Nghiên cứu cảm ứng hình thành rễ tơ bởi chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

i

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian thực hiện khóa luận, em đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt
tình của gia đình, thầy cơ và bạn bè. Đó là động lực lớn giúp em hồn thành khóa luận
tốt nhiệp này.
Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu trường Đại Học Tôn Đức
Thắng, Ban chủ nhiệm Khoa Khoa học ứng dụng và Bộ Môn Công nghệ Sinh học,
cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm cho em trong suốt quá
trình học tại trường.
Xin cảm ơn quý Công ty TNHH Gia Tường đã tạo điều kiện tốt nhất cho em và
các anh chị trong phịng thí nghiệm tại Cơng ty TNHH Gia Tường chi nhánh Bình
Dương đã nhiệt tình hướng dẫn giúp đỡ em trong suốt thời gian qua.
Em xin kính gửi lịng biết ơn sâu sắc đến thầy Th.S Nguyễn Như Nhứt, người
đã tận tình hướng dẫn, góp ý và khơng ngừng động viên em trong q trình nghiên cứu
và hồn thành khóa luận này.
Con thành kính ghi ơn Ba mẹ đã ni nấng, ln ở bên khuyến khích và tạo
niềm tin vững chắc trong những lúc khó khăn nhất. Tơi xin cảm ơn các bạn lớp
10SH1D đã luôn gần gũi và giúp đỡ tơi trong q trình thực hiện và hồn thành khóa
luận.
Cuối cùng xin cảm ơn tất cả mọi người đã giúp đỡ tơi suốt q trình học tập và
thực hiện tốt đề tài này.
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thanh Trường


ii

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự hướng
dẫn khoa học của Th.S Nguyễn Như Nhứt. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề

tài này là trung thực và chưa cơng bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây. Những số
liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác
giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo.
Ngồi ra, trong khóa luận còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số
liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn
gốc.
Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm
về nội dung khóa luận của mình. Trường đại học Tơn Đức Thắng khơng liên quan
đến những vi phạm tác quyền, bản quyền do tôi gây ra trong q trình thực hiện (nếu
có).
TP. Hồ Chí Minh, ngày 16 tháng 01 năm 2015
Tác giả


iii


iv

TĨM TẮT
NGUYỄN THANH TRƯỜNG

Đại Học Tơn Đức Thắng

Tháng 01 năm 2015

“NGHIÊN CỨU CẢM ỨNG TẠO RỄ TƠ CÂY DỪA CẠN
(Catharanthus roseus) BẰNG MỘT SỐ VI KHUẨN
Agrobacterium rhizogenes ĐƯỢC PHÂN LẬP
Ở VIỆT NAM”

Giảng viên hướng dẫn: ThS. NGUYỄN NHƯ NHỨT
Cây dừa cạn Catharanthus roseus là một loài cây thảo dược từ được xem như
một vị thuốc quý trong dân gian. Rễ tơ cây dừa cạn được cảm ứng bởi vi khuẩn
Agrobacterium rhizogenes đem đến nhiều tiềm năng ứng dụng trong sản xuất các sản
phẩm chứa hợp chất thứ cấp có dược tính sinh học. Đề tài nghiên cứu khả năng xâm
nhiễm của một số chủng Agrobacterium rhizogenes và những yếu tố ảnh hưởng đến
khả năng cảm ứng tạo rễ tơ của Agrobacterium rhizogenes trên cây dừa cạn bằng
phương pháp gây nhiễm trên mô lá in vitro bị tổn thương.
Những kết quả đạt được:
Từ 5 chủng Agrobacterium rhizogenes (01, 02, 04, 17, 18) được tiến hành gây
nhiễm trên hai giống dừa cạn VIN072 và VIN077, chỉ có 3 chủng 02, 04 và 18 có khả
năng cảm ứng tạo rễ tơ trên giống dừa cạn VIN072 và 2 chủng 04 và 18 có khả năng
cảm ứng tạo rễ tơ trên giống dừa cạn VIN077. Trong đó, chủng 18 cho tần số cảm ứng
rễ tơ cao nhất trên hai giống dừa cạn.
Khảo sát điều kiện thích hợp để chủng A. rhizogenes 18 cảm ứng tạo rễ tơ cao
trên các giống dừa cạn. Kết quả cho thấy, với cách ngâm mẫu lá in vitro bị tổn thương
trong dịch khuẩn, chế độ ánh sáng mạnh 2200 lux, 16 giờ/ngày và bổ sung
acetosyringone vào môi trường nuôi cấy khuẩn trước với nồng độ thích hợp là 100 µM
(đối với giống VIN072) và nồng độ 50 µM (đối với giống VIN077) thì tần số cảm ứng
tạo rễ tơ của chủng A. rhizogenes 18 sẽ cao.


v

MỤC LỤC
Trang
LỜI CÁM ƠN .............................................................................................................i
LỜI CAM ĐOAN................................................................................................... ......ii
NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN.........................................................................................iii
TÓM TẮT

...........................................................................................................iv

