Luận văn Thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Xác định dư lượng Ochratoxin A trong cà phê bột bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) và đề xuất giải pháp nhằm đảm bảo chất lượng

ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THU

XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG OCHRATOXIN A TRONG CÀ PHÊ BỘT
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC-MS/MS)
VÀ ĐỀ XUẤT GIẢI PHÁP NHẰM ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG
AN TOÀN THỰC PHẨM TẠI ĐỊA BÀN BUÔN MA THUỘT

LUẬN VĂN THẠC SĨ
CHẾ BIẾN LƯƠNG THỰC, THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG
Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm

HUẾ - 2019


ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THU

XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG OCHRATOXIN A TRONG CÀ PHÊ BỘT
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC-MS/MS)
VÀ ĐỀ XUẤT GIẢI PHÁP NHẰM ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG
AN TOÀN THỰC PHẨM TẠI ĐỊA BÀN BUÔN MA THUỘT

LUẬN VĂN THẠC SĨ
CHẾ BIẾN LƯƠNG THỰC, THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG
Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm
Mã số: 8540101

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. NGUYỄN VĂN HUẾ

HUẾ - 2019


i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài: "Xác định dư lượng Ochratoxin A trong cà phê bột
bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) và đề xuất giải pháp nhằm đảm
bảo chất lượng an toàn thực phẩm tại địa bàn Bn Ma Thuột” là một cơng trình
nghiên cứu độc lập khơng có sự sao chép của người khác. Đề tài là sản phẩm mà Tôi
đã nổ lực nghiên cứu trong quá trình học tập tại Trường. Các số liệu, kết quả nêu trong
luận văn là trung thực và chưa được cơng bố trong các cơng trình khác.Trong q trình
viết bài có sự tham khảo của một số tài liệu có nguồn gốc rõ ràng. Nếu khơng đúng
như trên, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm về đề tài của mình.
Huế, tháng 6 năm 2019
Người thực hiện

Nguyễn Thị Phương Thu


ii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này ngồi sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tơi

ln nhận được sự giúp đỡ, động viên sâu sắc của Thầy Cô, bạn bè và người thân, tôi
xin bày tỏ lòng cảm ơn đến:
Ban Lãnh đạo Viện vệ sinh Dịch tễ Tây Nguyên, các cô chú anh chị và các bạn
đồng nghiệp trong Trung tâm kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm khu vực Tây
Nguyên đã luôn quan tâm và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực
hiện nghiên cứu đề tài luận văn.
Bằng tình cảm chân thành nhất, tơi xin cảm ơn tồn bộ Quý Thầy Cô giáo
trường Đại Học Nông Lâm Huế đặc biệt là Q Thầy Cơ trong Khoa Cơ Khí Cơng
Nghệ, đã cho tôi những kiến thức quý giá, tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên
cứu trong môi trường hiện đại.
Đặc biệt tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc nhất đến:
Thầy TS. Nguyễn Văn Huế
Người động viên, giúp đỡ và hướng dẫn trực tiếp tơi hồn thành báo cáo luận
văn tốt nghiệp này.
Cuối cùng tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và tập thể lớp CNTP K23
đã đóng góp ý kiến xây dựng để tơi hồn thành bài báo cáo luận văn này.
Huế, tháng 6 năm 2019
Học viên

Nguyễn Thị Phương Thu


iii

TĨM TẮT
Ochratoxin A là một chất chuyển hóa thứ cấp được sinh ra bởi các chủng nấm
mốc thuộc các giống Aspergilus ochraceus và Penicillium verrucusum. Theo tổ chức
nghiên cứu ung thư Quốc tế (IARC) thì Ochratoxins được xếp vào loại chất có khả
năng gây ung thư nhóm IIB. Độc tố này đã được phát hiện trên nhiều nông sản khác
nhau bao gồm ngũ cốc và các sản phẩm của chúng và là loại độc tố có tiềm năng gây

ung thư và viêm thận ở người và động vật. Điều đáng lo ngại là khi chúng ta ăn phải
thức ăn bị nhiễm Ochratoxins nó khơng gây ngộ độc cấp tính mà tích lũy dần trong cơ
thể - là nguy cơ tiềm ẩn đe dọa sức khỏe cho con người.
Nước ta là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, rất thuận lợi cho nấm mốc
phát triển. Hàng năm, những tổn thất về lượng và chất của cà phê và các nông sản khác
do nấm mốc gây ra chiếm một phần đáng kể và là rào cản đối với thương mại ảnh
hưởng đến nền kinh tế của cả nước. Ochratoxin A là độc tố đầu tiên được phát hiện
sau độc tố aflatoxin và là một trong những độc tố nguy hiểm nhất thường nhiễm trên
cà phê.
Để kiểm soát mức độ nhiễm Ochratoxins trong thực phẩm, ở Việt Nam cũng
như trên thế giới đã có nhiều phương pháp phân tích được nghiên cứu và ứng dụng.
Nhưng với những đặc điểm ưu việt và độ chính xác cao nên các phương pháp phân
tích sắc ký lỏng khối phổ được coi là phương pháp phân tích có giá trị pháp lý để phát
hiện và định lượng nồng độ Ochratoxins ở lượng vết hay siêu vết. Vì những lý do đó,
chúng tơi chọn đề tài: "Xác định dư lượng Ochratoxin A trong cà phê bột bằng
phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) và đề xuất giải pháp nhằm đảm
bảo chất lượng an toàn thực phẩm tại địa bàn Buôn Ma Thuột”.
Nhằm xây dựng được phương pháp phân tích dư lượng của Ochratoxin A trong
cà phê bột bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ đạt độ nhạy cao, đáp ứng được nhu
cầu phân tích của các đơn vị kiểm nghiệm trong nước. Đồng thời khảo sát mức độ tồn
lưu dư lượng Ochratoxin A trong cà phê bột và đề xuất giải pháp đảm bảo chất lượng
cà phê bột tại địa bàn Buôn Ma Thuột với mong muốn góp phần với các cơ quan chức
năng đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng trong nước.
Từ các kết quả nghiên cứu đã lựa chọn được điều kiện phân tích phù hợp để
định lượng Ochratoxin A trong cà phê bột: Tối ưu hoá điều kiện MS/MS, tối ưu hoá
điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao, khảo sát quy trình xử lý mẫu và thẩm định
phương pháp (Phương pháp có LOD=0,63 ng/ml, LOQ=2,11 ng/ml, hiệu suất thu hồi
của Ochratoxin A trong nền mẫu cà phê bột ở tại 3 mức 2,5; 5 và 10 µg/kg thu được
nằm trong khoảng 70 đến 110%). Áp dụng vào phân tích mẫu thực tế, thực trạng
nhiễm Ochratoxin A vẫn cịn hiện hữu mặc dù đã có những cảnh báo về khả năng

nhiễm độc và độc tính cao của loại độc tố này. Kết quả phân tích cho thấy có 9 mẫu
nhiễm Ochratoxin A trong tổng số 55 mẫu (chiếm 16,36%). Các mẫu nhiễm
Ochratoxin A đều nằm trong giới hạn cho phép của Bộ Y tế.


