Định lượng flavonoid của lá quan âm biển (vitex rotundifolia l f , verbenaceae) bằng phương pháp ce pda

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.01 MB, 55 trang )

.

BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOID CỦA LÁ QUAN ÂM BIỂN
(VITEX ROTUNDIFOLIA L. f., VERBENACEAE)
BẰNG PHƯƠNG PHÁP CE-PDA

Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Khoa Dược, ĐH Y Dược TP. Hờ Chí Minh
Chủ trì nhiệm vụ: Nguyễn Thị Xuân Diệu

Thành phố Hồ Chí Minh - 2020
.

.

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOID CỦA LÁ QUAN ÂM BIỂN
(VITEX ROTUNDIFOLIA L. f., VERBENACEAE)
BẰNG PHƯƠNG PHÁP CE-PDA

(Đã chỉnh sửa theo kết luận của Hội đồng nghiệm thu ngày …………....)

Cơ quan chủ quản
(ký tên và đóng dấu)

Chủ trì nhiệm vụ
(ký tên)

Nguyễn Thị Xn Diệu
Cơ quan chủ trì nhiệm vụ
(ký tên và đóng dấu)

.

.

MỤC LỤC
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt ....................................................................................... iii
Mở đầu ............................................................................................................................................ 1
Chương 1. Tổng quan tài liệu........................................................................................................ 3
1.1. Tổng quan về thực vật học ........................................................................................................ 3
1.1.1. Tên khoa học .......................................................................................................................... 3
1.1.2. Vị trí trong bảng phân loại thực vật ....................................................................................... 3
1.1.3. Mô tả thực vật ........................................................................................................................ 3
1.1.4. Bộ phận dùng ......................................................................................................................... 4
1.2. Tổng quan về thành phần hóa học............................................................................................. 4
1.3. Tổng quan về tác dụng dược lý ................................................................................................. 7
1.3.1. Kháng viêm ............................................................................................................................ 7
1.3.2. Ức chế tiết prolactin ............................................................................................................... 8

1.3.3. Điều trị hội chứng tiền kinh nguyệt ....................................................................................... 8
1.3.4. Chống dị ứng và hen suyễn .................................................................................................... 9
1.3.5. Ức chế tế bào ung thư .......................................................................................................... 10
1.4. Công dụng trong y học cổ truyền............................................................................................................... 10
1.5. Tổng quan về cấu trúc hóa học và một số tính chất lý hóa của casticin, isoorientin và cynarosid ........ 11
Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu ................................................................... 13
2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................................. 13
2.1.1. Ngun liệu .......................................................................................................................... 13
2.1.2. Dung mơi, hóa chất .............................................................................................................. 13
2.1.3. Trang thiết bị nghiên cứu ..................................................................................................... 13
2.2. Phương pháp nghiên cứu......................................................................................................... 13
2.2.1. Khảo sát điều kiện phân tích cao lá Quan âm biển bằng phương pháp CE.......................... 13
2.2.2. Xây dựng quy trình định lượng bằng phương pháp UPLC .................................................. 16
Chương 3. Kết quả nghiên cứu ................................................................................................... 22
3.1. Độ tinh khiết của các chất đối chiếu ....................................................................................... 22
3.2. Khảo sát điều kiện phân tích cao quan âm biển bằng phương pháp CE ................................. 23
3.2.1. Lựa chọn kỹ thuật điện di..................................................................................................... 23
3.2.2. Lựa chọn bước sóng phát hiện ............................................................................................ 24
3.2.3. Khảo sát hệ đệm .................................................................................................................. 24
3.2.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của pH và tỉ lệ methanol thêm vào ................................................ 25
3.2.5. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ dung dịch đệm ........................................................... 27

i
.

.

3.2.6. Thay methanol bằng acetonitril và khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ dung dịch đệm .... 28
3.2.7. Khảo sát sự ảnh hưởng của điện thế .................................................................................... 29

3.2.8. Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ ................................................................................... 30
3.2.9. Khảo sát tính phù hợp hệ thống .......................................................................................... 30
3.2.10. Phân tích mẫu thử và mẫu đối chiếu ở điều kiện khảo sát ................................................ 31
3.3. Khảo sát điều kiện UPLC........................................................................................................ 32
3.3.1. Khảo sát chương trình rửa giải UPLC.................................................................................. 32
3.3.2. Khảo sát bước sóng phát hiện .............................................................................................. 33
3.3.3. Khảo sát tốc độ dịng ............................................................................................................ 34
3.3.4. Khảo sát nhiệt độ cột ............................................................................................................ 35
3.4. Khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu............................................................................................. 36
3.4.1. Khảo sát dung môi chiết....................................................................................................... 36
3.4.2. Khảo sát thời gian chiết........................................................................................................ 36
3.4.3. Khảo sát số lần chiết ............................................................................................................ 37
3.5. Đánh giá quy trình định lượng đồng thời isoorientin, cynarosid và casticin trong lá Quan âm
biển ................................................................................................................................................. 38
3.5.1. Khảo sát tính tương thích hệ thống ...................................................................................... 38
3.5.2. Khảo sát tính tuyến tính (khoảng xác định) ......................................................................... 39
3.5.3. Khảo sát độ đặc hiệu ............................................................................................................ 41
3.5.4. Khảo sát độ lặp lại ................................................................................................................ 42
3.5.5. Khảo sát độ đúng.................................................................................................................. 43
3.5.6. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) ................................................... 44
3.6. Định lượng so sánh các flavonoid trong lá quan âm biển thu hái ở Phú Yên và Nha Trang . 46
Chương 4. Bàn luận ..................................................................................................................... 47
Kết luận ......................................................................................................................................... 48
Tài liệu tham khảo ......................................................................................................................... a

ii
.

.

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
IFN-γ

Interferon gamma

IL

Interleukin

LPS

Lipopolysaccharide

MeOH

methanol

MRSA

Methicillin-resistant S. aureus

PMS

Premenstrual Syndrome - hội chứng tiền kinh nguyệt

UV

ultraviolet - tử ngoại

ISO

isoorientin

CYN

cynarosid

CAS

casticin

iii
.

.

