Ứng dụng kỹ thuật digital pcr đánh giá tồn lưu tế bào ác tính trong bệnh bạch cầu mạn dòng tủy tại bệnh viện truyền máu huyết học

.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
-----------------

CHÂU THÚY HÀ

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DIGITAL PCR
ĐÁNH GIÁ TỒN LƢU TẾ BÀO ÁC TÍNH
TRONG BỆNH BẠCH CẦU MẠN DÒNG TỦY
TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC

LUẬN VĂN BÁC SĨ CHUYÊN KHOA CẤP II

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2020

.


.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
-----------------

CHÂU THÚY HÀ

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DIGITAL PCR

ĐÁNH GIÁ TỒN LƢU TẾ BÀO ÁC TÍNH
TRONG BỆNH BẠCH CẦU MẠN DÒNG TỦY
TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC
CHUYÊN NGÀNH: HUYẾT HỌC
MÃ SỐ: CK 62 72 25 01

LUẬN VĂN BÁC SĨ CHUYÊN KHOA CẤP II
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. PHAN THỊ XINH

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2020

.


.

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu
và kết quả nêu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chƣa từng đƣợc
cơng bố trong bất kỳ cơng trình nghiên cứu nào khác.

Ngƣời làm nghiên cứu

Châu Thúy Hà

.


i.

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i
MỤC LỤC ......................................................................................................... ii
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... iv
DANH MỤC BẢNG ......................................................................................... v
DANH MỤC SƠ ĐỒ ...................................................................................... vii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................ viii
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU.............................................................................. 2
1. Mục tiêu tổng quát ..................................................................................... 2
2. Mục tiêu cụ thể........................................................................................... 2
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................ 3
1.1. Định nghĩa ............................................................................................... 3
1.2. Dịch tễ ..................................................................................................... 3
1.3. Bệnh sinh................................................................................................. 3
1.4. Lâm sàng ................................................................................................. 9
1.5. Sinh học................................................................................................. 10
1.6. Điều trị .................................................................................................. 11
1.7. Đánh giá đáp ứng điều trị...................................................................... 15
1.8. Vấn đề ngƣng thuốc TKI ...................................................................... 18
1.9. Các kỹ thuật theo dõi tồn lƣu bệnh tối thiểu trong BCMDT ................ 20
1.10. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam và thế giới .................................... 28
CHƢƠNG II. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 29

.


.

i

2.1. Dân số nghiên cứu................................................................................. 29
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ...................................................................... 31
2.3. Phƣơng pháp thu thập và xử lý số liệu.................................................. 38
2.4. Vấn đề y đức ......................................................................................... 39
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ ............................................................................... 41
3.1. Chuẩn hóa quy trình dPCR ................................................................... 41
3.2. Đặc tính kỹ thuật của RQ PCR và dPCR .............................................. 43
3.3. Tỉ lệ đáp ứng SHPT .............................................................................. 57
3.4. Mối tƣơng quan của kết quả dPCR với kết quả RQ PCR..................... 73
CHƢƠNG IV. BÀN LUẬN ............................................................................ 77
4.1. Chuẩn hóa quy trình dPCR ................................................................... 77
4.2. Đặc tính kỹ thuật của RQ PCR và dPCR .............................................. 77
4.3. Tỉ lệ đáp ứng SHPT .............................................................................. 84
4.4. Mối tƣơng quan của kết quả dPCR với kết quả RQ PCR..................... 91
KẾT LUẬN ..................................................................................................... 94
KIẾN NGHỊ .................................................................................................... 95
LỜI CẢM ƠN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC 1. BẢNG THU THẬP SỐ LIỆU
PHỤ LỤC 2. QUI TRÌNH THỰC HIỆN RQ PCR VÀ dPCR

.


v.

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Vị trí điểm gãy trên ABL và BCR.......................................................... 4
Hình 1.2. Con đƣờng dẫn truyền tín hiệu nội bào chính của BCR/ABL .............. 7

Hình 1.3. Sơ đồ con đƣờng dẫn truyền hoạt hóa bởi BCR/ABL .......................... 8
Hình 1.4. Con đƣờng RAS/PI3K và AKT dƣới BCR/ABL .................................. 9
Hình 1.5. Multiplex PCR phát hiện BCR/ABL ................................................... 21
Hình 1.6. Nested PCR phát hiện BCR/ABL ....................................................... 22
Hình 1.7. Phƣơng pháp dPCR tạo giọt ................................................................ 24
Hình 1.8. Kết quả đọc huỳnh quang của dPCR ................................................. 25
Hình 2.1. Hệ thống máy Realtime PCR .............................................................. 35
Hình 2.2. Máy tạo giọt ........................................................................................ 35
Hình 2.3. Máy dPCR ........................................................................................... 36
Hình 2.4. Máy đọc giọt ....................................................................................... 36
Hình 3.1. Các dạng NST đồ phức tạp của NB trong nghiên cứu........................ 61
Hình 3.2. Các dạng hình ảnh FISH có bất thƣờng kèm theo của NB ................. 62
Hình 3.3. Các kiểu tổ hợp BCR/ABL của NB trong nghiên cứu ......................... 63

.


.

