Luận văn Thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu xử lý nâng cao giá trị của bã đậu nành (okara) bởi Bacillus amyloliquefaciens N1 và Lactobacillus fermentum DC4t2
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.59 MB, 89 trang )
i
LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi. Các số
liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong bất
kỳ cơng trình nào khác.
Tôi xin cam đoan luận văn được tiến hành nghiên cứu một cách nghiêm túc và
kết quả của các nhà nghiên cứu đi trước đã được tiếp thu một cách chân thực, cẩn thận,
có trích nguồn dẫn cụ thể trong luận văn.
Nếu không đúng như đã nêu trên, tôi xin hồn tồn chịu trách nhiệm về đề
tài của mình.
Huế, ngày 27 tháng 9 năm 2017
Tác giả luận văn
Lê Thị Kim Anh
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
ii
LỜI CẢM ƠN
Để thực hiện và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được nhiều sự quan tâm
giúp đỡ nhiệt tình của các tổ chức và cá nhân.
Tơi xin cảm ơn đến các Thầy Cơ giáo khoa Cơ Khí - Cơng Nghệ, Phịng Đào tạo
Sau đại học, cùng tất cả quý Thầy Cô khác trong Trường Đại học Nông Lâm Huế đã
truyền đạt những kiến thức quý giá cho tơi trong suốt q trình học tại trường.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến cơ giáo PGS.TS. Đỗ Thị Bích Thủy đã tận
tình, chỉ bảo và giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt q trình thực
hiện luận văn.
Tơi xin gửi lời cảm ơn đến các giáo viên và các bạn tại phòng thí nghiệm khoa
Cơ Khí - Cơng Nghệ, Trường Đại học Nơng Lâm và các anh, chị cơng tác tại Phịng
thí nghiệm khoa Hóa Học, Trường Đại Học Khoa Học, Đại học Huế đã nhiệt tình giúp
đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tơi trong suốt q trình thực hiện đề tài luận
văn thạc sĩ.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, Lãnh đạo và các anh, chị
đồng nghiệp của Trung tâm Y tế huyện Bố Trạch - tỉnh Quảng Bình đã ủng hộ, chia sẻ,
giúp đỡ và hỗ trợ tôi về mọi mặt trong suốt thời gian qua.
Do bản thân còn thiếu kinh nghiệm nên luận văn này còn hạn chế và thiếu sót.
Rất mong sự thơng cảm và đóng góp ý kiến từ q thầy cơ và bạn bè để luận văn
hồn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Huế, ngày 27 tháng 9 năm 2017
Tác giả luận văn
Lê Thị Kim Anh
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
iii
TÓM TẮT
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
iv
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. ii
TÓM TẮT...................................................................................................................... iii
MỤC LỤC ......................................................................................................................iv
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................... vii
DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................... viii
DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ ...............................................................................ix
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề ....................................................................................................................1
2. Mục tiêu của đề tài ......................................................................................................2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .....................................................................................2
4. Tính mới của đề tài ......................................................................................................2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ........................................3
1.1. TỔNG QUAN VỀ BÃ ĐẬU NÀNH ......................................................................3
1.1.1. Giới thiệu chung ....................................................................................................3
1.1.2. Thành phần của bã đậu nành và tác dụng của sự lên men bởi vi sinh vật .............3
1.2. TỔNG QUAN VỀ Bacillus sp. ................................................................................7
1.2.1. Khả năng sinh tổng hợp amylase của Bacillus sp. ................................................7
1.2.2. Khả năng sinh tổng hợp protease của Bacillus sp. ................................................8
1.2.3. Khả năng sinh tổng hợp cellulase của Bacillus sp. ...............................................9
1.2.4. Khả năng sinh tổng hợp lipase của Bacillus sp. ....................................................9
1.3. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTIC .............................................................. 10
1.3.1. Tiềm năng probiotic của vi khuẩn lactic ............................................................. 11
1.3.2. Lên men lactic của vi khuẩn lactic ......................................................................12
1.4. MỘT SỐ CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CĨ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI .........13
1.4.1. Các cơng trình nghiên cứu ở nước ngồi............................................................. 13
1.4.2. Các cơng trình nghiên cứu ở trong nước ............................................................. 17
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
v
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 20
2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU ....................................................... 20
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................................... 20
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................. 20
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ..................................................................................20
2.2.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình thuỷ phân bã đậu nành bởi Bacillus
amyloliquefciens N1 .....................................................................................................20
