Nghiên cứu chế biến thực phẩm ăn liền từ bã đậu nành (okara) bằng phương pháp vi sinh

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐOÀN TP. HỒ CHÍ MINH


CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KH-CN TRẺ


BÁO CÁO NGHIỆM THU
(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu ngày tháng năm 2010)



N
N
G
G
H
H
I
I
Ê
Ê
N
N


C
C
Ứ
Ứ
U
U

C
C
H
H
Ế
Ế


B
B
I
I
Ế
Ế
N
N


T
T
H
H
Ự
Ự
C
C

P
P
H
H
Ẩ
Ẩ
M
M


Ă
Ă
N
N


L
L
I
I
Ề
Ề
N
N


T
T
Ừ
Ừ

B
B
Ã
Ã


Đ
Đ
Ậ
Ậ
U
U


N
N
À
À
N
N
H
H


(
(
O
O

K
K
A
A
R
R
A
A
)
)


B
B
Ằ
Ằ
N
N
G
G




P
P
H
H
Ư
Ư

Ơ
Ơ
N
N
G
G


P
P
H
H
Á
Á
P
P


V
V
I
I


S
S
I
I
N
N

H
H



CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: VÕ THANH TRANG
CƠ QUAN CHỦ TRÌ: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ




















THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 1/ 2010
LỜI CẢM ƠN

Xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến
Thầy, TS Lê Chiến Phương, người đã gợi mở đề tài, tận tình
hướng dẫn và cung cấp nhiều kiến thức thực nghiệm quý báu cũng như
tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành đề tài này.
Chân thành cảm ơn bạn Phan Văn Dân và các em sinh viên thực
tập tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực phẩm thuộc phòng
Công nghệ biến đổi sinh học đã hỗ trợ tôi hoàn thành đề tài này.

Xin chân thành cảùm ơn quý thầy cô, anh chò, các bạn đồng
nghiệp công tác tại Viện Sinh học Nhiệt đới TP.HCM đãõ nhiệt tình
giúp đỡ tôi trong quá trình công tác và hoàn thành đề tài.



I
TÓM TẮT ĐỀ TÀI
Ðậu nành và các sản phẩm chế biến từ nó, rất giàu protein, lipid, carbohydrat,
và các hoạt chất sinh học quý như polyphenols, lecithin, saponin, phytoestrogen
(isoflavonoids, lignans, isoflavones, coumestans …) có tính năng đa dạng bảo vệ cơ
thể phòng, chống nhiều bệnh hiểm nghèo. Protein đậu nành còn có tác dụng hữu hiệu
giảm cholesterol trong máu, giảm thiểu nguy cơ các bệnh liên quan đến tim mạch,
phòng ngừa ung thư vú, bệnh thận, bệnh tiểu đường, bệnh xốp xương, và các triệu
chứng rối lo
ạn tiền mãn kinh ở phụ nữ… Chất xơ (xơ tan) của đậu nành còn được cho
là có tác dụng hấp thu chất béo ở dạ dày, ức chế sản xuất cholesterol ở gan và làm
giảm cholesterol máu, làm chậm tốc độ hấp thu đường từ ruột. Tận dụng và xử lý chất
xơ của đậu nành thành dạng dễ sử dụng và làm cho sản phẩm thực phẩm có đặc điểm
cảm quan tố
t là vấn đề cần thiết. Trong khi đó, ở Việt Nam, ngành công nghiệp chế
biến sữa đậu nành hàng năm thải ra lượng xác bã (okara) rất lớn. Mặc dù lượng xác bã

này còn chứa nhiều chất dinh dưỡng nhưng khó làm thực phẩm cho người do có lượng
lớn chất khó ăn như cellulose… Vì vậy, việc tìm ra một phương pháp khả dĩ có thể tận
dụng được phế phẩm này để phục vụ lại con ng
ười là rất quan trọng. Một trong những
giải pháp đó là sử dụng enzyme vi sinh vật và sinh khối nấm sợi Linh chi. Các chất
dinh dưỡng và hoạt chất sinh học của sinh khối nấm sợi cũng phong phú và có thể so
sánh với tai nấm về thành phần và hàm lượng. Hỗn hợp các chủng vi sinh vật, có tác
dụng hỗ trợ tiêu hóa (probiotic) (B.subtilis, vi khuẩn lactic) và có dược tính (nấm sợi
Linh chi)… được sử dụng để chế biến các s
ản phẩm từ đậu nành có tác dụng tốt cho
sức khỏe, trong việc chế biến và sản xuất các sản phẩm thực phẩm chức năng.
Abstract: Soybean and its products, rich in protein, lipid, carbohydrate and
many precious biological active substances such as polyphenols, lecithin, saponin,
phytoestrogen (isoflavonoids, lignans, isoflavones, coumestans …), can save our
health from a lot of serious diseases. Soy protein also may reduce cholesterol and the
risk of heart disease, prevent cancers of the breast, kidney diseases, diabetes, porous
bone diseases, and some pre-menopausal disorders in women… Soy fibers (dietary
fibers) are considered as an agent for absorbing fat in stomach, inhibiting cholesterol
production in liver, slowering suger absorption. Taking adventage and treatment the
fiber of soybean into the easy taken and good organoleptic food are necessary
problems. Meanwhile, in Vietnam, the annual residue of the soymilk processing
industry is numerous. Although that by-product contains a high nutritional component,
it can not be used as a human food because of indigestable substances such as
cellulose…Consequently, an important method which can utilise this residue as a food
supply is using microorganisms’ enzymes such as Linhzhi (G.lucidum) hyphae. The
hyphae’s nutritions and biological substances are equivalent to the mushroom’s. A
complex of microorganisms which has digestive support effect (probiotic) (B.subtilis,
latic acid bacteria) and pharmacological properties (Ganoderma lucidum)… is used to
produced many soy food and funtional food.

II
MỤC LỤC
Trang
Tóm tắt đề tài/dự án………………………………………………………… …I
Mục lục…………………………………………………………………………II
Danh sách các chữ viết tắt…………………………………………………….V
Danh sách bảng………………………………… …………………………… .VI
Danh sách hình………………………………………………………………VII
Danh sách đồ thị…………………………………………………………….VIII
Phần mở đầu………………………………………………………………… …1
Báo cáo nghiệm thu…………………………………………………………….2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………………………………… 4
1.1. Okara…………………………………………………………………………… 4
1.2. Các tác nhân hóa học và sinh học……………………………………………….5
1.2.1. Chitosan………………………………………………………………… …5
1.2.2. Muối kiềm và muối polyphosphate………………………………………….6
1.2.3. Butyl hydroxy toluen (BHT) ……………………………………………… 6
1.2.4. Enzyme cellulase…………………………………………………………….6
1.3. Chất xơ……………………………………………………………………………6
1.3.1. Định nghĩa………………………………………………………………… 6

1.3.2. Công dụng của chất xơ………………………………………………………7
1.4. Các giống vi sinh vật sử dụng……………………………………………………8
1.4.1. Bacillus subtilis……………………………………………………………….8
1.4.1.1. Giới thiệu ………………………………………………………………8
1.4.1.2. Hệ enzyme của Bacillus subtilis……………………………………… 8
1.4.1.3. Công dụng của B. subtilis………………………………………………9
1.4.2. Lactobacillus……………………………………………………………… 9

1.4.2.1. Giới thiệu……………………………………………………………….9
1.4.2.2. Ứng dụng……………………………………………………………. .10
1.4.3. Nấm Linh chi……………………………………………………………….10
1.4.3.1. Đặc tính sinh học…………………………………………………… 10

1.4.3.2. Dược tính của nấm Linh chi………………………………………… 11
1.4.3.3. Công dụng của nấm Linh chi…………………………………………12
1.5. Ý nghĩa và tính mới về khoa học và thực tiễn…………………………………12
CHƯƠNG 2: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU……………………………………… 15
2.1. Vật liệu………………………………………………………………………… 15
2.2. Phương pháp nghiên cứu ………………………………………………………15
2.2.1. Nội dung 1. Nghiên cứu hình thái, các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi sinh
vật sử dụng……………………………………………………………… 15

III
2.2.1.1. Nghiên cứu hình thái, các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Lactobacillus
sp. ……………………………………………………………… 15
2.2.1.2 . Nghiên cứu hình thái, các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Bacillus
subtilis……………………………………………………………… 16
2.2.1.3. Nghiên cứu hình thái, các hoạt chất sinh học của nấm sợi Linh
chi…………………………………………………………………… 17
2.2.2. Nội dung 2. Phương pháp xác định hoạt tính hệ enzyme của các vi sinh vật
sử dụng theo thời gian……………………………………………………………… 19
2.2.2.1. Enzyme amylase của B.subtilis……………………………………… 19

2.2.2.2. Enzyme protease của B.subtilis……………………………………….20

2.2.2.3. Enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase) của nấm sợi Linh
chi…………………………………………………… ………………… 21

2.2.3. Nội dung 3. Quy trình kỹ thuật chế biến sản phẩm………………… 23
2.2.4. Nội dung 4. Phân tích chỉ tiêu dinh dưỡng sản phẩm………………… 24
2.2.4.1. Xác định độ ẩm……………… ……………… 24


