cũng đã được xác định
như alkaloid, quassinoid, eurycolactone, laurycolactone, eurycomalactone,
canthin-6-one… [25], [40]. Mật nhân là loài cây thân gỗ lâu năm, sinh trưởng
chậm, phải trồng mất 4 - 7 năm mới thu hoạch dùng làm thuốc [26]. Hiện nay ở
nước ta, nhu cầu sử dụng thực vật làm thuốc để chăm sóc sức khỏe và chữa bệnh
ngày càng tăng, việc khai khác thác quá mức cây mật nhân cũng đang diễn ra ở
nhiều nơi, có thể dẫn đến nguy cơ tuyệt chủng trong tương lai gần. Do đó, việc


2

nghiên cứu tìm ra phương thức bảo tồn, phát triển và khai thác bền vững nguồn
dược liệu quý này là vô cùng cần thiết.
Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tơi thực hiện đề tài: “Hồn thiện quy trình
nhân giống in vitro cây mật nhân (Eurycoma longifolia Jack)”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Xây dựng hồn thiện quy trình nhân giống cây in vitro cây mật nhân.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp dẫn liệu khoa học mới về nhân
giống in vitro cây mật nhân.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của đề tài là cơ sở khoa học tốt để xây dựng quy trình nhân giống

in vitro cây mật nhân, cung cấp nhanh, liên tục và ổn định nguồn cây giống phục
vụ bảo tồn, phát triển bền vững nguồn gen quý ở nước ta.


3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nhân giống in vitro ở thực vật
1.1.1. Lịch sử hình thành
Năm 1665, Robert Hooke với việc quan sát thấy tế bào sống dưới kính hiển
vi và đưa ra khái niệm “tế bào” đã mở ra nhiều hướng nghiên cứu mới cho các
nhà khoa học trên thế giới. Trên cơ sở về tính tồn năng của một tế bào, năm
1902 Haberlandt là người đầu tiên khởi xướng việc nuôi cấy mô, tế bào thực vật
để chứng minh tính tồn năng nhưng khơng thành cơng. Nhưng sau ông đã có
nhiều nhà khoa học tiếp bước và đã thành công như 3 nhà khoa học Gautheret,
Nobecourt, White nuôi cấy mô sẹo trong thời gian dài từ mô thượng tầng ở cà rốt
và thuốc lá, mơ sẹo có khả năng sinh trưởng liên tục. Hơn nữa các nhà khoa học
đã tìm ra một số chất điều hịa sinh trưởng và tỉ lệ giữa chúng để nuôi cấy cây in
vitro theo mong muốn [4].
1.1.2. Các giai đoạn của nhân giống in vitro
Giai đoạn 1: Cấy gây (tạo nguyên liệu khởi đầu)
Dựa vào đặc điểm từng loại cây mà lựa chọn những bộ phận như chồi đỉnh,
chồi nách, lá, thân, rễ… nuôi cấy in vitro. Theo Ninh Thị Thảo và cs (2009)
trong nhân giống in vitro cây loa kèn đỏ nhung cho thấy nguồn mẫu tốt nhất là
đế củ [17]. Còn theo nghiên cứu của Tạ Thục Anh và cs (2008) lại khảo sát các
chất điều hòa sinh trưởng để nhân giống in vitro cây hoắc hương từ mô lá [1].
Hay nhiều loài hoa nhân giống từ hạt như nghiên cứu của Nguyễn Thị Sơn và cs
đã nhân giống in vitro thành công lan Dendrobium fimbriatum Hook từ hạt [6].
Khi đưa vào nuôi cấy điều kiện đầu tiên mẫu phải được vơ trùng và cịn khả

năng sinh trưởng. Hiện nay người ta thường dùng cồn 70%, HgCl2, NaOCl,
Ca(OCl)2, hoặc một số chất diệt nấm khác... Một nghiên cứu vi nhân giống cây
lô hội của Nguyễn Thị Kim Thanh, Dương Huyền Trang đã khử trùng mẫu tốt