iv

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................ii
TÓM TẮT ................................................................................................................. iii
MỤC LỤC .................................................................................................................. iv
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ..................................................................................... vii
DANH MỤC BẢNG BIỂU ......................................................................................viii
DANH MỤC HÌNH ẢNH .......................................................................................... ix
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề................................................................................................................ 1
2. Mục tiêu của đề tài................................................................................................... 2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu ................................................ 3
3.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................................. 3
3.2. Ý nghĩa thực tiễn................................................................................................... 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU............................................................... 4
1.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cà phê .................................................................... 4
1.1.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cà phê tại địa bàn tỉnh Đăk Lăk ........................... 4
1.1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cà phê của Việt Nam ........................................... 5
1.1.3. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cà phê của thế giới .............................................. 6
1.2. Ochratoxins........................................................................................................... 7
1.2.1. Các loại độc tố Ochratoxins ............................................................................... 7
1.2.2. Tính chất hoá lý của độc tố Ochratoxins............................................................. 8

1.2.3. Sự tạo độc tố Ochratoxin A do các nấm mốc ...................................................... 9
1.2.4. Độc tính của Ochratoxin A................................................................................. 9
1.3. Giới hạn tồn dư tối đa cho phép (MRL) .............................................................. 10
1.4. Các phương pháp phân tích ................................................................................. 12
1.5. Lí thuyết phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ .............................................. 14
1.5.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao ................................................................................ 14


v
1.5.2. Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao ................................................................... 14
1.5.3. Sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS) ................................................................ 15
1.6. Một số quy định của Châu Âu về phương pháp phân tích mẫu bằng LC-MS/MS
(theo quyết định 2002/657/EC) .................................................................................. 21
1.6.1. Quy định về lựa chọn thông số thẩm định ........................................................ 21
1.6.2. Quy định về hiệu suất thu hồi ........................................................................... 21
1.6.3. Quy định về tỉ lệ ion xác định so với ion định lượng ........................................ 22
1.6.4. Quy định về quy tắc 4 điểm nhận danh............................................................. 22
1.7. Mức độ nhiễm nấm mốc sinh độc tố và độc tố Ochratoxin A trên cà phê ở
Việt Nam .................................................................................................................. 22
1.8. Tình hình nhiễm Ochratoxin A trên cà phê và các nông sản khác trên thế giới .... 23
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 25
2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ....................................................................... 25
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu....................................................................................... 25
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu .......................................................................................... 25
2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 25
2.3. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 25
2.3.1 Thiết bị dụng cụ và hóa chất.............................................................................. 25
2.3.2. Tối ưu các thơng số kĩ thuật điều kiện chạy của máy khối phổ MS/MS ............ 28
2.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích ................................................................... 33
2.4. Đánh giá thực trạng nhiễm dư lượng Ochratoxin A trong cà phê bột trên địa bàn

Thành phố Buôn Ma Thuột và đề xuất giải pháp đảm bảo chất lượng. ....................... 37
2.5. Phương pháp xử lý số liệu - Thống kê mô tả: ..................................................... 38
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ..................................... 39
3.1. Kết quả tối ưu hóa điều kiện chạy máy sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) ........ 39
3.2. Tối ưu các điều kiện MS ..................................................................................... 39
3.3. Tối ưu các điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ............................. 40
3.3.1. Khảo sát thành phần pha động.......................................................................... 40
3.3.2. Khảo sát tốc độ pha động ................................................................................ 42
3.4. Chọn quy trình xử lý mẫu ................................................................................... 43


vi
3.5. Chọn cột chiết pha rắn ........................................................................................ 46
3.6. Thẩm định phương pháp phân tích ...................................................................... 48
3.6.1. Tính đặc hiệu/ chọn lọc .................................................................................... 48
3.6.2. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn .................................................................. 51
3.6.3. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) .................................... 55
3.6.4. Độ chính xác (độ chụm và độ đúng) ................................................................. 57
3.6.5. Giới hạn lặp lại (r), giới hạn tái lặp nội bộ phịng thí nghiệm (R) ..................... 58
3.7. Kết quả khảo sát mức độ tồn lưu dư lượng Ochratoxin A trong cà phê bột và đề
xuất giải pháp đảm bảo chất lượng cà phê bột tại địa bàn Buôn Ma Thuột ................. 59
3.7.1. Kết quả khảo sát mức độ tồn lưu dư lượng Ochratoxin A trong cà phê bột tại địa
bàn Buôn Ma Thuột ................................................................................................... 59
3.7.2 Đề xuất giải pháp đảm bảo chất lượng cà phê.................................................... 64
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................................ 66
I. Kết luận .................................................................................................................. 66
II. Kiến nghị .............................................................................................................. 67
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................... 68
PHỤ LỤC .................................................................................................................. 72

vii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Ký hiệu
ACN

Tiếng Anh

Tiếng Việt

Acetonenitril

Acetonenitril

Association of Official Analytical
Chemists

Hiệp hội các nhà hóa phân tích
chính thức

CE

Collision energy

Năng lượng va chạm

EC

European Commission

Ủy ban Châu Âu

EI

Electron Ionization

Ion hóa bằng dịng electron

ESI

Eelectrospray ionization

Chế độ ion hóa phun điện tử

EU

European Union

Châu Âu

ICO

International Coffee Organization

Tổ chức cà phê thế giới

FDA

Food and Drug Administration

Cục quản lý thực phẩm và dược
phẩm Hoa Kỳ

HPLC

High performance liquid
chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IARC

International Agency for Research
oncancer

Tổ chức nghiên cứu ung thư
quốc tế

Identification point

Điểm nhận dạng

International Union of Pure and
Applied Chemistry
Liquid chromatography mass
spectrometry

Liên minh quốc tế về hóa học
cơ bản và ứng dụng

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of quantity

Giới hạn định lượng

MeOH

Methanol

metanol

MS/MS

Mass spectrometry

Khối phổ

MRL

Maximum Residue Limit

Giới hạn dư lượng tối đa

OTA

Ochratoxin A

Ochratoxin A

AOAC

IP
IUPAC
LC-MS

Sắc ký lỏng khối phổ

Quy chuẩn Việt Nam

QCVN
RSD

Relative standard deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

SPE

solid phase extraction

Chiết pha rắn

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam


viii

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1. Đặc tính lý hóa của các Ochratoxins. .......................................................... 9
Bảng 1.2. Mức dư lượng tối đa cho phép của Ochratoxin A ở Việt Nam, theo QCVN
8-1:2011/BYT, Quy chuẩn kỹ thuật Quốc Gia đối với giới hạn ô nhiễm độc tố vi nấm
trong thực phẩm. ........................................................................................................ 11
Bảng 1.3. Lựa chọn thông số thẩm định .................................................................... 21
Bảng 1.4. Quy định của Châu Âu về hiệu suất thu hồi ............................................... 21
Bảng 1.5. Qui định của Châu Âu về tỉ lệ ion xác định so với ion định lượng .............. 22
Bảng 1.6. Qui định số điểm nhận danh khi kết hợp các kỹ thuật phân tích ................. 22
Bảng 1.7. Mức nhiễm ochratoxin A trên một số đối tượng ........................................ 24
Bảng 2.1. Bảng pha dung dịch chuẩn chạy máy ......................................................... 28
Bảng 2.2. Cơng thức tính tốn đặc trưng trong phân tích số liệu ................................ 38
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ion mẹ của Ochratoxin A ............................................... 39
Bảng 3.2. Các thông số tối ưu cho ESI-MS/MS ......................................................... 39
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát dung môi pha động.......................................................... 41
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát tốc độ pha động............................................................... 43
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu ........................................................ 44
Bảng 3.6. Kết quả quá trình chiết mẫu ....................................................................... 47
Bảng 3.7. Bảng kết quả khảo sát ion mẹ và 2 ion con của Ochratoxin A .................... 49
Bảng 3.8. Kết quả phân tích chất chuẩn, mẫu trắng và mẫu trắng thêm chuẩn ............ 49
Bảng 3.9. Sự phụ thuộc của diện tích vào nồng độ ..................................................... 51
Bảng 3.10. Kết quả đường chuẩn ............................................................................... 52