2.2.4.2. Xác định hàm lượng N
tổng số
bằng phương pháp Kjeldahl……………24


2.2.4.3. Xác định hàm lượng N
amoniac
…………………………… ………… 26


2.2.4.4. Xác định hàm lượng N
formol
……………………… … 27

2.2.4.5. Xác định hàm lượng đường tổng …………………………… …… 28


2.2.4.6. Xác định hàm lượng đường khử…………………………… ……….29


2.2.4.7. Xác định hàm lượng lipid …………………………………… …… 29

2.2.4.8. Xác định chỉ số peroxide………………………………………… …30
2.2.4.9. Xác định hàm lượng cellulose………………………………… ……30
2.2.5. Nội dung 5. Đánh giá cảm quan sản phẩm………………………… 31

2.2.6. Nội dung 6. Phân tích chỉ tiêu tổng VSV gây bệnh 33
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………………………… 34
3.1. Nội dung 1. Kết quả nghiên cứu hình thái, đặc điểm sinh lý sinh hóa của vi
sinh vật sử dụng………………………… 34
3.1.1. Lactobacillus sp. ………………………… 34
3.1.1.1. Đặc điểm hình thái………………………… 34
3.1.1.2. Đặc điểm sinh lý………………………… 34
3.1.1.3. Đặc điểm sinh hóa………………………… 35
3.1.2. Bacillus subtilis………………………… 36
3.1.2.1. Đặc điểm hình thái………………………… 36
3.1.2.2. Đặc điểm sinh lý………………………… 36
3.1.2.3. Đặc điểm sinh hóa
………………………… 37
3.1.3. Nấm Linh chi………………………… 37
3.1.3.1. Hình thái………………………… 38
3.1.3.2. Định tính các chất có hoạt tính sinh học 38
3.1.3.3. Ảnh hưởng của nấm Linh chi đến sự phát triển của
B.subtils
……………… ………… 39
3.2. Nội dung 2. Kết quả định lượng hệ enzyme của các vi sinh vật 40
3.2.1. Hoạt tính enzyme amylase của B.subtilis theo thời gian 40
3.2.1. Hoạt tính enzyme protease của B.subtilis theo thời gian 39
3.2.3. Hoạt tính enzyme cellulase của nấm Linh chi theo thời gian 40
3.3. Nội dung 3. Chế biến sản phẩm 41

IV
3.3.1. Xử lý nguyên liệu 41
3.3.1.1. Thí nghiệm 3.1: xay mịn okara 41
3.3.1.2. Thí nghiệm 3.2: xác định độ ẩm của nguyên liệu 42
3.3.1.3. Thí nghiệm 3.3: khả năng biến tính nguyên liệu của một số tác nhân 42

3.3.2. Kết quả khảo sát tỉ lệ enzyme celluclast sử dụng………………………….43
3.3.3. Xử lý với vi sinh vật……………………………………………………… 44
3.3.3.1. Thí nghiệm 3.4: kết quả khảo sát tỉ lệ giống B.subtilis……………….44
3.3.3.2. Thí nghiệm 3.5: kết quả khảo sát tỉ lệ
giống Lactobacillus sp……… 44
3.3.3.3. Thí nghiệm 3.6: kết quả khảo sát thời gian tạo vỏ bọc cho sản phẩm
phomai từ sinh khối nấm sợi Linh Chi……………………………………… 44
3.3.3.4. Kết quả chế biến sản phẩm từ okara………………………………….45
3.4. Nội dung 4. Phân tích các chỉ tiêu dinh dưỡng của sản phẩm……………… 45
3.4.1. Độ ẩm (%)………………………………………………………………… 46
3.4.2. Hàm lượng N
TS
(%)……………………………………………………… 46
3.4.3. Hàm lượng N
formol
(%)…………………………………………………… 47
3.4.4. Hàm lượng N
amoniac
(%)…………………………………………………….47
3.4.5. Hàm lượng đường tổng (%)……………………………………………… 48
3.4.6. Hàm lượng đường khử (%)…………………………………………………48
3.4.7. Hàm lượng lipid (%)……………………………………………………… 49
3.4.8. Chỉ số peroxide…………………………………………………………… 49
3.4.9. Hàm lượng cellulose……………………………………………………… 49
3.5. Nội dung 5. Đánh giá cảm quan sản phẩm…………………………………….50
3.6. Nội dung 6. Phân tích chỉ tiêu vi sinh vật…………………………………… 50
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ…………………………………………….51
4.1. Kết luận……………………………………………………………………… 51
4.2. Đề nghị………………………………………………………………………… 51
PHỤ LỤC…………………………………………………………………………….53

TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………… 61




V
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG VIẾT
VK Vi khuẩn
VSV Vi sinh vật
HCSH Hoạt chất sinh học
ADI
Acceptable daily intake
Liều dùng hàng ngày chấp nhận được
CBTP Chế biến thực phẩm
SP Sản phẩm
FDA
Food and Drugs Administration
Tổ chức thuốc và thực phẩm
BHT Butyl hydroxy toluen


VI
DANH SÁCH BẢNG
SỐ TÊN BẢNG SỐ LIỆU TRANG
1.1. Thành phần hoạt chất cơ bản trong nấm Linh chi 11
2.1.
Bảng bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát
triển của B.subtilis
17

2.2. Bố trí thí nghiệm định lượng enzyme amylase 19
2.3. Đường glucose chuẩn 21
2.4 Bảng cơ sở đánh giá sản phẩm theo TCVN 3215 – 79 31
2.5 Bảng quy định các cấp chất lượng theo TCVN 3215 – 79 32
2.6. Bảng mô tả thang điểm cho các tiêu chuẩn của sản phẩm 1 33
2.7. Bảng mô tả thang điểm cho các tiêu chuẩn của sản phẩm 2 33
3.1.
Sự biến đổi số lượng tế bào B.subtilis theo điều kiện nuôi và
thời gian
35
3.2. Kết quả khảo sát tỉ lệ trương nước của okara (bột okara:nước) 42
3.3. Khả năng biến tính bã okara bằng muối kiềm 42
3.4. Khả năng biến tính bã okara bằng muối polyphosphate 42
3.5. Kết quả khảo sát tỉ lệ enzyme celluclast 43
3.6. Kết quả khảo sát tỉ lệ giống B.subtilis 44
3.7.
Kết quả khảo sát thời gian tạo vỏ bọc cho sản phẩm phomai
(100g) từ sinh khối nấm sợi Linh chi
44
3.8. Cảm quan sản phẩm từ okara 45
3.9 Sự biến đổi hàm lượng cellulose 49
3.10 Bảng hệ số quan trọng 50
3.11 Bảng điểm tổng hợp kết quả kiểm nghiệm cảm quan 50




VII
DANH SÁCH HÌNH
SỐ TÊN HÌNH ẢNH TRANG

3.1. Khuẩn lạc Lactobacillus sp. 34
3.2. Tế bào Lactobacillus sp. 34
3.3. Khả năng làm đông tụ sữa của Lactobacillus sp. 34
3.4. Kết quả định tính acid lactic 34
3.5. Thử nghiệm catalase 35
3.6. Thử nghiệm oxidase 35
3.7. Thử nghiệm nitratase 35
3.8. Thử nghiệm khả năng lên men glucose 35
3.9. Khuẩn lạc B.subtilis 36
3.10. Tế bào B.subtilis 36
3.11. Thử nghiệm catalase 37
3.12. Thử nghiệm nitratase 37
3.13. Phản ứng thủy phân tinh bột 38
3.14. Phản ứng thủy phân casein 38
3.15. Hình thái nấm sợi Linh chi 38
3.16. Định tính saponin - phản ứng Liebermann-Burchard 38
3.17. Định tính alkaloid 39
3.18. Định tính steroid - phản ứng Salkowki 39
3.19. Vòng phân giải CMC 39
3.20. Vòng kháng vi khuẩn B.subtilis của nấm Linh chi 39
3.21. Bột okara trước khi xay 41
3.22. Bột okara xay khô có bổ sung BHT 41
3.23. Bột okara xay ướt có bổ sung BHT 41
3.24. Bột okara xay ướt không bổ sung BHT 41
3.25. Sản phẩm 1 - phomai nấu 45
3.26. Sản phẩm 2 – phomai Linh chi 45


VIII
DANH SÁCH ĐỒ THỊ, BIỂU ĐỒ

SỐ TÊN ĐỒ THỊ, BIỂU ĐỒ TRANG
3.1.
Đường biểu diễn sự biến đổi số lượng tế bào B.subtilis theo thời
gian ở pH 2
36
3.2.
đường biểu diễn sự biến đổi số lượng tế bào B.subtilis theo thời
gian ở pH 7
37
3.3.
Sự biến thiên hoạt tính enzyme amylase của B.subtilis
theo thời gian
40
3.4.
Sự biến thiên hoạt tính enzyme protease của B.subtilis
theo thời gian
40
3.5.
Đường biến thiên hoạt tính enzyme cellulase của nấm sợi Linh
chi theo thời gian
41
3.6. Sự biến đổi độ ẩm theo thời gian 46
3.7. Sự biến đổi hàm lượng N
TS
của sản phẩm theo thời gian 46
3.8. Sự biến đổi hàm lượng N
formol
của sản phẩm theo thời 47
3.9. Sự biến đổi hàm lượng N
amoniac

của sản phẩm theo thời gian 47
3.10. Sự biến đổi hàm lượng đường tổng của sản phẩm theo thời gian 48
3.11. Sự biến đổi hàm lượng đường khử của sản phẩm theo thời gian 48
3.12. Sự biến đổi hàm lượng lipid của sản phẩm theo thời gian 49
3.13. Sự biến đổi chỉ số peroxide của sản phẩm theo thời gian 49