MỞ ĐẦU
Chi Vitex thuộc họ Verbenaceae bao gồm gần 250 loài phân bổ phổ biến cả khu vực
khí hậu nhiệt đới lẫn ôn đới. Trong đó, nhiều loài đã được con người sử dụng làm
thuốc từ rất lâu đời và được y học hiện đại nghiên cứu, chứng minh có những tác
động dược lý giá trị. Đáng chú ý nhất là loài Vitex agnus-castus mọc chủ yếu ở
vùng biển Địa Trung Hải. Loài này được biết đến với tên gọi “chaste tree” nghĩa là
“cây trong sạch”, xuất phát từ việc được các thầy tu từ thời Trung Cổ sử dụng với
mục đích giảm ham muốn tình dục. Loài này đã và đang được nghiên cứu, bào chế
thành các thành phẩm thuốc từ những thập niên cuối của thế kỷ 20 trong điều trị
nhiều bệnh như mụn trứng cá, rối loạn tiêu hóa, rối loạn kinh nguyệt, đặc biệt là hội
chứng tiền kinh nguyệt (premenstrual syndrome - PMS) tại Châu Âu, Bắc Mỹ.1
Ở Việt Nam, Quan âm biển (Vitex rotundifolia L.f.), được dân gian sử dụng để trị

nhức đầu, quáng gà và một số bệnh ngoài da như mẩn ngứa, mụn nhọt, phát ban và
đã được các nhà khoa học chứng minh có tác dụng điều trị hội chứng tiền kinh
nguyệt hiệu quả tương tự như Vitex agnus-castus.2 Đây là tín hiệu đáng mừng vì
loài này mọc khá phở biến ở nước ta, đặc biệt là các tỉnh duyên hải Miền Trung.
Với ng̀n ngun liệu dời dào, sẵn có, nếu như được quan tâm nghiên cứu và phát
triển thành chế phẩm thuốc thì ng̀n ngun liệu này sẽ đóng góp khơng nhỏ cho y
học hiện đại nói riêng và nhiệm vụ chăm sóc sức khỏe cho nhân dân nói chung.
Gần đây, các phương pháp phân tích hiện đại như CE, UPLC thể hiện nhiều ưu
điểm vượt trội trong việc kiểm nghiệm dược liệu như thời gian phân tích ngắn, tiêu
tốn ít dung môi và mẫu,… Phương pháp CE thích hợp để định lượng các thành phần
hoạt chất có khả năng phân ly (flavonoid, alkaloid,…) trong khi đó UPLC áp dụng
cho hầu hết các nhóm hoạt chất. Tuy nhiên, hiện nay chưa tìm thấy nhiều tài liệu
cơng bố việc dùng các phương pháp hiện đại này để định lượng thành phần hoạt
chất trong chi Vitex nói chung và dược liệu Quan âm biển nói riêng. Flavonoid là
một trong những thành phần hoạt chất chính của Quan âm biển. Đây là thành phần
đóng góp đáng kể vào các tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan, kháng viêm, kháng
khuẩn, kháng ung thư, điều hòa nội tiết tố… cho dược liệu này.3 Do đó, đề tài đặt
vấn đề xây dựng quy trình định lượng các flavonoid chính của lá Quan âm biển
(Vitex rotundifolia L. f., Verbenaceae) với mong muốn tìm kiếm một phương pháp
mới trong việc kiểm nghiệm dược liệu này. Đề tài được thực hiện với 3 mục tiêu cụ
1
.

.

thể như sau:
- Thăm dò và chuẩn hóa điều kiện phân tích định lượng flavonoid của lá Quan âm
biển bằng phương pháp phân tích hiện đại như CE, UPLC.
- Khảo sát điều kiện thích hợp để xây dựng quy trình chiết xuất định lượng

flavonoid của lá Quan âm biển.
- Định lượng so sánh mẫu Quan âm biển thu hái ở hai tỉnh Phú Yên và Khánh Hòa.

2
.

.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC
1.1.1. Tên khoa học: Vitex rotundifolia L.f.
Tên đồng nghĩa: Vitex trifolia var. simplicifolia Cham, Vitex trifolia var. ovata
(Thunb.) Makina, Vitex trifolia var. unifoliata Schauer, Vitex ovata Thunb.
Tên thường gọi: Quan âm biển, Màn kinh tử, Từ bi biển, Mạn kinh lá đơn, Mạn
kinh lá nhỏ, Bình linh xoan.4
1.1.2. Vị trí trong bảng phân loại thực vật
Theo hệ thống phân loại của Takhatajan và Phạm Hoàng Hộ, vị trí của loài Vitex
rotundifolia L.f. được xếp như sau:
Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida)
Phân Lớp Hoa môi (Lamiidae)
Bộ Hoa môi (Lamiales)
Họ Cỏ roi ngựa (Verbenaceae)
Chi Vitex
Lồi Vitex rotundifolia L.f.5
1.1.3. Mơ tả thực vật
Dạng sống: Cây gỗ nhỏ, cao từ 10-40 cm, mọc sà bên bờ biển tạo nên thảm dày, có
khi tới 10 m tính từ gốc. Thân non tiết diện vuông, màu xanh mốc, thân già tiết diện
tròn, bề mặt nứt nẻ, màu vàng nâu hay nâu, có mùi thơm. Lá: Lá đơn, mọc đối chéo

chữ thập, có mùi thơm, kích thước 2-6,5 x 1-4,5 cm, hình dạng biến thiến, thường
dạng trứng ngược hoặc hình thìa với đỉnh tù, đáy thn, mặt trên xanh đậm và có ít
lơng tơ hơn mặt dưới. Cuống lá ngắn gần như khơng có. Hoa: Hoa có màu tím
xanh, lưỡng tính, chùm xim mọc ở ngọn cành dài 3-10 cm. Đài hoa hình chén, 5 lá
đài gần đều, kích thước khoảng 0,4-0,5 cm, nhiều lông mịn ở ngoài, bên trong nhẵn,
tiền khai van. Tràng hoa không đều, dính thành ống hẹp bên dưới dài khoảng 0,8
cm, phía trên chia làm 2 mơi 2/3, có màu tím hay tím hoa cà; mặt trong và ngoài ống
tràng có nhiều lông mịn, tiền khai 5 điểm. Bộ nhị gồm có 4 nhị, kiểu hai trội, hai nhị
trước dài hơn hai nhị sau, có kích thước khoảng 0,8-1,2 cm, chỉ nhị màu trắng hay
3
.