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Tiêu chuẩn đáp ứng với điều trị TKI ................................................. 15
Bảng 1.2. Phân loại đáp ứng phân tử theo tiêu chuẩn IS .................................... 17
Bảng 1.3. Tiêu chuẩn ngƣng TKI trong các hƣớng dẫn điều trị ........................ 19
Bảng 2. Các biến số nghiên cứu .......................................................................... 31
Bảng 3.1. So sánh hiệu quả số lần trộn bằng pipet ............................................. 42
Bảng 3.2. Độ lệch chuẩn và độ biến thiên cho phép ........................................... 43
Bảng 3.3. Độ lặp lại của kỹ thuật RQ PCR ......................................................... 44
Bảng 3.4. Độ tái lập của kỹ thuật RQ PCR ......................................................... 45
Bảng 3.5. Độ lặp lại của kỹ thuật dPCR ............................................................. 45
Bảng 3.6. Độ tái lập của kỹ thuật dPCR ............................................................. 46

Bảng 3.7. Bảng kết quả mẫu ngoại kiểm ............................................................ 47
Bảng 3.8. Bảng kết quả định lƣợng BCR/ABL theo bậc thang nồng độ bằng
RQ PCR ............................................................................................................... 50
Bảng 3.9. Bảng kết quả định lƣợng BCR/ABL theo bậc thang nồng độ bằng
dPCR ................................................................................................................... 51
Bảng 3.10. Bảng kết quả khảo sát độ nhạy, độ đặc hiệu của RQ PCR ............... 55
Bảng 3.11. Bảng kết quả khảo sát độ nhạy, độ đặc hiệu của dPCR ................... 56
Bảng 3.12. Bảng kết quả đặc điểm sinh học lúc chẩn đoán của NB................... 58

.


.

i

Bảng 3.13. Tỉ lệ NB đạt các mức đáp ứng về SHPT bằng RQ PCR .................. 67
Bảng 3.14. Tỉ lệ NB đạt các mức đáp ứng về SHPT bằng dPCR ....................... 68
Bảng 3.15. Đặc điểm 4 NB mất MR3,0 ................................................................ 69
Bảng 3.16. So sánh nhóm đạt đáp ứng MR4,0 và chƣa đạt MR4,0 ở thời điểm
24 tháng sau điều trị ............................................................................................ 71
Bảng 3.16. So sánh nhóm đạt đáp ứng MR4,0 và chƣa đạt MR4,0 ở thời điểm
48 tháng sau điều trị ............................................................................................ 72
Bảng 3.18. Kết quả đánh giá đáp ứng SHPT bằng dPCR và RQ PCR ............... 74
Bảng 3.19. Khả năng đánh giá mức đáp ứng SHPT của RQ PCR và dPCR ...... 76
Bảng 4.1. Độ nhạy của dPCR trong nghiên cứu của Maier ................................ 84
Bảng 4.2. So sánh đặc điểm sinh học của NB trong các nghiên cứu .................. 85
Bảng 4.3. So sánh kiểu tổ hợp BCR/ABL của NB trong các nghiên cứu ............ 87
Bảng 4.4. So sánh loại TKI của NB trong các nghiên cứu ................................. 88
Bảng 4.5. Các yếu tố ảnh hƣởng khả năng đạt MR4,5 của NB trong các nghiên

cứu của Breccia ................................................................................................... 90

.


.

i

DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 3.1. Sơ đồ so sánh kết quả ngoại kiểm ..................................................... 48
Sơ đồ 3.2. Tính tuyến tính của kết quả RQ PCR với mức pha lỗng K562 ....... 53
Sơ đồ 3.3. Tính tuyến tính của kết quả dPCR với mức pha loãng K562 ............ 54
Sơ đồ 3.4. Phân bố tuổi của NB trong nghiên cứu.............................................. 57
Sơ đồ 3.5. Phân bố giới tính của NB trong nghiên cứu ...................................... 58
Sơ đồ 3.6. Khảo sát NST đồ của NB lúc chẩn đoán ........................................... 60
Sơ đồ 3.7. Khảo sát FISH của NB lúc chẩn đoán ............................................... 62
Sơ đồ 3.8. Khảo sát RT PCR của NB lúc chẩn đoán .......................................... 63
Sơ đồ 3.9. Phân bố thời gian điều trị imatinib của NB trong nghiên cứu........... 64
Sơ đồ 3.10. Phân bố thời gian đạt đáp ứng CHR của NB trong nghiên cứu ...... 65
Sơ đồ 3.11. Phân bố thời gian đạt CCyR của NB trong nghiên cứu................... 66
Sơ đồ 3.12. Phân bố thời gian đạt MR3,0 của NB trong nghiên cứu ................... 66
Sơ đồ 3.13. Phân bố thời gian đạt MR4,0 của NB trong nghiên cứu ................... 68
Sơ đồ 3.14. Phân bố thời gian đạt MR4,5 của NB trong nghiên cứu ................... 69
Sơ đồ 3.15. Mối tƣơng quan của kết quả BCR-ABL/ABL % (IS) của dPCR và
RQ PCR ............................................................................................................... 73
Sơ đồ 3.16. Số bản sao gen ABL của NB trong nghiên cứu................................ 75
Sơ đồ 4.1. Tƣơng quan giữa kết quả BCR-ABL/ABL % (IS) và tỉ lệ
K562:HL60.......................................................................................................... 80

.