2.2.2. Nghiên cứu xây dựng quy trình lên men bã đậu nành bởi Lactobacillus
fermentum DC4t2 ..........................................................................................................20
2.2.3. Nghiên cứu xác định tỷ lệ phối trộn của bã đậu nành đã được xử lý riêng rẽ bởi
Bacillus amyloliquefaciens N1 và Lactobacillus fermentum DC4t2 ảnh hưởng đến một
số chỉ tiêu trong thời gian bảo quản .............................................................................20
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................................................................20
2.3.1. Các phương pháp sử dụng để phân tích vi sinh và hóa sinh ............................... 20
2.3.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm để nghiên cứu nội dung của đề tài .....................23
2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu ...................................................................................23
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ......................................25
3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH THUỶ PHÂN BÃ ĐẬU
NÀNH BỞI Bacillus amyloliquefaciens N1 .................................................................25
3.1.1. Ảnh hưởng của mật độ gieo cấy ban đầu Bacillus amyloliquefaciens N1 lên hoạt
độ enzyme và khả năng thủy phân bã đậu nành ............................................................ 25
3.1.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh enzyme ngoại bào trong bã
đậu nành ......................................................................................................................... 26
3.1.3. Ảnh hưởng của thời gian ủ lên mật độ tế bào sống trong bã đậu nành ...............27
3.1.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ lên khả năng thủy phân bã đậu nành bởi chế phẩm vi
sinh Bacillus amyloliquefaciens N1 ..............................................................................28
3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH LÊN MEN BÃ ĐẬU
NÀNH BỞI Lactobacillus fermentum DC4t2 ............................................................... 29
3.2.1. Ảnh hưởng của mật độ gieo cấy ban đầu lên sự phát triển số lượng tế bào sống
của Lactobacillus fermentum DC4t2 trong bã đậu nành ...............................................30
3.2.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự phát triển số lượng tế bào sống của
Lactobacillus fermentum DC4t2 trong bã đậu nành ......................................................30
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
vi
3.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TỶ LỆ PHỐI TRỘN CỦA BÃ ĐẬU
NÀNH ĐÃ ĐƯỢC XỬ LÝ RIÊNG RẼ BỞI Bacillus amyloliquefaciens N1 VÀ
Lactobacillus fermentum DC4t2 ẢNH HƯỞNG ĐẾN MỘT SỐ CHỈ TIÊU TRONG
THỜI GIAN BẢO QUẢN............................................................................................. 31
3.3.1. Biến đổi của hoạt độ amylase ..............................................................................32
3.3.2. Biến đổi của hoạt độ protease ..............................................................................32
3.3.3. Biến đổi của hàm lượng nitơ formol ...................................................................34
3.3.4. Sự biến đổi của hàm lượng đường khử ............................................................... 35
3.3.5. Sự biến đổi của giá trị pH và hàm lượng acid tổng trong quá trình bảo quản ....36
3.3.6. Hàm lượng NH3 trong hỗn hợp sau khi bảo quản 15 ngày .................................37
3.3.7. Mật độ tế bào sống trong hỗn hợp sau 15 ngày bảo quản ...................................38
3.4. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ XỬ LÝ NÂNG CAO GIÁ TRỊ SỬ
DỤNG BÃ ĐẬU NÀNH Ở QUY MƠ PHỊNG THÍ NGHIỆM ..................................39
3.4.1. Giai đoạn xử lý riêng rẽ ....................................................................................... 39
3.4.2. Giai đoạn xử lý kết hợp ....................................................................................... 39
3.4.3. Tính chất của chế phẩm thu được ........................................................................39
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .....................................................................41
4.1. KẾT LUẬN ............................................................................................................41
4.2. ĐỀ NGHỊ ................................................................................................................41
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 42
PHỤ LỤC ......................................................................................................................49
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
vii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
Chữ được viết tắt
BĐN
: Bã đậu nành
DNS
: Dinitrosalisilic acid
ĐC
: Đối chứng
LAB
: Lactic acid bacteria
MRS
: The Man, Rogosa and Sharpes
NMR
: Monophosphate nucleoside
OD
: Optical Density
TCA
: Trichloacetic acid
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
viii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần của bã đậu nành ...........................................................................5
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu của B. amyloliquefaciens N1 lên hoạt
độ enzyme trong BĐN ...................................................................................................26
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy B. amyloliquefaciens N1 lên hoạt độ
enzyme ngoại bào trong BĐN ....................................................................................... 27
Bảng 3.3. Hoạt độ enzyme và hàm lượng nitơ formol và đường khử trong BĐN khi ủ
với B. amyloliquefaciens N1 ở các nhiệt độ khác nhau.................................................29
Bảng 3.4. Mật độ tế bào sống tương ứng với các tỷ lệ phối trộn khác nhau của BĐN đã