.

tím nhạt, có nhiều lông ở gốc chỉ nhị. Bao phấn màu tím, hình bầu dục, 2 b̀ng,
nứt dọc, đính giữa. Hạt phấn hình bầu dục có 3 rãnh dọc. Bầu trên hình cầu gờm 2
lá nỗn có vách giả chia làm 4 ơ, mỗi ơ một nỗn, đính nỗn trung trụ. Quả: Quả
hạch, hình cầu, đường kính 0,5-0,65 cm; khi cịn non có màu xanh lá cây, khi chín
màu vàng hay đỏ, quả khô màu nâu sẫm. Đài đồng trưởng bao lấy 1/3 - 2/3 phía dưới
quả, màu trắng xám, khó vỡ. Bên trong quả chia làm 4 ô, mỗi ô 1 hạt. Quả có mùi
đặc trưng, vị hơi nóng. Hạt: Hạt màu trắng xám, thường 1-2 phát triển.6, 7
1.1.4. Bộ phận dùng
Thường là quả, thu hái vào mùa thu khi chín rửa sạch và loại bỏ cuống, phơi hay
sấy khô, dùng tươi hoặc sao qua. Lá và hạt, rễ cũng được sử dụng bằng cách xông
hay sắc lấy nước uống.8

1.2. TỞNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HĨA HỌC
Trong những năm gần đây, Vitex rotundifolia L.f. được nghiên cứu và phân lập ra
chủ yếu 4 nhóm hợp chất chính: flavonoid, terpenoid, irrioid và lignan. Ngồi ra

trong cây cịn có các ecdysteroid, glucosid, phenolic acid…9, 10
Flavonoid trong Vitex rotundifolia L.f. chủ yếu thuộc nhóm euflavonoid, thường là
các polymethoxyflavonoid mà tiêu biểu là các flavonol với vòng B có 2 nhóm thế
như: casticin, artemin, quercetagenin. Trong đó, casticin là flavonoid có hàm lượng
cao nhất trong cây, đặc biệt là ở lá và quả. Dược điển Trung Quốc 2005 quy định
casticin là chất chuẩn trong Vitex rotundifolia L.f. với hàm lượng không nhỏ hơn
0,3%. Casticin (vitexicarpin) đang ngày càng được nhiều nhà khoa học quan tâm vì
khả năng tác động kiểu estrogen,2 điều hòa miễn dịch11 hay ức chế các tế bào ung
thư bằng cơ chế cảm ứng quá trình apoptosis.12 Ngồi flavonol, trong cây cịn có
các flavon như luteolin và các dẫn xuất glycosid của nó: luteolin 6-C-βglucopyranosid (isoorientin), luteolin 7-O-β-glucuronid, luteolin 7-O-βglucopyranosid (cynarosid), luteolin 3-O- β-glucuronid và apigenin 6-C-β-glucosid
(isovitexin).13
Terpenoid trong Vitex rotundifolia L.f. chủ yếu là các diterpen có cấu trúc khung
labdan-diterpen chiếm hàm lượng cao trong thành phần hóa học của quả và lá Vitex
rotundifolia L.f..14 Tính đến nay, đã có khoảng gần 30 diterpen được phân lập trong
đó đặc biệt rotundifuran và trisnor-γ-lacton có khả năng kháng ung thư nhờ tác động
cảm ứng quá trình apoptosis.15
4
.

.

Irioid trong Vitex rotundifolia nói riêng và chi Vitex nói chung thường là các
monoterpen cấu trúc đơn giản, đôi khi có trường hợp bị mở vòng lacton như 1-oxoeucommiol hoặc tạo liên kết -O-glycosid với α-D-glucose như trong agnusid.16
Lignan có chủ yếu trong rễ của Vitex rotundifolia với cấu trúc chính là arylnaphtalenlignan. Trong đó, vitrofolan C và D đã được nghiên cứu và chứng minh có khả năng
kháng khuẩn cao, đặc biệt là có hiệu quả với MRSA.17
R1

R2

1. Casticin

OMe

OH

2. Artemin

OMe

OMe

3. Quercetagenin

OH

OH

4. Penduletin

OH

H

R1
O

MeO

R2

OMe

MeO
OH

O

OH

OH

OH

OMe
O

MeO

H

O

HO

R

MeO
OH

OH

O

O

R1
3’,5-dihydroxy-4’,6,7-trimethoxyflavanon

1. Luteolin

H

2. Quercetin

OH

OH

OH
OH

OH
HO

HO

HO

O

O

O

O

O
OH

OH
OH

OH

OH

O

OH

OH

O

OH

Luteolin 7-O-β-glucopyranosid (cynarosid)

Luteolin 6-C-β-glucopyranosid (isoorientin)

OH
OH

O

HO

O

O

O

OH
OH
OH

OH

O

Luteolin 7-O-β-glucuconid

Hình 0.1 Cấu trúc hóa học các flavonoid trong Vitex rotundifolia L.f.

5
.

.

O

O

O

O

O
O

O
OH

H

H

OAc

OAc
H

Previtexilacton

Prerotundifuran

O

OAc

Vitexilacton

R2

OH

R1
H

R1

R2

Ferruginol

H

OH

Abietratrien-3-β-ol

OH

H

H

OAc

Rotundifuran

Hình 0.2 Cấu trúc hóa học các terpenoid trong Vitex rotundifolia L.f.

HO

HO

H

HO

H

OH

OH

OH

OH

Eucommiol

O
HO

1-oxo-eucommiol

Iridolacton

HO

H

HO

O

H

O

O

H

H
HO

O

HO

H

O
HO

Pedicularis-lacton

Viteosid I
HO

O
O

H
O

HO
O

O

OH
OH
OH

Agnusid

Hình 0.3 Cấu trúc hóa học các iridoid trong Vitex rotundifolia L.f.

6

O

Viteosid II

H

O

.

O

H

O

HO

HO

HO

H

.

OHC

OHC

OH

OHC

HO

OH

OMe

MeO

OMe

OHC

Vitrofolal B
OHC

O

Vitrofolal C

OMe

MeO

Vitrofolal D

R1

OH

OMe

OMe

OMe

OMe

R1

OH

OH
OMe

OMe

OMe
OMe

Vitrofolal A

HO

OMe

Vitrofolal E

H

Vitrolfolal F

OH

OMe

Hình 0.4 Cấu trúc hóa học các lignan trong Vitex rotundifolia L.f.

1.3. TỔNG QUAN VỀ TÁC DỤNG DƯỢC LÝ
1.3.1 Kháng viêm
Cơng trình được hợp tác nghiên cứu của các nhà khoa học từ Đại học tại Seoul, Hàn
Quốc đã phân lập thêm được 3 diterpen (vitextrifolin H, viterotulin A, viterotulin B)
và 2 neolignan (viterolignan A, viterolignan B) từ quả của Vitex rotundifolia L.f..
Các chất này được thử nghiệm về khả năng ức chế sản xuất NO ở dòng tế bào bạch
cầu RAW264,7. Kết quả ở IC50 = 11,3-24,5 μM cả 5 chất trên cho tác động ức chế
sản xuất NO đáng kể, tương tự như những thành phần đã được phân lập trước đó
như viteagnusin I, vitextrifolin D, viteagnusin F.18
Vitex rotundifolia L.f. từ lâu đã được sử dụng trong y học cổ truyền Hàn Quốc để
điều trị đau đầu, chóng mặt, sốt. Một nghiên cứu được thiết kế bởi các nhà khoa học
Hàn Quốc để nghiên cứu cơ chế kháng viêm của loài này thông qua tác động ức chế
sản xuất NO của đại thực bào màng bụng chuột được kích thích bởi IFN-γ và LPS.
Ban đầu, các tế bào sẽ được chia làm 2 nhóm: có hoặc không tác động bởi dịch chiết
MeOH của Vitex rotundifolia L.f. ở 3 mức nồng độ (0,01; 0,1 và 1 mg/ml). Sau đó cả
2 nhóm sẽ được kích thích bởi rIFN-γ (20 U/ml) và LPS (10 μg/ml). Lượng NO sinh
ra sẽ được xác định thông qua nồng độ NO trong tế bào sau 48 giờ. Thông thường
nếu không bị kích thích, lượng NO trong tế bào dao động trong khoảng 3,62 ± 0,4
μM. Ở nhóm chứng, nồng độ NO tăng lên gấp 10 lần giá trị bình thường, trong khi
đó, các tế bào được tác động trước bởi dịch chiết MeOH của Vitex rotundifolia L.f.,
nồng độ NO tăng lên ít hơn, đặc biệt là với nồng độ 1 mg/ml Vitex rotundifolia L.f.
7

.

