Nghiên cứu kiểu gen đề kháng colistin của một số vi khuẩn gram âm gây nhiễm trùng bệnh viện tại khu vực phía nam, việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRẦN KHÁNH LINH

NGHIÊN CỨU KIỂU GEN ĐỀ KHÁNG COLISTIN
CỦA MỘT SỐ VI KHUẨN GRAM ÂM
GÂY NHIỄM TRÙNG BỆNH VIỆN TẠI KHU VỰC
PHÍA NAM, VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

TP. Hồ Chí Minh – Năm 2020


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRẦN KHÁNH LINH

NGHIÊN CỨU KIỂU GEN ĐỀ KHÁNG COLISTIN
CỦA MỘT SỐ VI KHUẨN GRAM ÂM
GÂY NHIỄM TRÙNG BỆNH VIỆN TẠI KHU VỰC
PHÍA NAM, VIỆT NAM

Ngành: Di truyền học
Mã số ngành: 62 42 70 71

Phản biện 1: PGS.TS. Ngô Thị Hoa
Phản biện 2: TS. Nguyễn Thị Lệ Thủy
Phản biện 3: TS.BS. Huỳnh Minh Tuấn

Phản biện độc lập 1: PGS.TS. Ngô Thị Hoa
Phản biện độc lập 2: PGS.TS. Trần Huy Thịnh

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Cao Thị Bảo Vân

TP. Hồ Chí Minh – Năm 2020


LỜI CAM ĐOAN

Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi và cán bộ
hướng dẫn. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng
được ai công bố trong bất kỳ cơng trình nào khác. Nếu có điều gì khơng đúng
sự thật, tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm.

Nghiên cứu sinh

Trần Khánh Linh

i


LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Cao Thị Bảo Vân với tất cả lịng kính
trọng và biết ơn sâu sắc đến CÔ đã tận tâm hướng dẫn và tạo điều kiện cho em
trong suốt 5 năm nghiên cứu tại Viện Pasteur TP. HCM.
Cảm ơn các em Lê Thị Liên, Lê Hà Tầm Dƣơng, Trần Thị Bích Phƣợng,
Lê Nguyên Thảo và Lê Trọng Nghĩa đã luôn sát cánh cùng chị trong hành trình
thực hiện đề tài.

Xin gởi lời cảm ơn chân thành tới: Tập thể cán bộ nghiên cứu, kỹ thuật viên
phòng Sinh học Phân tử, Khoa Vi Sinh Miễn Dịch, Viện Pasteur TP. HCM: chị
Hạnh Lan và các em Yến Nhi, Hồng Ngọc, Thanh Hồng, Ngọc Trinh, Khoa,
Khánh Quỳnh đã hỗ trợ và đồng hành cùng tôi trong nghiên cứu.
Xin trân trọng cảm ơn PGS. TS. Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, TS. Nguyễn
Thụy Vy, TS Nguyễn My Nƣơng (giảng viên Bộ môn Di truyền) và cô Trần Thị
Phƣợng Giang (phòng Đào tạo Sau Đại học), Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐH
Quốc gia TP. HCM đã hỗ trợ và tạo điều kiện cho tơi hồn thành khố học.
Xin cảm ơn tất cả sự động viên và giúp đỡ của Thầy Cô, Anh chị đồng
nghiệp và Bạn bè đã dành cho tôi trong suốt thời gian qua.
Cảm ơn ông bà Nội Giác Nguyên, cảm ơn người chồng yêu quý Trần
Nguyễn Khánh Hùng đã hi sinh thầm lặng và luôn nắm chặt tay tơi vượt qua
những giai đoạn khó khăn nhất. Cảm ơn những điều bé nhỏ ý nghĩa mà hai con
Khánh Đan, Khánh Nghi đã làm mỗi ngày để mẹ yên tâm hoàn thành nghiên cứu
này.
Và trên hết con xin cảm ơn Ba Mẹ đã yêu thương và lo lắng cho con đến tận
những phút cuối cùng của cuộc đời. Cảm ơn tình yên và sự tin tưởng mà Ba Mẹ đã
trao cho con !
Xin trân trọng cảm ơn !

ii


MỤC LỤC
Trang phụ bìa ............................................................................................................i
Lời cam đoan ............................................................................................................ i
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt và dịch thuật............................................v
Danh mục các bảng ..................................................................................................ix
Danh mục các hình vẽ, đồ thị ................................................................................ xii
MỞ ĐẦU

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN .....................................................................................5
1.1.

Vi khuẩn Gram âm thường gặp trong nhiễm khuẩn bệnh viện .....................6

1.2.

Kháng sinh colistin ........................................................................................8

1.3.

Cơ chế kháng colistin ở vi khuẩn Gram âm ..................................................9

1.3.1.

Cơ chế kháng colistin do biến đổi lipopolysaccharide .........................10

1.3.2.

Cơ chế kháng colistin do mất tổng hợp lipopolysaccharide .................13

1.4.

Chuyển gen ngang và các yếu tố di truyền di động.....................................14

1.4.1.

Chuyển gen ngang ................................................................................14

1.4.2.

Các yếu tố di truyền di động .................................................................15

1.5.

Tình hình nghiên cứu kiểu gen kháng colistin ở vi khuẩn Gram âm ..........18

1.5.1.

Tình hình nghiên cứu kiểu gen kháng colistin trên thế giới .................18

1.5.2.

Tình hình nghiên cứu kiểu gen kháng colistin tại Việt Nam ................25

1.6.

Các phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu ......................................26

1.6.1.

Phương pháp phát hiện kiểu hình kháng kháng sinh ............................26

1.6.2.

Phương pháp sinh học phân tử xác định kiểu gen kháng kháng sinh ...27

1.6.3.