.

ii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BCMDT Bạch cầu mạn dòng tủy (chronic myeloid leukemia)
BV TMHH Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học
CHR

Đáp ứng huyết học hoàn toàn (complete hematologic response)

CCyR

Đáp ứng hoàn toàn về di truyền tế bào (Complete Cytogenetic
Response)

DMR

Đáp ứng sâu về sinh học phân tử (Deep Molecular Response)

dPCR

PCR kỹ thuật số (digital PCR)

DTTB

Di truyền tế bào

EFS

Sống không sự kiện (Event free survival)

EMR

Đáp ứng sớm về sinh học phân tử (Early Molecular Response)

FISH

Lai tại chỗ phát huỳnh quang (Fluorescence in situ hybridization)

IS

Thang đo quốc tế (International Score)

MCyR

Đáp ứng phần lớn về di truyền tế bào (Major Cytogenetic

Response)
mCyR

Đáp ứng phần nhỏ về di truyền tế bào (minor Cytogenetic

Response)
MMR

Đáp ứng phân tử phần lớn (Major Molecular Response)

MR

Đáp ứng phân tử (Molecular Response)

NB

Ngƣời bệnh

NCCN

Mạng lƣới ung thƣ quốc gia (National Comprehensive Cancer

Network)
NST

Nhiễm sắc thể

OS

Sống toàn bộ (Overall survival)

PCR

Phản ứng khuếch đại chuỗi (Polymerase Chain Reaction)

PFS

Sống không tiến triển (Progression free survival)

.


x.

Ph

Philadelphia

RQ PCR Real-Time Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain
Reaction
PCyR

Đáp ứng một phần về di truyền tế bào (Partial Cytogenetic

Response)
SHPT

Sinh học phân tử

TKI

Ức chế tyrosine kinase

.


.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh bạch cầu mạn dòng tủy (BCMDT) là bệnh tăng sinh tủy xuất phát
từ sự tăng sinh không kiểm sốt các tế bào tạo máu có mang tổ hợp gen sinh
ung BCR/ABL, mã hóa protein tyrosine kinase hoạt hóa BCR/ABL. Tổ hợp
gen này là kết quả của sự chuyển vị tƣơng hỗ giữa nhánh dài nhiễm sắc thể
(NST) 9 và 22, gọi là NST Philadelphia (Ph), có thể xác định đƣợc bằng kỹ
thuật di truyền tế bào (DTTB). Tyrosine kinase BCR/ABL khởi động nhiều
con đƣờng dẫn truyền tín hiệu cần thiết cho quá trình sinh ung thƣ.
Các thuốc ức chế tyrosine kinase BCR/ABL (TKI: tyrosine kinase
inhibitor), giúp cải thiện dự hậu ngoạn mục trên ngƣời bệnh (NB) BCMDT,
đƣa NB đạt các mức đáp ứng ngày càng sâu hơn. Tuy nhiên, việc duy trì điều
trị TKI có thể đem đến một gánh nặng kinh tế cho NB và xã hội. Ngoài ra,
nguy cơ kháng thuốc và các tác dụng phụ liên quan điều trị TKI là một yếu tố
bất lợi khi dùng thuốc trong thời gian dài. Điều này cho thấy việc quyết định
ngƣng thuốc TKI tại thời điểm thích hợp là thật sự cần thiết.
Kỹ thuật sinh học phân tử (SHPT) hiện là kỹ thuật nhạy trong theo dõi
đáp ứng điều trị BCMDT. Kỹ thuật Realtime Quantitative polymerase chain
reaction (RQ PCR) trƣớc đây cho phép đánh giá đến mức đáp ứng SHPT
giảm 4 log10 (MR4,0) so với lúc chẩn đốn. Hiện tại, có nhiều khuyến cáo đƣa
ra các tiêu chuẩn quyết định ngƣng thuốc, hầu hết NB cần duy trì mức đáp
ứng MR4,0 đến MR4,5 khi điều trị với TKI trong thời gian tối thiểu 2 năm. Sau
đó, cần bảo đảm rằng NB đƣợc theo dõi sát bằng kỹ thuật PCR định lƣợng đạt
độ nhạy từ MR4,5 trở lên để phát hiện sớm các trƣờng hợp tái phát về SHPT
nhằm tái điều trị kịp thời. Trong tình hình hiện nay, những kỹ thuật cho phép
xác định MR4,5 - MR5,0 có thể kể đến là RQ PCR hệ thống kín và PCR kỹ
thuật số (dPCR: digital polymerase chain reaction). RQ PCR hệ thống kín

.

.

chƣa thực hiện đƣợc vì kít của hệ thống này chƣa đƣợc nhập về Việt Nam. Kỹ
thuật dPCR vừa đƣợc triển khai tại Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học (BV
TMHH), với đặc điểm chia nhỏ dung dịch phản ứng thành khoảng 20.000 giọt
kích thƣớc siêu nhỏ vài nanolit, sau đó khuếch đại và định lƣợng số bản sao
gen đích trong từng giọt nên cho kết quả nhạy hơn. Tại Việt Nam, đến hiện
tại, các hệ thống RQ PCR có thể đánh giá đáp ứng ở mức MR4,0 để quyết định
ngƣng thuốc cho NB nhƣng theo dõi sau ngƣng thuốc thì chƣa thực hiện
đƣợc. Do đó, chúng tơi thực hiện đề tài này nhằm đánh giá khả năng theo dõi
tồn lƣu tế bào ác tính trong bệnh BCMDT bằng kỹ thuật dPCR.