.

cho kết quả ức chế việc sản xuất NO trên 64%. Đồng thời không có ảnh hưởng cũng
như độc tính nào đáng kể tới hoạt động của tế bào ngay cả ở nồng độ sử dụng cao
nhất (1 mg/ml). Do đó, Vitex rotundifolia L.f. có khả năng ức chế sản xuất NO nhưng
không gây độc tính tế bào. Bên cạnh đó, thử nghiệm Western blotting cũng được tiến
hành nhằm làm rõ cơ chế của khả năng ức chế sản xuất NO của Vitex rotundifolia
L.f.. Kết quả thu được cho thấy cơ chế chính là do Vitex rotundifolia L.f. làm giảm
biểu hiện của cyclooxygenase (COX-2) và yếu tố sản xuất enzym NO synthase từ Larginine (iNOS); tác động trên phụ thuộc vào liều.19
1.3.2 Ức chế tiết prolactin
Một nghiên cứu đã thử nghiệm tác động của casticin được phân lập từ loài Vitex
rotunfifolia L.f. lên chuột Sprague Dawley và tế bào tuyến yên từ những con chuột
trên. Cả hai nhóm đối tượng này đều được gây cường prolactin máu bởi
metoclopramid dihydroclorid (50 mg/kg, tid, ip/10 ngày). Casticin (10, 20 và 40
mg/kg, ip/7 ngày) làm giảm nồng độ prolactin lần lượt 33,9%, 54,3%, và 64,7%.
Trong khi đó bromocriptine 1mg/kg làm giảm nờng độ prolactin ở nhóm chuột
cường prolactin máu khoảng 44,9%. 17β-estradiol làm tăng đáng kể sự phát triển tế
bào tuyến yên, từ đó làm tăng sự tiết prolactin và casticin (1 và 10 μmol/L) làm suy
giảm đáng kể tác động đó theo thứ tự 27,7% và 42,1%. Casticin (1 và 10 μmol/L)
ức chế có ý nghĩa trên thụ thể ERα mRNA ở các tế bào tuyến yên được kích thích
bởi 17β-estradiol nhưng lại gia tăng tác động trên thụ thể ERβ mRNA ở nờng độ 10
μmol/L. Tuy nhiên, casticin khơng có tác động nào đáng kể trong sự phát triển cũng
như tiết prolactin của các tế bào tuyến yên không được kích thích bởi 17β-estradiol
in vitro. Như vậy, casticin có khả năng ức chế sự tiết prolactin từ các tế bào tuyến
yên đã được kích thích bởi 17β-estradiol của chuột Sprague Dawley in vivo và in
vitro. Nguyên nhân có thể liên quan tới khả năng ức chế những biểu hiên trên ERα
mRNA và gia tăng biểu hiện trên ERβ mRNA.20

1.3.3 Điều trị hội chứng tiền kinh nguyệt (PMS)
PMS là hội chứng liên quan tới sự rối loạn nội tiết tố nữ bao gồm một số triệu chứng
như lo âu, căng thẳng, trầm cảm, nóng nảy, nhức đầu, đau ngực, chướng bụng, buồn
nôn và nôn… trước khi bắt đầu chu kỳ kinh nguyệt. Các nguyên nhân của PMS vẫn
còn chưa rõ ràng, nhưng phần đông ý kiến đều cho rằng steroid sinh dục sản xuất bởi
hoàng thể của buồng trứng là nguyên nhân chính. Các nhà khoa học của Trung Quốc
và Anh đã hợp tác trong nghiên cứu về đánh giá tác động tương tự estrogen của Vitex
8
.

.

rotundifolia L.f. cũng như vai trò của nó trong điều trị PMS, cụ thể là 4 thành phần
chủ yếu trong dịch chiết cờn của quả lồi cây này, bao gờm: casticin, luteolin,
rotundifuran và agnusid thông qua ảnh hưởng của chúng đến phát triển của tế bào
cũng như trên receptor estrogen (ER), receptor progesteron (PR) và biểu hiện của pS2
mRNA trên dòng tế bào MCF-7. Kết quả cho thấy, chỉ rotundifuran và agnusid có
khả năng kích thích sự phát triển của các tế bào MCF-7. Tác động này phụ thuộc vào
liều (từ 100 nM tới 10 μM). ER, PR và mức biểu hiện pS2 mRNA tăng khi sử dụng
rotundifuran và agnusid trong vịng 24 giờ. Tóm lại, dịch chiết của Vitex rotundifolia
L.f. và các chất chủ yếu trong đó như rotundifuran và agnusid cho tác động tương tự
estrogen thông qua tương tác với ER, PR và pS2. Điều này sẽ rất ý nghĩa trong điều
hịa những thay đởi ở cơ quan sinh sản và trong điều trị một số bệnh liên quan tới
hormon như ung thư tuyến tiền liệt, ung thư vú, đồng thời điều hòa tỉ lệ estrogen và
progesteron trong hội chứng tiền kinh nguyệt.2
1.3.4 Chống dị ứng và hen suyễn
Dịch chiết nước quả Vitex rotundifolia L.f. cho tác động trên shock phản vệ in vivo và
in vitro. Với nồng độ (10−4-1,0 g/kg), khả năng ức chế phản ứng dị ứng phụ thuộc liều
theo mức độ lần lượt 48% và 80%. Dịch chiết làm giảm nồng độ histamin đồng thời