Phương pháp tin sinh học phân tích dữ liệu giải trình tự......................31

1.6.4.

Những khó khăn trong phân tích dữ liệu giải trình tự bộ gen ..............34

1.6.5.

Phương pháp RT-qPCR phân tích mức độ biểu hiện gen liên quan tính

kháng colistin .....................................................................................................35
CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................36
2.1.

Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................36

2.2.

Vật liệu nghiên cứu......................................................................................37
i


2.2.1.

Dụng cụ - thiết bị ..................................................................................37

2.2.2.

Hóa chất, sinh phẩm..............................................................................38

2.3.

Phương pháp kiểm tra tính nhạy cảm kháng sinh .......................................40

2.3.1.

Phương pháp khuếch tán đĩa thạch Kirby-Bauer ..................................40

2.3.2.

Phương pháp pha loãng trong thạch .....................................................41

2.3.3.

Phương pháp vi pha loãng ....................................................................42

2.4.

Phương pháp xác định kiểu gen liên quan tính kháng colistin ....................42

2.4.1.

Tách chiết ADN bằng kit Qiamp ADN purification .............................42

2.4.2.

Giải trình tự Sanger...............................................................................42

2.4.3.

PCR khuếch đại gen mục tiêu ...............................................................42

2.4.4.

Thu nhận ADN từ sản phẩm PCR khuếch đại gen mục tiêu ................43

2.4.5.

PCR phát hiện gen mục tiêu .................................................................43

2.4.6.

Tinh sạch sản phẩm ADN sau PCR phát hiện gen mục tiêu ................44

2.5.

Phương pháp giải trình tự hệ thống Miseq (Illumina) .................................44

2.5.1.

Chuẩn bị thư viện ..................................................................................44

2.5.2.

Giải mã trình tự .....................................................................................48

2.6.

Phương pháp phân tích dữ liệu giải trình tự WGS ......................................48

2.6.1.

Đánh giá chất lượng trình tự đọc ..........................................................49

2.6.2.

Mapping trình tự đọc ............................................................................50

2.6.3.

Xác định đột biến mới...........................................................................50

2.7.

Phương pháp tiếp hợp đánh giá khả năng lan truyền tính kháng của plasmid
51

2.8.

Phương pháp RT-qPCR phân tích sự biểu hiện gen ....................................52

2.8.1.

Thu nhận ARN tổng số .........................................................................52

2.8.2.

Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT-qPCR) ...................52

2.8.3.

Phản ứng RT-qPCR với kit Luna Universal qPCR Master Mix ..........53

2.9.

Phương pháp phân tích số liệu và xử lý thơng tin chủng ............................54

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ .........................................................................................56
3.1.

Đặc điểm kháng kháng sinh của 222 chủng vi khuẩn Gram âm .................56

ii


3.1.1.

Thông tin lâm sàng chủng nghiên cứu ..................................................56

3.1.2.

Đặc điểm kháng kháng sinh ..................................................................56

3.1.3.

Kiểu hình của chủng vi khuẩn gram âm kháng colistin .......................60

3.2.

Đánh giá chất lượng trình tự đọc thơ ...........................................................62

3.3.

Xác định kiểu gen mcr kháng colistin .........................................................65

3.3.1.

Sàng lọc gen mcr -1 đến mcr-9 từ dữ liệu WGS trong in silico ...........65

3.3.2.

Phân tích cấu trúc plasmid mang gen mcr ............................................65

3.3.3.

Xác định loại pMLST và gen kháng ở plasmid pKP27-MCR1............70

3.3.4.

Phân tích khả năng tiếp hợp của plasmid pKP27-MCR1 .....................72

3.4.

Xác định kiểu gen liên quan tính kháng colistin trên nhiễm sắc thể ...........77

3.4.1.

Kiểu gen mgrB ......................................................................................79

3.4.2.

Kiểu gen kháng colistin do biến đổi LPS .............................................81

3.4.3.

Khảo sát mức độ biểu hiện gen liên quan tính kháng colistin ..............85

3.5.

Xác định MLST, cây phân lồi và phân tích gen kháng kháng sinh ...........87

3.5.1.

MLST, cây phân lồi ............................................................................87

3.5.2.

Gen kháng kháng sinh...........................................................................88

3.6.

Tổng kết kết quả nghiên cứu .......................................................................90

CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN .......................................................................................99
4.1.

Đặc điểm kháng kháng sinh của 222 chủng vi khuẩn Gram âm .................99

4.1.1.

Kiểu hình kháng kháng sinh .................................................................99

4.1.2.

Kết quả sàng lọc chủng kháng colistin ...............................................100

4.2.

Đặc điểm gen mcr -1 kháng colistin ..........................................................102

4.2.1.

Cấu trúc plasmid mang gen mcr-1 ......................................................103

4.2.2.

Khả năng lan truyền tính kháng của plasmid pKP27-MCR1 .............104

4.3.

Kiểu gen liên quan tính kháng colistin trên nhiễm sắc thể ........................105

4.3.1.

Mức độ biểu hiện ở chủng mang đột biến gen mgrB..........................107

4.3.2.

Mức độ biểu hiện gen ở chủng mang đột biến gen pmrB ...................108

4.4.

Loại MLST, cây phân loài và gen kháng kháng sinh ................................109

4.4.1.

Loại MLST, cây phân loài ..................................................................109

iii


4.4.2.
4.5.

Gen kháng kháng sinh.........................................................................109

Tổng kết kết quả nghiên cứu .....................................................................111

CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ ...........................................................120
5.1.

Kết luận ......................................................................................................120

5.2.