1
MỞ ĐẦU

Bã đậu nành (okara) là phần bã và các chất dinh dưỡng khác không tan trong
nước, còn lại sau khi đã tách khỏi dịch các chất tan hoặc huyền phù trong nước của
công nghiệp sản xuất sữa đậu nành hay đậu hũ, chứa một lượng lớn protein,
carbohydrate, lipid, có cả calci, sắt, riboflavin. Tuy nhiên, trong việc xử lý okara để bổ
sung vào thực phẩm hay để chế biến thực phẩm từ okara thường gặp một số khó khăn
như thành phần protein trong okara rất cao (t
ừ 30-40%), chủ yếu là protein không tan
nên tạo cảm giác khó chịu về cơ học khi nhai và làm khó ăn. Hàm lượng xơ chủ yếu là
xơ không tan với thành phần chính là xơ tinh thể trong bã đậu nành khá cao tạo cảm
giác nhám, cứng do đó khó nuốt khi ăn. Vì vậy để dễ chế biến thực phẩm từ okara phải
giảm lượng xơ không tan, thủy phân protein thành dạng dễ tan, tăng tỷ lệ peptide và
đường khử.
Bên cạnh đó sinh kh
ối của một số loại VSV được dùng để xử lý okara (tơ nấm
Linh chi, B.subtilis, vi khuẩn lactic) có khả năng sinh tổng hợp các enzyme
peroxydase (hoặc catalase), polyphenoloxydase… có thể làm giảm lượng và hoạt tính
của các chất oxy hóa ở nơi chúng tồn tại. Mặt khác có thể cũng vì lý do này nên ở
phần ruột già các VSV yếm khí phân hủy xơ có thêm điều kiện để hoạt động mạnh hơn

do đó xơ được phân hủy nhi
ều hơn, tạo thêm dinh dưỡng cho cơ thể. Trong trường hợp
này xơ và các enzyme chống oxy hóa đóng vai trò prebiotic (tạo điều kiện phù hợp cho
các VSV có sẵn trong đường ruột hoạt động mạnh hơn). Các loại VSV này và các
HCSH do chúng tạo ra đóng vai trò probiotic vì bản thân sinh khối của chúng làm tăng
số lượng quần thể VSV có lợi cho cơ thể và ức chế VSV có hại nhờ khả năng cạnh
tranh thức ăn hay tạo yếu t
ố bất lợi (như tạo pH chua) đối với VSV có hại.
Trong các trường hợp trên, các sản phẩm đã được chế biến từ okara chủ yếu bằng
phương pháp sinh học có được vai trò chức năng là synbiotic (do prebiotic kết hợp với
probiotic). Đây là những đặc điểm mà ngành chế biến thực phẩm chức năng rất quan
tâm.


2
BÁO CÁO NGHIỆM THU

Tên đề tài: Nghiên cứu chế biến thực phẩm ăn liền từ bã đậu nành (okara) bằng
phương pháp vi sinh.
Chủ nhiệm đề tài: Võ Thanh Trang
Cơ quan công tác: Viện Sinh học Nhiệt đới
Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học – Công nghệ trẻ
Thời gian thực hiện đề tài: 12 tháng
Kinh phí được duyệt: 80.000.000đ (tám mươi triệu đồng)
Kinh phí đã cấp: theo TB số : /TB-SKHCN ngày / /
Mục tiêu:
+ Góp phần đưa đậu nành ra khỏi v
ị trí có sức cạnh tranh yếu trong nền kinh tế
quốc dân.
+ Phát huy vai trò của các phương pháp vi sinh kết hợp với các phương pháp

khác (cơ học và hóa học) trong chế biến các loại thực phẩm mới từ các phụ phế liệu
của công nghiệp chế biến thực phẩm từ đậu nành.
Nội dung:
+ Giải quyết hiện tượng oxy hoá trong quá trình xử lý okara để chế biến thực
phẩm. Chọn các đi
ều kiện thích hợp nhất để chống oxy hóa cho sản phẩm được chế
biến từ okara.
+ Thủy phân okara bằng các enzyme thương phẩm.
+ Thủy phân okara bằng sinh khối B.subtilis (nguyên liệu được dùng là mẫu sau
khi được thủy phân bằng enzyme thương phẩm).
+ Biến tính toàn diện okara
Okara sau khi được xử lý cơ học và được thủy phân bằng enzyme cellulase
thương phẩm (celluclast), được dùng để chế biến thực phẩm bằng phương pháp vi
sinh.
+ Nghiên cứu các giống VSV dùng để chế biến thực phẩm từ okara bằng
phương pháp vi sinh (Lactobacillus sp., B.subtilis, Ganoderma lucidum.) về đặc điểm
hình thái và khả năng sinh tổng hợp các hoạt chất sinh học.
+ Chế biến 2 sản phẩm từ okara đã được biến tính toàn diện bằng phương pháp
lên men VSV có bổ sung gia vị.
+ Phân tích các chỉ tiêu hoá sinh của nguyên liệu và của sản phẩm
+ Phân tích ATVSTP của sản phẩm (định lượng VSV có hạ
i tạp nhiễm)
+ Nghiên cứu thời gian bảo quản và hiện tượng thoái hóa chất lượng sản phẩm.
+ Đánh giá cảm quan sản phẩm
+ Xác lập các tiêu chuẩn chính của sản phẩm

3
Công việc dự kiến Công việc đã thực hiện
- Xử lý cơ học okara bằng máy xay chà
2 mặt đá
+ Xay khô
+ Xay ướt
(có và không có bổ sung BHT)
- Xử lý sinh học nguyên liệu okara
+ Với enzyme celluclast
+ Với B.subtilis
- Xử lý hóa học okara
+ Với muối kiềm
+ Với CaO
+ Với muối polyphosphate
+ Với chitosan
- Nghiên cứu vi sinh
+ Vi khuẩn lactic và propionic
+ Vi khuẩn subtilis
+ Nấm sợi G.lucidum
+ Định tính và định lượng các HCSH
được sinh tổng hợp
+ Acid hữu cơ (a.lactic của VK lactic)
+ Các enzyme protease và amylase của
B.subtilis.
+ Hệ enzyme cellulase c
ủa G.lucidum,
+ Enzyme peroxydase (hay catalase)
của tất cả các giống được dùng để

nghiên cứu
+ Chọn giống nấm sợi phù hợp nhất để
dùng làm vỏ bọc sinh học cho sản phẩm
- Chế biến 2 sản phẩm từ okara
+ Sản phẩm “phomai” nấu
+ Sản phẩm “phomai” có vỏ bọc sinh
học
- Nghiên cứu thời gian bảo quản sản
phẩm
- Phân tích sinh hóa (đạm, đường,
béo…)
- Đánh giá cảm quan s
ản phẩm
- Kiểm nghiệm vi sinh vật gây bệnh
- Xử lý cơ học okara bằng máy xay chà
2 mặt đá
+ Xay khô
+ Xay ướt
(có và không có bổ sung BHT)
- Xử lý sinh học nguyên liệu okara
+ Với enzyme celluclast
+ Với B.subtilis
- Xử lý hóa học okara
+ Với muối kiềm
+ Với CaO
+ Với muối polyphosphate
+ Với chitosan
- Nghiên cứu vi sinh
+ Vi khuẩn lactic Lactobacillus
+ Vi khuẩn B.subtilis

+ Nấm sợi Linh chi G.lucidum
+ Định tính và định lượng các HCSH
được sinh tổ
ng hợp
+ Acid hữu cơ (a.lactic của VK lactic)
+ Các enzym protease và amylase của
B.subtilis
+ Enzym cellulase của G.lucidum



+ Sử dụng nấm sợi Linh chi làm vỏ bọc
sinh học cho sản phẩm
- Chế biến 2 sản phẩm từ okara
+ Sản phẩm “phomai” nấu
+ Sản phẩm “phomai” có vỏ bọc sinh
học
- Nghiên cứu thời gian bảo quản sản
phẩm
- Phân tích sinh hóa (đạm, đường,
béo…)
- Đánh giá cảm quan sản phẩm
- Kiể
m nghiệm vi sinh vật gây bệnh




4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Okara
Bã đậu nành (tên tiếng Nhật là okara và “okara” đã trở thành thuật ngữ quốc tế
để gọi bã đậu nành) còn gọi là “soy-pulp” (sẽ gọi tắt là okara) là phần bã và các chất
dinh dưỡng khác không tan trong nước còn lại sau khi đã tách khỏi dịch các chất tan
hoặc huyền phù trong nước của công nghiệp sản xuất sữa đậu nành hay đậu hũ. Okara
là thứ bã màu trắng hay trắng ngà, thường nằm trên mặt lưới lọc sữa đậu nành, sau khi
sấy khô có màu vàng
|8
| Nhiều người không nhận ra rằng phần bã này là một sản phẩm
giàu dinh dưỡng, rất giàu xơ tan và xơ không tan, cũng như chứa một lượng lớn
protein, lipid…
|
27|