4

nhất với HgCl2 0,1% trong vòng 7 phút [15]. Đối với nghiên cứu của Nguyễn
Bảo Toàn và Lê Hồng Giang về nhân giống in vitro cây nắp bình, tác giả đã vô
trùng mẫu bằng cách ngâm mẫu bằng dung dịch Clorox 10% trong 15 phút. Sau
đó, mẫu được ngâm trong dung dịch Clorua thủy ngân (HgCl2) 0,5‰ trong 15
phút [19]…
Lưu ý: Chọn mẫu ưu việt nhất, tức là mẫu phải khỏe mạnh, sạch bệnh, khả
năng sinh trưởng tốt (chồi non, chồi ngủ, hoa non, lá non…). Các công việc đều
thực hiện trong điều kiện vơ trùng. Việc khử trùng cịn quyết định đến khả năng
sinh trưởng của mẫu nên cần lựa chọn những phương án tối ưu nhất.
Giai đoạn 2: nhân nhanh
Tùy thuộc vào mục đích ni cấy mà bổ sung các chất kích thích sinh
trưởng khác nhau của nhóm cytokinin, hay tổ hợp giữa auxin/cytokinin với tỉ lệ
thường nhỏ hơn 1. Tăng cường chiếu sáng 16 giờ/ngày, tối thiểu là 1000 Lux,
đảm bảo nhiệt độ vào khoảng 20 – 300C, tốt nhất là 250C [13], [25]. Theo nghiên
cứu của Phạm Thị Thu Hằng và cs trong nhân giống in vitro cây trầu bà cánh
phượng, mẫu ni cấy thích hợp trong điều kiện: nhiệt độ 22 – 250C, cường độ
ánh sáng là 2000 Lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ sáng/8 giờ tối [2]. Còn đối với
nghiên cứu của Bùi Đình Thạch và cs trong ni cấy in vitro cây bạch hoa xà,
các mẫu được nuôi cấy trong điều kiện chiếu sáng 10 giờ/ngày ở nhiệt độ 220C ±
2 [14].
Lưu ý: Chọn chồi sinh trưởng tốt để nhân nhanh, thời gian nhân nhanh
khoảng 10 – 36 tháng không nên để quá lâu, nhân 2000 – 3000 chồi sau 7 - 8 lần
cấy chuyển để tránh biến dị soma [4], [5]. Giai đoạn này cây cần được chăm sóc

kỹ về điều kiện môi trường như nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm…
Giai đoạn 3: tạo rễ
Các rễ có thể được hình thành trong q trình ni cấy, nhưng để rễ phát
triển mạnh thì các chồi thường chuyển sang mơi trường tạo rễ. Môi trường tạo rễ
thường bổ sung auxin hoặc kết hợp giữa auxin/cytokinin với tỉ lệ lớn hơn 1. Một
nghiên cứu nhân giống in vitro cây dầu mè của Bùi Văn Thế Vinh và cs (2011)


5

đã xác định môi trường tốt nhất để chồi ra rễ là ½ MS bổ sung 0,5 mg/L NAA
[22]. Đối với nghiên cứu của Nguyễn Thị Út và cs (2010) đã nghiên cứu môi
trường tốt nhất tạo rễ in vitro cây sâm cao là môi trường MS bổ sung 1 mg/L BA
và 1mg/L KIN đạt 15,75 chồi/mẫu [24].
Lưu ý: Ở giai đoạn này việc cung cấp đầy đủ ánh sáng là cần thiết để bộ rễ
có thể phát triển khỏe mạnh, lựa chọn những chồi có sức sống mạnh để cho ra rễ.
Giai đoạn 4: Chuyển cây ra đất trồng
Đây là giai đoạn cây in vitro thích nghi với các điều kiện tự nhiên, vì vậy
thời gian thích nghi sẽ kéo dài 5 - 7 ngày trước khi trồng ra ngồi đất. Chọn
những giá thể thích hợp kết hợp với sự điều chỉnh mơi trường tốt nhất để cây
thích nghi và phát triển như: che phủ bao nilon giảm lượng ánh sáng trực tiếp,
thiết kế hệ thống tưới phun, thường xun theo dõi và chăm sóc đặc biệt. Năm
2013, Hồng Thị Thế và cs đã nuôi cấy in vitro thành cơng cây ba kích và trồng
thử nghiệm ngồi vườn ươm với giá thể tốt nhất được sử dụng để tiếp nhận cây
là giá thể hữu cơ (50% bột dừa + 50% phế liệu sản xuất nấm ăn), cho tỷ lệ cây
sống đạt 96,1% sau 60 ngày. Cây được đặt trong nhà lưới, che phủ bằng nilon và
lưới che râm có khả năng cản 70% ánh sáng. Tưới nước giữ ẩm 3 lần/ngày trong
tháng đầu tiên và 2 lần/ngày từ tháng thứ 2. Tưới thúc bằng phân bón NPK Ðầu
Trâu sau 15 - 20 ngày chuyển cây ra vườn ươm với nồng độ tăng dần từ 0,4% 1%, định kỳ 10 ngày/lần [18].
1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro và nuôi cấy tế bào thực

vật
1.1.3.1. Nguồn mẫu vật ni cấy
Tùy theo từng lồi, từng mục đích nghiên cứu mà người ta lựa chọn bộ
phận nào đó của cây làm nguyên liệu trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật. Các
mẫu ni cấy có thể là chồi đỉnh, chồi nách, lá, chồi ngủ, rễ, thân… Theo nghiên
cứu của Võ Châu Tuấn và Huỳnh Minh Tư (2010) đã sử dụng đoạn thân có mắt
lá để nhân giống in vitro cây ba kích - một dược liệu q có cơng dụng bổ thận
âm, thận dương, trí não,… với hệ số nhân chồi cao (15 chồi/mẫu cấy) [20]. Năm


