Xây dựng phương pháp định lượng một số hoạt chất kháng HIV trong thuốc bằng phương pháp điện di mao quản

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN THỊ THÙY LINH

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HOẠT
CHẤT KHÁNG HIV TRONG THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐIỆN DI MAO QUẢN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2012


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN THỊ THÙY LINH

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HOẠT
CHẤT KHÁNG HIV TRONG THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐIỆN DI MAO QUẢN
Chun ngành: Hóa phân tích
Mã số: 604429

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. NGUYỄN VĂN RI

Hà Nội – Năm 2012


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN .................................................................................... 3
1.1. Giới thiệu về các thuốc điều trị HIV ................................................................... 3
1.2. Tình hình sử dụng thuốc HIV ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay .................. 6
1.3. Các phƣơng pháp phân tích định lƣợng thuốc HIV ............................................. 7
1.3.1.Các phƣơng pháp sắc ký

7

1.3.2.Phƣơng pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis-CE)

8

1.4. Giới thiệu chung về phƣơng pháp điện di mao quản...........................................9
1.4.1. Nguyên tắc của phƣơng pháp điện di mao quản.......................................9
1.4.2. Thiết bị của phƣơng pháp điện di mao quản...........................................10
1.4.3. Các quá trình xảy ra trong mao quản.......................................................11
1.4.4. Sự phân loại hay các kiểu (mode) của phƣơng pháp điện di mao quản...12
1.4.5. Điện di mao quản vùng (CZE).................................................................12
1.4.6. Phƣơng pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC)......13
1.4.7. Phân tích định lƣợng theo điện di mao quản............................................23
CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 24
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu......................................................................................... 24
2.1.1. Điều kiện nghiên cứu.............................................................................24
2.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu............................................................................25

2.2. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................. 26
2.2.1. Nội dung nghiên cứu...............................................................................26
2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.........................................................................26
CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................... 29
3.1. Nghiên cứu khảo sát tối ƣu điều kiện tách 3TC,NVP và AZT .......................... 29
3.1.1. Chọn bƣớc sóng phát hiện chất ..............................................................29
3.1.2. Mao quản và xử lý mao quản ................................................................31
3.1.3. Chọn phƣơng pháp bơm mẫu..................................................................32
3.1.4. Độ điện di và độ điện di hiệu dụng.........................................................33


3.1.5. Lựa chọn cơ chế tách..............................................................................34
3.1.6. Ảnh hƣởng pH của dung dịch đệm điện di.............................................36
3.1.7. Ảnh hƣởng của thành phần dung dịch đệm.............................................39
3.1.8. Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ chất tạo mixen SDS...........................39
3.1.9. Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ đệm....................................................41
3.1.10. Khảo sát ảnh hƣởng thời gian bơm mẫu...............................................43
3.1.11. Khảo sát ảnh hƣởng thế điện di.............................................................45
3.1.12. Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ của mao quản ........................................46
3.1.13.Tổng kết điều kiện tối ƣu ......................................................................47
3.1.14. Định tính 3TC, AZT và NVP trong điều kiện điện di thiết lập.............47
3.2. Đánh giá phƣơng pháp phân tích. ...................................................................... 50
3.2.1. Khảo sát tính tƣơng thích hệ thống.........................................................50
3.2.2 Tính đặc hiệu............................................................................................50
3.2.3. Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đƣờng chuẩn....................................52
3.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ)....................56
3.2.5. Độ lặp lại của phƣơng pháp................................................................... 57
3.2.6. Độ đúng của phƣơng pháp....................................................................58
3.2.7. Kết quả định lƣợng trong chế phẩm......................................................61
3.3. Ƣu nhƣợc điểm của phƣơng pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen

(MEKC)....................................................................................................................63
3.4. Hƣớng phát triển của đề tài ................................................................................ 64
KẾT LUẬN...............................................................................................................65


DANH MỤC CÁC BẢNG
STT bảng

Tên bảng

Trang

1.1

Các chất hoạt động bề mặt dùng trong MEKC

19

3.1

Tổng kết các điều kiện điện di tối ƣu

47

3.2

Kết quả khảo sát tính tƣơng thích hệ thống

49

3.3

Diện tích pic trên điện di đồ và nồng độ 3TC tƣơng ứng

52

3.4

Diện tích pic trên điện di đồ và nồng độ AZT tƣơng ứng

54

3.5

Diện tích pic trên điện di đồ và nồng độ NVP tƣơng ứng

55

3.6

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ)

57

Kết quả xác định độ lặp lại của MEKC trong định lƣợng
3TC
Kết quả xác định độ lặp lại của MEKC trong định lƣợng
AZT
Kết quả xác định độ lặp lại của MEKC trong định lƣợng
NVP

Kết quả khảo sát độ đúng của phƣơng pháp trên thêm
chuẩn 3TC
Kết quả khảo sát độ đúng của phƣơng pháp trên thêm
chuẩn AZT
Kết quả khảo sát độ đúng của phƣơng pháp trên thêm
chuẩn NVP

57

3.13

Kết quả định lƣợng viên nén Avocomb-N

61

3.14

Kết quả định lƣợng viên nén Lamivudine 150mg &
Zidovudine 300mg

62

3.7
3.8
3.9
3.10
3.11
3.12

58

58
59
60
60


DANH MỤC CÁC HÌNH
Tên hình

STT

Trang

1.1

Sơ đồ ngun tắc cấu tạo của hệ điện di mao quản

11

1.2

Quá trình tách các chất trong CZE

13

1.3

Cấu trúc của Mixen và dòng EOF trong MEKC

15

1.4

Cấu trúc không gian của β- cyclodextrin

20

1.5

Cấu trúc không gian của phân tử α-CD, β- CD, γ- CD

21

1.6

Cấu trúc phân tử của phân tử α-CD, β- CD, γ- CD

22

3.1

Phổ hấp thụ của 3TC, AZT và NVP

31

3.2

Khảo sát cơ chế tách CZE, MEKC

35

3.3

Điện di đồ ở pH 8,76; 9,06; 9,30; 9,62; 10,17.