được xử lý bởi B. amyloliquefaciens N1 và L. fermentum DC4t2 sau 15 ngày bảo quản
(lg CFU/g)......................................................................................................................38
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
ix
DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Sơ đồ chế biến hạt đậu nành và sự tạo thành okara .........................................4
Hình 1.2. Trạng thái của okara ........................................................................................4
Hình 3.1. Ảnh hưởng của thời gian lên số lượng tế bào sống trong bã đậu nành sau khi
ủ với B. amyloliquefaciens N1 ......................................................................................28
Hình 3.2. Ảnh hưởng của mật độ gieo cấy ban đầu lên số lượng tế bào sống trong bã
đậu nành sau khi ủ với L. fermentum DC4t2 .................................................................30
Hình 3.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên số lượng tế bào sống L. fermentum
DC4t2 trong bã đậu nành sau khi ủ ...............................................................................31
Hình 3.4. Sự biến đổi của hoạt độ amylase theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ thường
khi phối trộn BĐN đã được xử lý bởi B. amyloliquefaciens N1 và L. fermentum DC4t2
(1:1, 1:2, 2:1 và 0:1 là tỷ lệ giữa bã đậu nành đã được xử lý bởi B. amyloliquefaciens
N1 và L. fermentum DC4t2) .......................................................................................... 32
Hình 3.5. Sự biến đổi của hoạt độ protease theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ thường
khi phối trộn BĐN đã được xử lý bởi B. amyloliquefaciens N1 và L. fermentum DC4t2
(1:1, 1:2, 2:1 và 0:1 là tỷ lệ giữa BĐN đã được xử lý bởi B. amyloliquefaciens N1 và
L. fermentum DC4t2) .....................................................................................................33
Hình 3.6. Sự biến đổi của hàm lượng nitơ formol theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ
thường khi phối trộn BĐN đã được xử lý bởi B. amyloliquefaciens N1 và L. fermentum
DC4t2 (1:1, 1:2, 2:1 và 0:1 là tỷ lệ giữa BĐN đã được xử lý bởi B. amyloliquefaciens
N1 và L. fermentum DC4t2) .......................................................................................... 34
Hình 3.7. Sự biến đổi của hàm lượng đường khử theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ
thường khi phối trộn BĐN đã được xử lý bởi B. amyloliquefaciens N1 và L.fermentum
DC4t2 (1:1, 1:2, 2:1 và 0:1 là tỷ lệ giữa BĐN đã được xử lý bởi B. amyloliquefaciens
N1 và L. fermentum DC4t2) .......................................................................................... 35
Hình 3.8. Sự biến đổi của pH theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ thường khi phối trộn
BĐN đã được xử lý bởi B. amyloliquefaciens N1 và L. fermentum DC4t2 (1:1, 1:2, 2:1
và 0:1 là tỷ lệ giữa BĐN đã được xử lý bởi B. amyloliquefaciens N1 và L. fermentum
DC4t2) ........................................................................................................................... 36
Hình 3.9. Sự biến đổi của hàm lượng acid tổng theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ
thường khi phối trộn BĐN đã được xử lý bởi B. amyloliquefaciens N1 và L. fermentum
DC4t2 (1:1, 1:2, 2:1 và 0:1 là tỷ lệ giữa BĐN đã được xử lý bởi B. amyloliquefaciens
N1 và L. fermentum DC4t2) .......................................................................................... 36
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
x
Hình 3.10. Hàm lượng NH3 trong hỗn hợp đã bảo quản 15 ngày sau khi phối trộn
BĐN đã được xử lý bởi B. amyloliquefaciens N1và L. fermentum DC4t2 ...................37
Hình 3.11. Sơ đồ công nghệ xử lý bã nâng cao giá trị sử dụng của bã đậu nành hai giai
đoạn ............................................................................................................................... 40
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Ở Việt Nam có nhiều thương hiệu lớn về sản xuất sữa đậu nành như: Vinamilk,
Tribico, Vinasoy. Hằng năm, lượng bã đậu nành (okara), phế phụ phẩm của quá trình
sản xuất sữa đậu nành, được thải ra khá lớn. Hiện nay, hầu hết số lượng bã được bán
cho các công ty thức ăn chăn nuôi do còn chứa một lượng lớn các chất dinh dưỡng như
protein, carbohydrate, chất béo, chất khống và chất chống oxy hóa. Tuy nhiên do bã
đậu nành chứa hàm lượng nước lớn nên bị thối hỏng chỉ sau 2 đến 3 ngày bảo quản.
Các hợp chất carbohydrate có trong bã đậu nành thường khó tiêu hóa như rafinose,
stachyose, chất xơ nên giá trị dinh dưỡng của nó khơng cao. Nếu chúng được xử lý
bằng cách thủy phân các thành phần phức tạp thành đơn giản, tăng khả năng tiêu hóa
và hấp thụ thì sẽ mở ra một cơ hội cho bã đậu nành được tham gia vào sản xuất các
thực phẩm cho con người, ứng dụng vào các lĩnh vực khác như sản xuất cồn, thực
phẩm cho thú cưng, phân bón…
Lactobacillus fermentum thuộc nhóm vi khuẩn lactic, có khả năng lên men yếm
khí tạo ra sản phẩm chính là lactic acid làm giảm pH mơi trường xuống dưới 5. Bên
cạnh đó, nhóm vi khuẩn này cịn có khả năng sinh tổng hợp bacteriocine tiết ra ngồi
mơi trường. Sự giảm pH cùng với bacteriocin có tác dụng ức chế sự hoạt động của vi
khuẩn gây thối. Vì vậy, hoạt động sống của vi khuẩn lactic có tác dụng kéo dài thời
gian bảo quản thực phẩm. Hơn nữa, lượng lactic acid sinh ra vừa có tác dụng hồn
thiện hương vị cho sản phẩm. Một ý nghĩa lớn của nhóm vi khuẩn lactic cần được đề
cập đến là chúng có tiềm năng probiotic lớn với nhiều tác động có lợi cho sức khỏe
con người cũng như động vật. Vi khuẩn lactic trong đường ruột còn tạo ra một số
vitamin như thiamine, nicotin, folic acid, pyridoxin, Vitamin B12, …; tiết ra enzyme có
lợi như lactase; giải phóng các amino acid tự do, các acid béo mạch ngắn. Vì vậy, việc
sử dụng vi khuẩn lactic để lên men bã đậu nành đã được xử lý sẽ vừa kéo dài thời gian
bảo quản vừa tăng hiệu quả sử dụng lên rất lớn.