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
1. Mục tiêu tổng quát
Ứng dụng kỹ thuật dPCR đánh giá tồn lƣu tế bào ác tính trong bệnh
BCMDT.
2. Mục tiêu cụ thể
2.1. Chuẩn hóa quy trình kỹ thuật dPCR.
2.2. Khảo sát các đặc tính của kỹ thuật RQ PCR và dPCR.
2.3. Xác định tỉ lệ NB BCMDT đạt MR4,0 trở lên bằng kỹ thuật dPCR và
RQ PCR.
2.4. Khảo sát mối tƣơng quan giữa kết quả dPCR với kết quả RQ PCR.

.


.

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Định nghĩa

BCMDT là bệnh của tế bào gốc đa năng đặc trƣng bởi thiếu máu, sự
gia tăng quá mức bạch cầu hạt và các giai đoạn bạch cầu hạt không trƣởng
thành, bạch cầu ƣa kiềm trong máu, thƣờng kèm theo tăng tiểu cầu và lách to.
Các tế bào tạo máu chứa chuyển vị tƣơng hỗ của hai NST 9 và 22 gặp trong
hơn 90% NB, dẫn đến nhánh dài của một NST 22 bị ngắn lại gọi là NST Ph
[4, 72].
1.2. Dịch tễ
Theo thống kê của hội ung thƣ Hoa Kỳ, bệnh BCMDT chiếm từ 15 đến
20% trong nhóm bệnh bạch cầu nói chung. Tỷ lệ mới mắc của bệnh khoảng 12 trƣờng hợp trong 100.000 dân, chủ yếu xuất hiện ở nam nhiều hơn nữ và ở
tuổi trên 50. Nguyên nhân gây bệnh hiện vẫn chƣa rõ ràng.
1.3. Bệnh sinh
Chuyển vị tƣơng hỗ giữa NST 9 và 22 tạo tổ hợp gen BCR/ABL đóng
vai trị trung tâm trong phát triển BCMDT. mRNA tổ hợp dịch mã thành
protein tyrosine kinase có khả năng phosphoryl hóa các đầu tận tyrosine của
protein trong tế bào.
Vùng gãy trên NST 9 rộng, dao động từ 15 đến 40 kb trƣớc exon 1 của
gen ABL. Vùng gãy trên NST 22 rất ngắn, khoảng 5-6 kb, trên 3 vùng chính:
major (M-bcr), minor (m-bcr), và micro (μ-bcr), tạo các protein tổ hợp p210,
p190, và p230 tƣơng ứng.

.


.

Hình 1.1. Vị trí điểm gãy trên ABL và BCR [51]
Vùng trung tâm của BCR có vai trị kiểm sốt phân chia tế bào sau pha
S. Đầu C tận của BCR chứa protein hoạt hóa GTPase cho p21 rac, là protein
gắn GTP của họ RAS.
NB BCMDT chủ yếu mang chuyển vị e14a2 hay e13a2 (e: exon của

BCR, a: exon của ABL), tạo protein 210 kDa. Vị trí điểm gãy trên BCR có ý
nghĩa tiên lƣợng. Vùng gãy ở đầu 3’ thƣờng tăng tiểu cầu, vùng gãy ở đầu 5’
thƣờng tăng basophil. Vài nghiên cứu nhận thấy NB có tái sắp xếp ở đầu 3’ có
đáp ứng với IFN-α tốt hơn, hiện đang tiếp tục đánh giá đáp ứng điều trị
imatinib. NB BCMDT với điểm gãy m-bcr tiến triển sang giai đoạn chuyển
cấp với tăng monocyte và khơng có lách to hay tăng basophil. Protein p230
(e19a2) mã hóa bởi μ-bcr hiếm gặp, thƣờng kết hợp BCMDT tăng neutrophil
hay tăng tiểu cầu.
Không giống protein ABL chủ yếu khu trú trong nhân, p210 BCR/ABL
tồn tại trong bào tƣơng làm nó trở nên có nhiều tƣơng tác, tham gia vào nhiều
con đƣờng dẫn truyền tín hiệu. Protein này gắn và/hoặc phosphoryl hóa hơn
20 protein tế bào đóng vai trị là protein sinh ung. Một tiểu đơn vị

.


.

phosphatidylinositol 3′-kinase (PI3K) tƣơng tác với p210 cần thiết cho sự tăng
sinh tế bào phụ thuộc BCR/ABL và khởi phát BCMDT. Wortmannin là chất
ức chế không đặc hiệu tiểu đơn vị p110 của kinase, ức chế sự phát triển của
các tế bào này. Con đƣờng dẫn truyền và tƣơng tác gây ra bởi BCR/ABL tác
động trên mitogen-activated protein kinases nhiều và phức tạp. Hoạt tính
RAF-encoded serine-threonine kinase đƣợc điều hịa bởi p210 BCR/ABL.
Điều hòa ngƣợc của biểu hiện RAF ức chế tăng sinh cả tế bào tiền thân tạo
máu bình thƣờng. Hiệu quả gây chuyển dạng tế bào của BCR/ABL bị ảnh
hƣởng bởi adaptor protein vì protein này điều hịa tín hiệu dẫn truyền từ
tyrosine kinase đến RAS.
p210 BCR/ABL cũng có thể hoạt hóa nhiều con đƣờng dẫn truyền thay
thế của RAS (hình 1.2.). Các gốc oxy tái hoạt tăng trong tế bào BCMDT và