37

3.4

Điện di đồ tại nồng độ SDS 25mM; 50mM và 75mM

40

3.5

Điện di đồ tại nồng độ đệm 5mM; 10mM và 20mM

42

3.6

Điện di đồ tại thời gian bơm mẫu 3s, 5s và 7s

44

3.7

Điện di đồ tại thế điện di 15kV; 20kV và 22 kV

46

3.8

Điện di đồ của 3TC, AZT và NVP tại điều kiện tối ƣu

48

Điện di đồ của chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT và NVP tại
điều kiện tối ƣu
Điện di đồ của chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT và NVP sau khi
thêm 3TC tại điều kiện tối ƣu
Điện di đồ của chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT và NVP sau khi
thêm AZT tại điều kiện tối ƣu
Điện di đồ của chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT và NVP sau khi
thêm NVP tại điều kiện tối ƣu

48

3.13

Điện di đồ mẫu trắng

51

3.14

Điện di đồ của chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT và NVP

51

3.9
3.10
3.11
3.12

49
49
49


Điện di đồ của chế phẩm làm việc 3TC, AZT và NVP

51

Điện di đồ của chế phẩm làm việc 3TC, AZT và NVP
thêm hỗn hợp chuẩn
Đƣờng chuẩn biểu thị quan hệ giữa Diện tích pic và nồng
độ 3TC
Đƣờng chuẩn biểu thị quan hệ giữa Diện tích pic và nồng
độ AZT
Đƣờng chuẩn biểu thị quan hệ giữa Diện tích pic và
nồng độ NVP

52

3.20

Điện di đồ viên nén Avocomb-N

62

3.21

Điện di đồ viên nén Lamivudine 150mg & Zidovudine
300mg

63

3.15
3.16
3.17
3.18
3.19

53
54
55


DANH MỤC VIẾT TẮT

ARV

Virus gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời (Human
Immunodeficiency Virus)
Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở ngƣời
(Acquired immunodeficiency syndrome)
Thuốc kháng virut

USP

Dƣợc điển Mỹ (United State Pharmacopiea)

CE

Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis)

HIV
AIDS

CEC

Điện sắc ký mao quản (Capillary Electrochromatography)

CGE

Điện di mao quản gel (Capillary Gel Electrophoresis)

CZE

Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis)

DAD

Detector mảng diod (Diod Array Detector)

EOF

Spic

Dịng điện thẩm (Electro- osmotic Flow)
Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography)
Sắc ký điện động micell (Micellar Electrokinetic
chromatography)
Diện tích pic

tm

Thời gian di chuyển (Migration times)

SD

Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)

HPLC
MEKC

RSD %

Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative Standard Deviation)

STT

Số thứ tự

AZT

Zidovudine

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ

Giới hạn định lƣợng (Limit of Quantity)

NVP

Nevirapine

D4T

Stavudine

3TC

Lamivudine


MỞ ĐẦU
Theo phân tích của các chuyên gia, tổng số ngƣời nhiễm HIV vẫn đang
tiếp tục duy trì sự sống ngày càng đƣợc tăng cao là hệ quả của hai tác động chủ
yếu. Một là số ngƣời nhiễm HIV hàng năm trên tồn cầu vẫn ở mức cao. Chỉ
tính riêng năm 2008, thế giới vẫn có khoảng 2,7 triệu ngƣời mới nhiễm HIV.
Hai là do kết quả tích cực của liệu pháp điều trị kháng virut (ARV) làm giảm số
ngƣời tử vong, kéo dài sự sống cho ngƣời bệnh. Đến tháng 12/2008 ƣớc tính
khoảng 4 triệu ngƣời nhiễm HIV ở các nƣớc có thu nhập thấp và trung bình
đƣợc điều trị bằng thuốc kháng HIV, tăng lên 10 lần trong vòng 5 năm. Trong

vòng 4 năm (2004- 2008) nhờ chăm sóc điều trị tốt, số ngƣời chết do AIDS đã
giảm 10% [12].
HIV/AIDS đang là vấn đề lớn hiện nay trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam.
Ở nƣớc ta Thành Phố Hồ Chí Minh là nơi có nhiều ca nhiễm HIV/AIDS nhất
(Sau đó là Hội An, An Giang, Hải Phịng, Quảng Ninh,...). Chúng ta không chỉ
ngăn chặn sự lây lan của bệnh mà còn điều trị hiệu quả để giảm nguy cơ tử vong
kéo dài và cải thiện chất lƣợng cuộc sống cho ngƣời HIV/AIDS. Trong điều trị
thì kháng Retrovirut đóng vai trị rất lớn. Trƣớc đây nƣớc ta chƣa đầy đủ các loại
thuốc Retrovirut nên thƣờng dùng đơn hóa hoặc phối hợp hai loại thuốc trong
điều trị HIV/AIDS. Giờ có thể kết hợp 3 hoặc 4 loại thuốc trong những trƣờng
hợp lâm sàng nặng hơn. Hiện nay, nƣớc ta đã sản xuất đƣợc thuốc chống HIV là
Lamididrir (Lamivudine 150mg + Zidovudine 300mg). Tuy nhiên phần lớn vẫn
đang sử dụng thuốc kháng HIV theo chƣơng trình quốc gia đƣợc cấp [12]
Để đảm bảo trong điều trị, an toàn trong sử dụng, việc quản lý chất lƣợng
thuốc kháng HIV là rất cần thiết. Vì vậy cần có phƣơng pháp phân tích có độ tin
cậy cao, nhanh nhằm đáp ứng yêu cầu kiểm soát tốt chất lƣợng thuốc HIV.
Cho tới nay sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phƣơng pháp phân tích hóa lý
đa số đƣợc sử dụng để định lƣợng các loại thuốc. Ƣu điểm của phƣơng pháp này
là độ lặp lại, độ chính xác và khả năng tách tốt. Đồng thời thiết bị HPLC hiện đã

1


đƣợc tích hợp với hầu hết các kỹ thuật hóa lý hiện có (phổ UV-VIS, phân tích
điện hóa, MS, NMR,…) cho phép nâng cao độ nhạy và hạ thấp giới hạn phát
hiện của phƣơng pháp. Tuy vậy, phƣơng pháp HPLC địi hỏi sử dụng dung mơi
có độ tinh khiết cao, đắt tiền, có nhiều loại gây ảnh hƣởng xấu, gây ô nhiễm môi
trƣờng. Đó là xuất phát điểm của việc lựa chọn và phát triển phƣơng pháp định
lƣợng thuốc dựa trên kỹ thuật hóa lý khác thay thế cho HPLC mà chúng tôi thực
hiện trong nghiên cứu này. Kỹ thuật tách mà chúng tôi lựa chọn làm cơ sở cho