làm ức chế thụ động phản ứng phản vệ trên da do IgE kháng DNP (dinitrophenyl). Các
tác động này đều phụ thuộc vào liều. Hơn nữa, dịch chiết từ quả Vitex rotundifolia L.f.
(10-3mg/ml) cho tác động đáng kể trên IgE kháng DNP gây ra bởi sự phân hủy các
nhân tố α của tế bào ung thư từ đại thực bào màng bụng chuột.21
1H,8H-Pyrano [3,4-c]pyran-1,8-dion (PPY), phân lập từ Vitex rotundifolia L.f. cho
tác động chống lại hen suyễn in vitro. Thí nghiệm được thiết kế trên tế bào biểu mô
phổi (A549) được kích thích bởi TNF-alpha, IL-4 và IL-1 beta nhằm gây ra hóa ứng
động và kết dính với bạch cầu ưa kiềm. PPY với nồng độ 50 μM không gây độc tế
bào, lại làm giảm đáng kể biểu hiện của eotaxin, IL-8, IL-16 và VCAM-1 mRNA.
PPY giảm tiết eotaxin phụ thuộc liều và ức chế hóa ứng động tới A549. Đồng thời,
PPY ức chế rõ rệt q trình phosphryl hóa của p65 và ERK1/2, có nghĩa nó có khả
năng ức chế kênh MAPK/NF-KB. Để làm rõ khả năng kháng viêm và hen suyễn
của PPY in vivo, các tác giả đã thử nghiệm ảnh hưởng của PPY trên sự phát triển
bệnh viêm phởi trong mơ hình chuột hen suyễn bởi ovanbumin (OVA) và sau đó
kiểm tra những dấu hiệu đặc trưng của hen suyễn: sự gia tăng bạch cầu ưa acid ở
BALF; hiện diện của Th2 cytokines như IL-4 và IL-5 ở BALF; nồng độ IgE trong
9
.

.

huyết tương; và sự gia tăng của tế bào viêm phổi. Kết quả cho thấy PPY ức chế rõ
rệt sự tập trung của bạch cầu ái toan tại khí đạo thông qua việc giảm IL-4, IL-5 và
IL-13 ở BALF với liều sử dụng là 10 mg/kg, khả năng kháng viêm của liều PPY sử
dụng tương đương với 1 mg/kg dexamethason.22
1.3.5 Ức chế tế bào ung thư
Các polymethoxyflavonoid bao gồm: casticin, armentin và 3’,5-dihydroxy-4’,6,7trimethoxyflavanon được phân lập từ dịch chiết MeOH của Vitex rotundifolia L.f.
được báo cáo có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư bạch cầu dòng tủy
HL-60 thơng qua việc cảm ứng chu trình chết tế bào (apoptosis). Sau đó các tác giả

trên đã phân lập thêm một labdan-diterpen: rotundifuran từ quả của Vitex rotundifolia
L.f. cũng có khả năng ức chế tế bào ung thư dòng HL-60 với cơ chế tương tự như
polymethoxyflavonoid. Năm 2002, cũng từ quả của loài cây này, luteolin được phân
lập và được cho là có khả năng tiềm ẩn trong phòng ngừa và hóa trị ung thư ở dòng tế
bào ung thư bạch cầu tủy cũng thông qua cơ chế cảm ứng quá trình apoptosis.23, 24
Casticin phân lập từ quả Vitex rotundifolia L.f. cho tác động ức chế sự phát tế bào
lympho ở chuột. Bằng cách sử dụng 4 dòng tế bào EL-4, P815,9 và L929, casticin ở
nồng độ lớn hơn 0,1μM thể hiện khả năng ức chế sự tạo thành concanavaline A và
lipopolysaccarid – yếu tố cần thiết trong sự phát triển của tế bào lympho. Khả năng
ức chế sự phát triển tế bào của flavonoid nói chung phụ thuộc vào liên kết đôi tại vị
trí C2, C3 và phụ thuộc vào vị trí và số lượng của các nhóm –OH có trong cơng thức.
Khác với các flavonoid khác, casticin không những ức chế sự phát triển tế bào ở pha
sớm mà còn ở pha muộn. Điều này rất có ý nghĩa trong điều trị bệnh liên qua đến hệ
thống miễn dịch, ví dụ như viêm khớp dạng thấp bởi lẽ các tế bào lympho đã được
kích hoạt và phát triển trước khi xuất hiện các triệu chứng và được chuẩn đoán.12, 25

1.4. CÔNG DỤNG TRONG Y HỌC CỔ TRUYỀN
Quả trị đau đầu, chảy nước mắt, đau mắt do nhiệt, viêm sưng nướu, quáng gà với liều
dùng 5-9 g.8 Ngoài ra quả còn được dùng để trị hen suyễn, viêm phế quản, đau nửa
đầu, răng lợi sưng đau, đau cơ, đau thần kinh, tiêu chảy do nhiễm khuẩn tiêu hóa.26
Lá dùng chữa đòn ngã tởn thương, giã ra ngâm vào rượu, lấy nước uống, bã đắp. Lá
của Vitex rotundifolia L.f. là một trong những phương thuốc truyền thống của người
dân Hawaii. Họ dùng lá tươi để trị các bệnh liên quan đến viêm nhiễm trên da, ngứa,
nổi mẩn, phát ban. Một số nơi người ta dùng lá làm thuốc lợi tiêu hóa, long đờm. Ngoài
ra, do trong thành phần có rotundial nên lá của Vitex rotundifolia L.f. còn được sử dụng
10
.

.

để xua đuổi côn trùng, đặc biệt là muỗi Aedes aegypti.27

1.5. TỞNG QUAN VỀ CẤU TRÚC HĨA HỌC VÀ MỘT SỐ TÍNH
CHẤT LÝ HĨA CỦA CASTICIN, ISOORIENTIN VÀ CYNAROSID
1.5.1. Casticin
1.5.1.1. Cấu trúc hóa học

1.5.1.2. Một số tính chất lý hóa
Khối lượng phân tử: 374.345 g/mol
UV λ max (nm): 257, 349 (methanol)
pKa = 6.13±0.40 (Scifinder)
Tan trong methanol nóng, khơng tan trong nước,… (PubChem CID: 5315263)
1.5.2. Isoorientin
1.5.2.1. Cấu trúc hóa học

1.5.2.2. Một số tính chất lý hóa
Khối lượng phân tử: 448.38 g/mol
UV λ max (nm): 257, 350 (methanol)
pKa = 5.90±0.40 (Scifinder)
Tan trong nước, cồn, methanol,… (PubChem CID: 114776)
1.5.3. Cynarosid
11
.

.

1.5.3.1. Cấu trúc hóa học

1.5.3.2. Một số tính chất lý hóa
Khối lượng phân tử: 448.38 g/mol
UV λ max (nm): 253, 348 (methanol)
pKa = 6.10±0.40 (Scifinder)
Tan trong cồn nóng, methanol nóng, ít tan trong nước… (PubChem CID: 5280637)

12
.

.

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1.