Kiến nghị ...................................................................................................121

DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

iv


Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt và dịch thuật
Viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

aa

amino acid

acid amin

ARN

Ribonucleic acid

Acid ribonucleic

ADN

Deoxyribonucleic acid

Acid deoxyribonucleic

AMC

Amoxicillin/Clavulanic acid

Amoxicillin/ acid clavulanic

AMR

Antimicrobial resistance

Kháng kháng sinh

ARI

Antimicrobial Resistance Island

Đảo kháng kháng sinh

ATCC

American Type Culture

Bộ sưu tập giống chuẩn Mỹ

Collection
ATM

Aztreonam

BHI

Brain Heart Infusion

Môi trường nuôi vi sinh vật

BHIA

Brain Heart Infusion Agar

Môi trường BHI bổ sung agar.

bla

Gen coding β-lactamase

Gen mã hoá enzyme β-lactamase

BLAST

Basic local alignment search tool Cơng cụ tìm kiếm trình tự tương
đồng

BMD

Broth Micro Dilution

Phương pháp vi pha loãng

bp

base pair

cặp base

CAZ

Ceftazidime

CDC

Centers for Disease Control and

Trung tâm Kiểm sốt và Phịng

Prevention

chống bệnh

Centre for Genomic

Trung tâm dịch tễ học bộ gen

CGE

Epidemiology
Đơn vị tạo khuẩn lạc

CFU

Colony forming unit

CIP

Ciprofloxacin

CLSI

Clinical Laboratory Standards

Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và X t

Institute

nghiệm

Colistin Resistant

Kháng colistin

ColR

v


ColS

Colistin Sensitive

CRO

Ceftriaxone

CTX

Cefotaxime

CS

Colistin

CXM

Cefuroxime

dNTP

deoxynucleotide triphosphate

ddNTP

dideoxynucleotide triphosphate

EDTA

Ethylene Diamine Tetra Acetic acid

EUCAST

European Committee of

Nhạy colistin

y ban Châu u về thử nghiệm
tính nhạy cảm kháng sinh

Antimicrobial Susceptibility
Testing
ESBL

Extended Spectrum β-Lactamase β-lactamase phổ rộng

ETP

Ertapenem

FEP

Cefepime

FOX

Cefoxitin

GM

Gentamicin

I

Intermediate

IMP

Imipenem

In

integron

Yếu tố di truyền di động

ICU

Intensive care unit

Đơn vị săn sóc tích cực

IS

Insertion sequence

Trình tự gắn chèn

K

Kanamycin

kb

kilobase

kbp

kilobase pair

L-Ara4N

4-amino-4-deoxy-L-arabinose

LPS

Lipopolysaccharide

MCR-1

mobile colistin resistance 1

Kháng colistin di động 1

MDR

Multidrug-Resistance

Đa kháng

MEM

Meropenem

Trung gian

vi

MH

Mueller Hinton

MHA

Mueller – Hinton Agar

Thạch Mueller – Hinton

MIC

Minimum Inhibitory

Nồng độ ức chế tối thiểu

Concentration
MLST

Multi-Locus Sequence Typing

Giải trình tự đa vị trí

Thơng số kiểm tra chất lượng, chiều dài contig ngắn nhất ở 50% tổng
N50

chiều dài bộ gen

N/A

Not available

Không thể xác định

NCBI

National Centre of

Trung tâm Thông tin Công nghệ

Biotechnology Information

Sinh học Quốc gia

NGS

Next-Generation Sequencing

Giải trình tự thế hệ mới

OD

Optical Density

Mật độ quang

ORF

Open reading frame

Khung đọc mở

QC

Quality control

Kiểm tra chất lượng

qPCR

Quantitative PCR

Phương pháp định lượng ADN
dựa vào PCR

Pathosystems Resource

Trung tâm tích hợp dữ liệu hệ

Integration Center

thống sinh vật gây bệnh

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi trùng hợp

PDR

Pandrug resistant

Toàn kháng

R

Resistant

Kháng

RAST

RAST (Rapid Annotation using

Chú giải nhanh sử dụng kỹ thuật

Subsystem Technology)