nghiên cứu này là điện di mao quản (CE) [15].
CE là phƣơng pháp mới đƣợc phát triển, tuy nhiên có nhiều ƣu điểm vƣợt
trội là hiệu lực tách rất cao, kinh tế và đặc biệt là thời gian phân tích nhanh có
thể đáp ứng khơng những cho phân tích trong phịng thí nghiệm mà cịn phục vụ
cho phân tích lâm sàng và trong sản xuất. Vì thế đây là kỹ thuật rất hữu hiệu để
thay thế hay hỗ trợ HPLC trong nhiều lĩnh vực phân tích, trong đó có nghiên cứu
về Dƣợc.
Hơn nữa, chuyên luận chung về CE đã đƣợc quy định trong Dƣợc điển một
số nƣớc nhƣ Hoa Kỳ, Anh, Trung Quốc…Tuy nhiên ở Việt Nam, CE chƣa đƣợc
ứng dụng nhiều và kinh nghiệm ứng dụng trong phân tích dƣợc phẩm cịn hạn
chế. Do vậy chúng tơi nhận định hƣớng nghiên cứu của mình sẽ rất có ý nghĩa
thực tiễn cho công tác nghiên cứu quản lý chất lƣợng thuốc ở nƣớc ta.
Từ những phân tích trên, chúng tơi tiến hành nghiên cứu ứng dụng của
phƣơng pháp điện di mao quản vào định lƣợng thuốc kháng HIV với đề tài:
“Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng một số hoạt chất kháng HIV trong thuốc
bằng phƣơng pháp điện di mao quản”.

2


CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN
1.1.Giới thiệu về các thuốc điều trị HIV
Nhóm 1: thuốc ức chế men sao chép ngƣợc có gốc nucleosides (nucleoside
reverse transcriptase inhibitors = NRTIs): Zidovudine (AZT, ZDV), Didanosine
(DDI), Zalcitabine (DDC), Stavudine (D4T), Lamivudine (3TC), Abacavir (ABC),
Tenofovir disoproxil fumarate.
Nhóm 2: thuốc ức chế men sao chép ngƣợc khơng có gốc nucleosides (nonnucleoside reverse transcriptase inhibitors = NNRTIs): Nevirapine, Delavirdine,
Effavirenz.
Nhóm 3: là thuốc ức chế proteases (protease inhibitors = PIs): Indinavir,
Ritonavir, Saquinavir, Nelfinavir, Amprenavir, Lopinavir .

Qua nghiên cứu, ngƣời ta thấy khơng nên đơn hóa trị liệu mà nên phối hợp các
thuốc nhóm 1 với nhau và với một thuốc nhóm 2 hoặc với một thuốc nhóm 3 để đạt
đƣợc hiệu quả điều trị cao.
Phác đồ phối hợp Lamivudin, Zidovudin và Nevirapin trong điều trị
Lamivudin và Zidovudin có cấu trúc tƣơng tự nucleosid có tác dụng kháng
retrovirus bao gồm cả HIV-1 và HIV-2 do ức chế enzym phiên mã ngƣợc của virus.
Hai thuốc này đƣợc sử dụng phối hợp trong liệu pháp kháng retrovirus để điều trị
HIV. Bệnh nhân uống 3TC, AZT kết hợp Nevirapine trong 6 tháng cho kết quả khá
khả quan. Các chỉ số đánh giá tình trạng bệnh nhân đƣợc cải thiện rõ rệt và có ý
nghĩa thống kê. Ngƣời bệnh tăng cân, có số lƣợng tế bào lymphocyte tăng rõ rệt (từ
1273/mm3 lên 1547/mm3), số lƣợng tế bào CD4 từ 70/mm3 lên 145/mm3 làm cho số
lƣợng tế bào CD4 bị phá hủy giảm đi. Nhƣ vậy, phác đồ D4T/3TC/NVP có thể
khống chế sự phát triển của virus. Liệu pháp kháng retrovirus làm tăng thời gian
sống sót của ngƣời bệnh có số lƣợng tế bào CD4 dƣới 500 trong 1mm3. Liệu pháp
này cũng có thể dùng cho những ngƣời bệnh có mật độ virus HIV trên 30000/ml
huyết tƣơng, không phụ thuộc vào số lƣợng tế bào CD4, vì mật độ HIV là một yếu
tố tiên lƣợng sự tiến triển của bệnh [12].

3


Liều dùng dựa trên thể trọng và tuổi của ngƣời bệnh, bệnh lý mắc kèm.
150mg 3TC, 30mg d4T ngày hai lần và NVP 200mg ngày một lần trong hai tuần
đầu sau đó NVR 200mg ngày hai lần cho ngƣời cân nặng dƣới 60kg với ngƣời lớn
và thiếu niên trên 16 tuổi kể cả phụ nữ có thai, trẻ em, bệnh nhân lao và bệnh nhân
đồng nhiễm viêm gan B
* Lamivudin:

(3TC)
Công thức phân tử: C8H11N3O3S. Phân tử lƣợng 229,3.

Tên

khoa

học:

4-amino-1[2-(hydroxymethyl)-1,3-

oxathiolan-5-

yl]-2(1H)

pyrimidinon
Tính chất: Là bột kết tinh màu trắng.
Nhiệt độ nóng chảy: 1600-1620C. Dễ tan trong nƣớc, ít tan trong cồn, khó tan trong
các dung môi hữu cơ.
Năng suất quay cực: [α]21D = - 1350 ( C = 0,38 % trong methanol )
Hằng số pKa= 3,31.
Lamivudin hấp thụ UV ở bƣớc sóng hấp thụ cực đại là 278nm; A1%1cm trong H+ 1M
~ 600 abs
Sau khi uống Lamivudin khoảng 1giờ, sinh khả dụng 80%, không bị ảnh hƣởng bởi
thức ăn. Đạt Tmax khoảng 1h sau khi dùng thuốc. Nồng độ đỉnh sau khi uống 150mg
là khoảng 1,5μg/ml.