Thành phần dinh dưỡng của okara (tính theo 100g):
|
27|

Năng lượng: 77kcal, protein: 3.22g, béo tổng số: 1.73g, béo bão hòa: 0.193g,
béo 1 nối đôi: 0.295g, béo nhiều nối đôi: 0.755g, tro: 0.88g, carbohydrate: 12.54g, Ca:
80mg, Fe: 1.30mg, Mg: 26mg, P: 60mg, K: 213mg, Na: 9mg, Zn: 0.56mg, Cu: 0.2mg,
Mn: 0.4mg, Se: 10.6mcg, Thiamin: 0.02mg, Riboflavin: 0.02mg, Niacin: 0.1mg,
Pantothenic acid: 0.088mg, Vitamin B6: 0.115mg.
Okara tươi, mới có thể được dùng ngay hay có thể giữ 2-3 ngày trong tủ lạnh
hoặc hơn 4-5 tháng nếu đông lạnh.
Tuy nhiên, phần lớn thợ làm đậu hũ ở Nhật thường bỏ okara hoặc thải cho trại
nuôi heo. Ở Thụy Sĩ, okara được dùng nuôi bò.
|8|
Bột okara khô có giá trị ở Nhật, Châu Á nhờ lợi ích về dinh dưỡng của nó.
Okara tươi hoặc khô được dùng để chế bíên nhiều loại thức ăn mềm, mịn với nước

hoặc sữa, nấu cháo với các nguyên liệu khác như bột bắp, lúa mạch hay làm salad,
bánh mì
|27
|

Theo các thông tin của công ty sữa Việt Nam (Vinamilk) cung cấp cho Viện Sinh
học Nhiệt đới thì ở nước ngoài, có khi giá của bột okara không thấp hơn nhiều so với
giá của đậu nành hạt do hàm lượng dinh dưỡng của nó khá cao. Còn ở nước ta tại cty
Sữa Việt Nam, nơi có công nghệ sản xuất sữa đậu nành tận thu bột okara hiện đại của
nước ngoài thì okara có thành phần như sau
|19

|
:
- Okara dạng ướt có hàm ẩm: 17.76%, xơ: 1.75%
- Okara dạng bột có hàm ẩm: 6.7%, béo: 10.59%, xơ: 1.99% và đạm: 36.43%

Cho tới thời điểm cuối năm 2006, lượng okara do Vinamilk sản xuất (có hàm
lượng đạm 39.5% và xơ thô 8.36%) trên dây chuyền thiết bị hiện đại của nước ngoài
(có công suất khoảng 10 tấn/giờ) mới chỉ dùng làm thức ăn thô cho chăn nuôi.
|7 |
Tại công ty Tribeco theo quy trình sản xuất sữa đậu nành lọc sữa 1 lần chỉ thu
được khoảng 50% protein của hạt đậu nành (ở nước ngoài lọc 2 lần sẽ thu được
khoảng 65 – 70%). Từ 1kg đậu nành thu được 1.5kg bã đậu nành ướt (sau ly tâm),
chứa khoảng 20% chất khô. Bã ướt là dạng phế liệu cuối cùng của công nghệ sản xuất
sữa đậu nành và hiện nay mới chỉ được sử dụng cho chăn nuôi.
|10|
Cho tới vài năm gần đây chỉ có một số ít công trình nghiên cứu về okara và tất
cả tập trung tại TP.Hồ Chí Minh. Vũ Văn Độ và CTV
|3|

nghiên cứu dùng nấm sợi của
các loại nấm lớn (Linh chi (Ganoderma lucidum), Bào ngư (Pleurotus florida)) xử lý
okara để chế biến bánh bistcuit, trà túi lọc
Lê Chiến Phương và CTV (2004)
|15|
xử lý okara bằng nấm mốc Mucor và vi
khuẩn lactic. Ngô Đại Nghiệp dùng Asp.oryzae chế biến okara thành tương xay
|14|
. Lại
Mai Hương và CTV dùng enzyme kết hợp với phương pháp cơ học xử lý cellulose

5
trong okara để sản xuất chế phẩm giàu chất xơ bổ sung vô một số thực phẩm
|8|
. Chưa
có sản phẩm nào trong số các sản phẩm nêu trên được triển khai sản xuất thử ở quy mô
công nghiệp.
Điều này cho thấy ở Việt Nam ngay cả nơi có sản xuất okara ở quy mô công
nghiệp, hiện đại như công ty sữa Việt Nam, loại phụ phế liệu đậu nành này vẫn chưa
được tận dụng có hiệu quả vào các mục đích khác ngoài thức ăn chăn nuôi.
1.2. Các tác nhân hóa học và sinh họ
c
Trong sản xuất chế biến thực phẩm, phụ gia có tác dụng làm tăng độ giòn, dai,
thơm, tươi, chống vi sinh vật tạp nhiễm khiến người ăn cảm thấy ngon hơn và bảo
quản được lâu hơn. Nhưng thời gian gần đây, do thiếu hiểu biết thậm chí cố ý, một số
nhà sản xuất đã dùng thái quá cả một số loại phụ gia trôi nổi trên thị trường không
được phép sử dụng trong chế biến thực phẩm như formol, hàn the… Những chất này
gây tác hại trước mắt và lâu dài đến sức khỏe người dùng
|13|
. Vì thế việc ứng dụng các

phụ gia như BHT, chitosan, polyphosphate… vừa có khả năng chống oxy hóa cho sản
phẩm, vừa đảm bảo độ giòn, dai và an toàn cho người sử dụng.
Vì thành phần protein trong okara rất cao (từ 30-40%), chủ yếu là protein không
tan (lượng protein tan hầu hết đã được dùng làm sữa đậu nành). Đây là thành phần
chính tạo nên giá trị của okara. Chính thành phần protein không tan này tạo cảm giác
khó chịu về cơ học khi nhai và làm khó ăn. Điều này cũng gây khó kh
ăn trong việc chế
biến không chỉ các thực phẩm từ okara mà cả những thực phẩm khô từ protein đậu
nành. Các tác nhân khác nhau đã được sử dụng để biến tính okara để sau khi sấy khô,
sản phẩm vẫn có thể trương nước thành mềm và dai trở lại, trong nhiều trường hợp các
đặc điểm cơ học đã được cải thiện tốt hơn nguyên liệu gốc. Các nhóm tác nhân đó là:
1.2.1. Chitosan
Chitosan là một aminopolysaccharide, có nguồn gốc từ chitin – được tách chiết
từ và biến tính từ vỏ các loài giáp xác như tôm, cua, …
|
28|


Chitosan là chất rắn, xốp nhẹ, màu trắng ngà, không mùi, không vị, hòa tan dễ
dàng trong các dung dịch acid loãng.
Chitosan không độc, dùng an toàn cho người, có tính hòa hợp sinh học cao với
cơ thể, có khả năng tự phân hủy sinh học. Chitosan có nhiều tác dụng sinh học đa dạng
như tính kháng nấm, kháng khuẩn, kích thích sự phát triển tăng sinh của tế bào, cầm
máu, chống sưng u… Ngoài ra, chitosan còn có tác dụng làm giảm cholesterol và lipid
máu, làm to vi động mạch và hạ huyết áp, điều trị bệnh thậ
n mãn tính, chống rối loạn
nội tiết.
Trong công nghệ thực phẩm, chitosan được dùng để bảo quản, đóng gói thức
ăn, bảo quản hoa quả tươi vì nó tạo màng sinh học không độc. Chitosan cũng được đưa
vào thành phần trong thức ăn như sữa chua, bánh kẹo, nước ngọt v.v… Nhật Bản đã có

6
những sản phẩm ăn kiêng có chứa chitosan để làm giảm cholesterol, giảm cân nặng,
chống béo phì (bánh mì, khoai tây chiên…). Năm 1983, FDA chấp nhận chitosan được
dùng làm chất phụ gia trong thực phẩm và dược phẩm.
1.2.2. Muối kiềm và muối polyphosphate
Muối polyphosphate rất tốt cho cơ thể người. Theo các nghiên cứu gần đây cho
thấy muối polyphosphate cũng có tác dụng tương tự như hàn the trong việc làm dai
thực phẩm nhưng không gây độc hại cho sức khỏe con ng
ười.
Muối kiềm tốt nhưng nếu sử dụng nhiếu sẽ làm cho sản phẩm có độ pH cao, tạo
vị oi nồng, gắt cho sản phẩm, không tốt về mặt cảm quan.
1.2.3. Butyl hydroxy toluen (BHT)
BHT là chất chống oxy hóa được Bộ Y tế cho phép sử dụng trong thực phẩm ở
mức ADI: 0-0,125
|21|
. BHT thường được bổ sung trong dầu mỡ (giới hạn tối đa cho
phép 75mg/kg), magarin (giới hạn tối đa 100mg/kg).
1.2.4. Enzyme cellulase
|11|
- Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật và chúng được thực vật tổng hợp
với số lượng nhiều nhất trong tự nhiên. Cellulose cũng là một trong những chất hữu cơ
có trong tự nhiên chỉ bị vi sinh vật phân giải. Thực hiện quá trình phân giải cellulose
trong điều kiện tự nhiên là các loại enzyme cellulase, được các nhà khoa học phân ra
làm ba nhóm chủ yếu:
• 1,4 β-D-glucan cellobiohydrolase (EC.3.2.1.91). Enzyme cắt đầu không khử
của chuỗi cellulose
để tạo thành cellobiose. Enzyme này còn có các tên khác
như: cellobiohydrolase, exoglucanase, exocellulase, cellobiosidase và
avicellase. Enzyme này không có khả năng phân giải cellulose dạng kết tinh mà

chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng, giúp cho enzyme endocellulase
phân giải chúng.
• 1,4 β-D-glucan 4 (EC.3.2.1.4). Enzyme này tham gia phân giải liên kết β-1,4
glucosid trong cellulose, trong lichenin và β-D-glucan. Sản phẩm của quá trình
phân giải là cellodextrin, cellobiose và glucose. Enzyme này còn có các tên
khác như: endoglucanase, endo 1,4 β-glucanase, C-cellulase
• β-D glucoside glucohydrolase (EC.3.2.1.21). Enzyme này phân hủy cellobiose
tạo thành glucose. Chúng không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy.
Chúng còn được gọi là cellobiase và β-glucosidase
- Enzyme thương phẩm celluclast
|30|
Celluclast được sử dụng nhằm thủy phân các nguyên liệu giàu xơ thành các loại
đường lên men được, khử tính nhớt của các cơ chất là cellulose tan, hoặc làm tăng
năng suất các sản phẩm có nguồn gốc thực vật.
Trong thực nghiệm, điều kiện tối ưu cho cho hoạt tính enzyme là: pH 4,5-6,0,
nhiệt độ 50-60
o
C. Thường được lưu giữ ở nhiệt độ 25
o
C, hoạt tính ổn định trong 3
tháng; ở nhiệt độ thấp hơn (5-10 °C), thời gian này có thể kéo dài hơn
1.3. Chất xơ
1.3.1. Định nghĩa
|23|
Xơ tổng: chất xơ gồm các phần còn lại của tế bào thực vật, các polysaccharide,
lignin và các chất liên quan chịu được sự thủy phân của các enzyme trong hệ tiêu hóa
người.
Tùy theo độ phân tán trong nước mà chất xơ được chia thành 2 loại là tan và
không tan. Tất cả các thức ăn có nguồn gốc từ thực vật đều có cả 2 loại chất xơ này.

7
Xơ không tan
|17, 23|
: loại xơ này chiếm khoảng 2/3 lượng xơ trong thực phẩm.
Chủ yếu là cellulose, ngoài ra còn có hemicellulose, lignin, cutin… Chất xơ không hòa
tan có đặc tính thẩm thấu nước trong ruột, trương lên tạo điều kiện cho chất bã thải dễ
thoát ra ngoài.
• Cellulose: là polysaccharide chủ yếu của thành tế bào thực vật, được cấu tạo bởi
các β-D glucose-pyranose, các thành phần này liên kết với nhau bởi liên kết
glycoside. Cellulose không tan trong nước (cả nước nóng và nước lạ
nh), tan trong
acid và kiềm. Khi đun sôi với acid sulfuric đậm đặc, cellulose sẽ chuyển thành
glucose còn khi thủy phân trong điều kiện nhẹ nhàng sẽ tạo nên disaccharide
cellobiose. Cellulose không có ý nghĩa về mặt dinh dưỡng của người vì không tiêu
hóa được ở ống tiêu hóa. Động vật nhai lại có thể tiêu hóa dễ dàng cellulose vì
trong ruột của chúng có chứa các vi khuẩn có khả năng tiết ra enzyme cellulase là
enzyme thủy phân cellulose.
• Hemicellulose: là nhóm polysaccharide không tan được trong nước, chỉ tan được
trong dung dịch kiềm. Hemicellulose cũng là thành phần c
ủa thành tế bào thực vật
và tồn tại chủ yếu ở các phần như vỏ hạt, bẹ ngô, cám, rơm rạ, trấu. Khi thủy phân
hemicellulose sẽ thu được các monosaccharide thuộc nhóm hexose (như manose,
galactose) và nhóm pentose (như arabinose, xilose). Trong thiên nhiên, loại
hemicellulose dễ gặp nhất là xylan. Xylan thường thấy nhiều trong rơm, rạ…
Xơ tan
|17,23|
: gồm pectin, β-glucan, galactose, mannan, gum… Chất xơ hòa tan
khi đi qua ruột sẽ tạo ra thể đông làm chậm quá trình hấp thu một số chất dinh dưỡng
vào máu, và cũng làm tăng độ xốp, mềm của bã thải tiêu hóa.
• Pectin: là polysaccharide có nhiều ở quả, củ hoặc thân cây. Trong thực vật, pectin

tồn tại dưới hai dạng: dạng protopectin không tan (tồn tại chủ yếu ở thành tế bào)
và dạng hòa tan của pectin (tồn tại
ở dịch tế bào). Dưới tác dụng của acid, enzyme
protopectinase hoặc khi đun sôi, protopectin chuyển sang dạng pectin hòa tan. Đặc
tính quan trọng của pectin là khi có mặt acid và đường, nó có khả năng tạo thành
chất gel, vì vậy nó được ứng dụng rộng rãi trong kỹ nghệ sản xuất mứt kẹo.
1.3.2. Công dụng của chất xơ
|23|

Vài năm trở lại đây, nhiều nghiên cứu đã đưa ra bằng chứng về những tác dụng
đáng kể của chất xơ trong việc phòng và chữa bệnh, ngoài một vài tác dụng đã biết đến
từ rất lâu. Tác dụng phòng và điều trị của chất xơ chủ yếu tập trung vào các chứng
bệnh mạn tính gắn với tuổi già.
- Phòng ngừa táo bón: do có đặc tính hút nước, ch
ất xơ không hòa tan trương
lên khi ở trong ruột, làm nở và mềm khối phân, kích thích thành ruột, tăng nhu động
ruột khiến việc đẩy phân ra ngoài dễ dàng hơn. Ngoài ra, chất xơ có tác dụng hấp phụ
các chất độc có trong hệ tiêu hóa, tăng khả năng miễn dịch của hệ thống này, tăng
cường hoạt động của hệ vi khuẩn đường ruột nên giảm được nguy cơ nhiễm trùng
đường tiêu hóa, nhất là bệ
nh tiêu chảy.
- Phòng ngừa bệnh ung thư: các chuyên gia về ung thư học của Mỹ đã khẳng
định rằng: chất xơ có tác dụng rất mạnh trong việc phòng ung thư đường tiêu hóa mà
đặc biệt là ung thư đại tràng. Nó làm tăng khả năng miễn dịch của hệ thống tiêu hóa,
khuyến khích hệ vi khuẩn hữu ích trong ruột phát triển. Chính hệ vi khuẩn này đã tác
động thường xuyên lên thành ruột, hạn chế sự phân chia bất th
ường của các tế bào,
kìm hãm sự phát sinh, phát triển các túi nang bất thường trên thành ruột. Hơn nữa, khi

8

ở trong ruột, chất xơ còn tạo môi trường có tính khử cao, chống lại các chất oxy hóa,
chất độc phát sinh trong quá trình chuyển hóa thức ăn ở đại tràng.
Chất xơ còn có tác dụng ngăn ngừa nguy cơ ung thư vú ở phụ nữ. Với những
phụ nữ có chế độ ăn nhiều chất xơ, ít chất béo và đạm thì nguy cơ ung thư vú có liên
quan đến oestrogen giảm đáng kể. Ở những trẻ em gái có chế
độ ăn như vậy, tuổi xuất
hiện kinh nguyệt cũng muộn hơn và vì thế sẽ ít bị ung thư vú hơn khi trưởng thành.
- Giảm mỡ máu: khi các chất xơ không hòa tan hút nước, chúng giữ luôn một
phần muối mật nên kích thích cơ thể tăng cường sản xuất muối mật để bù vào lượng
thiếu hụt, vì thế mà tăng sử dụng cholesterol. Lượng cholesterol tích lũy sẽ giảm
đi
kéo theo lượng cholesterol trong máu cũng giảm. Còn các chất xơ hòa tan tác động lên
quá trình chuyển hóa lipid nên giảm nguy cơ xơ vữa động mạch. Các chuyên gia
khuyên rằng những người bị tăng cholesterol máu nên tăng lượng chất xơ trong khẩu
phần hằng ngày.
- Phòng ngừa và điều trị tiểu đường: chất xơ làm hạn chế tăng đường huyết sau
khi ăn (nhất là các chất xơ hòa tan) do có khả năng tăng tính nhạy c
ảm của insulin. Nó
tham gia chuyển hóa triglycerid nên giúp kiểm soát nồng độ đường trong máu một
cách hiệu quả. Đường sẽ được giải phóng từ từ vào máu, duy trì được nồng độ
đường/máu một cách ổn định. Đây chính là mục đích của việc phòng ngừa và kiểm
soát bệnh tiểu đường.
- Chống béo phì: chất xơ không có giá trị dinh dưỡng nên chỉ tạo cảm giác no
mà không tăng lượng calo cho cơ thể. Vì thế, nó rất l
ợi cho những người bị béo phì.
Mặt khác, do chất xơ có thể hạn chế và kiểm soát lượng đường trong máu nên không
tạo ra tình trạng thừa đường để chuyển hóa thành mỡ dự trữ. Ngay trong quá trình tiêu
hóa thức ăn, cả chất xơ hòa tan và không hòa tan đều làm tăng tốc độ vận chuyển thức
ăn trong ruột, hạn chế được sự hấp thu các chất dinh dưỡng nên cũng hạn chế tăng cân.
- Điề

u trị sỏi mật: khi kết hợp với acid mật, các chất xơ tự nhiên ngăn chặn
nguy cơ tạo ra sỏi mật.
Chất xơ quan trọng như vậy nhưng vẫn ngày càng giảm đi trong khẩu phần ăn
hằng ngày. Theo một khảo sát gần đây, lượng chất xơ trong khẩu phần ăn của chúng ta
hiện nay chỉ bằng 40-50% so với 30 năm trước. Điề
u này có thể được giải thích là do
sự phổ biến loại thực phẩm tinh chế (đã bị loại bỏ gần hết chất xơ). Đây cũng chính là
một trong những nguyên nhân làm tăng nguy cơ mắc các căn bệnh của xã hội hiện đại
như ung thư, tim mạch, tiểu đường Với người Việt Nam, để có đủ chất xơ trong một
ngày, mỗi người cần ăn t
ối thiểu 300 g rau xanh và 100g quả tươi.
1.4. Các giống vi sinh vật sử dụng
1.4.1. Bacillus subtilis
1.4.1.1. Giới thiệu
|5|