Mặt khác, các chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens được cơng bố là có
khả năng sinh tổng hợp nhiều enzyme ngoại bào như: cellulase, protease, amylase,
lipase…. Từ đó cho thấy có thể sản xuất chế phẩm enzyme hỗn hợp từ vi khuẩn này để
xử lý phế phụ phẩm này sẽ tăng khả năng hòa tan của một số hợp chất nên làm tăng
giá trị dinh dưỡng.
Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu xử lý nâng
cao giá trị của bã đậu nành (okara) bởi Bacillus amyloliquefaciens N1 và
Lactobacillus fermentum DC4t2” với mục đích nâng cao giá trị sử dụng của bã đậu
nành, phế phụ phẩm của nhà máy sản xuất sữa đậu nành.
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
2
2. Mục tiêu của đề tài
Nâng cao giá trị sử dụng và kéo dài thời gian bảo quản của bã đậu nành.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1) Ý nghĩa khoa học
Cung cấp các thông số công nghệ trong việc xử lý nâng cao giá trị sử dụng của
bã đậu nành bởi Bacillus amyloliquefaciens N1 và Lactobacillus fermentum DC4t2.
2) Ý nghĩa thực tiễn
- Nâng cao giá trị sử dụng của bã đậu nành thông qua khả năng dễ tiêu hóa và
kéo dài thời gian bảo quản.
- Giảm thiểu ơ nhiễm mơi trường.
4. Tính mới của đề tài
Lần đầu tiên sử dụng hỗn hợp vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enyme ngoại
bào (Bacillus amyloliquefaciens N1) và vi khuẩn lactic (Lactobacillus fermentum
DC4t2) có khả năng kéo dài thời gian bảo quản và chức năng probiotic trong việc xử
lý nâng cao giá trị sử dụng của bã đậu nành.
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. TỔNG QUAN VỀ BÃ ĐẬU NÀNH
1.1.1. Giới thiệu chung
Hiện nay, ở Việt Nam, diện tích trồng và sản lượng đậu nành (Glycine max) thu
được khá cao qua các năm. Theo Tổng cục thống kê Việt Nam và Bộ Nông nghiệpPhát triển Nơng thơn, năm 2012 diện tích trồng đậu nành là 119,6 nghìn ha với tổng
sản lượng thu được là 173,7 nghìn tấn. Năm 2013, diện tích trồng đậu nành là 117,8
nghìn ha với tổng sản lượng 168,4 nghìn tấn. Năm 2014, diện tích trồng sẽ đạt 120
nghìn ha, sản lượng dự kiến là 176,4 nghìn tấn [71].
Cùng với diện tích và sản lượng đậu nành không ngừng tăng lên, lượng bã đậu
nành (BĐN) (okara), phế phụ phẩm của quá trình chế biến đậu nành, dự báo cũng sẽ
tăng theo. Sau q trình nghiền hạt đậu nành và trích ly các chất hòa tan, phần bã còn
lại gọi là BĐN. Khi sử dụng 1 kg hạt đậu nành khô để sản xuất sữa đậu nành, người ta
thu được 1,1 đến 1,2 kg BĐN ướt (Khare và cộng sự, 1995) [27]. Vì vậy, hằng năm
lượng bã đậu nành, phế phụ phẩm của quá trình sản xuất sữa đậu nành, được thải ra
khá lớn. Lượng này được thải ra từ các nhà máy sản xuất đậu phụ ở Nhật Bản, Hàn
Quốc và Trung Quốc lần lượt là 800.000 tấn, 310.000 tấn và 2.800.000 tấn (Li và cộng
sự, 2011) [33]. Ở nước ta, chỉ tính riêng cơng ty sản xu 0
1.000
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
65
* Tỉ lệ 0:1
Duncana
Thời
gian ủ
(ngày)
Subset for alpha = 0.05
N
1
15.00
3
3.79967
13.00
3
3.80100
11.00
3
9.00
3
7.00
3
5.00
3
1.00
3
3.00
3
.00
3
Sig.
2
3
4
5
6
7
8
3.94067
4.11167
4.33867
4.64133
5.00133
5.10133
5.17100
.731
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
2.3.5. Sự biến đổi của pH theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ thường khi phối trộn
BĐN đã được xử lý bởi B. amyloliquefaciens N1 và L. fermentum DC4t2 ở các tỉ lệ
khác nhau
* Tỉ lệ 1:1
Duncana
Subset for alpha = 0.05
tile1.1
N
1
11.00
3
3.65000
15.00
3
3.65000
13.00
3
9.00
3
7.00
3
5.00
3
3.00
3
.00
3
1.00
3
Sig.