6

2010, Nguyễn Thanh Tùng và cs đã nuôi cấy in vitro thành cơng cây qua lâu
(Trichosanthes kirilowii) là lồi dược liệu quý chứa nhiều hợp chất hóa học có
giá trị như triterpenoid, sterol và đặc biệt là các protein bất hoạt ribosome như:
karasurin, trichosanthin (TCS), trichosanthes anti-HIV protein (TAP 29) có hoạt
tính ức chế khối u và kháng virus (bao gồm cả HIV), nguồn mẫu vật được sử
dụng là hạt chín của cây qua lâu [21]. Cịn theo Thiyagarajan M, Venkatachalam
P (2012), nguyên liệu được sử dụng nuôi cấy là chồi nách trong nghiên cứu nhân
giống in vitro cây cỏ ngọt (Stevia rebaudiana (Bert)) [61].
1.1.3.2. Môi trường nuôi cấy
Một trong những yếu tố quan trọng trong việc nuôi cấy in vitro là môi
trường. Môi trường phải đảm bảo đầy đủ các chất để kích thích khả năng sinh
trưởng và phát triển của mẫu. Tùy theo từng loài, từng bộ phận và mục đích ni
cấy mà thay đổi thành phần mơi trường.
* Nguồn carbon
Mô và tế bào nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng,
một số trường hợp sống bán dị dưỡng nhờ điều kiện ánh sáng nhân tạo mà lục
lạp khó có khả năng quang hợp tốt được. Vì vậy, việc đưa vào mơi trường ni
cấy nguồn carbon hữu cơ là điều bắt buộc. Ngoài ra nguồn carbon còn tham gia

vào việc điều chỉnh thẩm thấu vào khoảng 50% - 70% của môi trường. Ba nguồn
carbon thực vật thường hấp thụ là sucrose, glucose, fructose nhưng sử dụng chủ
yếu vẫn là đường sucrose với nồng độ thích hợp là 2% – 3% [4].
* Muối khống
Cây trồng thường sống chủ yếu dựa vào hai nguồn dinh dưỡng chính là
chất khống trong mơi trường đất và q trình quang hợp, hơ hấp. Việc bổ sung
các loại muối khống vô cơ giúp cây khỏe mạnh và phát triển. Các mơi trường
khác nhau có hàm lượng chất khống khác nhau. Một số môi trường nhân tạo
như White, Knop, B5, MS,… trong số đó mơi trường MS được dùng phổ biến
nhất. Môi trường nhân tạo chứa các nguồn vật liệu nitơ, lưu huỳnh, photpho là
thành phần không thể thiếu của các phân tử protein, các axit nucleic và nhiều


7

chất hữu cơ khác. Chúng cịn đóng vai trị trong việc ổn định áp suất thẩm thấu
của môi trường và tế bào, duy trì thế điện hóa của thực vật [4].
* Chất ĐHST
Bên cạnh cung cấp các chất dinh dưỡng thì việc bổ sung một số chất ĐHST
như auxin, cytokinin, gibberellin là rất cần thiết để cây có thể sinh trưởng và
phát triển một cách tốt nhất. Nghiên cứu của Nguyễn Trung Thành và Yoeup
(2008) về nhân nhanh rễ bất định nhân sâm (Panax ginseng) cho thấy ảnh hưởng
của một số nhân tố lý hóa lên sự tăng trưởng sinh khối và sản phẩm trao đổi chất
ginsenosides, kết quả 2,4-D là thích hợp cho sự hình thành và phát triển của mơ
sẹo, cịn IBA là thích hợp cho sự hình thành và tăng trưởng của rễ bất định. Số rễ
bất định được hình thành trên mơi trường được bổ sung IBA nhiều hơn rất nhiều
so với NAA [16].
- Nhóm auxin:
Có tính chất phân chia tế bào, có hoạt tính tăng cường chiều dài thân, lóng,
tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ và phân hóa mạch dẫn. Auxin tự

nhiên trong mơ thực vật là IAA. Ngồi ra cịn có các loại auxin nhân tạo là
NAA, 2,4-D, IBA, NOA, 4-CPA, PCPA,… Auxin kết hợp chặt chẽ với các chất
sinh trưởng để kích thích sự sinh trưởng của cây, mơ sẹo, huyền phù,… Auxin
thường được hòa tan với etanol hoặc NaOH pha lỗng [4]. Trương Thị Bích
Phượng và cs đã nguyên cứu nhân giống in vitro cây dược liệu - Nha đam (Aloe
vera L.). Môi trường tạo rễ tốt nhất là mơi trường ½ MS bổ sung NAA 0,5 mg/L
với số rễ đạt được cao nhất là 5,07 rễ/mẫu [10]. Năm 2011, Đặng Ngọc Phúc và
cs đã nghiên cứu nhân giống in vitro cây sa nhân tím (Amomum longiligulare
T.L.Wu). Mẫu sử dụng là đỉnh sinh trưởng và chồi nách từ thân rễ, rễ được cảm
ứng tốt nhất trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/L NAA [8].
- Nhóm cytokinin:
Các chất thuộc nhóm cytokinin là dẫn xuất của adenine liên quan chủ yếu
đến sự phân chia tế bào, thay đổi ưu thế ngọn,… Zeatin và 2-iP là hai cytokinin
tự nhiên, còn một số cytokinin nhân tạo như BAP, BA, Kinetin,… Cytokinin


