Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh phytohormone ứng dụng trong nông nghiệp sạch

PHÂN LẬP CÁC CHỦNG VI KHUẨN
CÓ KHẢ NĂNG SINH PHYTOHORMONE
ỨNG DỤNG TRONG NƠNG NGHIỆP SẠCH
Phạm Thị Diễm Trinh, Hồng Cơng Minh*, Nguyễn Tấn Khoa
Viện khoa học Ứng dụng HUTECH, Trường Đại học Cơng nghệ TP. Hồ Chí Minh
GVHD: TS.Nguyễn Hồi Hương

TÓM TẮT
PGPR (Plant growth promoting rhizobacteria) là những vi khuẩn phân bố tự do trong đất, trên bề
mặt rễ hoặc cộng sinh bên trong rễ, có khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật và ức chế bệnh thực
vật. Mục tiêu của nghiên cứu này là phân lập và ứng dụng các chủng vi khuẩn có khả năng sinh
phytohormone. Nhóm đã phân lập được sáu chủng vi khuẩn (được ký hiệu từ M1 đến M6) thuộc chi

Bacillus có khả năng ứng dụng trong nông nghiệp sạch, các thử nghiệm in vitro cho thấy các chủng
trên đều có khả năng sinh IAA và phân giải lân, đặc biệt là chủng M2 có khả năng sinh IAA mạnh
đạt nồng độ 111 µg/ml trên môi trường NB, và chủng M4 với hàm lượng lân hịa tan trong mơi
trường Pikovskaya đạt 21 mg/L sau 7 ngày ni cấy, bên cạnh đó phần lớn các chủng trên đều có
khả năng cố định đạm, điều này cho thấy tiềm năng của chúng trong nâng cao năng suất cây
trồng theo hướng hữu cơ.
Từ khóa: Cố định đạm, IAA, PGPR, phân giải lân, phytohormone.

1 GIỚI THIỆU
Hiện nay nông nghiệp Việt Nam đang đứng trước nhiều thách thức như biến đổi khí hậu, khơ hạn,
xâm nhập mặn, nơng sản thiếu đầu ra ổn định… Không những vậy việc lạm dụng thuốc trừ sâu,
phân bón hóa học và các chất sinh trưởng tổng hợp hóa học vẫn cịn phổ biến, gây ra nhiều hậu
quả lâu dài như ô nhiễm đất canh tác, nguồn nước, phá hủy hệ sinh thái, và gián tiếp gây nên
nhiều bệnh hiểm ngèo cho con người. Bên cạnh đó, việc sản xuất phân bón hố học góp phần làm
cạn kiệt các nguồn tài ngun khơng tái sinh như dầu mỏ và khí tự nhiên (được sử dụng để sản
xuất phân bón) và gây ra những mối nguy hiểm cho con người và môi trường [1]. Đứng trước thực
trạng trên, cùng những kiến thức thuộc chuyên ngành cơng nghệ sinh học đã học được, nhóm đã
nảy ra ý tưởng sử dụng các vi sinh vật có khả năng sinh phytohormone, cố định đạm và phân giải

lân nhằm cải thiện năng suất cây trồng, nâng cao độ phì nhiêu của đất, các PGPR nổi bật gồm
thành viên của các chi Arthrobacter, Azoarcus, Azospirillum, Bacillus, Burkholderia, Enterobacter,

Gluconacetobacter, Herbaspirillum, Klebsiella, Pseudomonas,…[1]. Hơn nữa, ứng dụng PGPR làm
giảm việc sử dụng phân hoá học và tiết kiệm về mặt kinh tế, đem lại lợi ích mơi trường và giảm chi
phí sản xuất [1, 2].

327


2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 Vật liệu
Nguồn phân lập: Mẫu đất quanh rễ cây cỏ Lào (Eupatorium odoratum L). Lựa chọn những cây khỏe
mạnh có phần gốc lớn, rễ sâu, khơng bị bệnh. Nhóm đã tiến hành thu mẫu tại các vườn chè tại
Bảo Lộc vào đầu tháng 10, tức cuối mùa mưa, là lúc cây phát triển mạnh nhất và chuẩn bị ra hoa.
2.2 Phương pháp

2.2.1 Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh IAA
Mẫu đất được pha lỗng theo dãy thập phân, trang trên mơi trường TWA, ủ ở 30 oC trong 24 giờ.
Ria các khuẩn lạc riêng rẽ trên môi trường TWA, lặp lại cho đến khi thu được khuẩn lạc thuần khiết.
Cấy các khuẩn lạc thuần khiết vào môi trường TWB, lắc ở 150 vòng/phút trong 7 ngày ở nhiệt
độ phòng.
Sau thời gian ni cấy định tính khả năng sinh IAA bằng thuốc thử Salkowski, lấy 1 ml dịch nuôi cấy
cho vào 2 ml thuốc thử Salkowski, kết quả dương tính nếu xuất hiện màu đỏ, so sánh với đối chứng
âm là 1ml môi trường TWB không được cấy khuẩn cho vào 2 ml thuốc thử Salkowski.
Nhuộm gram các chủng có khả năng sinh IAA và tiến hành giữ giống bằng cách cấy vào mơi
trường thạch nghiêng TWA.