MỤC LỤC

............................................................................................................v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT..................................................................................viii
DANH MỤC BẢNG....................................................................................................ix
DANH MỤC BIỂU ĐỒ................................................................................................x
DANH MỤC HÌNH....................................................................................................xi
MỤC LỤCv
CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU..................................................................................................1
1.1 Đặt vấn đề.............................................................................................................1
1.2 Mục tiêu................................................................................................................2
1.3 Nội dung nghiên cứu.............................................................................................2
1.4 Ý nghĩa.................................................................................................................. 2
CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN...........................................................................................3
2.1 Giới thiệu về vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes................................................3
2.1.1 Vị trí phân loại...............................................................................................3
2.1.2 Phân loại [19][46]..........................................................................................3
2.1.3 Đặc điểm phân bố và hình thái [2].................................................................3
2.1.4 Đặc điểm sinh lý............................................................................................4
2.1.5 Sự cảm ứng hình thành rễ tơ bởi vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes và đặc
điểm của rễ tơ 4
2.1.6 Đặc điểm của rễ tơ cảm ứng bởi vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes...........9
2.2 Sơ lược về nguồn gốc cây dừa cạn Catharanthus roseus.....................................10


vi

2.2.1 Vi trí phân loại và phân bố [37][18].............................................................10
2.2.2 Phân loại [28]...............................................................................................11
2.2.3 Đặc điểm thực vật học và sinh thái của cây dừa cạn [9][18]........................11
2.2.4 Các hợp chất sinh học có trong cây dừa cạn................................................12
2.2.5 Trồng trọt và thu hoạch................................................................................13
2.2.6 Công dụng từ cây dừa cạn [38][3]...............................................................14
2.3 Ứng dụng của việc cảm ứng tạo rễ tơ bằng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 16
2.3.1 Ứng dụng của nuôi cấy rễ tơ........................................................................16
2.3.2 Ứng dụng nuôi cấy rễ tơ cây dừa cạn cảm ứng bằng A. rhizogenes.............18
2.3.3 Tình hình ni cấy rễ tơ cây được cảm ứng bằng A. rhizogenes..................19
2.3.4 Những tồn động và triển vọng của việc nuôi cấy rễ tơ cảm ứng bởi vi khuẩn
A. rhizogenes 21
CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP...........................................................22
3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm........................................................22
3.2 Đối tượng nghiên cứu..........................................................................................22
3.3 Dụng cụ và hóa chất............................................................................................22
3.4 Mơi trường..........................................................................................................23
3.4.1 Môi trường bảo quản giống vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes [19].........23
3.4.2 Môi trường tăng sinh giống vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes................23
3.4.3 Môi trường nuôi cấy thực vật [7].................................................................23
3.5 Phương pháp.......................................................................................................25
3.5.1 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật trên môi trường YMB thạch
nghiêng [3] 25
3.5.2 Phương pháp tăng sinh vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes [3]..................25
3.5.3 Phương pháp trang đĩa vạch thẳng góc [2]...................................................25
3.5.4 Phương pháp khử trùng hạt [4]....................................................................25


vii
3.5.5 Phương pháp nuôi cấy cây dừa cạn in vitro [4]............................................26

3.5.6 Phương pháp gây nhiễm để cảm ứng tạo rễ tơ cây dừa cạn in vitro [14].....26
3.6 Bố trí thí nghiệm.................................................................................................27
3.6.1 Thí nghiệm 1: Sàng lọc chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes có khả
năng cảm ứng tạo rễ tơ cây dừa cạn......................................................................27
3.6.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện gây nhiễm...........28
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN..................................................................31
4.1 Khả năng cảm ứng tạo rễ tơ cây dừa cạn của các chủng A. rhizogenes...............31
4.2 Ảnh hưởng của một số điều kiện gây nhiễm.......................................................35
4.2.1 Ảnh hưởng cách gây nhiễm [24]..................................................................35
4.2.2 Ảnh hưởng của ánh sáng..............................................................................36
4.2.3 Ảnh hưởng cách bổ sung acetosyringone vào mơi trường đến tần số cảm ứng
hình thành rễ tơ 38
4.2.4 Ảnh hưởng của hàm lượng acetosyringone bổ sung vào dịch khuẩn...........40
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.....................................................................42
5.1 Kết luận...............................................................................................................42
5.2 Kiến nghị............................................................................................................. 42


viii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
A. rhizogenes.....................................................Agrobacterium rhizogenes
A. tumefaciens...................................................Agrobacterium tumefaciens
C. roseus............................................................Catharanthus roseus
ĐC.....................................................................Đối chứng
DNA..................................................................Deoxyribo Nucleic axit
MS.....................................................................Murashige và Skoog
NT.....................................................................Nghiệm thức
plasmid Ri.........................................................plasmid Root inducing
plasmid Ti..........................................................plasmid Tumour inducing

VIN072..............................................................Catharanthus roseus VIN072
VIN077..............................................................Catharanthus roseus VIN077
YMB..................................................................Yeast Manitol Broth


ix

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: Các nghiệm thức sàng lọc chủng vi khuẩn A. rhizogenes với giống dừa cạn
VIN072
28
Bảng 3.2: Các nghiệm thức khảo sát cách gây nhiễm đến việc hình thành rễ tơ ở cây
dừa cạn VIN072...........................................................................................................28
Bảng 3.3: Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của cường độ ánh sáng trong quá trình
ủ đến việc hình rễ tơ cây dừa cạn VIN072...................................................................29
Bảng 3.4: Các nghiệm thức cách bổ sung acetosyringone vào môi trường tạo rễ tơ cây
dừa cạn VIN072...........................................................................................................29
Bảng 3.5: Các nghiệm thức của thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng hàm lượng
acetosyringone đến tần số cảm ứng rễ tơ của cây dừa cạn VIN072.............................30
Bảng 4.6: Tần số cảm ứng rễ tơ (%) giống dừa cạn VIN072 và VIN077 bằng các
chủng Agrobacterium rhizogenes khác nhau................................................................31
Bảng 4.7: Tần số cảm ứng tạo rễ tơ của giống dừa cạn VIN072 và VIN077 bằng vi
khuẩn A. rhizogenes chủng 18 với các cách gây nhiễm khác nhau..............................35
Bảng 4.8: Tần số cảm ứng tạo rễ tơ của giống dừa cạn VIN072 và VIN077 bằng vi
khuẩn A. rhizogenes chủng 18 với các chế độ sáng khác nhau....................................37
Bảng 4.9: Tần số cảm ứng tạo rễ tơ của giống dừa cạn VIN072 và VIN077 bằng vi
khuẩn A. rhizogenes chủng 18 với các cách bổ sung acetosyringone khác nhau.........38
Bảng 4.10: Tần số cảm ứng tạo rễ tơ của giống dừa cạn VIN072 và VIN077 bằng vi
khuẩn A. rhizogenes chủng 18 với các hàm lượng acetosyringone bổ sung vào dịch
khuẩn 40