8

được hịa tan trong NaOH hoặc HCl lỗng. Ngồi ra, việc kết hợp auxin và
cytokinin sẽ tạo ra hỗn hợp chất kích thích sinh trưởng rất tốt. Nghiên cứu của
Tạ Như Thục Anh và cs (2008) trong phát sinh hình thái của mô lá cây hoắc
hương cho thấy, sự kết hợp NAA và BAP là tốt nhất trong việc hình thành mô
sẹo ở cây hoắc hương [1]. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Út và cs (2010), khả
năng nhân chồi của cây sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) tốt nhất trên môi
trường MS bổ sung BA với nồng độ 2,5 mg/L, đạt 8,25 chồi/mẫu [24].
- Nhóm gibberellin:
Chất này được phát hiện vào những năm 1930, chất thuộc nhóm này thơng
dụng nhất là GA3. Gibberellin đóng vai trị quan trọng trong nhiều q trình sinh
lý như: sinh lý ngủ nghỉ của hạt và chồi, sự phát triển của hoa, tăng sinh trưởng
chiều dài của hạt,… So với auxin và cytokinin thì gibberellin ít khi được sử dụng

[4].
* Các chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy
- Nước dừa (CW):
Với nhiều nghiên cứu của George năm 1993, 1996 đã xác định nước dừa rất
giàu hoạt chất hữu cơ, khống và các chất kích thích sinh trưởng, còn chứa một
số amino axit cần thiết cho cây [5]. Nước dừa được sử dụng để kích thích phân
hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều cây. Nước dừa thường được sử dụng ở nồng độ
từ 5% - 20%.
- Than hoạt tính (AC):
Bổ sung AC vào mơi trường có tác dụng kích thích sinh trưởng và phân hóa
lồi hoa lan, cà rốt, cà chua,… Nhưng nó lại ức chế ở thuốc lá, đậu tương,… AC
cịn giảm độc trong mơi trường. Người ta thường dùng AC với nồng độ 0,5% 3% [3]. Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Nhật Linh (2012) cho thấy khi cho AC
vào môi trường nuôi cấy cây hồng môn là 2 g/L và cúc là 3 g/L thì kết quả cho
thấy sự hình thành rễ và chồi tăng đáng kể, AC cịn có tác dụng tăng diện tích
mạch dẫn [6].


9

- Bột chuối:
Trong chuối chứa nhiều vitamin và đường cần thiết cho cây vì vậy người ta
thường làm khơ chuối chín rồi nghiền thành bột bỏ trộn với mơi trường với hàm
lượng khoảng 40g/L. Ngồi ra cịn có một số hợp chất hữu cơ khác như dịch
chiết cà chua, khoai tây, mạch nha, nấm men,… để làm tăng sự phát triển của mô
sẹo hay cơ quan nuôi cấy [4].
1.1.3.2. Điều kiện nuôi cấy
* Nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến sinh trưởng và phát triển cây in vitro trong
quá trình sinh trưởng, hơ hấp hay cả quang hợp. Nhiệt độ thích hợp là 20 – 270C,
tối ưu nhất là 250C. Cytokinin kích thích nhân chồi bi ức chế ở nhiệt độ 240C vì

vậy việc điều chỉnh nhiệt độ thật sự cần thiết để cây có thể sinh trưởng và phát
triển tốt. Nghiên cứu của Cha-um S và cs (2010) về ảnh hưởng của nhiệt độ và
độ ẩm đối với sự thay đổi sinh lý và phát triển của Phalaenopsisadapted trong in
vitro cho thấy, trọng lượng tươi cao nhất ở T: 25 ± 20C và RH: 60 ± 5 %, trọng
lượng khô cao nhất ở T: 35 ± 2°C và RH: 60 ± 5 %, chiều dài rễ cao nhất ở T: 15
± 2 và RH: 60 ± 5 % và diện tích lá cao nhất ở T: 35 ± 2°C và RH: 60 ± 5 %
[29].
* Ánh sáng
Những cây có lá xanh thì việc cung cấp ánh sáng là rất cần thiết cho hoạt
động sinh lý, đặc biệt là quang hợp. Cường độ chiếu sáng tùy thuộc vào mỗi loại
cây, từng giai đoạn, cường độ tốt nhất vào khoảng 2000 Lux [4]. Trong nghiên
cứu của Hanus-Fajerska TCE và cs (2007) về ảnh hưởng của bước sóng ánh sáng
lên cây Cattleya hybrids cho thấy, hệ số nhân giống đạt 11,7 dưới ánh sáng đỏ;
10,6 dưới màu xanh; 8,3 dưới ánh sáng trắng và 6.2 trong tối [34].
* Độ pH
pH ảnh hưởng đến sự di chuyển của các ion, quá trình thu nhận các chất
dinh dưỡng. Hầu hết môi trường nuôi cấy có pH: 5,5- 6,0 trước khi khử trùng là
tốt nhất. Nếu pH thấp hơn 5,5 làm agar khó đơng, nếu pH cao hơn 6,0 thì mơi