hệ thống phụ

rounds per minute

vòng/phút

PATRIC

rpm

PCR phiên mã ngược định lượng

RT-qPCR Real Time-quantitative
Polymerase Chain Reaction
S

Nhạy

Susceptible

vii


SNP

Single nucleotide polymorphism

Đa hình trình tự đơn

spp

species

Lồi

ST

Sequence type

SXT

Trimethoprim-Sulfamethoxazole

Taq

Thermus aquaticus ADN
polymerase

TAE

Tris Acetate
Ethylenediaminetetraacetate

TBE

Tris-borate-EDTA

TE

Tetracyclin

TOB

Tobramycin

Tn

Transposon

Yếu tố chuyển vị

Tnp

Transposon plasmid

Plasmid có yếu tố chuyển vị

XDR

Extensively drug-resistant

Kháng diện rộng

WHO

World Health Organization

Tổ chức Y tế Thế giới

WGS

Whole genome sequencing

Trình tự tồn bộ bộ gen

-

viii

Danh mục các bảng
Bảng 1.1. Một số IS và transposon phức hợp liên kết gen kháng ở VK Gram âm ..16
Bảng 1.2. Phân bố theo thời gian và khu vực họ gen mcr phát hiện đầu tiên ..........20
Bảng 1.3. Đột biến gen kháng colistin ở K. pneumoniae đã công bố.......................23
Bảng 1.4. Đột biến gen kháng colistin ở A. baumannii và P. aeruginosa đã công bố
...................................................................................................................................24
Bảng 1.5. Chỉ số PHRED và xác suất tín hiệu base lỗi ............................................31
Bảng 1.6. Danh sách thông số kiểm tra chất lượng bộ gen ......................................33
Bảng 1.7. Giá trị chu kỳ ngưỡng (CT) trong một thiết kế sau ..................................35
Bảng 2.1. Kháng sinh đĩa giấy (Oxoid) sử dụng trong kỹ thuật kháng sinh đồ .......38
Bảng 2.2. Hoá chất chuẩn bị thư viện theo bộ kit Nextera XT ................................ 39
Bảng 2.3. Giá trị MIC của kháng sinh theo CLSI 2018 và EUCAST 2019 .............41
Bảng 2.4. Mồi PCR đặc hiệu khuếch đại gen ...........................................................43
Bảng 2.5. Chương trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gen .................................43
Bảng 2.6. Chương trình nhiệt của phản ứng PCR đánh dấu.....................................44
Bảng 2.7. Thành phần phản ứng tinh sạch sản phẩm PCR đánh dấu. ......................44
Bảng 2.8. Thành phần phản ứng RT-PCR ................................................................ 53
Bảng 2.9. Thành phần phản ứng thu ADNc .............................................................53
Bảng 2.10. Thành phần một phản ứng qPCR ...........................................................53
Bảng 2.11. Danh sách mồi cho RT-qPCR ................................................................ 54
Bảng 2.12. Chu trình nhiệt phản ứng qPCR .............................................................54
Bảng 3.1. Phân bố 222 chủng vi khuẩn Gram âm trong nghiên cứu ........................56
Bảng 3.2. Tỉ lệ kháng kháng sinh của 222 chủng vi khuẩn Gram âm ......................58
Bảng 3.3. Thông tin lâm sàng của chủng K. pneumoniae kháng colistin.................60
Bảng 3.4. Kiểu hình kháng của chủng K. pneumoniae kháng colistin .....................61
Bảng 3.5. Kết quả đánh giá chất lượng trình tự đọc .................................................62
Bảng 3.6. Kết quả đánh giá quá trình lắp ráp bộ gen de novo chủng ND2.27 .........62
Bảng 3.7. Thông tin bộ gen chủng K. pneumoniae Res2015.ND2.27 và plasmid
pKP27-MCR1 trên cơ sở dữ liệu NCBI. ...................................................................66

ix


Bảng 3.8. Các yếu tố di động IS xác định trên plasmid pKP27-MCR1 ...................66
Bảng 3.9. Các plasmid thuộc nhóm InA/C2 tương đồng với pKP27-MCR1 ...........70
Bảng 3.10. Tập hợp gen kháng kháng sinh trên plasmid pKP27-MCR1 .................71
Bảng 3.11. Kết quả kiểm tra chủng sau tiếp hợp bằng phương pháp định danh ......74
Bảng 3.12. Kết quả kiểm tra kiểu hình kháng ở chủng sau tiếp hợp ........................75
Bảng 3.13. Độ tin cậy của đột biến gen dựa vào độ bao phủ (coverage) của base ..78
Bảng 3.14. Đột biến gen mgrB .................................................................................81
Bảng 3.15. Đột biến gen kháng colistin theo cơ chế biến đổi lipid A ......................81
Bảng 3.16. Đột biến gen kháng colistin theo cơ chế biến đổi LPS ..........................82
Bảng 3.17. Đột biến gen liên quan tính kháng colistin theo cơ chế biến đổi LPS ...83
Bảng 3.18. Sự thay đổi đặc tính amino acid ở một số đột biến gen .........................84
Bảng 3.19. Tổng kết đột biến gen kháng colistin trên nhiễm sắc thể .......................84
Bảng 3.20. Kết quả biểu hiện gen pmrD và pmrK ở chủng mang đột biến gen mgrB
...................................................................................................................................85
Bảng 3.21. Kết quả biểu hiện gen pmrC và pmrK ở chủng mang đột biến gen pmrB
...................................................................................................................................86
Bảng 3.22. Tổng kết mức độ biểu hiện gen liên quan tính kháng colistin ở chủng
mang đột biến gen mgrB và pmrB.............................................................................87
Bảng 3.23. Loại MLST của chủng K. pneumoniae kháng colistin...........................88
Bảng 3.24. Kiểu gen kháng kháng sinh của chủng K. pnemoniae kháng colistin ....89
Bảng 3.25. Tương quan kiểu hình và kiểu gen kháng kháng sinh ở chủng
Res2015.ND2.27 và plasmid pKP27-MCR1 ............................................................90
Bảng 3.26. So sánh plasmid mang gen mcr-1 trong nghiên cứu này với các plasmid
mang gen mcr-1 đã công bố. .....................................................................................91
Bảng 3.27. So sánh chủng K. pneumoniae Res2015.ND2.27 và K. pneumoniae
mang gen mcr-1 đã phát hiện tại Việt Nam ..............................................................93

Bảng 3.28. Tóm tắt đặc điểm lâm sàng và kiểu gen của chủng K. pneumoniae kháng
colistin ......................................................................................................................94

x


Bảng 3.29. Tương quan kiểu hình, kiểu gen kháng kháng sinh và phân bố dòng ST
của chủng K. pneumoniae kháng colistin..................................................................95
Bảng 3.30. So sánh đột biến gen kháng colistin trên nhiễm sắc thể trong nghiên cứu
này với các nghiên cứu đã công bố ...........................................................................96