2
3
4
5
6
7
8
3.84000
4.15000
4.68000
5.03000
5.63000
5.83000
6.14000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
66
* Tỉ lệ 1:2
Duncana
Subset for alpha = 0.05
tile1.2
N
1
2
3
15.00
3
3.72000
13.00
3
3.74000
9.00
3
3.82967
11.00
3
3.84000
7.00
3
5.00
3
3.00
3
1.00
3
.00
3
Sig.
4
5
6
7
3.93000
4.57000
5.20000
5.30000
5.40033
.475
.710
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
* Tỉ lệ 2:1
Duncana
Subset for alpha = 0.05
tile2.1
N
1
11.00
3 3.63000
15.00
3
13.00
3
9.00
3
7.00
3
5.00
3
3.00
3
1.00
3
.00
3
Sig.
2
3
4
5
6
7
8
9
3.79000
3.83000
4.03000
4.57000
4.74000
5.06000
5.74000
5.84033
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
67
* Tỉ lệ 0:1
Duncana
Subset for alpha = 0.05
tile0.1
N
1
2
3
4
9.00
3
3.26000
5.00
3
3.28000
3.28000
7.00
3
3.29000
3.29000
11.00
3
15.00
3
3.36000
13.00
3
3.37000
3.00
3
1.00
3
.00
3
3.33000
5
6
3.33000
4.04000
4.35000
4.60000
Sig.
.253
.063
.132
1.000
1.000
1.000
* Đối chứng
Duncana
Subset for alpha = 0.05
tileDC
N
1
.00
3 7.04000
1.00
3
3.00
3
5.00
3
7.00
3
9.00
3
11.00
3
15.00
3
13.00
3
Sig.
2
3
4
5
6
7
8
9
7.12000
7.24000
7.82000
7.93000
8.09000
8.31000
8.80000
8.89000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
68
2.3.6. Sự biến đổi của acid tổng theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ thường khi phối
trộn BĐN đã được xử lý bởi B. amyloliquefaciens N1 và L. fermentum DC4t2 ở các tỉ
lệ khác nhau
* Tỉ lệ 1:1
Duncana
Subset for alpha = 0.05
tile1.1
N
1
2
3
4
5
6
7
8
.00
3 1.59000
1.00
3
3.00
3
5.00
3
7.00
3
9.00
3
11.00
3
2.68000
15.00
3
2.71000
13.00
3
Sig.
1.94000
2.04000
2.18000
2.38000
2.61000
2.71000
2.73000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
.140
.317
* Tỉ lệ 1:2
Duncana
Subset for alpha = 0.05
tile1.2
N
1
2
3
4
5
6
7
8
.00
3
1.00
3
3.00
3
5.00
3
7.00
3
9.00
3
11.00
3
3.40000
13.00
3
3.45000
15.00
3
Sig.
2.28033
2.67000
2.92000
3.08000
3.26000
3.33000
3.51000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
.054
1.000
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
69
* Tỉ lệ 2:1
Duncana
Subset for alpha = 0.05
tile2.1
N
1
2
3
4
5
6
7
8
.00
3
1.61000
1.00
3
3.00
3
5.00
3
7.00
3
9.00
3
11.00
3
2.86000
15.00
3
2.89000
13.00
3
Sig.
2.00967
2.22000
2.39000
2.65000
2.79000
2.89000
2.91000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
.179
.363
* Tỉ lệ 0:1
Duncana
Subset for alpha = 0.05
tile1.0
N
1
.00
3 2.60967
1.00
3
3.00
3
5.00
3
7.00
3
9.00
3
11.00
3
13.00
3
15.00
3
Sig.
2
3
4
5
6
7
8
9
2.97000
3.29000
3.50000
3.68000
3.90000
3.97000
4.02000
4.12000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
70
2.4.7. Sự biến đổi của hàm lượng NH3 trong hỗn hợp đã bảo quản 15 ngày sau khi
phối trộn BĐN đã được xử lý bởi B. amyloliquefaciens N1 và L. fermentum DC4t2
Duncana
Subset for alpha = 0.05
Tỉ lệ
N
1
2
01:01
3
.01300
0:01
3
.01700
02:01
3
01:02
3
ĐC
3
Sig.
3
4
.01700
.01867
.02833
.42867
.110
.482
1.000
1.000
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
71
Phụ lục 3: Cách tiến hành các phương pháp nghiên cứu
3.1. Xác định hoạt độ protease bằng phương pháp Anson cải tiến
- Chuẩn bị mẫu thử, cân chính xác 50g BĐN cho vào bình tam giác 100 ml.
Dùng nước cất để hịa tan mẫu và chuyển tồn bộ (cả nước tráng cốc) vào bình định
mức 100 ml, sau đó cho thêm nước cất cho đúng 100ml. Tiến hành lắc đều sau đó đem
đi lọc .