10

trường sẽ đông cứng làm hạn chế khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng của cây.
Một số môi trường, cây ni cấy có thể tiết ra các axit hữu cơ làm thay đổi pH vì
vậy vần điều chỉnh pH cho phù hợp [4].
1.2. Sơ lược về nghiên cứu nhân giống in vitro cây dược liệu
Với nhu cầu sử dụng dược liệu tự nhiên đã làm cho số lượng các loài cây
này giảm mạnh, một số cây nguy cơ tuyệt chủng cao. Các nhà khoa học đã
khơng ngừng tìm kiếm các phương pháp để cải thiện tình hình và cơng nghệ nuôi
cấy mô, tế bào thực vật là giải pháp tốt nhất hiện nay. Không những cải thiện

được số lượng giống cây dược liệu thốt khỏi sự tuyệt chủng cịn đem lại giá trị
kinh tế cao [1].
1.2.1. Những nghiên cứu trên thế giới
Các nước trên thế giới đang hướng tới việc phát triển cơng nghệ ni cấy
mơ các lồi cây có giá trị kinh tế cao, đặc biệt để bảo tồn các nguồn gen q
hiếm có tính dược lý để bào chế các thuốc chữa bệnh. Cây mười giờ (Portulaca
grandiflora Hook) là một loại hoa phổ biến với đủ màu sắc đẹp, khơng những
thế trong cây cịn có chứa một số dược chất chữa bệnh đau bụng, sốt phát ban,
hổ trợ việc cai nghiện,… Nghiên cứu của Jain AK, Bashir M (2010), nguyên liệu
khởi đầu là chồi được khử trùng sơ bộ dưới vòi nước trong vòng 10 phút, sau đó
được khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 3 phút, tráng sạch bằng nước cất vô
trùng trong tủ cấy và được cấy vào môi tường cơ bản MS và môi trường MS bổ
sung BAP (0,5 - 4,5 mg/L), KIN (0,5 - 4,0 mg/L), kết quả đạt được tốt nhất trên
môi trường MS bổ sung BAP 4,0 mg/L với hệ số nhân chồi 98%, đạt 56,55
chồi/mẫu. Sau khi mẫu tốt chuyển qua môi trường rễ, môi trường tạo rễ tốt nhất
là NAA 0,75 mg/L đạt 95%, với 9,2 rễ/chồi [39].
Cây Psoralea corylifolia Linn thuộc họ đậu, là cây thuốc quý của Ấn Độ.
Trong cây có các nhóm chất như coumarins, psoralen, isopsoralen, angelicin,
daidzein và genistein có tác dụng kháng u, kháng khuẩn, kháng nấm và các hoạt
động chống oxy hóa dạ dày, tiểu đường, lợi tiểu,… Năm 2013, Pandey P và cs
đã nghiên cứu nhân giống in vitro để bảo tồn dược liệu này. Kết quả nghiên cứu


11

cho thấy, môi trường MS bổ sung BAP 12 mg/L, KIN 15 mg/L, NAA 10 mg/L
là môi trường tốt nhất cho chồi phát triển, với hệ số nhân chồi cao, đạt 6,12
chồi/mẫu; môi trường ra rễ tốt nhất là môi trường MS bổ sung IBA 2,5 mg/L
(đạt 6,8 chồi/mẫu) [49]. Năm 2011, Musallam I và cs đã nghiên cứu vi nhân
giống thành cơng cây bạch hoa (Capparis spinosa L.), lồi cây có tác dụng giảm