Là trực khuẩn Gram dương, nhỏ, thẳng, có kích thước 0,5-2,5 x 1,2-10µm,
thường xếp thành cặp đôi hay chuỗi ngắn, hai đầu tế bào tròn hoặc hơi vuông. Bào tử
hình bầu dục có kích thước 0,6 – 0,9µm, không phân bố theo một nguyên tắc chặt chẽ
nào - lệch tâm hoặc gần tâm nhưng không chính tâm
|22|
. Khuẩn lạc khô hoặc nhớt, vô
màu hay có màu trắng xám nhạt, hơi nhăn hay tạo thành lớp màng mịn lan trên bề mặt
thạch, có mép nhăn, mép lồi lõm nhiều hay ít, bám chặt vào mặt thạch
|5|
. B.subtilis có
mặt ở khắp mọi nơi trong tự nhiên, chúng có nhiều trong rơm cỏ nên còn gọi là “trực
khuẩn rơm cỏ”. Chúng còn phân bố trên bề mặt các loại hạt và các sản phẩm được chế
biến từ các loại hạt đó. Trong bột mì, B.subtilis chiếm khoảng 75-95% vi khuẩn tạo

9
bào tử. Trong các sản phẩm thực phẩm truyền thống như mắm, tương, cơm mẻ (cơm
lên men chua)… chúng cũng có mặt và có vai trò đáng kể trong quá trình biến đổi sinh
học.
1.4.1.2. Hệ enzyme của Bacillus subtilis
• Hệ enzyme protease
|11, 25|

B. subtilis được nuôi trên môi trường lỏng để kích thích việc sinh tổng hợp
enzyme protease (trung tính và kiềm). Điều kiện tối ưu cho việc sinh tổng enzyme
protease là : nồng độ cơ chất: 0,5%, thời gian ủ: 30 giờ, nhiệt độ ủ: 40
o
C, pH: 7, dung
dịch đệm: đệm phosphate, môi trường dinh dưỡng: nước chiết thịt bò có bổ sung muối,
nguồn C: lactose, nguồn N: (NH
4
)
2
SO
4
, nguồn acid amin: valine; các acid hữu cơ như
acid acetic, acid lactic, acid citric ở các nồng độ khác nhau có thể làm giảm khả năng
sinh tổng hợp protease. Enzyme protease được tinh sạch bằng muối (NH
4
)
2
SO
4
và
màng lọc sephadex G200.

Điều kiện để hoạt tính enzyme protease đạt cực đại là: pH 7, dung dịch đệm:
đệm phosphate, thời gian ủ: 24 giờ, nhiệt độ ủ: 35
o
C
B. subtilis tổng hợp protease ngoại bào (exoprotease) phân giải protein và các
cơ chất cao phân tử khác có trong môi trường dinh dưỡng thành các dạng phân tử thấp
để vi sinh vật dễ dàng hấp thụ.
• Hệ enzyme amylase
|11|

B. subtilis có khả năng tạo một lượng lớn
α
- amylase ngoại bào
Amylase của B. subtilis không có các liên kết sulfihidril và có khả năng phân giải tinh
bột nhanh gấp 2÷2,5 lần so với
α
- amylase nấm mốc.
α
- amylase của vi khuẩn B. subtilis thủy phân tinh bột tạo ra các dextrin có mạch dài
khoảng 6-8 gốc glucose. Các dextrin này lại bị phân giải tiếp tục theo sơ đồ:
G6 → G1 + G5 G7 → G1 + G6 hay G2 + G5 (ít)
G8 → G2 + G6 hay G3 + G5 (ít)
Sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân cơ chất bởi amylase là glucose và
maltose. Ở vi khuẩn tỉ lệ này là 1: 5.
pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của
α
- amylase B. subtilis
là từ 5,6÷6,2.
1.4.1.3. Công dụng của B. subtilis
- Tạo kháng sinh: subtilin, eumycin, bacillin, bacillomin chống được nhiều loại

vi trùng gây bệnh.
- Người ta cũng thường thu
α
- amylase chịu nhiệt cao, dùng trong công nghiệp
dệt để tách hồ tinh bột trên vải từ B. subtilis.
Chế phẩm amylase từ vi khuẩn B. subtilis được thay thế đại mạch nảy mầm
(malt) làm tác nhân đường hóa tinh bột trong sản xuất rượu, bia từ nguyên liệu có bột.
Amylase của B. subtilis chỉ được tạo thành ở giai đoạn đã hoặc đang kết thúc
quá trình sinh trưởng, bền nhiệt hơn so với enzyme của n
ấm mốc.
- Các enzyme thủy phân protein được tìm thấy ở khắp nơi, trong tất cả các sinh
vật sống, quan trọng cho sự tăng trưởng và biệt hóa tế bào. Mặc dù có nhiều loài vi
sinh vật có khả năng sinh tổng hợp protease nhưng chỉ có vài loài sinh tổng hợp được
enzyme protease có giá trị thương mại, trong đó B.subtilis có vai trò nổi bật trong các
ngành công nghiệp khác nhau như thực phẩm, sữa, dược, dệt.
Protease là một trong những nhóm enzyme công nghiệp quan trọ
ng nhất, chiếm
gần 60% tổng lượng enzyme được bán ra, được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp tẩy

10
rửa khô, sản xuất các loại thuốc tiêu hóa, thuốc điều trị các vết thương do bỏng hay do
tác nhân virus
|25|
.
1.4.2. Lactobacillus
|22|

1.4.2.1. Giới thiệu
Tế bào hình que ngắn, thường có kích thước 0,5 – 1,2 x 1 – 10µm, đôi khi có
dạng hình cầu kết thành chuỗi ngắn. Là vi khuẩn Gram dương, không tạo bào tử, hiếm

khi di động bằng lông roi, kị khí không bắt buộc nhưng phát triển tốt hơn trong điều
kiện không có oxy hay có bổ sung thêm 5% CO
2
.
Khuẩn lạc có kích thước 2-5mm, dạng lồi, mờ đục, không nhuộm màu. Hình
thức dinh dưỡng là hóa dưỡng hữu cơ, đòi hỏi môi trường nuôi cấy phải giàu chất dinh
dưỡng, phức tạp, có khả năng lên men và phân huỷ saccharose. Không khử được
nitrate, không làm tan gelatin, không có catalase cũng như cytochrome. Nhiệt độ tối ưu
cho sự phát triển là 30 – 40
o
C. Phân bố rộng rãi trong môi trường đặc biệt trên thực
phẩm có nguồn gốc thực vật, động vật, ruột chim và động vật hữu nhũ. Hiếm khi gây
bệnh. Các chủng điển hình: Lactobacillus delbrueckii.
1.4.2.2. Ứng dụng
|5, 26|

 Bacteriocin:
Việc lên men thực phẩm bằng cách sử dụng vi khuẩn lactic là phương pháp bảo quản
thực phẩm bằng sinh học cổ xưa nhất dựa vào sự đối kháng của các loại vi sinh vật
khác nhau. Tuy nhiên, đến những năm gần đây, phương pháp này mới nhận được sự
chú ý của các nhà khoa học, đặc biệt là việc sử dụng các vi khuẩn lactic khác nhau.
Một trong những đặc điể
m quan trọng của vi khuẩn lactic là khả năng tạo các hoạt chất
có khả năng kháng khuẩn gọi là các bacteriocin. Các bacteriocin có khả năng kìm hãm
sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh hay gây hư hỏng thực phẩm như Listeria,
Clostridium, Staphylococcus, Bacillus spp., Enterococcus spp.
 Probiotics:
Khi bắt đầu bước vào kỷ nguyên mới, chế độ ăn uống được con người chú ý
nhiều hơn và đóng vai trò quan trọng trong việc ngăn ng
ừa bệnh tật và gia tăng sức

khỏe. Khái niệm “probiotics” được biết vào đầu thập kỷ 1900, cho đến năm 1965,
thuật ngữ này chính thức được Lilly và Stillwell sử dụng. Probiotics là những vi sinh
vật sống mà khi được đưa vào cơ thể người hay động vật, nó có những tác động có lợi
lên sức khỏe vật chủ và làm tăng khả năng hoạt động hệ vi sinh vật của vật chủ
(Havenaar và Huis in’t Veld, 1992)
Mộ
t số loài vi sinh vật được sử dụng như probiotics là: Lactobacillus
acidophilus, L.plantarum, L.casei, L.casei subsp. rhamnosus, L.delbrueckii subsp.
bulgaricus, L.fermentum, L.reuteri, Lactococcus lactis subsp. lactis, Bifidobacterium
bifidum. B.infantis, Streptococcus salivarius subsp. thermophilus, Enterococcus
faecalis, Saccharomyces boulardii. (Nguồn: Conway, 1996)
 Một số ứng dụng khác
Ứng dụng trong công nghiệp chế biến sữa để sản xuất sữa chua, kefir,
phomai,
Ứng dụng trong muối chua rau quả: bắp cải muối, dưa chuột muối…
Ứng dụng trong ủ chua thức ăn gia súc dùng trong chăn nuôi.
Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất acid lactic và các loại mu
ối lactate.
Acid lactic được ứng dụng trong ngành thuộc da, dệt, công nghiệp tổng hợp
chất dẻo, công nghiệp thực phẩm.