2

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên liệu
Lá Quan âm biển (Vitex rotundifolia L. f.) thu hái tại thành phố Nha Trang, tỉnh
Khánh Hòa. Bột lá Quan âm biển được rây qua rây 0,3 mm trước khi dùng cho phân
tích định lượng. Thời gian thu hái: tháng 8/2013. Mẫu lá Quan âm biển so sánh
được thu hái tại Phú Yên vào tháng 8/2014.
2.1.2. Dung mơi, hóa chất
Chất đới chiếu: casticin, isoorientin và cynarosid (hàm lượng trên 99%) được phân
lập và xác định cấu trúc từ lá Quan âm biển.
Hóa chất và dung môi dùng cho điện di mao quản: natri hydroxyd, acid phosphoric,
acid boric, dinatri hydrophosphat, dinatri tetraborat, methanol (LiChrosolv® -Merck,
Đức), acetonitril (LiChrosolv® -Merck, Đức).

Dung môi dùng cho sắc ký lỏng siêu hiệu năng: methanol (LiChrosolv® -Merck,
Đức), acetonitril (LiChrosolv® -Merck, Đức), acid formic (Prolabo®, Pháp), nước
cất hai lần khử khoáng 18,2 M.
2.1.3. Trang thiết bị nghiên cứu
Máy điện di mao quản Agilent G7100A đầu dò DAD, điều khiển và xử lý số liệu
bằng phần mềm Chemstation; cột mao quản silicagel nung chảy đường kính trong
50 m, chiều dài tổng cộng 64,5 cm.
Máy sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC) Waters Acquity H-Class D12QSM851A,
đầu dò PDA B12UPD859A kết nối với phần mềm Enpower 3; cột sc ky Acquity
UPLCđ BEH C18 (130 ; 1,7 àm; 2,1 mm x 50 mm).
Máy đo pH Neomet pH 220 L.

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Khảo sát điều kiện phân tích cao lá Quan âm biển bằng phương pháp CE
2.2.1.1. Pha chế các dung dịch thử nghiệm
Dung dịch đối chiếu gốc
Cân 0,0100 g mỗi chất đối chiếu (casticin, isoorientin, cynarosid) cho chung vào
13
.

.

bình định mức 5 ml, hòa tan và điền đầy đến vạch bằng methanol.
Các dung dịch đệm
Các dung dịch đệm được pha trong nước cất hai lần.
- Đệm dinatri hydrophosphat 75 mM: Hòa tan 1,3431 g dinatri hydrophosphat với
40 ml nước, điều chỉnh đến pH 9,0 bằng dung dịch natri hydroxyd, thêm nước vừa
đủ 50 ml.
- Đệm amoni chlorid 75 mM: Hòa tan 0,2006 g amoni chlorid với 40 ml nước, điều

chỉnh đến pH 9,0 bằng dung dịch amoniac, thêm nước vừa đủ 50 ml.
- Đệm dinatri tetraborate 75 mM: Hòa tan 1,43 g dinatri tetraborat với 40 ml nước,
điều chỉnh đến pH 9,0 bằng dung dịch acid boric, thêm nước vừa đủ 50 ml. Tương
tự pha các dung dịch đệm dinatri tetraborat 25, 50 mM có pH 9,0.
- Đệm dinatri tetraborat 75 mM thêm methanol: Hòa tan 1,43 g dinatri tetraborat với
40 ml nước, thêm lần lượt 2,5 ml; 5 ml; 7,5 ml methanol, điều chỉnh đến pH 9,0 bằng
dung dịch acid boric, thêm nước vừa đủ 50 ml. Các dung dịch đệm thu được có nồng
độ methanol lần lượt là 5%, 10%, 15% và 20%. Tương tự pha các dung dịch đệm
dinatri tetraborat 25, 50 mM thêm methanol 5%, 10%, 15% và 20% có pH 9,0.
- Đệm dinatri tetraborat 75 mM thêm acetonitril: Hòa tan 1,43 g dinatri tetraborat
với 40 ml nước, thêm lần lượt 2,5 ml; 5 ml; 7,5 ml acetonitril, điều chỉnh đến pH
9,0 bằng dung dịch acid boric, thêm nước vừa đủ 50 ml. Các dung dịch đệm thu
được có nồng độ acetonitril lần lượt là 5%, 10%, 15% và 20%. Tương tự pha các
dung dịch đệm dinatri tetraborat 25, 50 mM thêm acetonitril 55%, 10%, 15% và
20% có pH 9,0.
Dung dịch mẫu thử
Cân chính xác khoảng 1 g bột lá Quan âm biển, chiết với 10 ml methanol với sự hỗ
trợ của sóng siêu âm (mức năng lượng sóng siêu âm 100% thiết kế của máy) ở nhiệt
độ 60C ± 2C trong vòng 30 phút, sau đó ly tâm lấy dịch chiết, lọc qua màng lọc
PTFE 0,2 µm trước khi tiến hành phân tích bằng CE.
2.2.1.2. Khảo sát các điều kiện phân tích cao lá Quan âm biển bằng CE
Cột mao quản mới được hoạt hóa bằng natri hydroxyd 1 N trong 30 phút, sau đó
được rửa lại bằng nước cất 2 lần trong 60 phút, tiếp tục với natri hydroxyd 0,1 N
trong 30 phút, rửa lại với nước cất 2 lần trong 60 phút, rồi cân bằng với dung dịch
đệm trong 30 phút.
14
.

.

Để đảm bảo độ lặp lại giữa các lần tiêm mẫu, cột mao quản được rửa bằng nước cất
2 lần trong 5 phút, natri hydroxid 0,1 N trong 3 phút, rửa lại bằng nước cất 2 lần
trong 10 phút rồi cân bằng với dung dịch đệm trong 10 phút.
Mẫu được tiêm bằng chương trình tiêm áp suất 50 mbar x 5 s
Trong quá trình thực hiện, các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân tách như hệ
đệm, pH, nờng độ dung dịch đệm, nồng độ dung môi hữu cơ thêm vào dung dịch
đệm, nhiệt độ, điện thế được khảo sát để chọn điều kiện điện di thích hợp, đáp ứng
các yêu cầu sau:
- Pic tách tốt (Rs ≥ 1,5); cân đối và ít kéo đuôi (0,8 ≤ AF ≤ 1,5);
- Cường độ dòng điện thấp (< 100 A)
- Tổng thời gian phân tích ngắn;
- Độ lặp lại tốt.
Hệ đệm
Chọn hệ đệm có khả năng đệm tốt ở môi trường kiềm (pH 8-10), có linh độ điện di
thấp (kích thước lớn, điện tích nhỏ) để tối thiểu hóa sự phát sinh dòng điện. Lần
lượt khảo sát các hệ đệm dinatri hydrophosphat, dinatri tetraborat, amoni chlorid ở
cùng nồng độ 75 mM và pH 10,0, điện thế 25 kV và nhiệt độ 25oC để chọn hệ đệm
tối ưu.
pH
pH có ảnh hưởng lớn đến quá trình điện di, vì ảnh hưởng đến sự ion hóa của nhóm
silanol, từ đó ảnh hưởng đến dòng EOF, linh độ điện di và thời gian phân tích. Bản
thân hệ đệm được chọn để tạo môi trường kiềm nên pH được khảo sát trong khoảng
8,5; 9,0; 9,5; 10 để tìm ra pH tối ưu.
Nờng đợ đệm
Sau khi chọn được hệ đệm và pH tối ưu, tiếp tục khảo sát nồng độ đệm cho khả
năng phân tách cao nhất để định lượng các flavonoid. Lần lượt thay đổi nồng độ đệm
25 mM, 50 mM và 75 mM cố định các thông số khác.
Nồng độ và bản chất dung môi hữu cơ (methanol, acetonitril) thêm vào dung dịch
đệm