2.2.2 Khảo sát đặc điểm có lợi của vi khuẩn trong đi u kiện in vitro
Xác định khả năng cố định đạm xác định bằng phương pháp nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường

Thompson-Skerman Agar [3] trong 7 ngày ở nhiệt độ 30 oC, lựa chọn những khuẩn lạc có khả năng
mọc riêng lẻ trên mơi trường đó.
Xác định khả năng sinh phytohormone IAA bằng cách ni cấy trên mơi trường NB, lắc ở 150
vịng/phút ở nhiệt độ phịng trong 7 ngày, sau đó ta ly tâm dịch ni cấy ở 10000 vịng/phút trong
15 phút, Sau 7 ngày, sự sản sinh IAA trong dịch nuôi cấy được phát hiện và định lượng bằng
phương pháp so màu với thuốc thử Salkowski ở ước sóng 530 nm [4-5], hút lấy phần dịch trong ở
trên và sử dụng thuốc thử Salkowski và đường chuẩn IAA để xác định nồng độ IAA (µg/ml) được
sinh ra trên mơi trường NB.
Xác định khả năng phân giải lân bằng cách nuôi cấy trên môi trường Pikovskaya trong 7 ngày, lắc
ở tốc độ 150 rpm dưới nhiệt độ phịng, sau thời gian ni cấy ta tiến hành ly tâm dịch nuôi cấy với
tốc độ 3000 rpm ở 15 phút, ta hút lấy dịch trong và xác định hàm lượng lân hịa tan trong mơi
trường nuôi cấy (PO43-) (mg/L) bằng phương pháp đo quang.

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Phân lập vi khuẩn và khảo sát khả năng cố định đạm
Từ mẫu đất quanh rễ cây cỏ Lào, 6 chủng vi khuẩn đã được phân lập. Sáu chủng này đều phát
triển tốt trên môi trường TWA, hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và đặc điểm sinh hóa đã được
nhóm nghiên cứu khảo sát. Các chủng này đều phát triển tốt trên môi trường TWA chứa amino acid
328


tự do bao gồm tryptophan, cho phép nghi ngờ đây là các chủng có khả năng chuyển hóa
tryptophan, mà một trong những kết quả chuyển hóa là phytohormone IAA (Bảng 1).
Bảng 1: Hình thái các chủng phân lập trên mơi trường TWA và kết quả khảo sát trên môi trường
Thompson-Skerman
Mọc trên mơi
trường
ThompsonSkerman

Stt

Ký
hiệu
chủng

1

M1

Trịn, lồi, trắng đục, iên đều

Gram (+), hình que ngắn.

+

2

M2

Dẹt, lồi, nâu nhạt, iên khơng đều

Gram (+), hình que ngắn.

-

3

M3

Trịn, lồi, vàng đục, iên đều

Gram (+), hình que.

+

4

M4

Trịn, mọc tràn, trắng đục, biên
khơng đều

Gram (+), hình que ngắn.

-

5

M5

Hình thoi, nâu nhạt, mọc tràn, biên
đều

Gram (+), hình que ngắn.

+

6

M6

Trịn, nâu đậm, mọc tràn, iên đều

Gram (+), hình que dài.

+

Hình thái khuẩn lạc trên mơi
trường TWA

Hình thái tế bào

+: Có mọc trên môi trường Thompson-Skerman.
- : Không mọc trên môi trường Thompson-Skerman.

Qua bảng trên ta thấy trong 4 trong số 6 chủng vi khuẩn trên như chủng M1, M3, M5, M6 có khả
năng mọc trên mơi trường Thompson-Skerman là mơi trường không chứa N, dùng để phân lập vi
khuẩn cố định đạm. Điều này chứng tỏ bốn chủng M1, M3, M5 và M6 có khả năng cố định đạm,
thể hiện tiềm năng trong việc nâng cao hàm lượng đạm, góp phần nâng cao năng suốt cây trồng
và giảm thiểu việc sử dụng phân bón hóa học.
3.2 Tuyển chọn các chủng phân lập dựa trên khả năng sinh IAA
Để khẳng định và tuyển chọn khả năng sinh IAA của các chủng phân lập, nuôi cấy chúng trong
môi trường NB 7 ngày và đo lượng IAA sinh bằng thuốc thử Salkowski.