đóng vai trị chất truyền tin thứ hai đến các enzyme điều hòa bởi cân bằng
giảm oxy hóa. Sự tăng sản xuất các gốc oxy tái hoạt này là điều kiện cần để
hình thành các đột biến đi kèm trong giai đoạn mạn, góp phần diễn tiến sang
giai đoạn tiến triển. Phân tử CRKL là cơ chất chính cho p210 BCR/ABL, liên
kết với các yếu tố dƣới dịng. Kháng thể kháng CRKL có thể tủa miễn dịch
paxillin. Bình thƣờng, paxillin liên kết p210 nhờ CRKL, đƣợc p210 BCRABL phosphoryl hóa. CRKL gắn CBL, đây là protein sinh ung gây bạch cầu
cấp dòng lympho B và dòng tủy. Domain Src homology 3 của CRKL không
gắn CBL nhƣng gắn BCR/ABL. Vì thế, CRKL là chất dẫn truyền trung gian
từ BCR/ABL đến CBL. P120 CBL, protein CRKL và c-CRK cũng liên kết cabl, p190 BCR/ABL và p210 BCR/ABL với con đƣờng PI3K. p120 CBL
cũng kết dính đồng thời với tiểu đơn vị p85 của PI3K, CRKL, và c-CRK, tạo
nhiều phức hợp của protein dẫn truyền. Các phức hợp này chứa paxillin và
talin và cũng giải thích sự khiếm khuyết kết dính của tế bào BCMDT.

.


.

Hef2 cũng gắn CRKL ở tế bào ung thƣ mang p190 BCR/ABL. Hef2 tác
động con đƣờng dẫn truyền tín hiệu integrin và cũng mã hóa protein thúc đẩy
thủy phân GTP của RAS và neurofbromin, từ đó điều hịa âm tính lên tín hiệu
yếu tố kích thích dịng hạt và monocyte GM-CSF trên tế bào tạo máu. P62
DOK, cũng liên kết ABL, nhanh chóng phosphoryl hóa tyrosine khi kích hoạt
thụ thể c-kit.
Hoạt hóa nuclear factor (NF)-κB cũng cần thiết trong chuyển dạng tế
bào BCR/ABL. Dòng tế bào p210 BCR/ABL cấu thành dạng kích hoạt của
Janus kinases (JAKs) và tín hiệu dẫn truyền hoạt hóa dịch mã (STATs),
thƣờng là STAT5. p210 BCR/ABL đồng kết tủa miễn dịch và cấu thành dạng
phosphoryl hóa tiểu đơn vị β của IL-3, thụ thể GM-CSF và JAK2. Cả ABL và
BCR đều là chất điều hòa nhiều chức năng của họ protein gắn GTP Rho và

protein gắn yếu tố tăng trƣởng GRB2, liên kết tyrosine kinase với RAS và tạo
thành phức hợp với BCR/ABL và yếu tố thay đổi nucleotide Sos dẫn đến hoạt
hóa RAS.
P210 BCR/ABL cũng hoạt hóa Jun kinase và cần Jun để chuyển dạng.
Ở vài dòng tế bào BCMDT, p210 BCR/ABL cũng liên kết retinoblastoma
(Rb) protein. Mất gen ức chế u neurofbromatosis (NF1), protein hoạt hóa
GTPase RAS, cũng gây tăng sinh tủy ở chuột tƣơng tự NB BCMDT gây ra
bởi tăng nhạy cảm qua trung gian RAS với GM-CSF.
P210 BCR/ABL ức chế apoptosis bởi trì hỗn chuyển pha G2/M của
chu kỳ tế bào sau tổn thƣơng DNA. P210 BCR/ABL không ngăn apoptosis
bởi NK hay lymphokine trực tiếp chống BCMDT hay tế bào bình thƣờng.
Trong giai đoạn tiến triển hay chuyển cấp, tỉ lệ apoptosis ở neutrophil
BCMDT thấp hơn. G-CSF và GM-CSF dƣờng nhƣ làm giảm tỉ lệ apoptosis ở
neutrophil BCMDT. Tỉ lệ rút ngắn của chiều dài telomere trong giai đoạn mạn
cũng tƣơng quan với tốc độ khởi phát giai đoạn tiến triển [51].

.


.

Hình 1.2. Con đường dẫn truyền tín hiệu nội bào chính của BCR/ABL [17]
BCR/ABL phosphoryl hóa Tyr177 của BCR là cơ chế sinh ung chính
của BCR/ABL. Phức hợp BCR-ABL/GRB2 giải phóng SOS, tới lƣợt nó đến
gắn vào GRB2 ở vùng SH3. Phức hợp BCR-ABL/GRB2/SOS kích thích
chuyển Ras ở dạng gắn GDP-bất hoạt thành dạng gắn GTP có hoạt tính và
hoạt hóa GAB2. Kết quả là phức hợp GRB2/GAB2/SOS hoạt hóa con đƣờng
tín hiệu dƣới RAS, từ đó hoạt hóa MEK1/2 và MAPK proteins dẫn đến tăng
sinh tế bào bất thƣờng. Ngồi ra, phức hợp này cịn hoạt hóa con đƣờng
PI3K/AKT[17].

.


.