DANH MỤC BIỂU ĐỒ


x

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Khối u gây ra do A. tumefaciens (trái) và rễ tơ do.........................................5
Hình 2.2: Các giai đoạn trong quá trình chuyển gen bằng Agrobacterium vào tế bào
thực vật. Bước 1: Sự cảm ứng vùng gen vir bằng các tín hiệu thực vật đặc hiệu các hợp
chất phenol như acetosyringone giải phóng ra từ tế bào thực vật tổn thương; Bước 2:
Gen virA được phosphoryl hóa nhờ tác động của tín hiệu. Sản phẩm của q trình này
lại tiếp tục phosphoryl hóa gen virG; Bước 3: Sự tạo sản phẩm hoạt hóa tồn bộ các
gen vir cịn lại, hai gen cuối cùng được hoạt hóa là gen virB và gen virE2; Bước 4:
Agrobacterium tiếp xúc với thành tế bào thực vật bị tổn thương. Quá trình này được
thực hiện nhờ các gen chain virA (chvA) và chain virB (chvB). Gen chvB mã hóa một
protein liên quan đến việc hình thành −1,2 glucan mạch vịng, trong khi đó gen chvA
mã hóa protein vận chuyển giúp vận chuyển −1,2 glucan vào khoảng giữa thành tế
bào và màng sinh chất, nhờ vậy vi khuẩn tiếp xúc với thành tế bào thực vật; Bước 5:
Gen virD2 được hoạt hóa, sản phẩm của nó được cảm ứng nhận biết lề trái và lề phải
của T-DNA và làm dứt phần T-DNA ra khỏi plasmid Ti thành các sợi đơn. Tạo thành
phức hợp ssT-DNA-virD2 (single strand T-DNA-virD2), gọi là phức hợp T chưa


xi
trưởng thành; Bước 6: Phức hợp này cùng với các gen vir liên quan sẽ di chuyển vào
tế bào thực vật qua cầu nối; Bước 7: Tại tế bào chất, Các virE2 đến bao lấy ssTDNAvirD2 chưa trưởng thành này, tạo thành phức hợp trưởng thành và dịch chuyển
dần về phía màng nhân; Bước 8: Phức hợp nhanh chóng xâm nhập vào nhân tế bào
thực vật. Tại đây, các protein vir tách rời khỏi phức hợp, ssT-DNA được chuyển thành
dsT-DNA (double stranded T-DNA), rồi được chèn vào nhiễm sắc thể thực vật [36]

[47]. 7
Hình 2.3. Cây dừa cạn.................................................................................................10
Hình 2.4: C. roseus var. roseus.....................................................................................11
Hình 2.5: C. roseus var. ocellatus.................................................................................11
Hình 2.6: C. roseus var. albus......................................................................................11
Hình 2.7. Cây dừa cạn.................................................................................................12
Hình 2.8: Tóm tắt ứng dụng của ni cấy rễ tơ............................................................16
Hình 3.9: Hoa của giống VIN072 (trái) và hoa của giống VIN077 (phải)...................22
Hình 3.10: Sơ đồ tóm tắt quy trình gây nhiễm A. rhizogenes lên cây dừa cạn in vitro.
27
Hình 3.11: Sơ đồ tóm tắt quá trình nghiên cứu............................................................31
Hình 4.12: Rễ tơ cây dừa cạn VIN072 được cảm ứng bởi A. rhizogenes chủng 18 sau 3
tuần gây nhiễm. 33
Hình 4.13: Rễ tơ cây dừa cạn VIN072 được cảm ứng bởi A. rhizogenes chủng 04 sau 3
tuần gây nhiễm. 34
Hình 4.14: Rễ tơ cây dừa cạn VIN072 được cảm ứng bởi A. rhizogenes chủng 02 sau 3
tuần gây nhiễm. 34
Hình 4.15: Rễ tơ cây dừa cạn VIN077 được cảm ứng bởi A. rhizogenes chủng 04 sau 3
tuần gây nhiễm. 34
Hình 4.16: Rễ tơ cây dừa cạn VIN077 được cảm ứng bởi A. rhizogenes chủng 18 sau 3
tuần gây nhiễm. 34