đau dạ dày, chữa chứng biếng ăn, các bệnh về da, chữa bệnh nấm candida ở âm
đạo… Theo nghiên cứu của nhóm tác giả, số chồi đạt cao nhất 6,9 chồi/mẫu
trong môi trường MS bổ sung BAP 2 mg/L và rễ tốt nhất trong môi trường ½
MS bổ sung 5 mg/L IAA [48]. Cây sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn) là
cây dược liệu quý giúp hạ đường huyết, chống co thắt, chống ung thư, điều trị
vàng da, hen suyễn, tiêu chảy,… Năm 2003, Wala BB, Jasrai YT nghiên cứu
nhân giống in vitro cây sâm cau từ đỉnh chồi, các chồi sinh trưởng nhiều nhất
trên môi trường MS bổ sung 2,21 µM BA, tạo rễ tốt nhất trên mơi trường MS có
bổ sung 0,53 µM NAA [63].
1.2.2. Những nghiên cứu tại Việt Nam
Cây Bắt mồi (Drosera burmanni Vahl) có nhiều đặc điểm lạ, đẹp mắt có
tiềm năng kinh tế to lớn. Mặt khác, nó cịn có tầm quan trọng to lớn đối với giá
trị dược tính do trong cây chứa chất quinine có tác dụng kháng khuẩn, chống ung
thư, chống lao, viêm phổi,… Năm 2007, Quách Diễm Phương và Bùi Thị Lệ đã
nghiên cứu nhân giống in vitro cây bắt mồi (Drosera burmanni Vahl) để thu hợp
chất quinine có hoạt tính sinh học. Mẫu sử dụng là hạt, khử trùng Javel 10%
(v/v) + Tween-20 (0,01%) trong thời gian 10 phút, tạo được 94,09% hạt vô
trùng. Hạt nảy mầm sau 3 tuần gieo trên mơi trường MS ½ dùng để tạo nguyên
liệu nuôi cấy in vitro. Nuôi cấy trong mơi trường lỏng, 100% mẫu cấy đều cịn
sống, lá tăng trưởng xanh tốt và tạo nhiều chồi. Dùng sắc khí cột với dung môi
eter dầu hỏa, benzen, chloroform, ethyl acetate thu được hoạt chất quinine [9].
Cây nha đam (Aloe vera L.) tác dụng làm lành vết thương, chống viêm
nhiễm và dị ứng, chứa vitamin C tốt cho cơ thể. Trong lá nha đam có chứa lignin
giúp da mịn màng, điều trị viêm gan siêu vi B, các loại ung thư, tăng cường miễn


12

dịch ức chế sinh trưởng và phát triển của virus HIV. Năm 2010, Trương Thị
Bích Phượng và cs đã nguyên cứu nhân giống in vitro cây dược liệu - Nha đam

(Aloe vera L.). Mẫu sử dụng là chồi đỉnh sinh trưởng, khử trùng bằng HgCl2
0,1% trong 9 phút là thích hợp nhất với tỷ lệ mẫu sống đạt 70%. Môi trường tái
sinh chồi từ đỉnh sinh trưởng tối ưu là môi trường MS bổ sung BAP 1,5 mg/L,
đạt 5,27 chồi/mẫu. Môi trường bổ sung tổ hợp BAP 1,0 mg/L và NAA 0,5 mg/L
thích hợp nhất cho nhân chồi từ đỉnh sinh trưởng hay đoạn thân in vitro, số chồi
thu được cao nhất đạt 12,87 chồi/đoạn thân. Môi trường tạo rễ tốt nhất là mơi
trường ½ MS bổ sung NAA 0,5 mg/L với số rễ đạt được cao nhất là 5,07 rễ/mẫu.
Giá thể cát và đất thịt (1:1) là giá thể thích hợp nhất để đưa cây ra điều kiện tự
nhiên, tỷ lệ cây con sống đạt 75% [10].
Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) là một loài dược liệu quý.
Quả sa nhân chứa tinh dầu, với nhiều hợp chất hóa học giá trị như: camphen, βpinen, limonen, camphor, borneol, saponin,… có tác dụng ức chế hoạt động của
nhiều loại vi khuẩn, chữa nhứt răng, đầy hơi, ăn khơng tiêu,… lại có giá trị kinh
tế cao, được biết đến là loại gia vị đắt thứ ba trên thế giới sau saffron và vanilla.
Năm 2011, Đặng Ngọc Phúc và cs đã nghiên cứu nhân giống in vitro cây sa nhân
tím. Mẫu sử dụng là đỉnh sinh trưởng và chồi nách từ thân rễ. Đỉnh sinh trưởng
được khử trùng bằng HgCl 20,1% trong 12 phút. Môi trường MS bổ sung BAP
(1,0 mg/L) hoặc kinetin (1,0 mg/L) thích hợp nhất cho giai đoạn tái sinh chồi.
Chồi in vitro được nhân nhanh trên môi trường MS bổ sung 1,5 mg/L BAP kết
hợp với 0,25 mg/L NAA hoặc 1,5 mg/L kinetin kết hợp với 0,25 mg/L NAA. Rễ
được cảm ứng trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/L NAA. Cây con in vitro
được trồng trên giá thể trộn 1 đất phù sa: 2 trấu hun: 1 mùn hữu cơ cho tỷ lệ sống
cao đạt 93,14% [8].
Lan kim tuyến (Anoectochilus roxburghii Wall.) được biết đến với sự lung
linh trên lá, lại là nguồn dược liệu quý chữa bệnh nhức mỏi, đau bụng, khó
tiêu,… Năm 2010, Phùng Văn Phê và cs đã tiến hành nhân giống in vitro lan kim
tuyến (Anoectochilus roxburghii Wall.). Mẫu vật được dùng là phôi hạt chín và