Hình 1.3. Sơ đồ con đường dẫn truyền hoạt hóa bởi BCR-ABL [17].
Con đƣờng PI3K/AKT cải thiện sự sống còn bởi ức chế hoạt động của
yếu tố phiên mã FOXO và thúc đẩy tăng sinh tế bào nhờ gây thoái giáng p27
proteosomal và sự hoạt hóa mTOR. PI3K hoạt hóa AKT kinase, kinase này là
yếu tố chìa khóa tạo ra nhiều hiệu ứng tế bào thơng qua sự phosphoryl hóa
các cơ chất dƣới dòng để điều hòa bộ máy chết lập trình (nhƣ Bad, caspase 9,
Mdm2, và Ask1), kết quả là kéo dài sự sống và lan tràn dòng tế bào bất
thƣờng. mTOR nằm ở hạ lƣu AKT trong con đƣờng PI3K kinase. Nó là một
serine / threonine kinase đƣợc tạo thành từ 2 phức hợp: mTORC1, điều khiển
quá trình chuyển từ pha G1 sang pha S của chu kỳ tế bào và mTORC2, giúp
phosphoryl hóa AKT, làm AKT hoạt hóa hồn tồn [17].

.


.

Hình 1.4. Con đường RAS/PI3K và AKT dưới BCR-ABL [17].
1.4. Lâm sàng
Về biểu hiện lâm sàng, BCMDT là một bệnh đƣợc diễn tiến qua 3 giai
đoạn: mạn, tiến triển và chuyển cấp. Các triệu chứng ở giai đoạn mạn thƣờng
liên quan đến lách to chèn ép gây tức, khó chịu vùng bụng hoặc liên quan đến
tình trạng tăng sinh ác tính nhƣ sốt nhẹ về chiều và sụt cân. Ngƣời bệnh NB
BCMDT giai đoạn mạn đƣợc chẩn đoán với bạch cầu tăng rất cao trên 50 x

109/L, một số trƣờng hợp hiếm có thể gây xuất huyết võng mạc và dấu hiệu
tăng độ nhớt của máu nhƣ rối loạn cƣơng dƣơng, tai biến mạch máu não, ù
tai, lú lẫn, hôn mê. Thời gian sống của NB giai đoạn mạn kéo dài trung bình
khoảng 5 năm nếu khơng điều trị đặc hiệu. Nếu khơng đƣợc kiểm sốt tốt,
tình trạng bệnh sẽ dần chuyển sang giai đoạn tiến triển hoặc chuyển cấp trong
vòng 3 - 5 năm. Ở giai đoạn tiến triển, do tình trạng tăng bạch cầu khó kiểm
sốt kèm giảm mức độ biệt hóa, các triệu chứng bắt đầu xuất hiện rầm rộ hơn
với đau xƣơng nhiều, sốt nhẹ và sụt cân. Càng về sau, bệnh sẽ chuyển sang
giai đoạn chuyển cấp. Đây là giai đoạn nặng nề nhất của bệnh cả về triệu

.


0.

chứng lẫn điều trị. Hình ảnh lâm sàng khá tƣơng đồng với một trƣờng hợp
bạch cầu cấp với tăng tỷ lệ tế bào non trong máu ngoại vi. Một số trƣờng hợp
khởi phát chuyển cấp rất đột ngột với những triệu chứng thiếu máu, xuất
huyết, nhiễm trùng. Đặc biệt hơn, NB giai đoạn chuyển cấp đáp ứng rất kém
với hóa trị liệu chuẩn, đây là yếu tố tiên lƣợng rất xấu của bệnh. Nguy cơ
chuyển cấp của bệnh khoảng 3 - 4% mỗi năm [78]. Nếu đã sang giai đoạn
cuối của bệnh, thời gian sống chỉ kéo dài từ 3 đến 6 tháng [3].
1.5. Sinh học
Huyết đồ của bệnh BCMDT đặc trƣng với tăng cao dòng bạch cầu hạt,
dao động ở mức 100 - 300 x 109/L, với đầy đủ các giai đoạn từ tế bào non đầu
dòng (Blast) đến tiền tủy bào (Promyelocyte), tủy bào (Myelocyte), hậu tủy
bào (Metamyelocyte) đến những tế bào bạch cầu đa nhân trung tính trƣởng
thành.
Tủy đồ của NB BCMDT giai đoạn mạn có hình ảnh tăng sinh dòng
bạch cầu hạt, đầy đủ các giai đoạn trƣởng thành và tỷ lệ tế bào non dƣới 5%.

Mẫu tiểu cầu cũng tăng mạnh, đa phần có hình thái nhỏ, và ít chia múi. Trong
khi đó, dịng hồng cầu giảm so với bình thƣờng. Sinh thiết tủy giúp phát hiện
tình trạng xơ hóa dần ở tủy, biểu hiện bằng hình ảnh tăng sợi reticulin. Đây là
một yếu tố tiên lƣợng xấu ở những giai đoạn sau của bệnh.
Di truyền phân tử đóng một vai trị quan trọng, giúp xác định chẩn đoán
và theo dõi điều trị lâu dài. NST Ph đặc trƣng cho bệnh BCMDT, chiếm từ 90
– 95% các trƣờng hợp. Các bất thƣờng NST khác nhƣ trisomy 8, trisomy 9,
17q… thƣờng xuất hiện trong giai đoạn tiến triển hay chuyển cấp, báo hiệu
tiên lƣợng xấu [4].

.


1.