Bảng 3.11. Kết quả xác định LOD, LOQ của OTA .................................................... 56
Bảng 3.12. Kết quả xác định RSD, H của OTA ......................................................... 57
Bảng 3.13. Qui định độ đúng và độ chụm của phương pháp phân tích định lượng phụ
thuộc nồng độ chất theo 2002/657/EC ....................................................................... 58
Bảng 3.14. Kết quả đánh giá độ tái lặp của Phịng thí nghiệm ................................... 59
Bảng 3.15. Kết quả phân tích mẫu thực tế. ................................................................ 60


ix

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Cấu trúc các Ochratoxins.............................................................................. 8
Hình 1.2. Mô tả tổng quát các bộ phận của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao ............... 15
Hình 1.3. Sơ đồ hệ thống ion hóa theo kỹ thuật APCI ................................................ 16
Hình 1.4. Sơ đồ hệ thống ion hóa theo ESI ................................................................ 17
Hình 1.5. Bộ phân tích khối một tứ cực...................................................................... 18
Hình 1.6. Chế độ SIM ................................................................................................ 18
Hình 1.7. Chế độ Full Scan ........................................................................................ 19
Hình 1.8. Sơ đồ bộ phân tích khối ba tứ cực.............................................................. 20
Hình 1.9 Chế độ vận hành khối phổ ba tứ cực............................................................ 20
Hình 2.1. Cấu tạo đầu dị khối phổ Triple Quad Agilent............................................. 26
Hình 2.2. Ngun tắc hoạt động của cột SPE (SCX) ................................................. 32
Hình 3.1. Sắc kí đồ khảo sát....................................................................................... 40
Hình 3.2. Sắc đồ của Ochratoxin A nồng độ 2,5ppb khi dùng dung môi pha động là
Methanol, CH3COONH4 10 mM................................................................................ 41
Hình 3.3. Sắc đồ của Ochratoxin A nồng độ 2,5ppb khi dùng dung môi pha động là
Acetonitrile: nước: acetic acid ................................................................................... 42
Hình 3.4. Sắc đồ của Ochratoxin A nồng độ 2,5ppb khi dùng dung môi pha động là
Acetonitrile: nước:Acid Formic ................................................................................. 42

Hình 3.5. Sắc đồ rửa giải tại tốc độ dịng 0,1ml/phút.................................................. 43
Hình 3.6. Sắc đồ rửa giải tại tốc độ dịng 0,2ml/phút.................................................. 43
Hình 3.7. Sắc kí đồ cột chiết Mycosep 228 Romer ..................................................... 47
Hình 3.8. Sắc kí đồ cột chiết C18 .............................................................................. 48
Hình 3.9. Sắc kí đồ cột chiết Ochra Test .................................................................... 48
Hình 3.10. Sắc kí đồ chất chuẩn OTA 2,5ppb ............................................................ 50
Hình 3.11. Sắc kí đồ mẫu trắng .................................................................................. 50
Hình 3.12. Sắc kí đồ mẫu trắng thêm chuẩn 2,5 ppb .................................................. 51
Hình 3.13. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích Peak vào nồng độ OTA......... 51
Hình 3.14. Đường chuẩn của OTA............................................................................ 52


x
Hình 3.15. Sắc kí đồ chuẩn OTA 1 ng/ml .................................................................. 53
Hình 3.16. Sắc kí đồ chuẩn OTA 10 ng/ml ................................................................ 53
Hình 3.17. Sắc kí đồ chuẩn OTA 50 ng/ml ................................................................ 53
Hình 3.18. Sắc kí đồ chuẩn OTA 100 ng/ml............................................................... 54
Hình 3.19. Sắc kí đồ chuẩn OTA 200 ng/ml............................................................... 54
Hình 3.20. Sắc kí đồ chuẩn OTA 300 ng/ml............................................................... 54
Hình 3.21. Sắc kí đồ chuẩn OTA 500 ng/ml............................................................... 55
Hình 3.22. Sắc kí đồ chuẩn OTA 1000 ng/ml............................................................. 55
Hình 3.23. Sắc kí đồ mẫu thêm chuẩn OTA 5 ng/ml .................................................. 57


1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cùng với sự phát triển khoa học công nghệ, kinh tế - xã hội việc chăm sóc và
bảo vệ sức khỏe, nâng cao chất lượng cuộc sống của con người ngày càng được quan

tâm, trong đó có vấn đề an tồn thực phẩm. Bảo đảm nguồn thực phẩm an tồn sẽ góp
phần bảo vệ và cải thiện sức khỏe, chất lượng cuộc sống và giống nòi dân tộc. An tồn
thực phẩm khơng chỉ ảnh hưởng trực tiếp, thường xuyên đến sức khỏe mà còn liên
quan chặt chẽ đến năng suất, hiệu quả phát triển kinh tế, thương mại, du lịch và an sinh
xã hội. Đảm bảo an tồn thực phẩm góp phần quan trọng thúc đẩy phát triển kinh tế xã hội, xố đói giảm nghèo và hội nhập quốc tế. Tuy nhiên, công tác bảo đảm an tồn
thực phẩm ln là một thách thức khơng chỉ với các nước đang phát triển mà ngay cả
với các nước phát triển. Sự đa dạng của các chủng loại thực phẩm, công nghệ, các chất
phụ gia, các chất hỗ trợ chế biến, các chất ô nhiễm thực phẩm luôn được cải tiến, bổ
sung .... là thách thức đối với hệ thống quản lý, kiểm sốt an tồn thực phẩm, đặc biệt
đối với các phịng kiểm nghiệm. Do đó, việc nâng cao năng lực hệ thống phòng kiểm
nghiệm an tồn thực phẩm đóng vai trị đặc biệt quan trọng trong cơng tác quản lý an
tồn thực phẩm của mỗi Quốc gia, nhất là trong giai đoạn hội nhập kinh tế toàn cầu
hiện nay.
Đắk Lắk được mệnh danh là thủ phủ cà phê của Việt Nam, sản phẩm cà phê
Buôn Ma Thuột hiện nổi tiếng đã có mặt ở gần 80 quốc gia và vùng lãnh thổ trên thế
giới, đóng góp lớn vào tổng giá trị xuất khẩu cà phê của cả nước; góp phần quan trọng
đưa kim ngạch xuất khẩu cà phê Việt Nam năm 2018 lên hơn 3,5 tỷ USD [43] . Ở Đắk
Lắk gần như huyện nào cũng có trồng cà phê, nhưng cà phê Bn Ma Thuột vẫn ln
được đánh giá là có chất lượng cao nhất và có hương vị đặc trưng nhất được giới hâm
mộ và các nhà rang xay cà phê đánh giá cao. Từ đó, Bn Ma Thuột hay được ví như
một "thủ phủ cà phê". Cây cà phê chiếm giữ một vị trí độc tơn, khơng loại cây trồng
nào sánh được trên cao nguyên đất đỏ bazan này. Trong cơ cấu cây trồng ở Bn Ma
Thuột, có đủ các lồi cà phê như: cà phê chè, cà phê vối, cà phê mít nhưng được trồng
rộng rãi nhất là cà phê vối. Hiện tại thương hiệu cà phê Buôn Ma Thuột đã được dùng
chung cho cà phê Đắk Lắk. Vì vậy, việc nâng cao chất lượng cà phê đồng thời chế
biến chúng thành những sản phẩm có giá trị dinh dưỡng bảo quản giữ gìn các giá trị
dinh dưỡng, ngăn cản các chất độc hại cao đang ngày càng được quan tâm.
Nước ta là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, rất thuận lợi cho nấm mốc
phát triển. Hàng năm, những tổn thất về lượng và chất của cà phê và các nông sản khác
do nấm mốc gây ra chiếm một phần đáng kể và là rào cản đối với thương mại ảnh hưởng

đến nền kinh tế của cả nước. Ochratoxin A là độc tố đầu tiên được phát hiện sau độc tố
aflatoxin và là một trong những độc tố nguy hiểm nhất thường nhiễm trên cà phê.