13

chồi được tái sinh từ thân ngầm, thân khí sinh của cây phù hợp nhất để nhân
nhanh trong môi trường thích hợp Knud* bổ sung 0,5 mg/L BAP + 0,3 mg/L
KIN + 0,3 mg/L NAA + 100 ml/L CW + 100 g/L dịch chiết khoai tây + 20 g/L
sucrose + 7 g/L agar + 0,5 g/L AC [7].
1.3. Giới thiệu về cây mật nhân
1.3.1. Đặc điểm hình thái
Cây mật nhân có tên khoa học là Eurycoma longifolia Jack thuộc họ
Simarubacease, cịn có tên gọi khác là Tongkat Ali (Malaysia), Pasak Bumi
(Indonesia), cây bá Bệnh (Việt Nam ),… là cây gỗ, cây phát triển cao khoảng 12
m, thường không phân nhánh, thân thẳng đứng, lá kép lông chim lẻ từ 20 - 30
cặp lá chét màu xanh sẫm nhẵn, hoặc có lớp lơng nằm dưới, hình trứng [31]. Hoa
gồm 5 cánh màu đỏ cam, hoa mọc thành chùm ở nách cây, mùa hoa thường vào
tháng 6 - 7, đậu quả vào tháng 9 [3], [42]. Quả mật nhân có hình elip giống quả
xoan, nhẵn, cịn non hoặc già có màu xanh, khi chín có màu đỏ, quả chỉ có 1 hạt
[4]. Cây chủ yếu sống ở rừng với độ cao tương đối thấp khoảng 700 m hoặc bãi
biển trên đất cát [40].
1.3.2. Phân bố
Cây mật nhân được biết đến đầu tiên ở Malaysia, hiện nay cây mật nhân
cịn được tìm thấy ở hầu hết các nước Đông Nam Á như Thái Lan, Indonesia,
Philippines, Sumatra, Lào,… Chúng thường phân bố ở các khu rừng thấp, có độ
cao khoảng 700 m so với mực nước biển, hay bãi cát ven biển [60]. Chúng
thường sống ở những nơi nghèo chất dinh dưỡng, đồi dốc. Ở Việt Nam, cây mật
nhân phân bố trải rộng ở Miền Trung, Tây Nguyên, Đồng Nai [55], [3].
1.3.3. Thành phần hóa học
Trong cây mật nhân chứa rất nhiều hợp chất quan trọng đối với sức khỏe
con người. Những nghiên cứu cho biết một số dược chất quý là quassinoids, các
dẫn xuất squalene, biphenylneolignans, tirucallane-type triterpenes, canthine-6one, and β-carboline alkoloids [65], [53].


14

Quassinoids: chủ yếu ở rễ, bao gồm eurycomanol; eury comanol-2-O-β-Dglycopyranoside; 13β-18-dihydroeurycomanol; 14,15β-dihydroxy klaineanone
và 6α-dydroxyeurycomalactone [53], [27], [28]. Các dẫn xuất squalene bao gồm
eurylene, 14-deacetyleurylene; longilene peroxide và teurilene [53], [38], [47].
Biphenylneolignans bao gồm 2 đồng phân 2,2-dimetoxy-4-(3-hydroxy-1propenyl)-4-(propyl 1,2,3-trihydroxy) este diphenyl và 2 biphenyls; 2-hydroxy3,2-phenyl (3-hydroxy-1-propenyl)-bi và 2-hydroxy-3,2-dimetoxy-4 (2,3 - ,6trimetoxy-4-(2,3-epoxy-1-hydroxypropyl)-5-epoxy-1-hydroxy-proply)-5-(3hydroxy-1-propenyn)-biphenyl [50]. Alkoids bao gồm: 9,10-dimetoxy canthin-6one; 10-hydroxy-9-methoxy canthin-6-one; 11-hydroxy-10-methoxy canthin-6one; 5,9-dimetoxy canthin-6-one và 9-methoxy-3-methyl canthin-5,6-dione [36].
1.3.4. Tác dụng dược lý
Cây mật nhân từ lâu được biết đến như là nhân sâm của Maylasia, cũng như
tại nhiều nước Đông Nam Á với tác dụng giúp nam giới tăng cường chức năng
sinh lý và sức khỏe tình dục, bổ sung năng lượng cho cơ thể, giúp giảm stress,
mệt mỏi, tăng cường miễn dịch, ngăn ngừa khối u và chống lão hóa. Tuy nhiên,
tác dụng nổi bậc nhất của cây mật nhân là khả năng tăng cường sức khỏe tình
dục cho nam giới, kích thích cơ thể tăng tiết hormon giới tính nam (testosteron)
một cách tự nhiên, chính là chìa khóa duy trì sự hưng phấn và phong độ tình dục
ở nam giới có dấu hiệu suy giảm khi bước vào tuổi trung niên,… [46], [59], [51].
Các bộ phận gồm lá, vỏ, quả, rễ của cây mật nhân đều có tác dụng trị bệnh.
Mật nhân có vị đắng, tính mát, khi đi vào kinh, can, thận có tác dụng bổ dưỡng
cho người bị khí huyết hư, gân xương đau nhức, tê chân tay, rối loạn tiêu hóa,
đau nhức ngực do khí ứ khơng thông. Lá cây dùng đun nước để trị ghẻ chốc, rễ
cịn dùng để trị chứng ăn khơng tiêu, tăng cường sự hấp thu dinh dưỡng ở ruột.
Mật nhân có khả năng chữa trị bệnh sốt rét, kiết lỵ, chất đông máu giảm khả
năng mất máu do chấn thương, chống sưng phù, tăng huyết áp, viêm loét… [44].
Ngoài ra, mật nhân cịn sử dụng để chữa trị bệnh lỗng xương, hay các bệnh về
tim mạch do thiếu androgen, testosterone [32].