Hình 1: Hàm lượng IAA được tạo thành bởi vi khuẩn trên môi trường NB (µg/ml) sau 7 ngày ni cấy

329


Từ Hình 1 ta thấy có nhiều chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp lên một lượng IAA đáng kể trong

môi trường NB sau 7 ngày nuôi cấy, đặc biệt là chủng M2 có hàm lượng IAA đạt 111 µg/ml. Các
chủng tổng hợp IAA mạnh là M2, M3 với nồng độ IAA lần lượt là 111 µg/ml và 110 µg/ml, các chủng
tổng hợp IAA trung bình là M1, M4, M5, M6 với nồng độ IAA từ 33 đến 53 µg/ml. Kết quả trên là rất
khả quan khi so với 10 chủng Pseudomonas được khảo sát bởi Kamble và cộng sự (2015) có khả
năng sản sinh IAA trong khoảng từ 21,5– 81,8 µg/ml [7]. Điều này cho thấy tiềm năng ứng dụng của
các chủng vi khuẩn trên trong nông nghiệp với vai trị kích thích sự phát triển của cây trồng.
3.3 Tuyển chọn các chủng phân lập dựa trên khả năng hịa tan lân vơ cơ khó tan

Hình 2: Hàm lượng lân hịa tan trong mơi trường Pikovskaya (mg/L) sau 7 ngày ni cấy

Từ Hình 2 trên ta thấy có nhiều chủng vi khuẩn có khả năng phân giải lân đáng kể hơn các chủng
khác, đặc biệt là chủng M4 với hàm lượng lân hịa tan trong mơi trường Pikovskaya đạt 21 mg/L
sau 7 ngày ni cấy. Các chủng có khả năng phân giải lân mạnh là chủng M1, M2, M4 với hàm
lượng lân hòa tan đạt 19 đến 21 mg/L, các chủng cịn lại khơng có hoặc có khả năng phân giải lân
không đáng kể với nồng độ lân hòa tan chỉ đạt dưới 10 mg/L, kết quả ở trên tuy thấp hơn như báo
cáo của Jayadi và cộng sự (2013) với lượng phosphorus hòa tan cao nhất lên đến 87,59 μg/ml [6],
nhưng điều này vẫn cho thấy tiềm năng ứng dụng của các chủng vi khuẩn trên trong nơng nghiệp
với vai trị phân giải lân khó tan thành lân dễ tan giúp cây dễ hấp thụ.

4 KẾT LUẬN
Trong 6 chủng vi khuẩn có khả năng sinh phytphormone phân lập được trên mơi trường TWA,
nhóm đã thực hiện các thử nghiệm in vitro và thu được kết quả khá khả quan về khả năng sinh IAA,
phân giải lân và cố định đạm. Trong đó nổi bật là chủng M2, M3 với nồng độ IAA lần lượt là 111
µg/ml và 110 µg/ml sau 7 ngày ni cấy trên mơi trường NB, trong đó M3 vừa sinh IAA vừa cố định
đạm; các chủng M1, M2, M4 với khả năng hòa tan lân vơ cơ khó tan, với hàm lượng lân hịa tan
trong môi trường Pikovskaya đạt 19 đến 21 mg/L sau 7 ngày ni cấy, trong đó M2 vừa hịa tan lân
vừa sinh tổng hợp nhiều IAA. Nghiên cứu đang được hoàn thiện.

330

TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]

G. Gupta, S.S. Parihar, N.K. Ahirwar, S.K. Snehi, V. Singh, ‚Plant Growth Promoting
Rhizobacteria (PGPR): Current and future prospects for development of sustainable
agriculture‛, Journal of Micribial & Biochemical Technology, vol. 07, no. 02, pp. 096–102,
2015.

[2]

M.Ahemad,M.Ki ret,‚Mechanisms

and

applications

of

plant

growth

promoting

rhizobacteria:Current perspective‛, Journal of KingSaud University - Science, vol. 26, no. 1, pp.
1–20, 2014.
[3]

Y. Bashan, G. Holguin, R. Lifshitz, ‚Isolation and characterization of plant growth-promoting

rhizo acteria‛, Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, pp. 331–345, 1993.

[4]

A. Wahyud, R. Astuti, ‚Screening of Pseudomonas sp. isolated from rhizosphere of soybean
plant as plant growth promoter and biocontrol agent‛, American Journal of Agricultural and
Biological Science, vol. 6, no. 1, pp. 134– 141, 2011.

[5]

B. Sasirekha, S. Shivakumar, S.B. Sullia, ‚Statistical optimization for improved indole-3-acetic
acid (IAA) production by Pseudomonas aeruginosa and demonstration of enhanced plant
growth promotion‛, Journal of Soil Science and Plant Nutrition, vol. 12, no. 4, pp. 863–873
(2012).

[6]

M. Jayadi, ‚In vitro Selection of Rock Phosphate solubility by microorganism from ultisols in
South Sulawesi,Indonesia‛, American Journal of Agriculture and Forest, vol. 1, no. 4, pp. 68–
73, 2013.

[7]

K.D. Kamble, D.K. Galerao, ‚Indole acetic acid ‚16S ribosomal DNA amplification for
phylogenetic study‛, Journal of Bacteriology, vol. 173, no. 2, pp. 697– 703, 1991.

331