2
Ochratoxin A (OTA) là một chất chuyển hóa thứ cấp được sinh ra bởi các
chủng nấm mốc thuộc các giống Aspergilus ochraceus và Penicillium verrucusum.
Theo tổ chức nghiên cứu ung thư Quốc tế (IARC) thì Ochratoxins được xếp vào loại
chất có khả năng gây ung thư nhóm IIB. Độc tố này đã được phát hiện trên nhiều nông
sản khác nhau bao gồm ngũ cốc và các sản phẩm của chúng và là loại độc tố có tiềm
năng gây ung thư và viêm thận ở người và động vật. Điều đáng lo ngại là khi chúng ta
ăn phải thức ăn bị nhiễm Ochratoxins nó khơng gây ngộ độc cấp tính mà tích lũy dần
trong cơ thể - là nguy cơ tiềm ẩn đe dọa sức khỏe cho con người.
Hiện nay, trên thế giới, việc nghiên cứu mức nhiễm nấm mốc sinh độc tố trên
lương thực thực phẩm và các biện pháp phòng chống đã được coi là một vấn đề quan
trọng. Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và Tổ chức Nông Lương thế giới (FAO) cũng như
Bộ Nông nghiệp, Bộ Y Tế của nhiều nước đã đưa ra những chương trình khuyến cáo
về độc tố nấm mốc và xây dựng tiêu chuẩn về giới hạn cho phép của độc tố nấm mốc
trên lương thực.
Để kiểm soát mức độ nhiễm Ochratoxins trong thực phẩm, ở Việt Nam cũng
như trên thế giới đã có nhiều phương pháp phân tích được nghiên cứu và ứng dụng.
Nhưng với những đặc điểm ưu việt và độ chính xác cao nên các phương pháp phân
tích sắc ký lỏng khối phổ được coi là phương pháp phân tích có giá trị pháp lý để phát
hiện và định lượng nồng độ Ochratoxins ở lượng vết hay siêu vết.
Xuất phát từ tính cấp thiết của xã hội và tính ưu việt của phương pháp phân tích,
tơi xây dựng phương pháp nghiên cứu: "Xác định dư lượng Ochratoxin A trong cà
phê bột bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) và đề xuất giải pháp
nhằm đảm bảo chất lượng an tồn thực phẩm tại địa bàn Bn Ma Thuột”.
2. Mục tiêu của đề tài
- Mục tiêu chung:

+ Xây dựng được phương pháp phân tích dư lượng của Ochratoxin A trong cà
phê bột bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ đạt độ nhạy cao, đáp ứng được nhu
cầu phân tích của các đơn vị kiểm nghiệm trong nước.
+ Khảo sát mức độ tồn lưu dư lượng Ochratoxin A trong cà phê bột và đề xuất
giải pháp đảm bảo chất lượng cà phê bột tại địa bàn Buôn Ma Thuột với mong muốn
góp phần với các cơ quan chức năng đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm cho người
tiêu dùng trong nước.
- Mục tiêu cụ thể:
+ Khảo sát các điều kiện trên máy sắc ký lỏng hai lần khối phổ;
+ Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu;


3
+ Thẩm định phương pháp đã xây dựng;
+ Phân tích mẫu thực;
+ Đề xuất giải pháp đảm bảo chất chất lượng cà phê bột.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu
3.1. Ý nghĩa khoa học
Thẩm định phương pháp phân tích phù hợp. Kết quả của thẩm định phương
pháp được sử dụng để đánh giá chất lượng, độ tin cậy của kết quả phân tích.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Xây dựng phương pháp xác định dư lượng Ochratoxin A trong cà phê bột
bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS), chứng minh rằng phương pháp
đáp ứng được các yêu cầu đặt ra.
- Thực hiện phương pháp này vào việc phân tích dư lượng Ochratoxin A trong cà
phê bột tại Trung tâm kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm khu vực Tây Nguyên;
- Nghiên cứu này sẽ góp phần vào việc bảo đảm vệ sinh an toàn thực phẩm và
bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.

4

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

1.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cà phê
1.1.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cà phê tại địa bàn tỉnh Đăk Lăk[42]
Theo số liệu của Cục Thống kê tỉnh Đắk Lắk, trong niên vụ 2017 - 2018, diện
tích cà phê tồn tỉnh là 204.808 ha, tăng 1.071 ha so với niên vụ trước.
Trong đó, diện tích cho sản phẩm 187.279 ha, năng suất bình quân đạt 24,55
tạ/ha. Tổng sản lượng ước đạt 459.785 tấn, tăng 11.975 tấn so với niên vụ 2016 2017.Sản lượng cà phê tỉnh Đắk Lắk niên vụ 2017 - 2018 tăng tăng gần 12.000 tấn
Tồn tỉnh có 12 công ty được cấp giấy chứng nhận quyền sử dụng Chỉ dẫn địa
lý Bn Ma Thuột, với tổng diện tích trên 15.600 ha, sản lượng đăng ký 48.691
tấn/năm.
Tính đến hết niên vụ 2017 - 2018, các địa phương thực hiện tái canh cà phê
được 26.818 ha, riêng năm 2018 thực hiện tái canh được 4.862 ha.
Về hoạt động chế biến và xuất khẩu, niên vụ 2017 - 2018 Đắk Lắk có 301 cơ sở
chế biến cà phê, tăng 41 cơ sở so với niên vụ 2016 - 2017.
Xuất khẩu cà phê đạt 191.169 tấn, giảm 9.993 tấn. Kim ngạch xuất khẩu đạt
365 triệu USD, giảm 80,23 triệu USD so với niên vụ trước.
Dự kiến niên vụ 2018 - 2019, diện tích cà phê trên địa bàn tỉnh là 204.577 ha,
giảm 231 ha so với niên vụ 2017 - 2018. Năng suất bình quân ước đạt 24,46 tạ/ha;
tổng sản lượng ước khoảng 464.175 tấn.
Tuy nhiên, nhiều vùng trồng cà phê khác ở Tây Nguyên đang phải đối diện với
thách thức mất mùa trong khi giá giảm.Vùng chuyên canh cà phê lớn nhất Việt Nam
đang đối mặt với nhiều thách thức như cà phê già cỗi, giá giảm và mất mùa trong niên
vụ này. Niên vụ 2017-2018 do sự tác động của biến đổi khí hậu, q trình tái canh,
chuyển đổi cơ cấu cây trồng là một năm khó khăn cho xuất khẩu cà phê của Đắk Lắk,
với giá xuất khẩu liên tục giảm kể từ đầu vụ dẫn đến số lượng và kim ngạch đều giảm
so với niên vụ 2016-2017. Công tác tái canh diễn ra chậm và gặp nhiều khó khăn về
vốn đối với cả nông dân và một số doanh nghiệp sản xuất cà phê trên địa bàn tỉnh...

Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, quan điểm của tỉnh Đắk Lắk là khơng
tăng diện tích cà phê ngoài quy hoạch, tập trung tái canh cà phê theo kế hoạch đã được
UBND tỉnh phê duyệt, nâng cao năng suất, sản lượng, chất lượng nhằm đáp ứng nhu
cầu xuất khẩu. Đặc biệt, tỉnh sẽ quan tâm đến việc phát triển sản phẩm cà phê đặc sản
của Đắk Lắk. Cây cà phê vẫn là cây trồng chủ lực và cà phê là mặt hàng xuất khẩu chủ
lực của tỉnh. Đặc biệt, trong niên vụ 2017-2018, Đắk Lắk đã phát triển được sản phẩm


5
cà phê đặc sản, đây là hướng phát triển mới, phù hợp với nhu cầu tiêu dùng trên thế
giới. Trong niên vụ sắp tới, các địa phương chú trọng nâng cao năng suất, chất lượng
cà phê trên địa bàn; khuyến khích các nơng hộ đầu tư, ứng dụng khoa học kỹ thuật vào
canh tác và trồng xen; phát triển nhiều hơn nữa các vùng trồng cà phê đặc sản; tăng
cường kêu gọi, thu hút các nhà đầu tư vào chế biến sâu; cần thúc đẩy tiêu thụ thị
trường trong nước; đẩy mạnh bảo hộ cà phê có Chỉ dẫn địa lý Bn Ma Thuột trên các
thị trường nước ngồi, đồng thời tận dụng các nguồn nhân lực, tài chính, chính sách
của các tổ chức, hiệp hội, doanh nghiệp để đưa tiến bộ khoa học vào sản xuất, nâng
cao năng suất, chất lượng sản phẩm.
1.1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cà phê của Việt Nam [41]
Tình hình sản xuất
Theo cập nhật mới nhất từ Bộ Nông nghiệp Mỹ (USDA), sản lượng cà phê xanh
của Việt Nam trong năm mùa vụ 2018 - 2019 tăng khoảng 2% lên 30,4 triệu bao. Bên
cạnh đó, USDA cũng nâng dự báo xuất khẩu cà phê xanh năm 2018 - 2019 của Việt
nam lên 25,5 triệu bao, so với mức 25,2 triệu bao trước đó. Trong năm 2017 - 2018,
USDA điều chỉnh ước tính xuất khẩu của Việt nam lên 27,9 triệu bao từ con số chính
thức 27,7 triệu bao. Nguyên nhân của sự gia tăng là giá xuất khẩu thấp.
Tiêu thụ
Theo Bộ Công Thương Năm 2018, xuất khẩu cà phê của nước ta đạt 1,882 triệu
tấn, trị giá 3,544 tỷ USD, tăng 20,1% về lượng và tăng 1,2% về trị giá so với năm
2017. Tháng 12/2018, giá xuất khẩu bình quân cà phê của Việt Nam đạt mức 1.794

USD/tấn, giảm 3,8% so với tháng 11/2018 và giảm 10,0% so với tháng 12/2017. Năm
2018, giá xuất khẩu bình quân cà phê của Việt Nam đạt mức 1.883 USD/tấn, giảm
15,7% so với năm 2017.
Trong 11 tháng năm 2018, xuất khẩu cà phê Robusta đạt 1,47 triệu tấn, trị giá
2,541 tỷ USD, tăng 31,6% về lượng và tăng 8,1% về trị giá so với 11 tháng năm 2017.
Giá xuất khẩu bình quân cà phê Robusta 11 tháng năm 2018 đạt mức 1.728 USD/kg,
giảm 17,8%. Trong khi đó, giá xuất khẩu bình qn cà phê hịa tan đạt 5.078 USD/tấn,
tăng 3,2% so với 11 tháng năm 2017.
Theo Hiệp hội Cà phê - Ca Cao Việt Nam, sản lượng cà phê Việt Nam niên vụ
2018/19 giảm khoảng 20% so với dự kiến trước đó do ảnh hưởng của biến đổi khí hậu
năm 2018 và diện tích trồng cà phê giảm khoảng 6% trong năm 2017 và năm 2018 do
chuyển đổi cây trồng.
Hiện Việt Nam là nguồn cung cà phê lớn nhất tại Thái Lan, với tốc độ nhập
khẩu tăng trưởng 75,9% về lượng trong 9 tháng, tăng cao nhất trong top 10 nguồn
cung cà phê cho Thái Lan.


6
1.1.3. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cà phê của thế giới [41].
Tình hình sản xuất
Tổ chức Cà phê Thế giới (ICO) ước tính sản lượng cà phê niên vụ 2017 - 2018
sản lượng cà phê toàn cầu ước tăng 4,8% lên 163,51 triệu bao so với năm ngoái. Như
vậy, sản lượng cà phê cao hơn 3,1% so với lần dự báo ICO đưa ra ở kì trước đó. Sản
lượng cà phê Arabica tăng 1,7% lên 101,23 triệu bao; cà phê Robusta tăng 10,5% lên
62,28 triệu bao.
Sản lượng tăng tại tất cả khu vực sản xuất cà phê. Khu vực châu Á - Thái Bình
Dương tăng trưởng mạnh nhất với sản lượng tăng 8,3% lên 47,95 triệu bao. Theo sau
là Mexico - Trung Mỹ, sản lượng tăng 4,3% lên 21,34 triệu bao. Nam Mỹ, khu vực sản
xuất lớn nhất thế giới, có sản lượng cà phê tăng 3,3% lên 76,98 triệu bao trong khi
châu phi tăng 3,4% lên 17,25 triệu bao.

Bộ Nông nghiệp Mỹ dự báo Bộ Nông nghiệp Mỹ (USDA) cho biết tại Mumbai,
Ấn Độ ước tính sản lượng cà phê thấp hơn 300.000 bao 60 kg so với ước tính chính
thức của USDA đưa ra trước đó là 5,5 triệu bao 60 kg cho năm 2018 - 2019. Theo
USDA, sản lượng cà phê Arabica Ấn Độ đạt 1,5 triệu bao 60 kg và sản lượng cà phê
Robusta đạt 3,7 triệu bao. Trong đó, tỉnh Karnataka đóng góp 70% sản lượng cà phê
trên cả nước, theo sau là Kerala với 20%. Các nguồn thương mại cho biết mưa trong
tháng 8 đã gây thiệt hại đang kể không chỉ đối với mùa vụ cà phê, mà còn tới những
cây trồng khác như tiêu và cau, hai loại cây đang trở thành nguồn thu nhập lớn của
người nông dân. Theo các hiệp hội, sản lượng cà phê mất thêm khoảng 20% so với
ước tính trước đó của Cơ quan Quản lí Cà phê Ấn Độ. Sản lượng cà phê Arabica trước
đó ước đạt 455 kg/ha, và cà phê Robusta là 991 kg/ha. Ấn Độ là nhà sản xuất chính
các loại cà phê Robusta với gần 49% tổng sản lượng.
Tiêu thụ
Theo ICO, tổng xuất khẩu cà phê tăng mỗi năm kể từ 2010 - 2011 với mức kỉ
lục mới đạt được năm 2017 - 2018 là 121,86 triệu bao, tăng 2% so với năm 2016 2017. Xuất khẩu cà phê mùa vụ 2017 - 2018 tăng 2% lên 121,86 triệu bao so với
119,52 triệu bao của năm ngoái, với khối lượng xuất khẩu tháng 9 đạt 9,43 triệu bao,
so với 8,75 triệu bao trong cùng kì năm 2017. Trong 12 tháng kết thúc vào tháng
9/2018, tổng khối lượng xuất khẩu cà phê Arabica xanh đạt 70,95 triệu bao so với
70,51 triệu bao của năm ngoái; trong khi xuất khẩu cà phê Robusta tăng từ 38,87 triệu
bao của năm 2017 lên 39,24 triệu bao. Trong tháng 9, Brazil và Colombia chiếm
60,4% tổng xuất khẩu cà phê Arabica xanh, trong khi Việt Nam chiếm 60% tổng khối
lượng cà phê Robusta xuất khẩu. Năm cà phê 2017 - 2018, tổng xuất khẩu cà phê các
loại tăng tại 4 trong số 10 nhà xuất khẩu lớn nhất.