- Nguyên tắc của phương pháp là định lượng sản phẩm tạo thành do quá trình
thủy phân cơ chất casein của protease bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin.
- Hỗn hợp phản ứng thủy phân gồm dung dịch enzyme và dung dịch casein
2,0%, tỷ lệ 1:2 (v/v) được ủ ở 30oC, 10 phút; chuẩn bị 3 eppendorf sạch, cho vào mỗi
eppendorf thí nghiệm 175µl dung dịch enzyme.
- Ngưng phản ứng bằng dung dịch axit tricloacetic (TCA) 5,0% theo tỷ lệ 5 thể
tích dung dịch axit cho 1 thể tích enzyme;
- Ly tâm thu dịch nổi để thực hiện phản ứng tạo màu với thuốc thử Folin 0,2N
có mặt Na2CO3 6% (tỷ lệ dịch nổi:dung dịch Na2CO3:Folin 0,2N = 1:4:1).
- Thực hiện đồng thời mẫu kiểm tra bằng cách cho dung dịch TCA vào enzyme
trước khi ủ với cơ chất.
- Độ hấp thụ ánh sáng (OD) của dung dịch màu thu được sau phản ứng được đo
trên máy quang phổ kế ở bước sóng 750nm. Dựa vào đồ thị chuẩn tyrosine, để tính sản
phẩm tạo thành tương ứng dưới tác dụng của enzyme. Một đơn vị hoạt độ protease
(HP) được định nghĩa là lượng enzyme mà trong một phút ở 30oC có khả năng phân
giải protein tạo thành các sản phẩm hoà tan trong axit tricloacetic, cho phản ứng màu
tương đương với 1,0 µmol tyrosine.
- Tính kết quả: từ kết quả OD đo được
+ Dựa vào đồ thị chuẩn tính lượng µmol tyrozin tương ứng
+ Tính số đơn vị hoạt động proteolitic của 1ml dung dịch enzyme đã lấy xác
định hoạt độ theo cơng thức:
HP/ml =
µmol tyrozin. 8
đơn vị
t
Trong đó:
t:
thời gian phản ứng
8:
số phần thể tích của các dung dịch phản ứng
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
72
Hoạt độ tính theo gam HP/g =
Trong đó:
HP/ml ×a
𝑏
a: số ml dịch enzyme trích ly được khi ly tâm
b: số gam canh trường B. amyloliquefaciens N1 đem đi ly tâm
- Phương trình đường chuẩn tyrosine: y = 1,8207x + 0,0501
y: OD750nm, x: nồng độ tyrozin µmol/ml
3.2. Xác định hoạt độ amylase bằng phương pháp Bernfiel
- Tinh bột được sử dụng làm cơ chất để xác định hoạt độ amylase trên cơ sở
định lượng sản phẩm tạo thành bằng phản ứng màu với thuốc thử 3,5- axit
dinitrosalisilic (hòa tan 1g axit 3,5-dinitrosalisilic (DNS) trong 20 ml NaOH 2N và
50ml nước cất, cho thêm 30g kali/natri tartrate và dẫn nước đến 100 ml).
- Độ hấp thụ ánh sáng (OD) được đo trên máy quang phổ ở bước sóng 540 nm.
Dựa vào đường chuẩn để tính sản phẩm tạo thành dưới tác dụng của enzyme.
- Chuẩn bị mẫu thử, cân chính xác 50g BĐN cho vào bình tam giác 100 ml.
Dùng nước cất để hịa tan mẫu và chuyển tồn bộ (cả nước tráng cốc ) vào bình định
mức 100 ml, sau đó cho thêm nước cất cho đúng 100ml. Tiến hành lắc đều sau đó đem
đi lọc.
- Hỗn hợp phản ứng gồm 0,1 ml 1% tinh bột (hòa tan 1g tinh bột và 35mg NaCl
trong 60ml dịch đệm phosphate, pH = 7, đun sôi cho đến tan, để nguội và dẫn đến
100ml) và 0,1ml dung dịch enzyme.
+ Hỗn hợp phản ứng được ủ 10 phút ở 30C,
+ Tiếp tục cho vào hỗn hợp trên 0,2 ml dung dịch 1% DNS và ủ 10 phút ở
100C, sau đó, ủ 10 phút trong nước đá.
+ Bổ sung 2 ml nước cất vào hỗn hợp và so màu ở 540nm.
- Mẫu trắng được làm song song với mẫu chuẩn nhưng enzyme bị biến tính 10
phút trong nước sôi và 1% DNS.
- Lượng đường khử tạo thành được xác định dựa vào đường chuẩn maltose.
Một đơn vị hoạt độ α-amylase được xác định là lượng μmol maltose tạo thành bởi 1 ml
dịch enzyme trong thời gian 1 phút ở 30C.
- Tính kết quả:
Từ giá trị OD thu được, dựa vào phương trình đường chuẩn maltose để biết
nồng độ maltose.
Một đơn vị hoạt độ α- amylase được xác định là lượng μ mol maltose tạo thàmh
bởi 1ml dịch enzyme trong thời gian một phút ở nhiệt độ 30oC.