xi


Danh mục các hình vẽ, đồ thị
Hình 1.1. Hình thái Klebsiella pneumoniae trên kính hiển vi điện tử ........................6
Hình 1.2. Hình thái Escherichia coli trên kính hiển vi điện tử ..................................6
Hình 1.3. Hình thái Acinetobacter baumannii trên kính hiển vi điện tử ....................7
Hình 1.4. Hình thái Pseudomonas aeruginosa trên kính hiển vi điện tử ...................7
Hình 1.5. Sơ đồ minh họa cấu trúc màng tế bào vi khuẩn Gram âm .........................9
Hình 1.6. Sơ đồ minh họa phản ứng xúc tác của protein MCR-1 ............................10
Hình 1.7. Sơ đồ gen liên quan tính kháng colistin do biến đổi LPS ........................11
Hình 1.8. Sinh tổng hợp undecaprenyl phosphate-α-L-Ara4N và xúc tác gắn LAra4N vào lipid A .....................................................................................................11
Hình 1.9. Biến đổi lipid A ở E. coli và S. typhimurium ...........................................12
Hình 1.10. Con đường sinh tổng hợp lipid A ...........................................................13
Hình 1.11. Các yếu tố di truyền di động và quá trình di động gen kháng kháng sinh
nội bào hoặc ngoại bào. .............................................................................................17
Hình 1.12. Bảng tổng kết các nghiên cứu về chủng vi khuẩn mang gen mcr-1 ở
người và động vật trên thế giới. ................................................................................18
Hình 1.13. Bản đồ phân bố chủng vi khuẩn mang gen mcr-1 trên Thế giới ............19

Hình 1.14. Cấu trúc gen mgrB và trình tự amino acid của protein MgrB giữa chủng
K. pneumoniae kháng colistin và chủng nhạy colistin. .............................................21
Hình 1.15. Nguyên lý giải trình tự bằng hệ thống Illumina. ....................................29
Hình 1.16. Ví dụ trình tự đọc ở một file FASTQ ....................................................31
Hình 2.1. Sơ đồ phân tích dữ liệu thơ bộ gen từ hệ thống Illumina ........................48
Hình 2.2. Sơ đồ phân tích dữ liệu thơ bộ gen plasmid từ hệ thống Nanopore ........49
Hình 2.3. Kết quả phân tích trình tự đọc bằng cơng cụ FastQC .............................49
Hình 3.1. Phân bố mức độ kháng kháng sinh nhóm Carbapenem theo MIC (µg/ml)
...................................................................................................................................59
Hình 3.2. Phân bố mức độ kháng kháng sinh nhóm Cephalosporin III theo MIC
(µg/ml).......................................................................................................................59
Hình 3.3. Chất lượng base trên trình tự đọc ở chủng Res2015.ND2.1. ...................63

xii


Hình 3.4. Chất lượng base trên trình tự đọc ở chủng Res2015.ND2.2. ...................63
Hình 3.5. Chất lượng base trên trình tự đọc ở chủng Res2015.ND2.13. .................63
Hình 3.6. Chất lượng base trên trình tự đọc ở chủng Res2015.ND2.14. .................64
Hình 3.7. Chất lượng base trên trình tự đọc ở chủng Res2015.ND2.22. .................64
Hình 3.8. Chất lượng base trên trình tự đọc ở chủng Res2015.ND2.27. .................64
Hình 3.9. Kết quả sàng lọc gen mcr .........................................................................65
Hình 3.10. Kết quả phân tích plasmid ......................................................................65
Hình 3.11. Sơ đồ chú giải trình tự plasmid pKP27-MCR1. .....................................67
Hình 3.12. So sánh vùng gen mcr-1 trên plasmid pKP27-MCR1 với các plasmid
khác mang gene mcr-1. .............................................................................................68
Hình 3.13. So sánh sự tương đồng của plasmid pKP27-MCR1 với plasmid khác. .69
Hình 3.14. Kết quả phân tích pMLST của plasmid pKP27-MCR1 .........................70
Hình 3.15. Kết quả kiểm tra K. pneumoniae Res2015.ND2.27 và E. coli J53 ........72
Hình 3.16. Kết quả cấy chủng sau tiếp hợp THJ53/Res2015.ND2.27 .....................73

Hình 3.17. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại của gen mcr-1...............76
Hình 3.18. Kết quả kiểm tra gen mcr-1 bằng giải trình tự Sanger ...........................76
Hình 3.19. Kết quả phát hiện đột biến gen mgrB bằng công cụ CLC Genomics
Workbench v.11 ........................................................................................................79
Hình 3.20. Kết quả phát hiện đột biến gen mgrB bằng cơng cụ CodonCode Aligner.
...................................................................................................................................79
Hình 3.21. Kết quả xác nhận đột biến gen mgrB bằng thực nghiệm với phương
pháp giải trình tự Sanger ...........................................................................................80
Hình 3.22. Xác định cấu trúc bậc 3 của protein MgrB đột biến ...............................80
Hình 3.23. Mức độ biểu hiện gen pmrK và pmrD ở chủng mang đột biến gen mgrB
...................................................................................................................................86
Hình 3.24. Mức độ biểu hiện gen pmrC và pmrK ở chủng mang đột biến gen pmrB
...................................................................................................................................87
Hình 3.25. Cây phân loài của chủng Klebsiella pneumoniae kháng colistin ...........88

xiii


MỞ ĐẦU

Trên thế giới, bệnh nhiễm khuẩn do vi khuẩn kháng thuốc có thể gây tử vong
ít nhất 700.000 người mỗi năm. Dự đoán vào năm 2050, số người tử vong mỗi năm
do bệnh nhiễm khuẩn gây ra bởi vi khuẩn kháng thuốc có thể lên tới 10 triệu người
mỗi năm, vượt xa số ca tử vong do ung thư[112]. Nhiễm khuẩn bệnh viện và kháng
kháng sinh là những vấn đề thời sự y học trên qui mơ tồn cầu, đặc biệt ở Việt Nam
do tăng nguy cơ tử vong và tăng gánh nặng chi phí điều trị[109], [112].
Nhiễm khuẩn bệnh viện do vi khuẩn Gram âm đa kháng (MDR) hoặc kháng
diện rộng (XDR) là một thách thức trong điều trị lâm sàng vì ngay cả những kháng
sinh hiệu quả nhất cũng khơng cịn tác dụng[102]. Ở người, kháng sinh colistin
thường được sử dụng trong điều trị bệnh nhiễm khuẩn do vi khuẩn đa kháng