7
Brazil: xuất khẩu 32,34 triệu bao cà phê, tăng so với mức 31,93 triệu bao năm
2016 - 2017. Do năm sản xuất cà phê của quốc gia này được chia làm hai niên vụ, vì
vậy xuất khẩu năm 2017 - 2018 tăng phản ánh hai vấn đề đó là: Sự sụt giảm về sản
lượng trong năm mùa vụ 2016 - 2017 và sự gia tăng 14,7% trong sản xuất của năm

2017 – 2018. Xuất khẩu giai đoạn tháng 4 - 8 của Brazil đạt 15,52 triệu bao, tăng
11,2% so với cùng kì năm 2017. Colombia: Ngược lại, xuất khẩu cà phê của Colombia
năm 2017- 2018 giảm 5,7% xuống 12,72 triệu bao do sản lượng đi xuống hạn chế khối
lượng sẵn có để xuất khẩu. Indonesia: Xuất khẩu cà phê tại Indonesia ghi nhận mức
giảm lớn nhất khi khối lượng giảm từ 8,72 triệu bao năm 2016 - 2017 xuống 5,64 triệu
bao năm 2017 - 2018. Sản lượng giảm cùng với nhu cầu nội địa gia tăng đã dẫn tới sự
sụt giảm này. Tiêu thụ cà phê trên thế giới được ước tính tăng 1,8% so với năm ngối
lên 161,93 triệu bao trong năm 2017 - 2018. Trong đó, tăng trưởng nhanh nhất là châu
Á - Thái Bình Dương, với lượng tiêu thụ trong tăng 3,1% so với năm ngoái lên 35,9%.
Bắc Mỹ là khu vực có tăng trưởng tiêu thụ nhanh thứ hai với 2,6% lên 30,34 triệu bao.
Còn châu Phi và Mexico - Trung Mỹ được dự báo tăng 1,7% so với năm ngoái lên lần
lượt 11,08 triệu bao và 5,3 triệu bao. Tiêu thụ cà phể tại Châu Âu tăng 0,5% lên 52,32
triệu bao trong năm 2017 – 2018.
1.2. Ochratoxins
1.2.1. Các loại độc tố Ochratoxins
Sau Aflatoxin thì Ochratoxins là nhóm độc tố tiếp theo được phát hiện. Độc tố
Ochratoxins, là một sản phẩm chuyển hoá thứ cấp của một số lồi nấm mốc.
Ochratoxin có mặt trong khắp các loại nông sản thực phẩm: ngũ cốc, thảo dược, bia,
cà phê... trong các sản phẩm có nguồn gốc động vật do bị lây nhiễm trước.
Ochratoxins được biết đến là sản phẩm của các loài nấm Aspergillus và Penicillium và
thường được tìm thấy trong nhiều loại sản phẩm lương thực và thức ăn chăn ni.
Ochratoxin A lần đầu tiên được tìm thấy ở nấm mốc A. ochraceus vùng Nam
Phi bởi Scott (1965) trên hạt lúa bị nhiễm A.ochraceus [38]. Hiện nay có 4 loại
Ochratoxins được biết đến là Ochratoxin A, Ochratoxin B, Ochratoxin C (este etyl của
ochratoxin A) và este metyl của Ochratoxin A.
Công thức phân tử của Ochratoxin A: C20H18ClNO6
Ochratoxin A độc là do sự ghép một nhân phenylalanine và một nhân
izocumarin, khi phân hủy nó tạo chất dihydro-izocumarin, đây là chất gây độc [13].

8

Hình 1.1. Cấu trúc các Ochratoxins
(R)-N-[(5-chloro-3,4-dihydro-8-hydroxy-3-methyl-1-oxo-1H-2-benzopyran-7yl) carbonyl]-L-phenylalanin.
Trọng lượng phân tử OTA: 403,8
Điểm nóng chảy: 169°C
Phổ hấp phụ UV: 2 đỉnh: 216 – 333 nm
Ochratoxins là độc tố gây tác hại vào các cơ quan quan trọng của cơ thể như:
thần kinh, gan, thận và hệ miễn dịch. Ochratoxin A gây hậu quả nghiêm trọng đối với
người và động vật nuôi ở nồng độ cực thấp (ppb). Ochratoxin B có tính độc ít hơn
ochratoxin A, tuy nhiên chúng đều là chất độc thuộc nhóm IIB theo Tổ chức nghiên
cứu ung thư Quốc tế (IARC). Trong các loại trên, Ochratoxin A được nghiên cứu
nhiều nhất do đặc tính gây ung thư và viêm thận cũng như sự nhiễm phổ biến của nó
trên ngũ cốc. Ochratoxin A gây độc nhiều và mạnh hơn Ochratoxin B và Ochratoxin C
do đó được xem là đối tượng chính cho việc xác định Ochratoxin [3]. Trong khn
khổ luận văn này tôi quan tâm nghiên cứu đến Ochratoxin A.
1.2.2. Tính chất hố lý của độc tố Ochratoxins
Ochratoxins là độc tố tinh thể không màu, bền với nhiệt, tan trong dung môi
hữu cơ phân cực như chloroform, methanol, …, ít tan trong nước và tan trong đệm
carbonat loãng. Ochratoxins rất bền vững với các xử lý nhiệt và hóa chất. Độc tố được
sản sinh nhiều nhất ở nhiệt độ từ 20-25°C. Sự sản sinh Ochratoxins phụ thuộc chủng
nấm mốc, hoạt tính của nước trong hạt, cơ chất, nhiệt độ. Ochratoxins dễ bị phân hủy
bởi ánh sáng, trong môi trường kiềm hoặc chất tẩy rửa [6].
Ochratoxin A phát huỳnh quang và hấp thụ UV cực đại tại 365nm. Ochratoxin
A có điểm nóng chảy ở 169 0C. Phổ hồng ngoại trong cloroform cho các Peak có độ dài
3380, 1723,1678, 1655 cm-1 OTA có tính axit yếu pKa1 = 4,2-4,4 và pKa2 = 7,0- 7,3.
Ochratoxin A phát huỳnh quang xanh khi dùng thiết bị sắc ký lớp mỏng chiếu tia UV
ở 366 nm.