1.6. Điều trị
Điều trị nhắm trúng đích vào cơ chế phân tử của sự tăng sinh và tiến
triển của BCMDT, hay nói cách khác là ức chế hoạt tính BCR/ABL và làm
giảm số lƣợng tế bào mang NST Ph là điều trị nền tảng của bệnh BCMDT
[40].
* Imatinib: Đây là TKI đầu tiên có hoạt lực trên mọi giai đoạn bệnh
BCMDT. Imatinib có ái lực cao đối với ABL kinase, ức chế BCR/ABL kinase
bằng cách liên kết với cấu hình bất hoạt, khơng phosphoryl hóa của kinase, do
đó che lấp một phần vị trí gắn kết ATP nên ABL kinase khơng phosphoryl
hóa đƣợc. Điều này ngăn chặn dẫn truyền tín hiệu, làm mất khả năng tăng
sinh và mất sự ức chế apoptosis của tế bào. Với liều 400mg/ngày, NB
BCMDT giai đoạn mạn đạt đáp ứng DTTB hoàn toàn (CCyR: complete
cytogenetic response) 74 - 87%, tỉ lệ sống toàn bộ (OS: overall survival) 97%
ở 18 tháng [21], [64]. Nghiên cứu trên 260 NB BCMDT giai đoạn mạn điều
trị imatinib 400mg/ngày, ở thời điểm 5 năm sau điều trị, có 26% NB đạt

CCyR, 49% đạt đáp ứng SHPT phần lớn (MR3,0: major molecular response),
28% đạt MR4,0, và 18% đạt MR4,5 [22]. Nghiên cứu trên 1503 NB BCMDT
điều trị imatinib, sau 10 năm, tỉ lệ sống không tiến triển là 82%, tỉ lệ OS là
84%, 89% đạt MR3,0, 81% đạt MR4,0, 72% đạt MR4,5, 59% đạt MR5,0. Toàn bộ
các mức đáp ứng trên đạt sớm hơn với liều imatinib 800mg/ngày ngoại trừ
MR5,0. Tuy nhiên tác dụng phụ nhiều hơn khi điều trị imatinib liều 800mg so
với liều 400mg/ngày [47]. Do đó, imatinib liều 400mg/ngày vẫn là chọn lựa
tối ƣu để khởi đầu điều trị NB BCMDT.
* Các thuốc ức chế tyrosine kinase thế hệ 2
- Dasatinib:
Đây là thuốc có tiềm năng ức chế tyrosine kinase BCR/ABL gấp 325
lần imatinib in vitro [30]. Ngoài ra, dasatinib cịn có khả năng ức chế kinase

.


2.

họ Src [56]. Ở dòng tế bào kháng imatinib, dasatinib có tiềm năng ức chế hoạt
tính gấp 1000 lần so với imatinib [63]. Có nhiều nghiên cứu cho thấy
dasatinib hiệu quả trên các NB BCMDT kháng hay bất dung nạp imatinib.
Nghiên cứu trên 160 NB BCMDT giai đoạn tiến triển kháng hay bất dung nạp
imatinib, điều trị dasatinib 140mg/ngày, tỉ lệ sống không tiến triển (PFS:
progression free survival) 5 năm là 30,3%; tỉ lệ OS 5 năm là 57,6% [66]. Theo
dõi 259 NB BCMDT giai đoạn mạn mới chẩn đoán, điều trị với dasatinib
100mg/ngày, sau 5 năm, tỉ lệ tích lũy đạt MR3,0 và MR4,0 lần lƣợt là 76% và
42%, cao hơn so với khi so sánh với nhóm 260 NB đƣợc điều trị với imatinib
400mg/ngày có tỉ lệ tƣơng ứng là 64% và 33% (p = 0,0022 và p = 0,0251).
Các tỉ lệ đáp ứng ở thời điểm 5 năm sau điều trị dasatinib 28% đạt CCyR,
52% đạt MR3,0, 39% đạt MR4,0, và 25% đạt MR4,5 [57]. NCCN cũng đã cập

nhật việc dùng dasatinib cho các NB BCMDT đề kháng hay bất dung nạp
imatinib [71].
- Nilotinib:
Nilotinib là một dẫn xuất phenylamino-pyrimidin, đƣợc thiết kế dựa
trên cấu trúc tinh thể của imatinib. Khảo sát cấu trúc không gian vùng ABL
kinase mà imatinib gắn kết, các nhà nghiên cứu giả thuyết rằng tính chọn lọc
và hiệu lực của imatinib cịn có thể cải thiện hơn nữa bằng cách lấp đầy vị trí
gắn kết này hiệu quả hơn nhờ tận dụng tính ƣa lipid. Dựa trên nguyên tắc này,
nilotinib đƣợc thiết kế để duy trì liên kết với cấu hình bất hoạt của ABL
kinase. Bằng cách thay thế phân tử N-methylpiperazine có trong imatinib
bằng một phenyl gắn trifluoromethyl và imidazole, hiệu lực của nilotinib tăng
đáng kể nhờ giảm số lƣợng liên kết hydro (4 liên kết hydro so với 6 liên kết
trong imatinib). Những thay đổi cấu trúc này giúp nilotinib có ái lực và hoạt
động ức chế kinase BCR/ABL lớn hơn so với imatinib. Ngoài ra, sự khác biệt
về cấu trúc giữa nilotinib và imatinib làm sự dung nạp chéo giữa hai loại

.