xii


1

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề

Agrobacterium rhizogenes là vi khuẩn Gram âm sống chủ yếu trong đất, có thể
xâm nhập vào vị trí tổn thương trên cây, kích thích tạo rễ tơ ở thực vật bậc cao. A.
rhizogenes có khả năng chuyển gen T-DNA từ plasmid Ri của chúng vào bộ gen thực
vật (Christey, 2001; Broothaerts và cộng sự, 2005) [23]. Những nghiên cứu kỹ thuật
nuôi cấy rễ tơ được cảm ứng bằng vi khuẩn A. rhizogenes được xem là một trong
những giải pháp đầy tiềm năng vì rễ tơ tạo ra bởi lồi vi khuẩn này có ưu điểm phát
triển nhanh, ổn định và không cần sử dụng đến các chất điều hòa sinh trưởng khác
(Collier và cộng sự, 2005) [39]. Vì thế, việc ứng dụng A. rhizogenes trong chuyển gen
ở thực vật đã trở thành công cụ hỗ trợ hữu hiệu trong việc phát hiện chức năng gen và
nghiên cứu sinh học rễ ở thực vật do sự tiện lợi, đơn giản và nhanh chóng của phương
pháp này (Cao và cộng sự, 2009) [39].
Cây dừa cạn Catharanthus roseus, thuộc họ Trúc đào Apocynaceae, là một
trong những dược liệu từ lâu được dân gian xem như một trong những “thần dược”.
Trong cây dừa cạn có khá nhiều hợp chất mang dược tính quan trọng, đem đến nhiều
cơng dụng trong việc chữa bệnh, cũng như nâng cao sức khỏe của con người như: tẩy
giun, chữa sốt, làm đẹp, làm săn da (astringent), lọc máu (dépuratif), chữa một số bệnh
ngoài da… Cây dừa cạn C. roseus có khả năng sản xuất một lượng lớn terpenoid
indole alkaloid và một vài hợp chất sinh học có dược tính khác lồi này là một trong
những đối tượng được sử dụng để sản xuất alkaloid, góp phần khơng nhỏ trong điều trị
bệnh ung thư [3].
Rễ tơ hiện nay được sử dụng trong sản xuất hợp chất thứ cấp, trong di truyền
học, nuôi cấy nhân giống thực vật trong nông nghiệp, lĩnh vực môi trường và nghiên
cứu công nghệ kỹ thuật mới cho sản xuất các sản phẩm sinh hóa từ cây. Tiềm năng của
rễ tơ cây dừa cạn C. roseus đã được ứng dụng để tạo ra sản phẩm chứa hợp chất
alkaloid từ một nghiên cứu ban đầu của Flores (1987) do hàm lượng alkaloid trong rễ
tơ khá cao và dễ thu nhận [2].
Từ những đặc tính ưu việt đó, các nhà khoa học đã ứng dụng Công nghệ sinh
học trong việc nuôi cấy rễ tơ của cây dừa cạn C. roseus bằng vi khuẩn A. rhizogenes
với mong muốn thu được lượng hợp chất sinh học có dược tính đáp ứng nhu cầu của

2
xã hội. Những đề tài nghiên cứu về vi khuẩn A. rhizogenes và khả năng tạo rễ tơ của
loài này ở thực vật cũng như ở cây Dừa cạn trên thế giới đã đạt được nhiều thành tựu,
nhưng chủ yếu về q trình, cơ chế và đặc tính hoạt động của chúng. Nước ta hiện nay
cũng đã có những nghiên cứu ứng dụng trong chuyển gen, y dược, nhưng những báo
cáo về nhận dạng, phân lập, xác định đặc tính từng chủng… trong cảm ứng tạo rễ tơ
vẫn còn sơ khai. Với những ưu điểm vượt trội của rễ tơ cây Dừa cạn (C. roseus) cùng
kết quả kế thừa của các nghiên cứu trước đây, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu
cảm ứng tạo rễ tơ cây dừa cạn (Catharanthus roseus) bằng một số vi khuẩn
Agrobacterium rhizogenes được phân lập ở Việt Nam”.

1.2 Mục tiêu
Sàng lọc chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes có tần số cảm ứng tạo rễ tơ
cao trên cây dừa cạn.
Đánh giá sự ảnh hưởng của một số điều kiện lên tần số cảm ứng tạo rễ tơ cây
dừa cạn của chủng A. rhizogenes đã sàng lọc như cách gây nhiễm, ánh sáng, cách bổ
sung acetosyringone và nồng độ acetosyringone.

1.3 Nội dung nghiên cứu
Khảo sát khả năng cảm ứng tạo rễ tơ cây dừa cạn của các chủng vi khuẩn A.
rhizogenes.
Khảo sát tần số cảm ứng tạo rễ tơ cây dừa cạn của chủng A. rhizogenes đã sàng
lọc được ở một số điều kiện khác nhau như cách gây nhiễm, ánh sáng, cách bổ sung
acetosyringone và nồng độ acetosyringone.

1.4 Ý nghĩa
Ý nghĩa khoa học: Đánh giá được khả năng xâm nhiễm cảm ứng tạo rễ tơ của
một số chủng Agrobacterium rhizogenes (01, 02, 04, 17 và 18) được phân lập ở Việt
Nam và đánh giá được vai trị của 1 số yếu tố trong q trình xâm nhiễm cảm ứng tạo

rễ tơ của Agrobacterium rhizogenes trên cây dừa cạn.
Ý nghĩa thực tiễn: Đề tài sẽ cung cấp thêm thông tin cho việc nghiên cứu sản
xuất rễ tơ cây dừa cạn (C. roseus) làm nguồn nguyên liệu để chiết xuất các hợp chất
thứ cấp có hoạt tính sinh học dùng trong y dược.


3

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN
2.1 Giới thiệu về vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
2.1.1 Vị trí phân loại
Agrobacterium rhizogenes cịn có tên gọi khác là Rhizobium rhizogenes, được
định danh lần đầu tiên cách bởi Riker và cộng sự năm 1930 [45]. Vi khuẩn A.
rhizogenes là tác nhân gây bệnh ở thực vật được gọi là hội chứng tạo rễ tơ . Theo Riker
và cộng sự (1930) A. rhizogenes có vị trí phân loại như sau:
Giới

:

Bacteria

Ngành

:

Proteobacteria

Lớp

:

Rhizobiales

Họ

:

Rhizobiales

Chi

:

Agrobacterium

Lồi

:

Agrobacterium rhizogenes

2.1.2 Phân loại [19][46]
Có khá nhiều cách phân loại khác nhau. Những chủng A. rhizogenes có thể
được phân loại theo các phân nhóm dựa vào dạng opine mà chúng tổng hợp. Opine là
các amino acid dị thường, nó là dẫn xuất của amino acid với đường, cũng được tìm
thấy ở các tế bào thực vật được chuyển gen bởi A. rhizogenes.
Hiện nay, A. rhizogenes được phân biệt gồm dạng agropine (đại diện là các
plasmid root inducing (plasmid Ri) pRiA4, pRi1855, pRiHRI, pRi15834 và
pRiLBA9402), dạng mannopine (đại điện plasmid Ri là pRi8196), dạng cucumopine
(đại diện plasmid Ri là Ri2659) và mikimopine (đại diện plasmid Ri là pRi1724).