4


*Zidovudin:

(AZT)

Công thức phân tử C10H13N5O4 . Phân tử lƣợng 267.242 g/mol.
Tên khoa học:
1-[(2R,4S,5S)-4-azido-5-(hydroxymethyl)

oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-

dione
Tính chất : Tinh thể trắng hoặc hơi nâu.
Nhiệt độ nóng chảy: ~ 1240C. Khó tan trong nƣớc, ít tan trong cồn .
Năng suất quay cực + 60,50 → + 63,00 ( C = 1% trong EtOH) ; + 990 (C = 0,5%
trong nƣớc)
Hằng số pKa= 9,36
Sau khi uống Zidovudin khoảng 0,5- 1giờ, sinh khả dụng 60-70%, bị ảnh hƣởng
khi ăn nhiều chất béo. Đạt Tmax khoảng 1h sau khi dùng thuốc. Nồng độ đỉnh sau
khi uống 250mg là khoảng 1,2 μg/ml.
*Nevirapin

(NVP)
Công thức phân tử C15H14N4O. Phân tử lƣợng 266.888 g/mol.
Tên khoa học:

5


11-cyclopropyl-4-methyl-5,11-dihydro-6H- dipyrido[3,2-b:2′,3′-e][1,4]diazepin-6one
Tính chất : Bột kết tinh màu trắng hoặc gần nhƣ trắng. Thực tế khơng tan trong
nƣớc, ít tan trong CH3Cl.
Năng suất quay cực + 60,50 → + 63,00 ( C = 1% trong EtOH) ; + 990 (C = 0,5%
trong nƣớc)
Hằng số pKa= 2,42.

Sau khi uống Nevirapin khoảng 4 giờ, sinh khả dụng > 90%, không bị ảnh hƣởng
bởi thức ăn hoặc thuốc kháng acid. Đạt Tmax khoảng 4h sau khi dùng liều duy nhất.
1.2. Tình hình sử dụng thuốc HIV ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay
Tính đến 31/5/2012, trên tồn quốc có 66.191 ngƣời nhiễm HIV trong đó có
62.654 ngƣời lớn và 3.537 trẻ em, đạt 94,6% kế hoạch năm 2012. Kết quả báo cáo
tại 10 tỉnh có số ngƣời đƣợc điều trị cao nhất là 46.332 bệnh nhân, chiếm 70% số
ngƣời nhiễm HIV đang đƣợc điều trị trên toàn quốc. Thành phố Hồ Chí Minh tiếp
tục là thành phố dẫn đầu cả nƣớc về số lƣợng ngƣời nhiễm HIV đang điều trị.
Tính đến 31/5/2012, thành phố Hồ Chí Minh có 20.435 ngƣời nhiễm HIV đang
điều trị, chiếm 30,9% số lƣợng bệnh nhân đang điều trị trên toàn quốc[10].
Tốc độ tăng trƣởng bệnh nhân điều trị ARV trung bình là 950 bệnh
nhân/tháng. Phác đồ bậc 1 chiếm đa số với tỷ lệ là 96,76%, phác đồ bậc 2 là
2,97% và có 0,27% thuộc phác đồ khác.
- Thực hiện chỉ đạo của Lãnh đạo Bộ Y tế tại Quyết định số 4139/QĐ-BYT
ngày 26/11/2011 về việc sửa đổi, bổ sung một số nội dung “Hƣớng dẫn chẩn
đoán và điều trị HIV/AIDS” đƣợc ban hành kèm theo Quyết định số 3003/QĐBYT ngày 19/8/2009 của Bộ trƣởng Bộ Y tế, Cục Phòng, chống HIV/AIDS đã
ban hành các văn bản hƣớng dẫn về việc điều trị bằng thuốc ARV tại các địa
phƣơng với các nội dung chính nhƣ sau:
- Bệnh nhân bắt đầu điều trị ARV: Phác đồ chỉ định là TDF/3TC/EFV
hoặc TDF/3TC/NVP. Khơng sử dụng phác đồ có Stavudin (d4T) cho các bệnh
nhân bắt đầu điều trị ARV.

6


- Đối với bệnh nhân đang điều trị ARV với phác đồ có Stavudin (d4T): thay thế
dần tiến đến loại trừ việc sử dụng thuốc d4T vào tháng 6/2013. Thuốc d4T chủ
yếu đƣợc chuyển đổi sang phác đồ có TDF hoặc AZT.
Hiện nay Cục Phòng, chống HIV/AIDS đang điều phối tồn bộ các nguồn
thuốc ARV do các chƣơng trình, dự án hỗ trợ để cung cấp thuốc ARV điều trị

cho bệnh nhân trên toàn quốc. Phối hợp chặt chẽ với các đối tác trong việc nhập
khẩu các dạng bào chế mới của thuốc ARV nhằm tăng cƣờng sự tuân thủ điều trị
ở ngƣời bệnh đặc biệt việc mua thuốc viên kết hợp 3 loại thuốc TDF/3TC/EFV
ngày uống 1 lần.[10]
Kể từ ca nhiễm HIV đƣợc phát hiện đầu tiên tại Mỹ từ năm 1981, cho đến nay
loài ngƣời đã trải qua 30 năm đối phó với một đại dịch quy mơ lớn, phức tạp, tính
đến cuối năm 2009, có 33,3 triệu ngƣời đang bị nhiễm HIV, tỷ lệ ngƣời nhiễm HIV
trong nhóm tuổi 15-49 là 0,8%. Riêng năm 2009 ƣớc tính có 2,6 triệu ngƣời nhiễm
mới HIV và 1,8 triệu ngƣời tử vong do AIDS. So sánh với năm 1999, số ngƣời
nhiễm mới HIV đã giảm 21%. Báo cáo UNAIDS cũng ghi nhận tính cuối năm 2009
đã có 33 nƣớc có số ca nhiễm mới giảm, trong đó 22 nƣớc khu vực cận Saharan,
Châu Phi. Tuy nhiên hiện vẫn còn 7 nƣớc tỷ lệ nhiễm mới tăng trên 25% khi so
sánh giữa năm 1999 và 2009[11].
1.3. Các phƣơng pháp phân tích định lƣợng thuốc HIV
1.3.1. Các phƣơng pháp sắc ký (HPLC & HPTLC)
Trong những năm gần đây, phƣơng pháp HPLC đã đóng một vai trị vơ cùng
quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất
là trong việc tách và phân tích lƣợng vết các chất. Phƣơng pháp HPLC với cột tách
pha đảo đƣợc sử dụng rất rộng rãi để xác định thuốc HIV trong các loại mẫu khác
nhau do có nhiều ƣu thế so với các phƣơng pháp khác vì có độ chính xác, độ nhạy,
độ lặp lại cao, khoảng tuyến tính rộng…
Detector ghép nối trong máy HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất sau khi
rửa giải. Hiện nay có rất nhiều loại detector đƣợc sử dụng cho mục đích này đã mở
rộng khả năng phân tích đƣợc rất nhiều loại chất bằng phƣơng pháp HPLC. Đối với

7


phân tích dƣ lƣợng, detector khối phổ (MS) là một sự lựa chọn ƣu tiên do có thể
phát hiện và phân tích chất trong các đối tƣợng phức tạp.

Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) với pha động là
20mM đệm Natri photphats (8mM muối Natrioctanesulphonic acid) : axetolnitril
(04:01,v/v), pH= 3,5 điều chỉnh bằng acid photphoric. Pha tĩnh là Cột C18-ODS
Hypersil (5µm x 250mm x 4,6mm). Thời gian lƣu của mỗi chất là Stavudine là 2,85
phút, Lamivudine là 4,33 phút và Nevirapine là 8,39 phút.[26]
Xác định bằng Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao với dung môi pha
động là chloroform: methanol(9:1,v/v), pha tĩnh là bản mỏng Silicagen 60F254 và
định lƣợng các chất ở bƣớc song hấp thụ 265nm. Hệ số lƣu giữ của Stavudine,
Lamivudine và Nevirapine lần lƣợt là 0.21-0.27, 0.62-0.72 và 0.82-0.93.[26]
Xác định thuốc HIV trong huyết tƣơng bằng phƣơng pháp LC-MS/MS với
metaxalone là chất chuẩn nội với giai đoạn đầu tiên là Chiết pha rắn, sau đó sử dụng
cột C18 (5µm x 150mm x 3.9mm) pha động là 0.5% acetic băng trong nƣớc :
axetolnitril (20:80,v/v). Các ion đƣợc tách ra và theo dõi trên máy phổ khối tứ
cực.[21]
1.3.2. Phƣơng pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE)
Gần đây, phƣơng pháp CE đƣợc sử dụng rộng rãi do tính chất ƣu việt về hiệu
quả tách cao, thời gian tách ngắn, lƣợng mẫu tiêu tốn ít. Phƣơng pháp đã đƣợc ứng
dụng để tách và xác định thuốc HIV trong nhiều đối tƣợng mẫu khác nhau.
Xác định Lamivudin (3TC), Stavudine( d4T) và Nevirapin (NVP) bằng phƣơng
pháp MEKC. Tác giả đã sử dụng Cột mao quản silica trần dài 73,5 cm (chiều dài
hiệu dụng 62cm), đƣờng kính trong là 75µm. Dung dịch điện li nền bao gồm 10mM
sodium tetraborat (pH= 9,8), 100mM sodiumdodecylsunphat (SDS) và 15%(v/v) 2propanol. Áp thế 20kV.Bơm mẫu bằng áp suất 50mbar trong 9s. Tất cả các chất
đƣợc tách ra trong vòng 14 phút. Khoảng tuyến tính 20-200 µg/ml (r2= 0,9996) cho
3TC; 5-50 µg/ml (r2= 0,9985) cho d4T và 25-250 µg/ml (r2= 0,9987) cho NVP[24]
Nhóm nghiên cứu đã tách đƣợc lamivudin và tạp đồng phân hoàn toàn (độ phân
giải 1,95) với điều kiện điện di thích hợp là: cột mao quản silaca nung chảy, đƣờng

8

kính trong 50 µm, chiều dài 48 cm, chiều dài hiệu quả 39,5 cm, nhiệt độ cột 250C,
điện thế 15 kV, bƣớc sóng phát hiện 270 nm… Về định lƣợng lamivudin trong chế
phẩm, với dung dịch đệm natri tetraborat (pH khoảng 9,2) và sự hiện diện của chất
hoạt động bề mặt là SDS (sodium dodecyl sulfat) có thể phân tích đồng thời
lamivudin và chất phối hợp zidovudin…; điều kiện điện di thích hợp là: cột mao
quản silaca nung chảy, đƣờng kính trong 50 µm, chiều dài 48 cm, chiều dài hiệu
quả 39,5 cm, nhiệt độ cột 250C, điện thế 15 kV, bƣớc sóng phát hiện 270 nm, dung
dịch đệm natri tetraborat 50 Mm chứa 50 mM SDS [9]
Micellar điện động sắc ký (MEKC) phƣơng pháp để tách và định lƣợng đồng
thời lamivudine và zidovudine trong dƣợc phẩm đã đƣợc phát triển. Các yếu tố ảnh
hƣởng đến sự tách, chẳng hạn nhƣ pH, nồng độ chất hoạt động bề mặt (sodium
dodecyl sulfate, SDS), dung môi hữu cơ và điện áp áp dụng đã đƣợc tối ƣu
hóa. Dung dịch điện ly nền bao gồm 12,5 decahydrate tetraborat mM sodium và 15
mM axit boric điều chỉnh pH 10,8, có chứa 90 mM SDS 5% (v / v) acetonitrile
(ACN) đã đƣợc khảo sát là phù hợp cho việc tách các loại thuốc. p-aminobenzoic
acid (PABA) đã đƣợc sử dụng nhƣ là chất chuẩn nội (IS). Phát hiện chất phân tích
và IS đƣợc thực hiện ở bƣớc sóng 210 nm. Điện di đồ đã đƣợc quan sát thấy rằng cả
hai loại thuốc và IS đã đƣợc di chuyển trong vòng 20 phút ở điện áp 10 kV. Đánh
giá của phƣơng pháp này đã đƣợc thực hiện về tính chính xác, độ tuyến tính, độ
đúng, giới hạn phát hiện (LOD) và định lƣợng (LOQ). Khoảng tuyến tính từ 10-80
mg / ml cho Lamivudine và 10-100 mg / ml cho Zidovudine. Các giới hạn phát hiện
cho Lamivudine và Zidovudine đƣợc tìm thấy là 2,5 và 2,0 mg / ml, tƣơng
ứng. Phƣơng pháp đã đƣợc áp dụng để xác định đồng thời Lamivudine và
Zidovudine trong huyết tƣơng. Độ thu hồi của cả hai thuốc ở dạng bào chế viên
thuốc và trong huyết tƣơng ≥ 99,72% (độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD) ≤ 1,84%) và
≥80,4% (RSD ≤ 5,4%), tƣơng ứng.[25]
1.4. Giới thiêụ chung về phƣơng pháp Điêṇ di mao quản
1.4.1. Nguyên tắc của phƣơng pháp điện di mao quản