11
Lactate calci là loại dược phẩm bổ sung calci dưới dạng dễ hấp thu, lactate sắt
dùng để chữa bệnh thiếu máu, lactate đồng dùng làm dung môi…
1.4.3. Nấm Linh chi
1.4.3.1. Đặc tính sinh học
|16|
Nấm Linh chi đã nổi tiếng từ ngàn xưa ở các nước Á Đông, phiên âm theo tiếng
Trung Quốc gọi là Lingzhi, theo tiếng Nhật là reishi, ở Việt Nam thì hay gọi là nấm
Lim. Nấm Linh chi còn có nhiều tên gọi khác như: Bất lão thảo, Vạn niên nhung, Mộc

Linh chi… nhưng tên Linh chi có lẽ mang tính tiêu biểu và được sử dụng phổ biến hơn
cả (tên Linh chi chính thức được sử dụng trong sách “Thần nông bản thảo” cách đây
hơn 2000 năm).
Linh chi thường m
ọc ký sinh trên các cây gỗ trong nhiều năm. Cây gỗ bộ Đậu
(Fabales) là những cây chủ ưa thích của chúng, ta thường gặp Linh chi trên các cây
Lim, phượng vĩ, so đũa và một số loài cây khác đã chết, mục hoặc cả trên cây sống
như xoài, mít, mãng cầu, phi lao, dừa v.v…
Tính đa dạng của các loài Linh chi ở Việt Nam bộc lộ qua biến dị hình thái thể
quả. Cuống thể quả biến dị rất lớn, từ rất ngắn (0,5cm), r
ất mảnh (0,2cm) cho đến dài
cỡ hàng 5-10cm hoặc rất dài 20-25cm. Cuống có thể đính ở bên hoặc đính gần tâm do
quá trình liên tán mà thành. Mũ nấm dạng thận - gần tròn, đôi khi xòe hình quạt hoặc ít
nhiều dị dạng. Trên mặt mũ có vân gợn đồng tâm và có tia rãnh phóng xạ, màu vàng
nâu – vàng cam - đỏ cam - đỏ nâu – nâu tím – nâu đen, nhẵn bóng, láng như verni.
Sẫm màu dần khi già. Kích thước tán biến động từ 2-30cm dày 0,8-2,5cm. Thịt nấm
dày từ 0,4-1,8cm màu vàng kem – nâu nhạt - trắng. Nấm mềm dai khi tươ
i, trở nên
chắc cứng và nhẹ khi khô, hệ sợi kiểu trimitic, đầu tận cùng lớp sợi phình hình chùy,
màng rất dày đan kít vào nhau tạo thành lớp vỏ láng phủ trên mũ và bao quanh cuống.
1.4.3.2. Dược tính của nấm Linh chi
|16|

Số lượng các chủng loài nấm Linh chi được sử dụng trong công nghệ dược liệu,
dược phẩm ngày càng tăng và đó cũng là bí quyết của các quốc gia Á Đông. Vào thập
niên 70-80, bắt đầu một trào lưu khảo cứu hóa dược học các nấm Linh chi.
Một số loài Linh chi đã được phân chất:
Ganoderma applanatum, G.boninese,
G.lucidum … với các nhóm hoạt chất steroid, triterpenoid, và polysaccharide
Từ những năm 1980 đến nay, bằng các phương pháp hiện đại: phổ kế UV, IR…

đặc biệt là sắc ký lỏng cao áp (HPLC) và phổ kế plasma (ICP), đã được xác định chính
xác gần 100 hoạt chất và dẫn xuất trong nấm Linh chi. Có thể khái quát trong bảng
sau:
Bảng 1.1. Thành phần hoạt chất cơ bản trong nấm Linh chi
Hoạt chất Nhóm Hoạt tính dược lý
Cyclooctasulfur Ức chế giải phóng histamine
Adenosine dẫn xuất Nucleotide Ức chế kết dính tiểu cầu, thư giãn
cơ, giảm đau
Lingzhi-8 Proteine Chống dị ứng phổ rộng, điều hòa
miễn dịch
*** Alcaloid Trợ tim
Ganodosterone Steroide Giải độc gan
Lanosporeric acid A Steroide Giảm cholesterol
Lanosterol Steroide Ức chế sinh tổng hợp
II, III, IV, V Steroide Giảm cholesterol

12
Ganoderans A, B, C Polysaccharide Hạ đường huyết
Beta-D-Glucan Polysaccharide Chống ung thư, tăng tính miễn dịch
BN-3B: 1, 2, 3, 4 Polysaccharide
D-6 Polysaccharide Tăng tổng hợp protein, tăng chuyển
hóa acid nucleic
*** Polysaccharide Trợ tim
Ganoderic acids R, S Triterpenoid Trợ tim
Ganoderic acids B, D, F,
H, K, Y
Triterpenoid Hạ huyết áp, ức chế ACE
Ganoderic acids Triterpenoid Ức chế sinh tổng hợp cholesterol
Ganodermadiol Triterpenoid Hạ huyết áp, ức chế ACE
Ganodermic acids Mf Triterpenoid Ức chế sinh tổng hợp cholesterol

Ganodermic acids T.O Triterpenoid Ức chế sinh tổng hợp cholesterol
Lucidone A Triterpenoid Bảo vệ gan
Lucidenol Triterpenoid Bảo vệ gan
Ganosporelacton A Triterpenoid Chống khối u
Ganosporelacton Triterpenoid Chống khối u
Oleic acid dẫn xuất Acid béo Ức chế giải phóng histamine
Điều đáng lưu ý là các nhóm hoạt chất này gặp khá phổ biến trong cấu trúc
nấm, trong thể mang bào tử, trong bào tử đảm và trong hệ sợi (Mycelia), trong nấm tự
nhiên hoang dại và nuôi trồng chủ động.
1.4.3.3. Công dụng của nấm Linh chi
|29|

+ Hạ bớt lượng đường trong máu của người bị tiểu đường (nhờ chất Ganoderan) nhất
là tiểu đường type 2 (do cơ thể sản xuất insulin không đủ).
+ Tăng cường đào thải các chất phóng xạ nhiễm vào trong cơ thể. Dùng uống kèm khi
xạ trị và hóa trị để giảm các triệu chứng xấu như đau đớn, rụng tóc.
+ Ức chế sự tạo thành u bướu, ngăn ngừ
a ung thư.
+ Điều hoà huyết áp, dưỡng tim lọc máu, chống tích mỡ trong mạch máu gây ra bệnh
tim, tai biến mạch máu não.
+ Thanh tâm, êm dịu thần kinh giúp dễ ngủ, ăn ngon; chống dị ứng.
+ Làm chậm quá trình lão hóa, tăng cường thể lực, giảm mệt mỏi.
+ Chống độc: giúp cơ thể thải loại nhanh các chất độc vô cơ và hữu cơ do ăn uống,
tiếp xúc, hít thở; các độc tố do ký sinh trùng, vi trùng gây bệnh trong cơ
thể, các bệnh
suy gan, suy thận v.v
+ Kích thích quá trình phục hồi hệ miễn dịch (tăng cường tính thực bào, tiết ra
interferon) làm tăng sức đề kháng (theo Cổ Đức Trọng). Đây là điểm quan trọng khiến
trên thế giới dùng Linh chi như là thực phẩm vì sức khỏe và được dùng kèm với các
loại thuốc trị bệnh. Vì vậy nên dùng nấm ở những thời gian hay xảy ra dịch bệnh cảm

cúm để nâng cao sức kh
ỏe.
1.5. Ý nghĩa và tính mới về khoa học và thực tiễn
Trong việc xử lý okara để bổ sung vào thực phẩm hay để chế biến thực phẩm từ
okara thường gặp một số khó khăn chính như sau:
 Vì thành phần protein trong okara rất cao (từ 30-40%), chủ yếu là protein không
tan (lượng protein tan hầu hết đã được dùng làm sữa đậu nành). Đây là thành phần
chính tạo nên giá trị của okara. Chính thành phần protein không tan này tạo cảm giác
khó chịu v
ề cơ học khi nhai và làm khó ăn vì sau khi bị sấy khô protein không tan rất

13
khó trương nước để mềm trở lại, dù được nấu sôi lâu, kỹ, nhất là ở pH acid. Điều này
cũng gây khó khăn trong việc chế biến không chỉ các thực phẩm từ okara mà cả những
thực phẩm khô từ protein đậu nành.
Để khắc phục nhược điểm đó, đề tài đã sử dụng các nhóm tác nhân như muối
kiềm, hệ enzyme của các vi sinh vật để xử lý okara. Ngoài ra còn có một phát hiệ
n mới
có lợi trong trường hợp này: B.subtilis có thể sinh tổng hợp một loại dịch nhớt trong
quá trình sống, làm cơ chất nhão ra, giảm được độ cứng cố hữu.
 Hàm lượng xơ chủ yếu là xơ không tan với thành phần chính là xơ tinh thể
trong bã đậu nành khá cao, từ 9,0 – 19,0% tạo cảm giác nhám, cứng do đó khó nuốt
khi ăn. Vì vậy để dễ chế biến thực phẩm từ okara phả
i giảm lượng xơ không tan và
biến tính một phần thành xơ tan và đường khử.
Nghiên cứu của Vũ Văn Độ và CTV (2004) đã nuôi sinh khối tơ nấm Linh chi và
Bào ngư (là 2 loại nấm hoại gỗ có hoạt tính enzyme phân hủy xơ cao nhất trong số
những loại nấm ăn được) trên cơ chất okara sau đó sấy khô và nghiền thành bột mà
không dùng sinh khối tươi sống.
Nghiên cứu của Lê Chiến Phương và CTV (2004) đã nuôi sinh kh