9
Bảng 1.1. Đặc tính lý hóa của các Ochratoxins [6].
Ochratoxins KLPT

λmax

điểm nóng

ε

Ánh sáng

hấp thu

chảy (0C)

(l.mol-1.Cm-1)

huỳnh quang

A

403

330

169

5550

Xanh lục

B

369

320

221

6000

Xanh lam

C

431

330

-

6200

Xanh lam

1.2.3. Sự tạo độc tố Ochratoxin A do các nấm mốc
Ochratoxin A đầu tiên được phân lập từ Aspergillus ochraceus nhưng những
nghiên cứu tiếp theo cho thấy các biến chủng của chi Aspergillus và Penicillium cũng
tạo Ochratoxin A.

Các nấm mốc tạo Ochratoxin A ở chi Aspergillus gồm: A.ochraceus, A.
elegans, A.fresenii, A.melleus, A.ostianus, A.petrakii, A.screrotium, A.sulphureus.
Các nấm mốc tạo ochratoxin A ở chi Penicillium gồm: P.verrucosum,
P.viridicatum, P.chrysogenum, P.commune và P.cyclopium, P.expansum, P.palitans,
P.purpurescence, P.nordiceum, P.variable [5].
Ochratoxin A được tạo ở nhiệt độ tối thích từ 20º- 30ºC và hoạt độ nước 0,953
(39% hàm lượng nước tính theo phần trăm trọng lượng khơ), ở nhiệt độ cao hơn hàm
ẩm yêu cầu cao hơn aw= 0,997 hay 52% ẩm. Các nấm Penicillium thường tạo
ochratoxin A trong điều kiện nhiệt độ thấp còn các nấm Aspergillus thường tạo
ochratoxin A ở nhiệt độ cao hơn [1].
1.2.4. Độc tính của Ochratoxin A
Sự nhiễm Ochratoxin A ở một số sản phẩm thực vật và động vật đã được thông
báo rộng rãi, có sự thay đổi lớn hàm lượng Ochratoxin A ở các hạt lương thực trong
thời gian bảo quản do điều kiện khí hậu [12].
Thận là cơ quan nhạy cảm nhất đối với Ochratoxin A như có thể gây ra
thương tổn cấp tính cũng như mãn tính cho thận. Thêm vào đó, tác dụng của độc tố
đối với hệ miễn dịch và tác dụng gây quái thai của Ochratoxins cũng đã được xác
định. Ochratoxin A cũng là một chất có khả năng gây ung thư. Thí nghiệm cho
chuột uống Ochratoxin A trong hai năm ở các liều từ 3500-6000 g/kg trọng lượng
cơ thể chuột cái và 70g/kg trọng lượng cơ thể/ngày ở chuột đực, đã kích thích tạo
các u ở thận [14],[30].


10
Tác dụng đầu tiên của Ochratoxin A vào cơ thể là ức chế sinh tổng hợp protein.
Tác dụng là đặc trưng và bao gồm ức chế cạnh tranh của sự tổng hợp phenylalanin
tRNAPhe là quá trình cần thiết cho các bước acyl hoá axit amin cơ bản trong sinh tổng
hợp protein. Khi phân tích huyết thanh người, nhận thấy Ochratoxin A đạt tới 40
mg/ml huyết thanh. Sự dao động ở mức độ nhiễm đã liên quan tới địa lý, mùa, sự thay
đổi hàng năm của hàm lượng Ochratoxin A ở các sản phẩm thực phẩm. Bệnh thận địa

phương của vùng Balkan là một bệnh nghiêm trọng, chẳng hạn như vùng Vratza ở
Bungary, với cách bảo quản truyền thống, đã là vùng có tỷ lệ này rất cao [37].
Ochratoxin A độc là do sự ghép một nhân phenylalanin và một nhân izocumarin khi phân
hủy tạo ra chất dehydroizocumarin đây là chất gây độc [23]. Tác dụng của độc tố này ảnh
hưởng đến sức khỏe con người và gây tổn thất trong chăn nuôi gia súc. Ochratoxin A tác
động lên thận gây ra các đợt bộc phát bệnh thận ở động vật và là tác nhân gây tổn thất về
mặt kinh tế.
Liều độc cấp tính LD50 của Ochratoxin A đối với vịt con 1 ngày tuổi là 25
µg/con theo đường miệng, với chuột đực là 22 mg/kg và chuột cái là 20 mg/kg, đối với
lợn 1,0-6,0 mg/kg. Gà bị nhiễm Ochratoxin A ở nồng độ thấp chậm hình thành sinh
dục và đẻ ít trứng, ở nồng độ cao gây rối loạn gan thận và làm chết gà. Đối với vịt khi
bị nhiễm Ochratoxin A sẽ bị viêm ruột, rối loạn thận, hoại tử ở tiểu quản thận.
Ochratoxin A gây sẩy thai ở cả động vật thí nghiệm và động vật chăn ni như lợn,
bò... [28].
1.3. Giới hạn tồn dư tối đa cho phép (MRL)
Mức dư lượng tối đa cho phép là giới hạn dư lượng của một loại thuốc, được
phép tồn tại về mặt pháp lí hoặc xem như có thể chấp nhận được ở trong nông sản,
thức ăn mà không gây hại cho người sử dụng và vật nuôi khi dùng.


11
Bảng 1.2. Mức dư lượng tối đa cho phép của Ochratoxin A ở Việt Nam, theo QCVN 81:2011/BYT, Quy chuẩn kỹ thuật Quốc Gia đối với giới hạn ô nhiễm độc tố vi nấm
trong thực phẩm.
TT

Tên thực phẩm

MRL
(µg/kg)

1

Ngũ cốc chưa qua chế biến

5

2

Ngũ cốc sử dụng làm thực phẩm, các sản phẩm từ ngũ cốc (đã và
chưa qua chế biến) (không bao gồm các sản phẩm quy định tại phần
2.9 và 2.10)

3

3

Nho khô (currants, raisins và sultanat)

10

4

Hạt cà phê rang và cà phê bột (khơng bao gồm cà phê hịa tan)

5

5

Cà phê hòa tan (cà phê uống liền)

10

6

Rượu vang, rượu vang nổ và rượu vang hoa quả (không bao gồm
rượu mùi và rượu vang có độ cồn khơng thấp hơn 15o)

2

7

Rượu vang có hương thơm (aromatised wine), đồ uống pha chế từ
rượu vang có hương thơm, cocktail từ rượu vang có hương thơm

2

8

Nước nho ép, nước nho ép cơ đặc hoàn nguyên, nectar nho, dịch nho
ép (grape must) và dịch nho ép hoàn nguyên sử dụng làm thực phẩm

2

9

Thực phẩm chế biến từ ngũ cốc và các thực phẩm khác dành cho trẻ
dưới 36 tháng tuổi (dạng khô)

0,5

10

Thực phẩm sử dụng với mục đích y tế đặc biệt dành cho trẻ dưới 12
tháng tuổi

0,5

Gia vị:
Ớt: bao gồm tất cả các loại, tương ớt, ớt bột, ớt cựa gà, ớt cay.
Hạt tiêu: hạt khô bao gồm cả tiêu trắng và tiêu đen
11

Hạt nhục đậu khấu

30

Gừng và nghệ
Hỗn hợp các loại gia vị trên
12

Sản phẩm chiết xuất từ cam thảo (1kg sản phẩm thu được từ 3 - 4 kg
rễ cam thảo) dùng trong chế biến nước giải khát và bánh kẹo 80

80

Hiện chưa có quy định cụ thể nào về mức MRL cho ochratoxin B và C kể cả
trong nước và tiêu chuẩn Châu Âu (EN).