9

Nguyên tắc của sự tách: là dựa trên cơ sở tính chất điện di (sự di chuyển Mobility) của các phần tử chất tan (các ion chất tan, chất phân tích) trong mao quản
(đƣờng kính 25 - 100 m ID) trên nền của dung dịch chất điện giải và có chất đệm
pH thích hợp, dƣới tác dụng của một từ trƣờng điện E nhất định đƣợc cung cấp bởi
một nguồn thế cao một chiều (V: 15 - 30 kV) đặt vào hai đầu mao quản. Nghĩa là
CEC là kỹ thuật tách đƣợc thực hiện trong mao quản nhờ lực từ trƣờng điện E điều
khiển sự tách của các chất. Việc dùng cột mao quản có nhiều ƣu việt, nhƣ tốn ít mẫu
và các hoá chất khác phục vụ cho sự tách, nhƣng số đĩa hiệu dụng Nef lớn, sự tách
các chất xẩy ra nhanh và hiệu quả cao.
Cơ chế điện di: Sự điện di của các phần tử chất tan (các ion) trong ống mao
quản là cơ chế di chuyển khác nhau của chất tan ( chất phân tích ), dƣới tác dụng
của lực điện trƣờng E nhất định (Electric Field Force: EFF) và tính chất (đặc trƣng)
của dịng điện di thẩm thấu (Electro-Osmotic Flow: EOF), trong sự phụ thuộc vào
điện tích và kích thƣớc của chúng. (Trong đó dịng EOF gọi là dòng điện di thẩm
thấu, hay dòng điện thẩm).
1.4.2. Thiết bị của phƣơng pháp điện di mao quản
Trang thiết bị của hệ: Theo nguyên tắc, để thực hiện điện di, hệ thống máy
phải có các bộ phận chính nhƣ sau:
1. Buồng điện cực, bình điện di và các điện cực trơ (Au hay Pt).
2. Cột tách (cột mao quản hay gọi tắt là mao quản),
3. Nguồn cấp thế cao một chiều (15-40 kV), tạo lực điện trƣờng E, để điều khiển
quá trình điện di của các chất.
4. Bộ phận nạp mẫu vào mao quản (cột tách).
5. Bô ̣ phâ ̣n phát hiê ̣n các chấ t sau khi tách (detector).
6. Bộ phận điều nhiệt cho mao quản.
7. Bộ phận ghi nhận sắc đồ tách của các chất trong hỗn hợp mẫu.
Các bộ phận này có thể xem trong sơ đồ ngun lý mơ tả ở hình 2.1

10

Hình 1.1. Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của hệ điện di mao quản
1.4.3 . Các quá trình xảy ra trong mao quản
Trong quá trình điện di, dƣới tác dụng của lực điện trƣờng E, do điện thế V
đặt vào hai đầu mao quản tạo ra, trong mao quản có các quá trình là:
1. Sự xuất hiện lớp điện kép sát thành mao quản.
2. Trong mao quản có dịng điện i (5 – 200 A).
3. Xuất hiện dòng điện di thẩm thấu EOF.
4. Sự tƣơng tác của các chất mẫu và pha động (MP) với thành mao quản.
5. Sự khuếch tán, hay hội tụ của vùng mẫu các chất, khi di chuyển.
6. Sự phân bố của các chất giữa 2 pha (động và tĩnh), khi mao quản có pha tĩnh thật
hay pha tĩnh giả (Mixen, trong hệ MEKC).
7. Hiệu ứng nhiệt Jun, làm mao quản nóng lên.
8. Sự phân tán, gradient và truyền nhiệt từ tâm mao quản ra xung quanh.
9. Sự di chuyển (sự điện di) của các chất (nhƣ các ion âm, ion dƣơng, và phần tử
trung tính) trong mao quản. Đây là q trình chính tạo ra sự sắc ký của các chất.
Nhƣng các quá trình trên (1-8) lại có tƣơng tác và ảnh hƣởng đến quá trình 9, nó có
thể làm tốt và cũng có thể làm xấu q trình điện di chuyển này của chất.
Đó là các q trình ln xẩy ra trong mao quản của HPCEC. Trong 9 q
trình xẩy ra đó, chỉ có quá trình 9 là dẫn đến sự tách của các chất, nhƣng các quá
trình khác (1-8) lại ảnh hƣởng đến quá trình 9, hoặc trực tiếp, hoặc gián tiếp. Vì thế,

11


muốn có kết quả điện di tốt, nhất thiết chúng ta phải ln xem xét tất cả các q
trình đó và các yếu tố liên quan đến các quá trình đó trong mao quản. Tức là phải
tối ứu hố các điều kiện điện di cho một loại đối tƣợng mẫu và các chất cần xác
định, để có đƣợc hiệu quả tách cao.

1.4.4. Sự phân loại hay các kiểu (mode) của phƣơng pháp điện di mao quản
Sắc ký điện di mao quản rất đa dạng, nhiều kiểu, từ đơn giản đến hoàn chỉnh
và phức tạp, nhƣng tuỳ theo cơ chế, bản chất, và đặc điểm của sự tách (sự điện di)
xẩy ra trong ống mao quản mà ngƣời ta thƣờng phân chia thành các loại hay các
kiểu (Mode) khác nhau, và gán cho mỗi kiểu một tên riêng, để dễ hiểu, hay phân
biệt và sử dụng chúng cho thích hợp. Cụ thể các kiểu đó là:
1. Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis: CZE)
2. Điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (Micell), (Micellary Capillary
Electro-Kenetic:MEK hay MCEK).
3. Điện di mao quản Gel-Filter (sàng lọc hay rây phân tử), (Capillary Gel
Electrophoresis: Gel-CE),
4. Điện di mao quản hội tụ đẳng điện (Capillary Iso-electric Focusing : CIEF).
5. Điện di mao quản đẳng tốc độ (Capillary Iso-Tacho-Phoresis: CITP).
1.4.5 Điện di mao quản vùng (CZE)
Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophiresis- CZE) là phƣơng pháp
phân tích cơ bản nhất của kỹ thuật CE vì đơn giản, linh hoạt và dễ thao tác. Phƣơng
pháp này có phạm vi ứng dụng rộng trong việc tách và phân tích nhiều loại hợp chất
khác nhau, bao gồm các amino acid, peptid, các hợp chất cấu tạo ion, các hợp chất
đồng phân không gian và nhiều loại hợp chất có khả năng ionic hóa [8].
Đây là phƣơng pháp tách dựa trên sự di chuyển của chất tan có điện tích trong
điện trƣờng với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào độ linh động điện di của chúng. Độ
linh động điện di là đại lƣợng phụ thuộc vào điện tích ion, chính xác hơn là tỷ lệ
giữa điện tích và khối lƣợng của ion, bán kính của ion, trạng thái của ion nhƣ mức
độ ion hóa, trạng thái liên kết với các đối ion. Do đó độ linh động điện di phụ thuộc
vào hằng số điện môi, pH, độ nhớt của dung dịch... Khi ta đặt một điện áp cao vào

12


hai đầu mao quản, các tiểu phân tích điện sẽ bắt đầu di chuyển, tất nhiên là về phía

điện cực trái dấu. Các ion có độ linh động cao hơn sẽ di chuyển nhanh hơn, hình
thành các vùng mà ở từng vùng, các ion tại đó có độ linh động điện di tƣơng tự
nhau. Mặt khác khi đặt một điện áp cao vào hai đầu của mao quản, ở một vùng pH
đủ lớn, sẽ hình thành một dịng điện thẩm.