(multidrug resistance, MDR)[102].
Với sự lây lan của một số vi khuẩn Gram âm có tính kháng cao và có khả
năng tạo carbapenemase, colistin đã được sử dụng như một liệu pháp điều trị cuối
cùng. Việc xuất hiện tính kháng colistin ở nhóm vi khuẩn đa kháng này là mối quan
tâm đáng kể đối với điều trị lâm sàng và sức khoẻ cộng đồng[61]. Các nghiên cứu từ
Châu Á cho thấy tính kháng colistin phổ biến ở vi khuẩn nhóm đường ruột
Enterobacteriaceae[18].
Vi khuẩn Gram âm kháng colistin có thể do đột biến, thích nghi hoặc kháng
tự nhiên. Cơ chế kháng colistin phổ biến nhất liên quan sự biến đổi hoặc mất tổng
hợp thành phần lipopolysaccharide (LPS) ở màng tế bào nhằm ngăn cản tác động
diệt khuẩn của kháng sinh colistin[82].
Trước năm 2015, các nhà nghiên cứu chỉ ghi nhận tính kháng colistin liên
quan hai nhóm gen trên nhiễm sắc thể gồm nhóm gen biến đổi LPS (mgrB,
pmrHFIJKLM, pmrCAB, phoPQ, …) và nhóm gen gây mất tổng hợp LPS
(lpxACD)[124]. Tuy nhiên, từ tháng 11 năm 2015, tính kháng colistin trở nên nghiêm
trọng hơn sau khi Trung Quốc công bố phát hiện chủng E. coli phân lập từ heo
mang gen kháng colistin mcr-1 trên plasmid có khả năng chuyển gen mcr-1 qua
nhiều tác nhân gây bệnh[81]. Chỉ ba tháng sau phát hiện này, gen mcr-1 đã được phát
1


hiện ở nhiều chủng vi khuẩn phân lập từ người, động vật và cả ngồi mơi trường ở
nhiều nước trên thế giới[124]. Năm 2019, một nghiên cứu điều tra dịch tễ đã cung cấp
dữ liệu phân bố của 457 chủng vi khuẩn mang gen mcr-1 kháng colistin từ 31 nước
khác nhau trên bản đồ thế giới

[163]

. Nghiên cứu này đã cơng bố nước có số lượng

chủng vi khuẩn mang gen mcr-1 nhiều nhất là Trung Quốc (212 chủng), kế tiếp là
Việt Nam (58 chủng) và Đức (25 chủng) [163].
Tại Việt Nam, gen mcr-1 kháng colistin trên plasmid được phát hiện ở chủng
vi khuẩn Gram âm[13],[14],[133] được phân lập từ động vật và người. Hiện tại, những
nghiên cứu về kiểu gen kháng colistin ở vi khuẩn gram âm tại Việt Nam cịn khá ít.
Đặc biệt rất ít dữ liệu nghiên cứu công bố thông tin về cấu trúc plasmid mang gen
mcr-1 đi kèm yếu tố di truyền di động (trình tự gắn chèn IS, gen tra tiếp hợp) và các
vùng đảo kháng kháng sinh tồn tại trên plasmid mang gen mcr-1. Đồng thời cũng có
rất ít dữ liệu nghiên cứu về kiểu gen liên quan tính kháng colistin trên nhiễm sắc thể
cũng như sự lưu hành các dòng chủng vi khuẩn Gram âm kháng colistin phân lập
trên bệnh nhân trong những bệnh viện lớn tại Việt Nam.
Hiện nay, sàng lọc dữ liệu giải trình tự bộ gen WGS là một cách tiếp cận
thay thế trong nghiên cứu kiểu gen kháng thuốc ở vi khuẩn vì cung cấp nhiều thơng
tin hơn về kiểu gen, khả năng lan truyền gen kháng liên quan yếu tố chuyển vị trên
plasmid của các chủng vi khuẩn[14],[39]. Việc giải trình tự tồn bộ bộ gen kết hợp
cùng với các cơng cụ phân tích tin sinh học giúp tăng khả năng phát hiện nhiều gen
kháng thuốc cùng một lúc, đây là điều mà phương pháp PCR không làm được[14],[39].
Cơng nghệ giải trình tự gen thế hệ mới giúp việc phân tích bộ gen hay trình tự
plasmid của vi khuẩn một cách hiệu quả, nhanh chóng với chi phí thấp hơn so với
phương pháp giải trình tự Sanger[14].
Vì những lý do đề cập bên trên, chúng tôi sử dụng cơng nghệ giải trình tự
gen thế hệ mới khi thực hiện đề tài: ―Nghiên cứu kiểu gen đề kháng colistin của
một số vi khuẩn Gram âm gây nhiễm khuẩn bệnh viện tại khu vực phía Nam,
Việt Nam‖ để góp phần tìm hiểu kiểu gen liên quan tính kháng colistin và khả năng
lan truyền tính kháng giữa các chủng vi khuẩn Gram âm tại Việt Nam.

2


MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Mục tiêu tổng quát
Nghiên cứu kiểu gen liên quan tính kháng colistin ở một số vi khuẩn Gram
âm thường gặp gây nhiễm khuẩn bệnh viện tại khu vực phía Nam, Việt Nam.