Khảo sát ảnh hưởng của dung môi hữu cơ thêm vào với các nồng độ lần lượt là 5%,
10%, 15% và 20%.
15
.

.

Điện thế
Sau khi chọn được dung dịch đệm tối ưu, thay đởi điện thế trong quá trình phân tích
để đạt được hiệu quả phân tích tốt nhất. Các điện thế khác nhau 15 kV, 20 kV và 25
kV được khảo sát để chọn điện thế phù hợp nhất.
Nhiệt độ
Tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình phân tích ở các nhiệt độ
20oC, 25oC và 30oC để chọn điều kiện nhiệt độ tốt nhất.
2.2.2. Xây dựng quy trình định lượng bằng phương pháp UPLC
2.2.2.1. Khảo sát các điều kiện sắc ký
Khảo sát chương trình rửa giải
Tiến hành trên mẫu thử là dịch chiết methanol 40 mg/ml của bột lá Quan âm biển
được chuẩn bị theo quy trình sau: Cân chính xác khoảng 200 mg bột lá Quan âm
biển cho vào erlen 100 ml, thêm 40 ml methanol, đun hồi lưu 30 phút ở nhiệt độ cài
đặt 90C, lọc lấy dịch, cơ dịch lọc đến cắn. Hịa cắn bằng methanol cho vào bình
định mức 5 ml, thêm dung mơi cho đủ thể tích bình, lọc qua màng lọc PTFE 0,2 μm
trước khi khai triển trên UPLC.
Khảo sát các pha động khác nhau ở tốc độ dòng 0,15 ml/phút, chọn lựa điều kiện
pha động thích hợp nhất dựa trên các tiêu chí:
- Pic tách tốt (Rs ≥ 1,5); cân đối và ít kéo đi (0,8 ≤ As ≤ 1,5);
- Pic cần định lượng đạt độ tinh khiết pic;
- Tởng thời gian phân tích ngắn;
- Độ lặp lại tốt.

Khảo sát bước sóng phát hiện
Triển khai mẫu đối chiếu trên UPLC theo điều kiện đã chọn với dải bước sóng phát
hiện từ 210 - 400 nm. Dựa vào phổ UV của các chất đối chiếu, chọn bước sóng có
sự hấp thu UV cao nhất cho cả ba chất đối chiếu làm bước sóng phát hiện khi định
lượng.
Khảo sát tớc đợ dòng
Khảo sát các tốc độ dòng khác nhau 0,15 ml/phút; 0,17 ml/phút; 0,2 ml/phút; 0,25
ml/phút; 0,3 ml/phút trên cùng 1 mẫu thử 40 mg/ml ở cùng điều kiện pha động với
mục đích rút ngắn thời gian phân tích nhưng vẫn đảm bảo các tiêu chí đã nêu.
16
.

.

Khảo sát nhiệt độ cột
Triển khai mẫu thử 40 mg/ml ở cùng điều kiện pha động và tốc độ dòng đã chọn với
các nhiệt độ cột khác nhau 25oC, 30oC, 35oC, 40oC, lựa chọn nhiệt độ cột thích hợp
theo tiêu chí đặt ra.
Từ kết quả khảo sát, rút ra điều kiện sắc ký áp dụng cho quy trình định lượng (ký
hiệu là QAB ĐKĐL).
2.2.2.2. Khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu thử
Quy trình chuẩn bị mẫu được xây dựng dựa trên các tiêu chí:
- Chiết được tối đa hoạt chất, hạn chế tạp;
- Đơn giản, nhanh, dễ dàng cho kết quả lặp lại;
Đánh giá dựa vào kết quả diện tích pic của các chất cần định lượng sau khi khai
triển trên UPLC ở điều kiện đã chọn.
Khảo sát dung môi chiết
Tiến hành khảo sát các dung môi acetonitril, methanol 100%, methanol 90%,
methanol 80%;

Cân chính xác khoảng 20 mg bột lá Quan âm biển, chiết với 1 ml dung môi trong
ống eppendorf 1,5 ml với sự hỗ trợ của sóng siêu âm (mức năng lượng sóng siêu âm
100% thiết kế của máy) ở nhiệt độ 60C ± 2C trong vòng 15 phút, sau đó ly tâm
bằng máy Hettich Mikro 200 trong 4 phút, tốc độ 12000 vòng/phút, lấy dịch, lọc
qua màng lọc PTFE 0,2 µm, tiến hành phân tích bằng UPLC.
Khảo sát thời gian chiết
Tiến hành khảo sát các thời gian chiết khác nhau 15 phút, 30 phút và 45 phút;
Cân chính xác khoảng 50 mg bột lá Quan âm biển, chiết với 15 ml methanol 90%
trong ống ly tâm 15 ml với sự hỗ trợ của sóng siêu âm (mức năng lượng sóng siêu
âm 100% thiết kế của máy) ở nhiệt độ 60 C ± 2 C trong thời gian khảo sát, sau đó
ly tâm bằng máy Sigma 6K15 Sartorius trong 10 phút, lực ly tâm 17000 g, lấy dịch,
lọc qua màng lọc PTFE 0,2 µm, tiến hành phân tích bằng UPLC.
Khảo sát sớ lần chiết
Cân chính xác khoảng 50 mg bột lá Quan âm biển, chiết lần 1 với 15 ml, lần 2 với 5
ml methanol 90% với sự hỗ trợ của sóng siêu âm (mức năng lượng sóng siêu âm
100% thiết kế của máy) ở nhiệt độ 60C ± 2C trong vòng 30 phút, sau đó ly tâm
17
.