Hình 1.2 : Quá trình tách các chất trong CZE
Trong mao quản silica dịng này hƣớng về phía cực âm (catod). Do các ion
dƣơng có cùng hƣớng với dịng này cho nên tốc độ đƣợc tăng thêm, các ion âm do
không cùng hƣớng với dòng điện di thẩm thấu cho nên di chuyển chậm lại và nếu
khơng vƣợt đƣợc nó thì cũng bị cuốn đi về phía cực âm. Các phân tử khơng tích
điện sẽ di chuyển cùng tốc độ với dịng điện thẩm.
CZE là mơ hình phân tích đơn giản nhất của CE. Hệ thống phân tích CZE cũng
chính là cơ sở xuất phát cho các kỹ thuật CE khác. Từ xuất phát điểm là một mao
quản với một dung dịch điện ly nền nhất định, ngƣời sử dụng chỉ cần thêm vào một
hay nhiều chất phụ gia thích hợp là có thể chuyển sang các kỹ thuật điện di khác.
Tùy thuộc vào chất phụ thêm vào thì sẽ có nhiều kỹ thuật khác nhau.
1.4.6. Điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) [8,15]
Phƣơng pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen ( MCEK, hay viết
ngắn gọn là MEKC) là một kiểu của kỹ thuật tách theo bản chất của sự điện di có sử
dụng kết hợp cả tính chất của kỹ thuật điện di mao quản ( Capillary Electrophoresis)
và sắc ký lỏng (LC) có pha tĩnh. Nó là một trong các kiểu tách sắc ký (separation

13


mode) của kỹ thuật CE đƣợc ứng dụng rộng rãi trong sinh học, y học và dƣợc. Nó là
một kiểu kỹ thuật điện di mao quản có sức mạnh, tiện lợi và đƣợc ứng dụng cho
việc tách cả các chất phân tử trung hồ và các chất mang điện tích (hợp chất liên kết
ion). Vì thế nó bổ sung và làm phong phú về chủng loại của kỹ thuật điện di.
Nguyên lý tách của phƣơng pháp giống nhƣ sắc ký nhƣng phƣơng pháp MEKC sử

dụng hiện tƣợng điện động học để thực hiện q trình phân bố chất phân tích.
MEKC sử dụng điện áp cao tạo ra dòng EOF mang chất phân tích di chuyển dọc
mao quản và phân bố vào các mixen. Sự khác nhau về linh độ điện di của các chất
phân bố trong và ngoài mixen và linh độ của dòng điện thẩm là bản chất của quá
trình tách.. Sự tách của các phân tử chất tan trung hoà bằng kỹ thuật MEKC đƣợc
điều chỉnh bởi các chất hoạt động bề mặt nằm trong dung dịch điện di. Khi chất
hoạt động bề mặt ở nồng độ cao hơn nồng độ ngƣỡng của Mixen (giới hạn hình
thành Mixen, CMC: Critial Micellary Concentration), ví dụ chất hoạt động bề mặt
SDS (Sodium Dodecyl Sulfat), có CMC=9 mM, thì một tổ hợp của các phần tử tiểu
phân của chất hoạt động bề mặt đƣợc tích tụ lại và chúng hình thành (hay tạo ra)
trong ống mao quản các tổ hợp của các tiểu phân SDS. Nó chính là các Mixen (pha
tĩnh giả). Các Mixen này là các tiểu phân có đầu kị nƣớc của chất hoạt động bề mặt,
định hƣớng vào trung tâm của Mixen và để cho đầu ƣa nƣớc của nó ra ngồi và sẽ
tƣơng tác với ion chất đệm, hay ion chất tan. Nghĩa là đầu mang điện tích của chất
hoạt động bề mặt sẽ hƣớng ra chất đệm. Cấu trúc tiêu biểu của Mixen đƣợc mô tả
trong hình 2.3. Các Mixen ở đây hoạt động nhƣ một pha tĩnh. Các phân tử của chất
mẫu (chất phân tích) đƣợc phân bố vào trong cả Mixen và cả ở ngoài Mixen (trong
pha động) theo một cân bằng động học, có hằng số phân bố Ki xác định, trong
những điều kiện nhất định đã đƣợc chọn để chạy điện di và mỗi chất tan Xi sẽ có
một hằng số phân bố Ki nhất định trong điều kiện đó. Nếu các Ki của các chất tan là
khác nhau rõ rệt thì sẽ có đƣợc kết quả sắc kí điện di tốt.
Phƣơng pháp MEKC dùng để tách các chất phân tích có điện tích và khơng có
điện tích. Đối với các chất có điện tích, các Mixen loại này chuyển động hoặc là
cùng chiều hoặc là ngƣợc chiều với dòng EOF, là tuỳ thuộc vào điện tích của chất

14


hoạt động bề mặt và cấu trúc của Mixen . Các chất hoạt động bề mặt Aniơnic, ví dụ
nhƣ SDS, sẽ di chuyển về Anốt (cực dƣơng), nghĩa là ngƣợc chiều với hƣớng của

dòng EOF. Trong dung dịch đệm điện di có pH trung tính và kiềm, khi dịng EOF di
chuyển nhanh hơn tốc độ của Mixen , thì sự điện di thực (net movement) của Mixen
là theo hƣớng của dòng EOF. Trong khi di chuyển nhƣ thế, các Mixen có thể tƣơng
tác với các phần tử chất tan (chất phân tích) nhƣ kiểu phân bố của sắc ký cột lỏng
rắn (R-LC) theo cả tƣơng tác ƣa nƣớc, tƣơng tác kị nƣớc và tƣơng tác tĩnh điện, để
tạo ra quá trình sắc ký của các chất mẫu, khi chạy qua cột mao quản trong quá trình
điện di.