Hoạt độ
(U/ml)
Trong đó
t:
v:
=
𝜇𝑚𝑜𝑙𝑚𝑎𝑙𝑡𝑜𝑠𝑒
𝑡×𝑣
Thời gian phản ứng
Thể tích enzyme
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
73
Hoạt độ U/g
=
𝑈/𝑚𝑙×𝑎
𝑏
a: Số ml dịch enzyme trích ly được khi ly tâm
b: Số gam canh trường vi sinh vật đem đi ly tâm
- Phương trình đường chuẩn maltose : y = 0,0507x + 0,014
y: OD540nm, x: Nồng độ maltose µmol/ml
3.3. Định lượng hàm lượng đường khử bằng phương pháp Bertrand
- Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa trên cơ sở trong mơi trường kiềm (glucose, fructose,
maltose) có thể dễ dàng khử đồng (II) oxit thành đồng (I) oxit có màu đỏ gạch, qua đó
tính được lượng đường khử.
- Định lượng đường khử thường dùng thuốc thử fehling. Thuốc thử fehling là
hỗn hợp (1:1) của hai dung dịch. Dung dịch đồng sunfat gọi là fehling I (fehling A) và
dung dịch kiềm của muối Seignett (muối Kali natri tactrat) gọi là fehling II (fehling B).
- Khi trộn hai dung dịch fehling với nhau thì phản ứng giữa chúng theo hai giai
đoạn. Đầu tiên tạo thành kết tủa đồng hydroxit màu xanh da trời.
CuSO4 + NaOH
Cu(OH)2 + Na2SO4
Sau đó Cu(OH)2 tác dụng với muối Seignett tạo thành muối phức hịa tan, dung
dịch có màu xanh thẫm. Muối phức trên là một hợp chất không bền. Các đường có
chứa nhóm andehit hoặc xeton dễ dàng khử Cu2+ thành Cu1+, tạo kết tủa đồng (I) oxit
màu đỏ gạch và đường bị oxy hóa khi tác dụng với dung dịch fehling.
Để định lượng đồng (I) oxit tạo thành, trước hết oxy hóa nó bằng sắt (III) sunfat
hoặc bằng amoni sắt kép sunfat trong môi trường axit sunfuric, Cu1+ bị oxy hóa trở lại
thành Cu2+, cịn Fe3+ bị khử thành Fe2+
Cu2O + Fe2(SO4)3 + H2SO4→ 2CuSO4 + 2FeSO4 + H2O
Lượng Fe2+ tạo thành được xác định bằng cách oxy hóa nhờ dung dịch KMnO 4
trong mơi trường axit
10FeSO4 + 2KMnO4 + 8H2SO4→ K2SO4+ 2MnSO4 + 5Fe2(SO4)3 + 8 H2O
Biết được lượng KMnO4(1/30N) dùng để chuẩn độ lượng đồng tạo thành, dựa
vào bảng tỷ lệ trực tiếp giữa lượng KMnO4 (1/30N) và đường khử bằng thực nghiệm,
tính được đường trong dung dịch thí nghiệm.
- Hóa chất
+ Dung dịch fehling A: CuSO4.5H2O 4%
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
74
+ Dung dịch fehling B: cân 200g muối Seignett và 150g NaOH hịa tan trong
nước và chuyển vào bình định mức 1 lít rồi thêm nước cất đến vạch mức, lắc đều.
+ Dung dịch Fe2(SO4)3 trong axit sunfuric: hòa tan 50g Fe2(SO4)3trong 400ml
H2O, thêm từ từ và thận trọng 100ml H2SO4 đậm dặc, để nguội và thêm nước cất đến
1000ml.
+ KMnO4 1/30N: cân 1,06g KMnO4 trong 1 lít nước cất, đun nóng đến tan.
- Cách tiến hành:
+ Lấy 10ml dung dịch thí nghiệm có chứa khoảng 0,8 - 40mg đường cho vào
bình nón dung tích 100ml.
+ Thêm vào 10ml dung dịch fehling (5ml fehling A + 5ml fehling B)
+ Đun sôi hỗn hợp 3 phút
+ Để lắng kết tủa, lọc vào bình lọc chân khơng Buchner (phễu lọc xốp chun
dùng để định lượng đường).
+ Rửa bình và phễu lọc bằng nước cất nóng 3 - 4 lần. cần chú ý sao cho giữ
phần lớn kết tủa đồng (I) oxit trên phễu cũng như ở bình nón ln được phủ bởi một
lớp nước nóng, tránh cho Cu2O khỏi bị oxy hóa bởi khơng khí.
+ Hịa tan kết tủa đồng (I) oxit vào bình Buchner bằng cách cho những lượng
nhỏ (5ml) dung dịch Fe2(SO4)3 trong môi trường H2SO4 và dùng đũa thủy tinh khuấy
thật cẩn thận để hịa tan hồn tồn kết tủa đồng oxit trên phễu.