Trong số các chủng A. rhizogenes được biết đến, K47, K599 và HRI là các dạng độc
tính cao có thể xâm nhiễm vào một phạm vi rộng các loại thực vật khác nhau.
2.1.3 Đặc điểm phân bố và hình thái [2]
Agrobacterium là nhóm vi khuẩn hiếu khí, hình que, Gram âm, khơng tạo bào
tử, chiều rộng khoảng 0,6 – 1,0 µm và chiều dài khoảng 1,5 – 3,0 µm. Các tế bào đứng
riêng lẻ hoặc kết đơi. Trong đó, có hai lồi được nghiên cứu nhiều nhất đó là A.
tumefaciens gây bệnh khối u thân, rễ và A. rhizogenes gây hội chứng tạo rễ tơ ở các vị
trí tổn thương của thực vật hai lá mầm. Khuẩn lạc A. rhizogenes có dạng hình trịn lồi,
trơn nhẵn và khơng chứa sắc tố.


4
Vào đầu những năm thế kỷ 19, các nhà sinh vật học đã phát hiện ra căn bệnh
tạo rễ tơ ở một số lồi thực vật. Bằng các phân tích sinh hóa, các nhà sinh học đã phân
lập và nhận diện được loài vi khuẩn A. rhizogenes gây ra bệnh này. Chúng phân bố chủ
yếu trong đất, sống ở vùng rễ của nhiều lồi thực vật khác nhau, có khả năng nhiễm
vào vết thương trên rễ cây, gây cảm ứng tạo rễ tơ và làm tăng sinh rễ thứ cấp.
2.1.4 Đặc điểm sinh lý
Agrobacterium rhizogenes có khả năng kích thích hệ rễ phát triển theo chiều
rộng và chiều sâu, giúp tăng cường sự trao đổi chất cũng như khả năng chịu đựng
stress của cây. Sự hiện diện của A. rhizogenes giúp cây trồng chống lại một số loại
nấm bệnh nhất định. A. rhizogenes tăng trưởng ở nhiệt độ tối ưu từ 20-28 0C và pH trên
4. Các chủng vi khuẩn A. rhizogenes khác nhau có điều kiện nhiệt độ và độ ẩm cũng sẽ
khác nhau [11].
Agrobacterium rhizogenes đóng vai trị như một yếu tố trung gian khiến cho
mầm bệnh tấn cơng vào cây trồng dễ dàng hơn [30], chúng có khả năng tổng hợp và
kích thích các hormon thực vật như auxin và cytokinin, gây tăng trưởng rễ thứ cấp ở
cây trồng, thông qua vết thương trên rễ cây và chuyển DNA của nó vào tế bào vật chủ.
Chúng được xem là một công cụ cho kỹ thuật di truyền cho các mục đích nghiên cứu
sinh hóa, dược học, sản xuất hợp chất thứ cấp trị bệnh ung thư… có tiềm năng lớn

trong tương lai [34].
2.1.5 Sự cảm ứng hình thành rễ tơ bởi vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes và đặc
điểm của rễ tơ
2.1.5.1

Quá trình hình thành rễ tơ bởi vi khuẩn A. rhizogenes
Trong các loài vi khuẩn Agrobacterium được dùng để chuyển gen vào thực vật

thì A. rhizogenes và A. tumefaciens được nghiên cứu nhiều nhất. Vi khuẩn A.
tumefaciens gây ra bệnh khối u (crown gall) do sự có mặt của plasmid Ti (Tumour
inducing), A. rhizogenes gây bệnh tạo rễ tơ ở vị trí tổn thương của thực vật, do có
plasmid Ri [5].


5

Hình 2.1: Khối u gây ra do A. tumefaciens (trái) và rễ tơ do
A. rhizogenes (phải) [5].
Mỗi chủng A. rhizogenes khác nhau có khả năng xâm nhiễm khác nhau vào tế
bào thực vật. Khi vi khuẩn xâm nhiễm vào tế bào thực vật, chúng sẽ chuyển plasmid
mang gen có kích thước vài trăm kb vào tế bào thực vật, tái tổ hợp vào genome của
thực vật chủ, tế bào thực vật có thể tổng hợp auxin và gia tăng tính nhạy cảm với
auxin. Quá trình chuyển gen tạo ra sản phẩm là rễ tơ được hình thành tại vết thương
xâm nhiễm hay vị trí gần đó [5].
2.1.5.2

Cơ chế và các yếu tố ảnh hưởng đến chuyển khả năng chuyển gen
Sau khi Agrobacterium rhizogenes xâm nhiễm vào tế bào, chúng gắn đoạn T-

DNA (đoạn gen cần chuyển) của Plasmid Ri vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật,

dẫn đến sự rối loạn các chất sinh trưởng nội sinh, tạo ra rễ tơ.


6

Hình 2.2: Cấu trúc plasmid Ri của A. rhizogenes [5].
Plasmid Ri là phân tử DNA mạch vịng, sợi kép, có trọng lượng phân tử lớn,
200-800 kb, gồm 2 vùng chính là T-DNA (gen được chuyển) và vùng vir (hệ thống tiết
các protein cần thiết). T-DNA được chia làm 2 loại là T-DNA đơn và T-DNA đơi. TDNA đơn có ở các chủng thuộc nhóm mikinopine, mannopine và cucumopine. T-DNA
đơi gồm TL-DNA và TR-DNA có ở các chủng thuộc nhóm agropine. Hai vùng này đều
có kích thước khoảng 15-20 kb và được xen kẽ bởi một đoạn DNA. Vùng TR của
plasmid Ri mang gen mã hóa các hormon, các chất kích thích sinh trưởng. Vùng TL
chứa hàng nghìn khung đọc trong đó có 4 locus 10, 11, 12, 15 mã hóa cho rolA, rolB,
rolC và rolD [34].