12

1.4. Các phương pháp phân tích
Phương pháp ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
Nguyên tắc dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể.
Ochratoxin chuẩn được cộng hợp với enzyme, tạo thành phức hợp Ochratoxinenzyme và được sử dụng như một kháng nguyên ở nồng độ nhất định, cạnh tranh với
Ochratoxin có trong mẫu. Kháng thể đặc hiệu với Ochratoxin được gắn lên bề mặt
giếng nhựa polystryren. Dịch chiết mẫu trong methanol 70% được trộn cộng hợp với
Ochratoxin – enzyme và được cho vào giếng có phủ kháng thể, các Ochratoxin có
trong mẫu (nếu có) sẽ cạnh tranh với phức hợp Ochratoxin- enzyme để gắn vào kháng
thể cố định trên polystryren. Sau đó rửa sạch các phức hợp thừa, cơ chất phản ứng với
enzyme được đưa vào tạo màu. Ủ một thời gian sau đó thêm vào dung dịch ngưng phát
màu để tạo điều kiện đồng đều về thời gian cho mọi giếng. Tiến hành đo độ hấp thụ
của mẫu và dãy chuẩn bằng máy đo màu, từ đó tính được nồng độ của Ochratoxin có
trong mẫu. Màu càng đậm chứng tỏ cộng hợp Ochratoxin – enzyme được giữ trong
giếng càng nhiều, đồng nghĩa với nồng độ Ochratoxin trong mẫu càng thấp. Ngược lại,
màu càng nhạt thì nồng độ Ochratoxin càng cao.
Sử dụng phương pháp ELISA để xác định ochratoxin có thể kể đến một số
nghiên cứu sau:
Nhóm tác giả Aihua Zhang, Yanna Ma, Lulu Feng, Ying Wang, Chenghua He,
Xichun Wang, Haibin Zhang [21] xác định Ochratoxin trên đối tượng mẫu ngũ cốc
nguyên liệu tại Nanjing, Trung Quốc. Phương pháp phân tích có giới hạn phát hiện
0,15 ng/ml. Độ thu hồi của phương pháp đạt từ 87-101% tại mức thêm chuẩn 2,5-10
ppb. Nhóm tiến hành phân tích trên 65 mẫu ngơ, gạo, lúa mì. Kết quả cho thấy 8 trong
số 22 mẫu lúa mì chứa Ochratoxin A trong khoảng 2- 9 ppb (chiếm 36% tổng số mẫu),
6 trong số 23 mẫu ngô (chiếm khoảng 26% tổng số mẫu) dương tính với Ochratoxin A
trong khoảng 3-23 ppb, 3 trong số 20 mẫu gạo (chiếm khoảng 15% tổng số mẫu)
dương tính với Ochratoxin A trong khoảng 2-3 ppb.
Nhóm tác giả Pedro Novoa, Géraud Moulasa, Duarte Miguel Franc¸ Prazeresb,
Virginia Chua, Jỗo Pedro Conde [24] đã xác định Ochratoxin trong mẫu rượu với giới
hạn phát hiện là 0,85 ng/ml. Ochratoxin được phát hiện trong dung dịch đệm PBS với
việc sử dụng cấu hình một kênh thẳng.

Kỹ thuật có ưu điểm: nhanh, đơn giản,tiết kiệm dung môi, đặc hiệu và khá nhạy
nhưng so với phương pháp HPLC thì kém hiệu quả hơn do dễ cho kết quả dương tính
giả hoặc âm tính giả.


13
Phương pháp sắc ký khí (Gas chromatography-GC)
Phương pháp sắc ký khí đã được một số tác giả ứng dụng để xác định các loại
độc tố Ochratoxin. Tuy nhiên phương pháp chỉ phân tích được những chất dễ bay hơi,
cịn các chất khó bay hơi thì phải tạo dẫn xuất nên tốn thời gian và hóa chất. Hơn nữa,
để phân tích được đồng thời các chất thì cần thời gian phân tích dài. Do vậy, phương
pháp ít được ứng dụng để phân tích các loại độc tố Ochratoxin. Tác giả Yuying Jiao và
các cộng sự [39] đã tiến hành xác định Ochratoxin trong thực phẩm bằng phương pháp
sắc ký khí, ở đó Ochratoxin A được chuyển thành dạng dẫn xuất ester 0-methyl
ochratoxin A và được xác định bằng sắc ký khí khối phổ với chế độ ESI âm.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và cột ái lực miễn dịch (IAC)
Giống như ELISA, cột ái lực miễn dịch cũng dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa
kháng nguyên và kháng thể. Kháng thể đặc hiệu với Ochratoxin được gắn lên giá rắn
của cột sắc ký (thường dùng Sepharose 4B), tạo cho IAC đặc tính vừa tinh sạch vừa cơ
đặc Ochratoxin. Mẫu được chiết với acetonitril/H2O, sau đó được pha loãng và cho
qua cột ái lực miễn dịch. Cột được rửa sạch những tạp chất không gắn lên kháng thể và
được giải hấp bằng methanol. Tiến hành định lượng bằng HPLC với detector huỳnh
quang. Bản thân Ochratoxin là chất phát huỳnh quang tại bước sóng hấp thụ 333 nm,
bước sóng phát xạ 460 nm nên đã có rất nhiều nghiên cứu sử dụng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao với detector huỳnh quang để xác định. Tác giả Catherine Tessini và
cộng sự [26] đã tiến hành thực hiện phân tích 154 mẫu rượu xuất xứ Chi Lê, khảo sát
trên cột ái lực miễn dịch với các hệ dung môi khác nhau, giới hạn phát hiện của
phương pháp từ 1-9 ppb, hiệu suất thu hồi nằm trong khoảng 60-90%.
Tác giả R.Ghali và cộng sự [32] đã tiến hành thực hiện trên 180 mẫu thực phẩm
xuất xứ Tunisia. Mẫu được chiết bằng ACN/H2O (80/20) và làm sạch bằng cột ái lực

miễn dịch. Độ thu hồi ở mức nồng độ 0,5 và 2 ng/g trong khoảng 84 đến 94 %.
Phương pháp có giới hạn phát hiện 0,1 ng/g. Loại mẫu thường bị nhiễm là lúa mạch,
lúa mì. Tuy nhiên, khi sử dụng detector huỳnh quang phương pháp có độ nhạy tương
đối tốt, nhưng chỉ có thể nhận biết chất phân tích thơng qua thời gian lưu. Đối với
những nền mẫu phức tạp, các chất phân tích rất dễ bị ảnh hưởng bởi nền mẫu, nếu chỉ
dựa vào thời gian lưu sẽ rất khó để có thể khẳng định đúng đắn chất cần phân tích.
Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ
Hiện nay, phương pháp phân tích sắc ký lỏng khối phổ đặc biệt là phương pháp
sắc ký lỏng hai lần khối phổ với những đặc điểm ưu việt như độ chính xác cao, giới
hạn phát hiện thấp, thời gian phân tích nhanh, có thể định lượng đồng thời các chất có
thời gian lưu giống nhau đang được coi là phương pháp phân tích có giá trị pháp lý để
phát hiện và định lượng nồng độ Ocharatoxins ở lượng vết hay siêu vết.