+ Tráng cẩn thận bình và phễu lọc bằng nước cất nóng, cho vào bình nón.
+ Chuẩn độ dung dịch thu được bằng KMnO4 1/30N cho đến khi xuất hiện màu
hồng nhạt bền trong khoảng 20 - 30 giây.
+ Tính lượng KMnO4 chuẩn độ, tra bảng suy ra lượng đường có trong mẫu thí
nghiệm. Song song làm thí nghiệm đối chứng bằng cách thay dung dịch đường bằng
nước cất.
- Tính kết quả:
X=
𝑎 × V × 100
𝑉1 × 𝑤 × 1000
Trong đó:
X: Hàm lượng đường khử tính theo %
a: Số mg glucose tìm được khi tra bảng ứng với ml KMnO4 1/30N dùng để
chuẩn độ mẫu thí nghiệm trừ đi số ml KMnO4 1/30N chuẩn độ ở mẫu đối chứng.
V: Dung tích bình định mức
V1: Lượng dung dịch lấy để xác định đường khử (ml)
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
75
w: Lượng mẫu thí nghiệm (g)
100: Hệ số tính chuyển thành %
1000: Hệ số đổi gam thành mg
3.4. Xác định hàm lượng Nitơ formol.
- Nguyên tắc
Axit amin hòa tan trong nước có tính chất muối nội phân tử, các nhóm amin và
cacboxyl trung hịa lẫn nhau. Nhóm –COO- của axit amin bị cản trở bởi các nhóm
amin nên khơng thể chuẩn độ trực tiếp được. Trong fomandehyt, các nhóm amin của
axit amin phản ứng với nhóm andehyt cho metylen, kết quả của phản ứng là nhóm
amin mất tính chất cơ bản của nó, ngược lại nhóm cacboxyl trong axit amin tồn tại
dạng metylen khơng bị cản trở và có thể chuẩn độ được.
Số nhóm cacboxyl tự do bằng số nhóm amin liên kết với fomandehyt, khi chuẩn
độ nhóm cacboxyl thì xác định được nhóm amin. Vì vậy cho phép định lượng được
axit amin có trong dung dịch nghiên cứu.
- Hóa chất
+ Dung dịch NaOH 0,1N
+ Dung dịch fomandehyt trung hòa: lấy 50ml fomandehyt 30% cho 0,1ml
phenolphtalein 1% và chỉnh bằng NaOH 0,1N đến khi có màu hồng nhạt.
+ Dung dịch phenolphtalein 1%.
- Cách tiến hành
+ Cho vào bình nón 20ml dung dịch chứa axit amin và 0,5ml dung dịch
phenolphtalein 1%.
+ Để trung hòa dung dịch axit amin, cho từng giọt NaOH 0,1N đến khi xuất
hiện màu vàng nhạt.
+ Cho thêm 20 ml dung dịch fomandehyt 30% đã trung hòa và lắc đều bình
nón. Sau 5 phút, dung dịch mất màu.
+ Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu vàng nhạt trở lại. Thí
nghiệm kiểm tra cũng được tiến hành tương tự với các hóa chất trên nhưng thay dung
dịch axit amin bằng nước cất cùng thể tích.
+ Tính kết quả:
1ml dung dịch NaOH tương đương 1,4mg nitơ. Số mg nito amin của dung dịch
nghiên cứu được tính theo cơng thức:
mgN = (A – B) × 1,4
trong đó: A- Số ml NaOH 0,1 N dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm
B- Số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ bình kiểm tra.
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
76
3.5. Phương pháp xác định hàm lượng NH3
- Chuẩn bị mẫu thử, cân chính xác 50g BĐN cho vào bình tam giác 100 ml.
Dùng nước cất để hòa tan mẫu và chuyển tồn bộ (cả nước tráng cốc) vào bình định
mức 250 ml, sau đó cho thêm nước cất cho đúng 250 ml. Tiến hành lắc đều sau đó
đem đi lọc.
- Dùng pipet hút chính xác 50ml dịch lọc vào bình Kejldahl, thêm tiếp 20ml
nước cất, 5 giọt phenolphatalein 1% và cho dung dịch magie oxyt 5% cho đến khi
trong bình xuất hiện màu hồng
- Đặt bình Kejldahl có chứa mẫu xử lý vào vị trí bên trái của hệ thống chưng cất
đạm, đặt bình hứng chứa 20ml dung dịch acid sunfuric 0,1N vào vị trí bên phải hệ
thống chưng cất.
- Bật hệ thống chưng cất để hệ thống chân cất sục vào bình, q trình chưng cất
bắt đầu, khí bay lên được ngưng tụ chảy vào bình hứng.
- Khi chưng cất được khoảng 10p, dùng giấy đo pH thử dịch chảy ra ở đầu ống
ngưng. Nếu giấy khơng có màu xanh nghĩa là quá trình chưng cất kết thúc. Lấy bình
hứng ra và chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N cho đến khi dung dịch có màu xanh
lá mạ
- Tiến hành xác định mẫu trắng với các lượng hóa chất, nước cất với các bước
tiến hành tương tự.
PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