7

Hình 2.2: Các giai đoạn trong quá trình chuyển gen bằng Agrobacterium vào tế
bào thực vật. Bước 1: Sự cảm ứng vùng gen vir bằng các tín hiệu thực vật đặc hiệu các hợp
chất phenol như acetosyringone giải phóng ra từ tế bào thực vật tổn thương ; Bước 2:
Gen virA được phosphoryl hóa nhờ tác động của tín hiệu. Sản phẩm của q trình này
lại tiếp tục phosphoryl hóa gen virG; Bước 3: Sự tạo sản phẩm hoạt hóa tồn bộ các
gen vir cịn lại, hai gen cuối cùng được hoạt hóa là gen virB và gen virE 2; Bước 4:
Agrobacterium tiếp xúc với thành tế bào thực vật bị tổn thương. Quá trình này được
thực hiện nhờ các gen chain virA (chvA) và chain virB (chvB). Gen chvB mã hóa một
protein liên quan đến việc hình thành β-1,2 glucan mạch vịng, trong khi đó gen chvA
mã hóa protein vận chuyển giúp vận chuyển β-1,2 glucan vào khoảng giữa thành tế
bào và màng sinh chất, nhờ vậy vi khuẩn tiếp xúc với thành tế bào thực vật; Bước 5:
Gen virD2 được hoạt hóa, sản phẩm của nó được cảm ứng nhận biết lề trái và lề phải

của T-DNA và làm dứt phần T-DNA ra khỏi plasmid Ti thành các sợi đơn. Tạo thành
phức hợp ssT-DNA-virD2 (single strand T-DNA-virD2), gọi là phức hợp T chưa
trưởng thành; Bước 6: Phức hợp này cùng với các gen vir liên quan sẽ di chuyển vào
tế bào thực vật qua cầu nối; Bước 7: Tại tế bào chất, Các virE2 đến bao lấy ssTDNAvirD2 chưa trưởng thành này, tạo thành phức hợp trưởng thành và dịch chuyển
dần về phía màng nhân; Bước 8: Phức hợp nhanh chóng xâm nhập vào nhân tế bào
thực vật. Tại đây, các protein vir tách rời khỏi phức hợp, ssT-DNA được chuyển thành
dsT-DNA (double stranded T-DNA), rồi được chèn vào nhiễm sắc thể thực vật [36]
[47].
Theo như Kim và cộng sự (2008) [26], chủng vi khuẩn A. rhizogenes khác nhau
có khả năng cảm ứng tạo rễ tơ khác nhau trên cùng một giống thực vật. Cho đến nay
cơ chế chuyển gen A. tumefacien được ứng dụng để giải thích cho cơ chế chuyển gen
cho A. rhizogenes và trong quá trình chuyển gen này chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố
như độ tuổi cây, loại mô (Sevon và Oksman-Caldentey, 2002), chủng vi sinh vật và
nồng độ huyền phù vi khuẩn (Park và Facchini, 2000). Jung Tao và Ling Li (2006)


8
quan tâm tới các yếu tố ảnh hưởng gồm nồng độ acetosyringeone (0-40µM bổ sung
vào mơi trường ni cấy mỗi nguyên liệu thực vật và nuôi cấy trong 2 ngày trước khi
gây nhiễm) và pH (4,5-7,5, môi trường nuôi cấy mẫu nguyên liệu thực vật và nuôi cấy
trong hai ngày trước khi gây nhiễm), khả năng kháng kháng sinh kanamycin (0-300
mg/l) của rễ được chuyển gen [22]. Manuel Sánchez-Olate và cộng sự (2009) báo cáo
thời gian chiếu sáng có ảnh hưởng lên khả năng cảm ứng tạo rễ tơ trên thực vật A.
rhizogenes nhưng tùy theo chủng vi khuẩn [31].
2.1.5.3

Vai trị của các gen rol
Như trình bày trên, trong plasmid Ri có chứa 4 gen gây bệnh khối u quan trọng

nằm ở các locus 10, 11, 12, 15 tương ứng với các gen rolA, rolB, rolC và rolD. Vai trò

của các gen rol trong thực vật chuyển gen đến nay còn đang được quan tâm nghiên
cứu. Theo các báo cáo trước đây, bằng các phương pháp gây đột biến để đưa từng gen
rol riêng lẻ vào trong tế bào thực vật thì cây chuyển gen có các kiểu hình thay đổi khác
nhau tương ứng với từng gen rol [37].
a. RolA
Hiện diện trong tất cả các plasmid Ri, nó mã hóa một protein với khối lượng
phân tử 11kDa. Ngoài tác động lên sự hình thành rễ tơ, gene rolA hiện diện trong thực
vật chuyển gene cịn tạo ra kiểu hình khác thường cao, mang đặc tính như lá nhăn,
xanh đậm, lóng ngắn, giảm tăng trưởng và hoa bất thường [37].
b. RolB
Gene rolB kích thước khoảng 362-437 bp, mã hóa một protein chiều dài khoảng
178-180 amino acid. Sự hiện diện gene rolB trong các thực vật chuyển gene là rất cần
thiết, vì khi thiếu gene này, sẽ gây mất cảm ứng tạo rễ tơ. Gene rolB làm rễ tơ phát
triển rất nhanh, theo hướng nghiêng và phân nhánh. Sự biểu hiện rolB cũng gây ra
những thay đổi trong cảm ứng với auxin và trong tổng hợp hợp chất thứ cấp [36][37].
c. RolC
Sự biểu hiện rolC cần thiết cho hoạt động tăng trưởng của rễ tơ. Các trình tự
gene rolC từ các T-DNA plasmid Ti khác nhau tương tự nhau, cỡ khoảng 637-643 bp.
RolC mã hóa một protein chiều dài khoảng 259-279 amino acid. Cây mang rolC có
biểu hiện kiểu hình lùn, tăng số lượng nhánh ở rễ, giảm ưu thế đỉnh, lá hình mũi mác
và ra hoa sớm, giảm kích thước hoa và lượng phấn hoa. Sự bất hoạt các gene rol cho