.

riêng dịch chiết từng lần chiết bằng máy Sigma 6K15 Sartorius trong 10 phút, lực ly
tâm 17000 g, lấy dịch, lọc qua màng lọc PTFE 0,2 µm, tiến hành phân tích bằng
UPLC.
Từ kết quả khảo sát, xây dựng quy trình chuẩn bị mẫu định lượng (ký hiệu là QAB
QTCBM)
2.2.3. Đánh giá quy trình định lượng
2.2.3.1. Khảo sát tính tương thích hệ thống
Mục đích: Đảm bảo hệ thống sắc ký có hiệu năng phù hợp có thể xác định độ phân

giải và độ lặp lại của hệ thống sắc ký đối với phép phân tích đang thực hiện.
Tiến hành triển khai sắc ký lần lượt 6 lần liên tiếp cùng một mẫu thử 10 mg/ml (được
chuẩn bị theo quy trình QAB QTCBM). Điều kiện khai triển như đã xây dựng (QAB
ĐKĐL). Ghi nhận các thông số: thời gian lưu (tR); diện tích pic (S); số đĩa lý thuyết (N);
hệ số dung lượng (k’); hệ số chọn lọc (α); hệ số bất đối xứng (As); độ phân giải (Rs);
Tính tương thích hệ thống đạt yêu cầu khi:
- Giá trị RSD% của thời gian lưu, diện tích pic, số đĩa lý thuyết phải ≤ 2%;
- Các thông số khác của pic phải đáp ứng yêu cầu:
k’ ≥ 1,0;

1,05 ≤  ≤ 2,0;

RS > 1,5;

0,8 ≤ As ≤ 1,5;

2.2.3.2. Độ đặc hiệu
Tiến hành phân tích theo điều kiện đã chọn (QAB ĐKĐL) các mẫu sau:
- Mẫu trắng: Dung môi pha mẫu;
- Mẫu chuẩn đối chiếu: Hỗn hợp isoorientin, cynarosid và casticin với nồng độ 30
µg/ml mỗi chất đối chiếu;
- Mẫu thử: Theo quy trình chuẩn bị mẫu định lượng (QAB QTCBM);
- Mẫu thử thêm chuẩn: Mẫu thử thêm 120% chuẩn trong thử nghiệm khảo sát độ
đúng.
Quan sát, so sánh thời gian lưu, phổ UV và độ tinh khiết pic của isoorientin,
cynarosid và casticin trong các mẫu trên;
Yêu cầu:
- Thời gian lưu, phổ UV của các pic isoorientin, cynarosid và casticin trong các
dung dịch mẫu chuẩn đối chiếu, mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn tương đương nhau.
18

.

.

Mẫu trắng khơng có tín hiệu của các pic này;
- Chiều cao và diện tích pic của các chất cần định lượng trong mẫu thử thêm chuẩn
cao hơn so với mẫu thử;
- Các pic của các chất cần định lượng tách hồn tồn với các pic khác và khơng có
thành phần khác khi sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết pic.
2.2.3.3. Tính tuyến tính (khoảng xác định)
Pha các dung dịch đối chiếu gốc:
- Dung dịch isoorientin gốc 200 µg/ml: Cân chính xác 2 mg chất đối chiếu
isoorientin cho vào bình định mức 10 ml, thêm methanol 90% hịa tan và bở sung
cho đủ thể tích.
- Dung dịch cynarosid gốc 100 µg/ml: Cân chính xác 2 mg chất đối chiếu cynarosid
cho vào bình định mức 2 ml, thêm methanol 90% hịa tan và bở sung cho đủ thể tích
được dung dịch cynarosid 1000 µg/ml. Lấy 1 ml dung dịch này pha loãng 10 lần
được dung dịch cynarosid gốc 100 µg/ml.
- Dung dịch casticin gốc 250 µg/ml: Cân chính xác 2,5 mg chất đối chiếu casticin cho
vào bình định mức 10 ml, thêm methanol 90% hịa tan và bở sung cho đủ thể tích.
Từ các dung dịch đối chiếu gốc, pha các giai mẫu có nờng độ isoorientin, cynarosid
và casticin tương ứng như bảng 1.1.
Bảng 1.1. Nồng độ giai mẫu các chất đối chiếu
Dd 1

Dd 2

Dd 3

Dd 4

Dd 5

Dd 6

Isoorientin (µg/ml)

100

50

25

10

2

1

Cynarosid (µg/ml)

100

20

10

5

2

1

Casticin (µg/ml)

100

20

10

5

2

0,4

Ghi chú: Dd là dung dịch

Tiến hành triển khai trên UPLC với điều kiện sắc ký đã khảo sát (QAB ĐKĐL). Xác
định sự tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của các chất đối chiếu. Dùng phần
mềm Excel để tính tốn, biện ḷn và đưa ra phương trình hời quy tuyến tính.
u cầu: Hệ số tương quan tuyến tính R2 ≥ 0,999.
Sử dụng trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của phương trình hời quy và trắc
nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hời quy.
- Trắc nghiệm F (phân phối Fisher).
19
.

.

Giả thuyết:
H0: Bj = 0 “Phương trình hời quy khơng tương thích”
HA: Bj ≠ 0 “ Phương trình hời quy tương thích”
Giá trị thống kê:
S f2 : Phương sai của yếu tố khảo sát

2
Sf
F=
2
Sr

S 2r : Phương sai của yếu tố ngẫu nhiên

F0,05 = FINV (0,05;  1 ;  2 ) với  1 = 1 ;  2 = N – 2.
Biện luận:
Nếu F < F0,05 → chấp nhận giả thuyết H0.
Nếu F > F0,05 → chấp nhận giả thuyết HA.
- Trắc nghiệm t (phân phối Student)
Giả thuyết:
H0: Bj = 0 “Hệ số Bj khơng có ý nghĩa thống kê”
HA: Bj ≠ 0 “Hệ số Bj có ý nghĩa thống kê”
Giá trị thống kê:

t=

SB =

B
SB
S

2
N 2 N

X
−
X


 /N
i=1 i  i=1 i 

N: cỡ mẫu. Bậc tự do của giá trị t:  = N – 2.

Biện luận:
Nếu t < t0,05 () → chấp nhận giả thuyết H0.
Nếu t > t0,05 () → chấp nhận giả thuyết HA.
2.2.3.4. Độ lặp lại
Chuẩn bị 6 mẫu thử theo quy trình chuẩn bị mẫu định lượng (QAB QTCBM). Mỗi
mẫu tiến hành phân tích 1 lần với điều kiện đã chọn (QAB ĐKĐL). Thực hiện bởi
một người trong cùng một ngày, cùng phòng thí nghiệm và trên cùng một thiết bị.
2.2.3.5. Độ đúng
Thêm chính xác một lượng các chất đối chiếu vào mẫu thử đã được xác định hàm
20
.

Định lượng flavonoid của lá quan âm biển (vitex rotundifolia l f , verbenaceae) bằng phương pháp ce pda

Tài liệu liên quan

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về