Mục tiêu chuyên biệt
1. Xác định đặc điểm kháng kháng sinh của 222 chủng vi khuẩn Gram âm, thu
nhận chủng kháng colistin ở bốn bệnh viện tại khu vực phía Nam, Việt Nam.
2. Sàng lọc chủng vi khuẩn Gram âm kháng colistin có mang gen mcr (mcr-1 đến
mcr-9). Phân tích cấu trúc và khả năng lan truyền tính kháng của plasmid mang
gen mcr (nếu có).
3. Phân tích kiểu gen liên quan tính kháng colistin trên nhiễm sắc thể. Bước đầu
khảo sát mức độ biểu hiện của một số gen liên quan tính kháng colistin.
4. Xác định MLST, cây phân loài và phân loại ST (sequence type) các dịng
chủng. Xác định tương quan giữa kiểu hình và kiểu gen kháng kháng sinh ở vi
khuẩn Gram âm kháng colistin thu nhận được trong nghiên cứu.

3


NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
1. Xác định kiểu hình kháng của 222 chủng vi khuẩn Gram âm trong nghiên cứu
với 16 loại kháng sinh khác nhau dựa vào đường kính vùng ức chế (phương
pháp kháng sinh đồ) và giá trị nồng độ ức chế tối thiểu MIC (phương pháp pha
loãng trong thạch). Riêng kháng sinh colistin, phải sử dụng phương pháp vi pha
loãng sàng lọc chủng vi khuẩn Gram âm kháng colistin.

2. Giải trình tự bộ gen tất cả chủng vi khuẩn Gram âm kháng colistin thu nhận
được bằng hệ thống Illumina. Phân tích in silico dữ liệu giải trình tự WGS, xác
định gen mcr (mcr-1 đến mcr-9) kháng colistin. Giải trình tự bộ gen chủng vi

khuẩn Gram âm mang gen mcr bằng hệ thống nanopore nhằm thu được dữ liệu
bộ gen hồn chỉnh. Chứng minh khả năng lan truyền tính kháng colistin của
plasmid mang gen mcr bằng phương pháp tiếp hợp. Kiểm tra và xác nhận sự
hiện diện của gen mcr ở chủng sau tiếp hợp bằng phương pháp giải trình tự
Sanger.
3. Xác định kiểu gen liên quan tính kháng colistin trên nhiễm sắc thể (mgrB,
pmrCAB, phoPQ, lpxACD, pmrHFIJKLM …). Dự đoán khả năng thay đổi chức
năng protein của gen đột biến qua phân tích cấu trúc protein. Bước đầu khảo sát
mối liên quan giữa mức độ tăng biểu hiện của nhóm gen biến đổi LPS ở chủng
mang đột biến gen liên quan tính kháng colistin bằng phương pháp RT-qPCR.
4. Phân tích in silico xác định loại MLST, cây phân loài, hồ sơ gen kháng và sự
tương quan giữa kiểu hình và kiểu gen kháng kháng sinh ở vi khuẩn Gram âm
kháng colistin thu nhận được trong nghiên cứu.

4


1.

1CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

Bệnh nhiễm khuẩn được xác định dựa vào các yếu tố như ngõ vào của vi
khuẩn (ổ nhiễm khuẩn), cơ địa bệnh nhân và tác nhân gây bệnh. Trong đó việc phân
lập được tác nhân gây bệnh đóng vai trị rất quan trọng đặc biệt trong những trường
hợp nhiễm khuẩn nặng đe dọa tính mạng hoặc những trường hợp cần điều trị kháng
sinh k o dài. Mốc thời gian 48 giờ được sử dụng để phân biệt nhiễm khuẩn mắc
phải ở cộng đồng, nhiễm khuẩn liên quan đến chăm sóc y tế và nhiễm khuẩn bệnh
viện[24].
Nhiễm khuẩn mắc phải ở cộng đồng: nhiễm khuẩn được phát hiện trong
vòng 48 giờ đầu sau khi nhập viện hoặc bệnh nhân khơng có các tiêu chuẩn nhiễm

khuẩn liên quan đến chăm sóc y tế[24].
Nhiễm khuẩn liên quan đến chăm sóc y tế: nhiễm khuẩn xảy ra trong vòng
48 giờ nhập viện. Có điều trị ngắn hạn tại các cơ sở y tế ít nhất 2 ngày trong 90 ngày
gần đây, nhưng khơng có thủ thuật xâm lấn[24].
Nhiễm khuẩn liên quan đến bệnh viện: nhiễm khuẩn xảy ra sau 48 giờ
nhập viện[24], [120]. Nhập viện nhiều lần (≥ 3 lần), nằm viện k o dài (≥ 5 ngày) và/
hoặc có thủ thuật xâm lấn trong vòng 2 tuần hoặc tại lần nhập viện này hoặc mới
vừa nằm viện trong vòng 2 tuần tính từ đợt nhập viện này[24], [120].
Khoảng 90% các tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện là vi khuẩn[46] nên
nhiễm khuẩn bệnh viện còn được gọi là nhiễm khuẩn bệnh viện. Đặc biệt ở đơn vị
Hồi sức tích cực, tác nhân gây nhiễm khuẩn chủ yếu là vi khuẩn Gram âm chiếm
đến 70%[46].
Nhiễm khuẩn xảy ra sau khi phơi nhiễm một kháng sinh có thể do vi khuẩn
đã phát triển đề kháng với kháng sinh đó và có khả năng kháng với cả các kháng
sinh đồng chọn lọc, ví dụ như sử dụng cephalosporin thúc đẩy vi khuẩn phát triển
kháng thuốc bằng cách sinh ESBL, giúp vi khuẩn kháng ch o với quinolone,
aminoglycoside[46].
Tiêu chí đánh giá nguy cơ nhiễm khuẩn mắc phải ở bệnh viện do vi khuẩn đa
kháng bao gồm: yếu tố như tuổi nhỏ/cao, phẫu thuật, đặt dụng cụ nhân tạo, việc
dùng kháng sinh, thời gian nằm viện, chăm sóc y tế, tình trạng miễn dịch[46].
5


1.1.