9
thấy sự thay đổi của kiểu hình rễ hay làm mất sự hình thành rễ tơ và tương tự như
rolB. RolC cũng kích thích tăng tổng hợp các hợp chất thứ cấp [36][41].
a. RolD
RolD cỡ khoảng 1032 bp và mã hóa protein 344 amino acid, một enzyme
ornithine cyclodeaminse xúc tác sự kết hợp của ornithine với proline. Sự biểu hiện của
rolD tác động theo nhiều hướng bao gồm cảm ứng sự ra hoa và làm tăng lượng hoa,

cuối cùng có thể có liên quan đến năng suất cây trồng [37][41].
2.1.6 Đặc điểm của rễ tơ cảm ứng bởi vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
Rễ tơ (hairy root) được tạo ra do sự chuyển gene sử dụng hệ thống vector tự
nhiên từ tác nhân gây bệnh là A. rhizogenes vào tế bào thực vật. Rễ tơ phát triển nhanh
theo hướng nghiêng, phân nhánh nhiều mà khơng cần chất điều hịa tăng trưởng thực
vật ngoại sinh, có sự ổn định về mặt di truyền, có khả năng tổng hợp một lượng lớn và
ổn định các hợp chất thứ cấp trong thời gian ngắn. Đặc biệt có khả năng sản xuất các
hợp chất mới khơng tạo ra ở các rễ không chuyển gene [8].
Trong quá trình xâm nhiễm vào mơ thực vật bị thương, vi khuẩn này chuyển TDNA, một phần của Ri-plasmid vào bộ gene tế bào chủ. Những chủng vi khuẩn thuộc
nhóm agropine có hoạt lực mạnh, T-DNA chứa 2 phần riêng rẻ được gọi là TL-DNA,
mang những gene rol cảm ứng cho sự hình thành kiểu hình rễ tơ và TR-DNA mang
một số gene mã hóa ra enzyme điều hịa sự sinh tổng hợp và xác định sự cân bằng
hormone trong những rễ đã chuyển gene. Sau khi A. rhizogens xâm nhiễm vào mơ, rễ
hình thành và phát triển từ vị trí bị thương, được cắt ra và sau đó chuyển sang môi
trường lỏng và nuôi cấy lắc để tăng sinh khối.


10

2.2 Sơ lược về nguồn gốc cây dừa cạn Catharanthus roseus
2.2.1 Vi trí phân loại và phân bố [37][18]
Dừa cạn hay hải đằng, dương giác, bông dừa, trường xuân hoa… là một loại
cây thảo dược. Từ lâu, dân gian xem như là một vị thuốc quý để chữa bệnh và hiện
đang được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu [1].
Vị trí phân loại cây dừa cạn [28][37]:
Giới

:

Thực vật

Ngành

:

Hạt kín

Lớp

:

Hai lá mầm

Bộ

:

Long đỏm

Họ

:

Dừa cạn

Giống

:

Catharanthus

Lồi

:

Catharathus roseus
Hình 2.3. Cây dừa cạn
Catharanthus roseus

Chi Catharanthus có nguồn gốc ở Madagasca, trong đó bao gồm cả loài C.
roseus (cây dừa cạn). Cây này được du nhập sang nhiều nước nhiệt đới ở Nam Á cũng
như Đơng Nam Á, trong đó có Việt Nam và đảo Hải Nam Trung Quốc. Vào đầu
khoảng giữa thế kỷ 18, cây dừa cạn được trồng ở Paris, sau đó có mặt tại nhiều vườn
thực vật khác ở Châu Âu.
Môi trường ven biển cũng là nơi mọc tập trung của cây dừa cạn như
Madagasca, Srilanca, Ấn Độ, Philippin, Malaysia, Thái Lan. Ở Madagasca, cây còn
mọc cả ở những vùng đồi, savan, cây bụi trên đất pha cát hoặc sỏi đá, độ cao tới
1500m.
Nguồn cây dừa cạn mọc tự nhiên ở Việt Nam tương đối dồi dào. Trước năm
1975, miền Bắc đã từng xuất khẩu sang Đông Âu 1 - 3 tấn/năm. Những năm gần đây,
lượng xuất khẩu sang Pháp (khoảng trên 10 tấn/năm) thường xuyên hơn, nhưng chủ
yếu là từ cây trồng tại tỉnh Phú Yên.
Ở Việt Nam, cây dừa cạn là cây hoang dại, phân bố phổ biến từ tỉnh Quảng
Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng ven biển và ở các tỉnh miền Trung như Thanh
Hóa, Nghệ An, Huế, Quảng Nam, Ðà Nẵng, Bình Ðịnh và Phú Yên. Cây dừa cạn có


11
khi mọc gần như thuần loại trên các bãi cát dưới rừng phi lao, trảng cỏ cây bụi thấp, có
khả năng chịu đựng điều kiện đất đai khô cằn của vùng cát ven biển. Cây dừa cạn còn

được trồng khắp nơi trong nước để làm cảnh và làm thuốc. Ngoài ra, chúng cịn có ở
Cơn Đảo và Phú Quốc.
2.2.2 Phân loại [28]
Catharanthus roseus là nguồn giàu alkaloid. Những alkaloid này thuộc chủng
loại alkaloid indole terpenoid được cô lập từ 3 giống cây khác nhau:
•

‘roseus’ với hoa màu tím hoặc hồng.

•

‘albus’ với hoa màu trắng.

•

‘ocellatus’ với hoa màu trắng tâm đỏ.

Hình 2.4: C. roseus var. roseus .

Hình 2.5: C. roseus var. ocellatus.