3.

thuốc trở nên tối thiểu ở NB BCMDT [11]. Tuy nilotinib có tiềm năng ức chế
tyrosine kinase BCR/ABL gấp 20-30 lần imatinib in vitro nhƣng kém
dasatinib 16 lần [30, 87]. Nilotinib có khả năng phủ nhiều đột biến vốn gây
kháng với imatinib và gần đây đã đƣợc khuyến cáo lựa chọn điều trị trong
những trƣờng hợp giai đoạn mạn hoặc tiến triển có đề kháng hoặc bất dung
nạp với imatinib [29], [50], [55].
Nghiên cứu trên 20 NB: 16 NB BCMDT bất dung nạp imatinib, 4 NB
bất dung nạp nilotinib, đƣợc chuyển sang điều trị nilotinib 300mg 2 lần/ngày,
tỉ lệ đáp ứng MR4,5 tích lũy tới thời điểm 24 tháng là 50% [32]. Signorovitch

đã so sánh tỉ lệ đáp ứng về SHPT ở những NB dùng nilotinib 300 mg hai lần
mỗi ngày với những ngƣời dùng dasatinib 100 mg mỗi ngày một lần trong 12
tháng và 48 tháng. Kết quả cho thấy nilotinib cho tỷ lệ đạt đáp ứng về SHPT
cao so với dasatinib trong điều trị BCMDT giai đoạn mạn mới đƣợc chẩn
đốn: sau 12 tháng, nilotinib có tỉ lệ đạt MR3,0 cao hơn 11,7% (p = 0,045), tỉ lệ
đạt MR4,0 cao hơn 8,2% (p = 0,029), và tỉ lệ đạt MR4,5 cao hơn 8,5%
(p < 0,001); sau 48 tháng, tỉ lệ đạt MR3,0 cao hơn (Hazard Ratio = 1,44;
p = 0,018) và tỉ lệ đạt MR4,0 cao hơn (Hazard Ratio = 1,58; p = 0,013) so với
dasatinib [10].
* Bosutinib
Đây là thuốc ức chế SCR/ABL, có tiềm năng mạnh hơn imatinib gấp
10 - 20 lần nhƣng khơng có hoạt tính chống đột biến T315I của BCR/ABL
[70]. Trong một nghiên cứu pha III trên 250 NB BCMDT giai đoạn mạn, tỉ lệ
CCyR là 79% và MR3,0 là 59% sau thời gian theo dõi 24 tháng. Khi điều trị
với vai trò hàng thứ 2 trên các NB kháng imatinib, thì bosutinib duy trì CCyR
50% trƣờng hợp, tỉ lệ chuyển cấp hay tử vong là 21% trong 5 năm. Trong
trƣờng hợp bosutinib là thuốc thứ 3 hay 4 sau dasatinib hay nilotinib ở NB
kháng imatinib, tỉ lệ đạt CCyR là 32%, OS 4 năm là 78% [53].

.


4.

* Bafetinib
Bafetinib là thuốc TKI tiềm năng mạnh hơn imatinib gấp 55 lần nhƣng
khơng có hoạt tính chống đột biến T315I của BCR/ABL, đồng thời ức chế đặc
hiệu Lyn và kinase Scr. Nghiên cứu pha I cho thấy bafetinib dung nạp tốt với
liều từ 30 mg/ngày đến 240 mg x 2 lần/ ngày, mang lại đáp ứng lâm sàng cho
6 trên 14 NB (43%) trƣớc đó từng điều trị với imatinib và dasatinib hay

nilotinib [49]. Nghiên cứu trên 56 trƣờng hợp BCMDT kháng hay bất dung
nạp imatinib, bafetinib cho đáp ứng di truyền tế bào phần lớn là 19% sau 1
đến 12 tháng [48].
* Ponatinib
Ponatinib là một TKI đƣờng uống thế hệ thứ ba rất mạnh đã đƣợc FDA
chấp thuận cho điều trị NB BCMDT kháng hoặc bất dung nạp với TKI thế hệ
trƣớc vào năm 2012. Ponatinib điều trị nhắm trúng đích BCR/ABL kinase ở
cả cấu dạng khơng hoạt hóa và hoạt hóa, đồng thời chống lại các đột biến
kháng thuốc của vùng kinase ABL. Ngồi ra, nó cũng có khả năng ức chế phổ
rộng kinase bao gồm các họ VEGFR (Vascular endothelial growth factor
receptor), FGFR (Fibroblast growth factor receptor), SRC (Steroid receptor
coactivator) và PDGFR (Platelet-derived growth factor receptor) của tyrosine
kinase.
Đây là TKI duy nhất có hoạt lực chống lại đột biến BCR/ABL T315I. Ở
tế bào mang đột biến T315I, threonine đƣợc thay thế bằng isoleucine,
isoleucine làm thay đổi cấu trúc không gian ngăn TKI gắn vào túi kỵ nƣớc
nhƣng vẫn cho phép ATP liên kết. Các thuốc dasatinib, bosutinib và nilotinib
không thể tạo liên kết hydro để gắn vào túi kỵ nƣớc, cịn ponatinib có liên kết
ba ethynyl cho phép nó vƣợt qua chuỗi bên isoleucine cồng kềnh. Hơn nữa,
liên kết ba giúp hiệu lực của thuốc tăng gấp 10 lần so với các phân tử liên kết
đơn hoặc đơi trƣớc đó [68].

.