15

1.3.5. Một số nghiên cứu liên quan đến cây mật nhân
Nhiều nghiên cứu về cây mật nhân như: nghiên cứu của Keng CL và cs
(2010) đã khảo sát và sản xuất hợp chất alkaloids từ tế bào cây mật nhân và thu

được 9-hydroxycanthin-6-0ne (hợp chất chống ung thư tiềm năng) và khi bổ
sung Na2CO3 còn thu thêm chất 9 methoxycanthin-6-one trong môi trường MS
bổ sung 100 mg/L chitosan khi nuôi cấy huyền phù tế bào cây mật nhân [43].
Ngoài ra năm 2001, Ang HH và cs đã phân lập được 3 quassinoids là
eurycolactone D, eurycolactone E và eurycolactone F từ rễ mật nhân ngoài tự
nhiên [25].
Nhu cầu thu các hợp chất quý từ cây mật nhân ngày càng tăng, vấn đề nan
giải về nguồn dược liệu ngoài tự nhiên ngày càng cạn kiệt đã được giải quyết
bằng các cơng trình nghiên cứu nhân giống in vitro cây mật nhân, chẳng hạn
Hasnida và cs (2001) đã nghiên cứu nhân giống in vitro cây mật nhân từ hạt.
Khử trùng hạt bằng ethanol 70% trong vịng 3 phút, sau đó khử trùng bằng
chlorox 20% và Tween 20% trong 30 phút, sau đó được cấy trên môi trường MS,
phát triển chồi in vitro mật nhân tốt nhất trên môi trường MS bổ sung 0,25 mg/L
BA [35]. Năm 2005, Hussein S và cs đã nghiên cứu nhân giống in vitro cây mật
nhân từ callus. Thí nghiệm được tiến hành bằng cách tạo callus từ các bộ phận
của cây như lá, thân , rễ,… trên môi trường MS bổ sung lượng auxin khác nhau.
Kết quả cho thấy trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/L KIN, 1,0 mg/L 2,4-D và
than hoạt tính 1,0 g/L lá mầm tạo ra lượng callus tốt nhất, sau đó chuyển sang
mơi trường MS bổ sung 1,0 mg/L KIN là môi trường tốt nhất để tái sinh chồi
(90%) và tạo rễ con [36]. Ở Việt Nam, Võ Châu Tuấn và Trần Quang Dần
(2012) đã nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro cây mật nhân. Tỷ lệ nảy mầm đạt
lớn nhất trên môi trường cơ bản MS. Đoạn chồi sau khi nảy mầm (khoảng 0,5
cm) được cấy trên môi trường cơ bản MS bổ sung KIN (1,0 - 5,0 mg/L) để cảm
ứng nhân nhanh chồi. Số chồi in vitro đạt lớn nhất trên môi trường cơ bản MS bổ
sung 5,0 mg/L KIN với 3,6 chồi/mẫu cấy). Chồi (dài khoảng 2 cm) hình thành rễ
tốt trên môi trường cơ bản MS bổ sung 0,5 mg/L Indole 3-butyric acid (IBA).


16

Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu là cây mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) thuộc
họ Simarubaceae (Hình 2.1.).
- Nguyên liệu sử dụng là cây in vitro nảy mầm từ hạt (Hình 2.2.) tại phịng
thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học, khoa Sinh – Mơi trường, trường Đại học Sư
Phạm – ĐHĐN.

Hình 2.1. Cây mật nhân ngồi tự nhiên

Hình 2.2. Gốc thân cây mật nhân in vitro

2.2. Phương pháp nghiên cứu
Các thí nghiệm được tiến hành tại phịng thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học,
khoa Sinh - Môi trường, Đại học Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng từ tháng 9/2013 –
5/2014.