Hình 2.6: C. roseus var. albus.
2.2.3 Đặc điểm thực vật học và sinh thái của cây dừa cạn [9][18]
Cây dừa cạn là loại cây ưa sáng, ưa ẩm và có khả năng chịu được hạn. Cây sinh
trưởng phát triển mạnh. Cây ra hoa quả nhiều hàng năm, cây trồng từ hạt ra hoa quả
sau 4 - 5 tháng. Trong thời kỳ sinh trưởng mạnh, nếu bị cắt, cây tái sinh chồi khỏe.


12

Hình 2.7. Cây dừa cạn.
1. Cành hoa; 2. Hoa; 3. Đài hoa theo mặt cắt dọc;
4. Trái dừa cạn; 5. Hạt dừa cạn.

Cây dừa cạn là cây thân thảo sống lâu năm, cao 40 – 60 cm, phân nhiều cành.
Thân mọc thẳng, hình trụ nhẵn, màu xanh lục nhạt hay nâu đỏ. Lá mọc đối, hình bầu
dục, gốc thn, đầu tù hoặc hơi nhọn, dài 4 – 6 cm, rộng 2 – 3 cm, hai mặt nhẳn, mặt
trên sẫm bóng, mặt dưới nhạt. Hoa màu hồng hoặc trắng (trắng hiếm hơn). Hoa mọc
riêng lẻ ở kẽ lá gần ngọn, đài 5 thùy, hình ống ngắn, tràng có 5 cánh, ống tràng hẹp
phình ra ở dưới các cánh hoa, nhị 5 đính vào họng của ống tràng. Quả dài 2,5 – 3 cm,
mọc thẳng hơi chỗi ra, hạt nhỏ, hình trứng màu nâu nhạt hoặc nâu đen. Mùa hoa quả,
tháng 4 – 5 và tháng 9 – 10.
2.2.4 Các hợp chất sinh học có trong cây dừa cạn
Trong tự nhiên, các hợp chất có hoạt tính sinh học trong cây dừa cạn được chia
thành 2 nhóm. Nhóm hợp chất sơ cấp là những thành phần không thể thiếu trong cây,
gồm các chất cơ bản cần cho sự sống của cây và có ở tất cả các loại cây trồng (các
hydrat cacbon, lipit và acid amin..) và nhóm hợp chất thứ cấp là được sinh tổng hợp từ
chất trao đổi sơ cấp nhưng có sự phân bố giới hạn trong thực vật những hợp chất đặc


13
trưng cho lồi cây trồng, đóng vai trị quan trọng trong sự sống và sinh sản của thực
vật [9].
Nghiên cứu của các nhà khoa học cho thấy, cây dừa cạn có chứa một số
alkaloid có tác dụng hạ huyết áp như trong cây ba gạc Ấn Độ (Rawolfia serpentiana
Benth). Ngoài ra, cịn có resecpin, secpentin, ajmalixin, vinxein, vindolixin, digitalin
và hoạt chất giống insulin, nhưng đáng chú ý nhất là những alkaloid có nhân indol có
trong tất cả các bộ phận của cây, nhiều nhất là ở rễ và rất thấp ở lá. Năm 1958, Noble
và cộng sự đã chiết được một alkaloid từ lá dừa cạn vincaleucoblastine (còn gọi là
vinblastine). Sau đó 4 năm, Svoboda và cộng sự cũng phát hiện thêm một alkaloid nữa

là vincaleucocristin (còn gọi là vincristine) [9]. Hiện nay, trên thế giới nhiều loại thuốc
tổng hợp đã được sử dụng nhưng chúng vẫn không thay thế được các loại thuốc có
nguồn gốc từ thực vật. Vì có một số hoạt chất thứ cấp chưa tổng hợp được bằng con
đường hóa học hoặc nếu tổng hợp được thì giá thành của các loại thuốc sản xuất tổng
hợp không rẻ hơn mà tác dụng lại không bằng các chất chiết xuất từ cây. Ví dụ như
ajmalin, morphin, scopolamin, quinin, strychmin [50]… Serpentine dùng để điều trị
bệnh cao huyết áp và thuốc an thần. Ajmalicine là chất có biệt tính dược học mạnh,
dùng để điều trị cao huyết áp, dùng làm thuốc giảm đau và điều trị các bệnh về hệ thần
kinh và các triệu chứng lâm sàng khác. Vindoline và catharanthine được dùng trong
việc điều trị bệnh bí tiểu và làm hạ lượng đường trong máu. Từ vindoline và
catharanthine người ta tổng hợp được những alkaloid chứa nhóm dimer như
vinblastine và vincristine có tác dụng trị ung thư. Vincristin sulfat là một trong những
thuốc chống ung thư được dùng rộng rãi nhất, đặc biệt có ích đối với các bệnh ung thư
máu, thường được dùng để làm thuyên giảm bệnh bạch cầu lympho cấp. Vinblastin
sulfat là thuốc dùng trong liệu pháp phối hợp, được lựa chọn hàng đầu để điều trị ung
thư biểu mơ tinh hồn và được lựa chọn hàng thứ hai trong liệu pháp trị bệnh ung thư
lá lách, ung thư nhau, ung thư biểu mô da đầu và ung thư biểu mô thận.
2.2.5 Trồng trọt và thu hoạch
Dừa cạn là loại cây ưa sáng, ưa ẩm và có khả năng chịu được hạn. Trong điều
kiện trồng trọt, khi được cung cấp đầy đủ điều kiện cần thiết, cây sinh trưởng phát
triển mạnh, khối lượng chất xanh thu được có thể cao gấp đơi cây mọc từ thiên nhiên.
Cây mọc từ hạt trong tự nhiên vào khoảng 40%, nếu được xử lý có thể tăng lên 90%.
Cây trồng từ hạt ra hoa sau 4-5 tháng. Trong thời kì sinh trưởng mạnh, nếu bị cắt, cây