Hình 1.3. Cấu trúc của các Mixen và dòng EOF trong MEKC
: dòng EOF. O: Chất hoạt động bề mặt. ': Chất tan (chất PT). : Dòng điện di của
chất.
Đối với các phần tử chất tan trung tính, nó chỉ là sự phân bố của chất tan vào
trong Mixen và ở ngoài Mixen theo một cân bằng động học có hằng số phân bố Ki
nhất định trong điều kiện đã chọn. Chính sự phân bố theo kiểu cân bằng động học
này gây ra sự lƣu giữ khác nhau của các chất tan, và tạo ra sự tách sắc ký các chất
phân tích theo kiểu Mixen. Vì thế các Mixen trong ống mao quản của kỹ thuật tách
này đƣợc gọi là pha tĩnh giả. Nhiều chất tan tƣơng tác với Mixen khá bền, nó tồn
tại trong Mixen dài hơn (lâu hơn) sự di chuyển của nó, khi các Mixen mang nó (các
chất tan trung tính) một phần đi ngƣợc chiều của dòng EOF.

15


Khi mà các chất tan lại không tƣơng tác với các Mixen, thì nó đƣợc dịng
EOF mang một cách đơn thuần cùng với dòng EOF. Nhiều hợp chất kị nƣớc tƣơng
tác rất mạnh với các Mixen, và nó bị lƣu lại khá lâu trong mao quản, nên làm tăng
thời gian lƣu giữ của chất tan
Cơ chế của sự tách các phần tử trung tính trong MEKC về cơ bản vẫn là kiểu
tƣơng tác phân bố của chất tan, tƣơng tự nhƣ trong sắc ký cột lỏng-rắn (LC) hấp
phụ, nhƣng lại đƣợc điều khiển bới lực điện trƣờng E của thế cao V giữa hai đầu

mao quản tạo ra, mà không phải bằng áp suất đẩy pha động nhƣ trong HPLC. Trong
kỹ thuật phân tích MEKC, các tính tốn về hệ số dung tích ki‟, số đĩa N của cột mao
quản, độ phân giải R,... cũng dựa trên cơ sở tƣơng tự với các tính tốn của hệ sắc kí
cột LC, và tất nhiên có bổ sung thêm một số yếu tố cho thích hợp và đúng đắn hơn
cho hệ pha MEKC. Chính tỷ số giữa tổng số mol của chất tan (total moles of solute)
ở trong Mixen và tổng số mol của chất tan ở trong pha động (dung dịch đệm điện
di), cũng đƣợc xem nhƣ là dung lƣợng của cột mao quản, và nó đƣợc biểu diễn theo
cơng thức sau.
ki‟ = ( ti – t0 )/[t0.(1- ti/tmc)] = Ki.(VMC/VMP)

(1)

Trong đó:
ti : Thời gian lƣu của chất tan.
t0 : Thời gian không lƣu giữ của chất.
tMC : Thời gian không lƣu giữ của Mixen.
Ki : Hệ số phân bố nhiệt động của chất tan giữa hai pha (VMC và VMP).
Với VMC : Thể tích của pha Mixen , và VMP : Thể tích của pha động.
Và tỷ số q = (VMC/VMP) cũng đƣợc gọi là tỷ số pha của hệ MEKC. Đồng thời từ
biểu thức (1) chúng ta cũng rút ra đƣợc thời gian lƣu của chất tan tR nhƣ sau.
ti = [ t0.tMC.( 1+ ki‟) ] / [ tMC + t0.ki‟ ) ]

(2)

Nếu nhƣ mà ( tMC << t0.k‟ ) thì chúng ta lại có:
ti = [ tMC.( 1 + ki‟) ] / ki‟ ]

(3)

Nghĩa là thời gian lƣu tR có quan hệ chặt chẽ với hệ số dung tích ki‟. Khi hệ số ki‟

lớn, thì thời gian lƣu ti cũng lớn. Mặt khác, trong MEKC, tỷ số pha q là phụ thuộc

16


vào nồng độ của chất hoạt động bề mặt trong mao quản, và quan hệ này đƣợc biểu
diễn bởi công thức sau đây.
q = [V.( CSP- CMC )] / [ 1 – vmc.(CSP – CMC )]

(4)

Trong đó:
V : Điện thế sử dụng để tạo ra điện trƣờng E của sự điện di.
CSP : Nồng độ của Mixen (mol/l.)
CMC : Nồng độ giới hạn chuẩn của Mixen (mol/l.)
Vmc : Tốc độ trung bình của Mixen .
Ki : Hệ số phân bố của chất thứ i ở trong và ngoài Mixen .
Và khi nồng độ Mixen khơng lớn, thì hệ số dung tích ki‟, và tốc độ của dịng EOF,
đƣợc tính nhƣ sau.
ki‟ = Ki.vmc .( CSP - CMC )
vEOF = ( e + MC ).E

(5)
(6)

Cùng với các tham số tR, ki‟ , Rij đã nói ở trên, hệ số phân bố nhiệt động
Ki của chất tan trong hệ MEKC, cũng là một đại lƣợng quan trọng có liên quan đến
các quá trình xẩy ra trong mao quản và đƣợc xác định theo biểu thức sau.
lnKi = (H0/R.T) + ( S0/R )

(7)

Trong đó: H0, S0 là Entanpi và Entropi tiêu chuẩn của chất tan. R là hằng
số khí, và T là nhiệt độ (0K) của cột mao quản. Biểu thức này cho chúng ta thấy
hằng số phân bố Ki luôn luôn phụ thuộc vào nhiệt độ. Nó cũng là một hằng số nhiệt
động.
Nhìn chung, chúng ta thấy khi nhiệt độ tăng thì hệ số phân bố Ki đều giảm
dần ở tất cả các chất. Với các chất khác nhau, thì hệ số Ki này cũng thay đổi rất
khác nhau. Đó chính cũng là yếu tố thuận lợi cho sự tách trong kỹ thuật điện di.
Đồng thời với các chất hoạt động bề mặt khác nhau thì cũng gây ảnh hƣởng đến hệ
số Ki khác nhau.
Ngoài các đại lƣợng trên, độ phân giải R cũng là một thông số quan trọng
của kỹ thuật MEKC. Độ phân giải Rij của hai chất , ví dụ nhƣ I và J trong hệ MEKC
cũng đƣợc biểu thị bằng công thức sau đây theo ba thành phần cơ bản.

17