ối nấm sợi
Mucor theo phương pháp truyền thống làm vỏ bọc cho sản phẩm từ đậu hũ và từ bã
đậu nành. Sản phẩm có hình khối lớn, chứa 7-8% NaCl và 7.5% cồn etilic. Nấm sợi
Mucor có hoạt tính enzyme protease khá cao song hoạt tính enzyme cellulase không
mạnh lắm.
Ngoài ra Lê Chiến Phương và CTV (2007) còn dùng mốc trắng Penicillium
camemberti tạo vỏ bọc sinh học cho sản phẩm từ đậu hũ lên men.
Nghiên cứu của Ngô Đại Nghiệp và CTV (2005) đã nuôi sinh khối n
ấm mốc
Aspergillus oryzae trên cơ chất bã đậu nành để chế biến thành tương xay và tương
gừng sản phẩm chứa 14,5% NaCl. Nấm mốc này có hoạt tính enzyme protease khá
mạnh song hoạt tính enzyme cellulase không cao lắm.
Nghiên cứu của Lại Mai Hương và CTV đã dùng phương pháp nghiền cơ học
(xay ướt và xay khô kết hợp dùng 2 enzym cellulase và pectinase thương phẩm của
hãng NOVO (Đan Mạch) để xử lý okara.
Ở đề tài này, sinh khối nấm sợi Linh chi được cho phát triển trên cơ ch
ất okara đã
được tạo hình khối cụ thể (trước đó đã được xay cơ học, xử lý xơ bằng enzyme
cellulase rồi thủy phân hoặc biến tính protein) để tạo vỏ bọc sinh học tươi, sống có các
tính chất:
• Màu trắng bông: Dày và bền chắc, đảm bảo hình dáng ổn định cho sản phẩm.
• Có khả năng sinh tổng hợp các enzyme đặc trưng, trong đó có cellulase, có thể hoạt
độ
ng âm thầm phân hủy xơ trong suốt quá trình bảo quản và lưu trữ sản phẩm.
• Có chứa phần lớn các hoạt chất sinh học (HCSH) quý có trong thể quả của nấm
Linh chi: Polyphenols, saponin, alkaloid, sterol, glucoside…
 Nếu chỉ giải quyết được một trong hai khó khăn nêu trên mà không giải quyết
được cả hai thì bất kỳ một sản phẩm nào từ okara đều khó sử dụng và khó tiêu thụ.
Đề tài đã học tập và vận d
ụng kết hợp các thành tựu của các tác giả đi trước

mong đạt được kết quả toàn diện hơn trong việc xử lý 2 thành phần chủ yếu và cũng là
khó khăn nhất của okara là protein không tan và xơ thô.
 Ngoài giá trị dinh dưỡng cao (giàu protein, lipid) và khả năng hỗ trợ tiêu hóa
(nhiều xơ) thì giá trị về thực phẩm chức năng của các nguyên liệu và sản phẩm từ
okara chưa được chú ý giữ gìn và nâng cao đúng m
ức.

14
 Trong okara hàm lượng chất béo còn khá cao (9,0-22,0%) mà phần lớn chất béo
của đậu nành là không no và nhiều nối đôi. Trong quá trình chế biến từ đậu nành hạt
tới okara thô đã có một số công đoạn làm tăng khả năng oxy hóa chất béo (ngâm, xay
các kích cỡ hạt, lọc…) Vì vậy trong quá trình xử lý tinh tiếp theo để ngăn chặn và
giảm bớt hiện tượng oxy hóa phải tiến hành xử lý chống oxy hóa ngay từ đầu.
 Phát hiện kh
ả năng chất xơ (cellulose) có thể đóng vai trò của chất chống oxy
hóa nhờ bản thân chất xơ có tính khử. Mạch phân tử cellulose càng ngắn, hoạt tính khử
chung của khối lượng xơ cố định càng cao vì đầu mạch có tính khử tăng.
 Bên cạnh đó sinh khối của một số loại VSV được dùng để xử lý okara (tơ nấm
Linh chi và các loại nấm sợi khác, B.subtilis, VK lactic và propionic) có khả năng
sinh t
ổng hợp các enzyme peroxydase, (hoặc catalase), polyphenoloxydase… có thể
làm giảm lượng và hoạt tính của các chất oxy hóa ở nơi chúng tồn tại.
 Mặt khác có thể cũng vì lý do này nên ở phần ruột già các VSV yếm khí phân
hủy xơ có thêm điều kiện để hoạt động mạnh hơn do đó xơ được phân hủy nhiều hơn,
tạo thêm dinh dưỡng cho cơ thể.
Trong trường hợp này xơ và các enzyme chống oxy hóa đóng vai trò prebiotic
(tạo đ
iều kiện phù hợp cho các VSV có sẵn trong đường ruột hoạt động mạnh hơn).
 Các sản phẩm từ okara có chứa sinh khối VK B.subtilis, lactic, nấm sợi Linh
chi. Một phần của sinh khối B.subtilis là những bào tử có sức chịu đựng cao trong

nhũng điều kiện bất lợi (pH chua của dạ dày) và khi sang ruột non và ruột già (có pH
thích hợp) chúng nảy mầm và tạo các tế bào dinh dưỡng hoạt động sống.
Các loại VSV này và các HCSH do chúng tạo ra đóng vai trò probiotic vì bản
thân sinh khối của chúng làm tăng số lượng quần thể VSV có lợi cho cơ thể và ức chế
VSV có hại nhờ khả năng cạnh tranh thức ăn hay tạo yếu tố bất lợi (như tạo pH chua)
đối với VSV có hại.
 Trong cả hai trường hợp trên, các sản phẩm đã được chế biến từ okara chủ yếu
bằng phương pháp sinh h
ọc có được vai trò chức năng là synbiotic (do prebiotic kết
hợp với probiotic). Đây là những đặc điểm mà ngành CBTP chức năng rất quan tâm.
Đồng thời lại tiết kiệm, tận dụng mọi nguồn nguyên liệu nhất là phụ phế liệu để biến
đổi thành những dạng hàng hóa có giá trị hơn.


15
CHƯƠNG 2: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
- Nguyên liệu:
+ Okara do công ty cổ phần sữa Việt Nam Vinamilk cung cấp
- Giống vi sinh vật sử dụng:
+ Lactobacillus sp.
+ Bacillus subtilis
+ Nấm Linh chi
Do phòng thí nghiệm Công nghệ biến đổi sinh học cung cấp
- Các hóa chất, dụng cụ và máy móc tại Viện Sinh học nhiệt đới.
- Enzyme cellulase thương phẩm có tên thương mại là celluclast của hãng Novo
- Đan Mạch.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Nội dung 1. Nghiên cứ
u hình thái; các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi sinh vật

sử dụng
2.2.1.1. Nghiên cứu hình thái; các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Lactobacillus sp.
 Quan sát hình thái bằng phương pháp nhuộm Gram
|4, 5|

Nguyên tắc:
Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào với thuốc tím kết tinh (crystal violet) và
iod mà vi khuẩn chia làm 2 nhóm khác nhau là:
Vi sinh vật có màu tím đậm là Gram dương.
Vi sinh vật có màu hồng, đỏ nhạt là Gram âm.
Cách tiến hành:
- Làm vết bôi trên lame
- Nhỏ dung dịch Crystal violet thấm ướt hết giấy lọc, để yên từ 30 giây - 1 phút, rửa
trôi thuốc nhuộm dư với nước.
- Nhỏ dung dịch Lugol, để 30 giây, rửa lại nhẹ nhàng với nước.
- Tẩ
y màu bằng cồn 96
o
từ 15-20 giây: giữ phiến kính ở góc nghiêng nhỏ và cẩn thận
nhỏ giọt cồn cho cồn chảy ngang qua vết bôi cho đến khi không thấy vết thuốc nhuộm
chảy theo. Ngay lập tức rửa vết bôi lại với nước.
- Phủ hoàn toàn vết bôi với safranin và để yên trong vòng 30 giây. Rửa với nước.
- Thấm khô phiến kính với giấy thấm. Khi phiến kính khô hoàn toàn, quan sát dưới
kính hiển vi với vật kính dầu x100.
 Phương pháp định tính acid lactic

Nguyên tắc:
- Khi tác dụng với acid lactic, thuốc thử Ufermen sẽ đổi màu từ xanh tím sang màu
vàng.
Cách tiến hành:

- Chuẩn bị khoảng 5 ml môi trường dinh dưỡng, cấy vi khuẩn lactic vào.
- Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng khoảng một ngày. Sau đó cho dịch lên men phản ứng với
thuốc thử Ufermen.
- Chuẩn bị các ống nghiệm chứa các thành phần như sau:
Ống 1: 3 ml dịch môi trường, 1 ml thuốc thử Ufermen.
Ống 2: 3 ml dịch lên men, 1 ml thuốc thử Ufermen.
Ố
ng 3: 3 ml acid lactic 98%, 1 ml thuốc thử Ufermen.
- Quan sát và nhận xét sự đổi màu của thuốc thử.