Vi khuẩn Gram âm thƣờng gặp trong nhiễm khuẩn bệnh viện
Vấn đề nhiễm khuẩn nghiêm trọng xảy ra ở các bệnh viện thường do nhóm

vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae (Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli),
Pseudomonas aeruginosa và Acinetobacter spp gây ra[160]. K. pneumoniae là căn

nguyên gây nhiễm khuẩn bệnh viện thường gặp ở người[157]. Đặc điểm kháng thuốc
của vi khuẩn này cực kì nguy hiểm vì có khả năng sinh men β-lactamase phân giải
hầu hết các loại kháng sinh thuộc nhóm β-lactam[157] và làm tăng tỉ lệ tử
vong[106],[157].
Hệ thống phân loại:
Giới: Bacteria
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gamma Proteobacteria
Bộ: Enterobacteriale
Họ: Enterobacteriaceae
Chi: Klebsiella
Lồi: K. pneumoniae
Hình 1.1. Hình thái Klebsiella pneumoniae trên kính hiển vi điện tử
(Nguồn: />Escherichia coli là vi khuẩn gây bệnh quan trọng, có thể gây nhiều bệnh
khác như viêm phổi, viêm màng não, nhiễm khuẩn vết thương.
Hệ thống phân loại:
Giới: Bacteria
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gamma Proteobacteria
Bộ: Enterobacteriale
Họ: Enterobacteriaceae
Chi: Escherichia
Lồi: E. coli
Hình 1.2. Hình thái Escherichia coli trên kính hiển vi điện tử
(Nguồn: />6


Acinetobacter baumannii là một trong những tác nhân hàng đầu gây nhiễm
khuẩn bệnh viện với những bệnh lý khác nhau từ viêm phổi đến nhiễm khuẩn vết
thương, … [38]. A. baumannii dễ tồn tại trong môi trường bệnh viện do có khả năng

sống sót trên bề mặt khơ và kháng lại các chất khử trùng[38]. Tỉ lệ nhiễm khuẩn do
A. baumannii ngày càng tăng, đặc biệt khả năng kháng hầu hết kháng sinh là thách
thức cho điều trị vì kéo dài thời gian nằm viện, tăng chi phí điều trị và tỷ lệ tử
vong[38].
Hệ thống phân loại:
Giới: Bacteria
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gammaproteobacteria
Bộ: Pseudomonadales
Họ: Moraxellaceae
Chi: Acinetobacter
Lồi: A. baumannii
Hình 1.3. Hình thái Acinetobacter baumannii trên kính hiển vi điện tử
(Nguồn: />Pseudomonas aeruginosa là vi khuẩn gây bệnh cơ hội, nhiễm khuẩn P.
aeruginosa thường khó điều trị vì bản thân chủng có cơ chế đề kháng tự nhiên với
nhiều nhóm kháng sinh, bao gồm β-lactam, aminoglycoside và fluoroquinolone[146].
Hệ thống phân loại:
Giới: Bacteria
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gamma Proteobacteria
Bộ: Pseudomonadales
Họ: Pseudomonadaceae
Chi: Pseudomonas
Lồi: P. aeruginosa
Hình 1.4. Hình thái Pseudomonas aeruginosa trên kính hiển vi điện tử
(Nguồn: />7


1.2.

Kháng sinh colistin
Colistin (polymyxin E) là loại kháng sinh polypeptide thế hệ cũ của những

năm 1950[82],[124]. Đầu những năm 1970, colistin bị cấm sử dụng vì được phát hiện
gây độc cho hệ thần kinh và thận[82],[124].
Đến đầu những năm 2000, do tình trạng gia tăng nhanh chóng các chủng vi
khuẩn Gram âm đa kháng kèm theo sự thiếu hụt nguồn kháng sinh mới nên colistin
đã được sử dụng trở lại vì ưu điểm diệt khuẩn nhanh, phổ hoạt động đặc hiệu và sự
phát sinh tính kháng chậm.
Kháng sinh colistin được xếp vào nhóm ―liệu pháp điều trị cuối cùng‖ cho
những bệnh nhân nhiễm vi khuẩn Gram âm đa kháng (MDR) hoặc kháng phần lớn
(XDR) kháng sinh[82],[124].
Phổ hoạt động
Colistin có phổ hoạt động hẹp vì chỉ hiệu quả khi điều trị một số vi khuẩn
Gram âm như K. pneumoniae, E. coli, A. baumannii và P. aeruginosa[15],[82],[97].
Kháng sinh colistin không được sử dụng trong điều trị một số vi khuẩn Gram âm có
tính kháng colistin tự nhiên (Neisseria spp, Stenotrophomonas mallei, Proteus,
Serratia, Providencia, Moraxella catarrhalis, Helicobacter pylori, Edwarsiella sp.,
Brucella sp. và Burkholderia cepacia), vi khuẩn Gram dương, trực khuẩn và cả cầu
khuẩn[82].
Cấu trúc hóa học
Colistin có cấu trúc vịng 10 peptide, cấu thành từ D-leucine, L-threonine và
acid L-α-γ-diaminobutyric (DAB), với chuỗi bên ba peptide liên kết acid béo. Do
thành phần peptide liên kết với gốc NH4+ tự do nên colistin mang điện tích
dương[82].
Có 2 dạng colistin lưu hành trên thị trường là: colistin sulfate và dạng colistin
methanesulfonate với cấu trúc hóa học khác nhau[82]. Colistin sulfate được đưa vào
sử dụng đầu tiên có độc tính mạnh đối với thận và hệ thần kinh[82]. Năm 1959,
colistimethate sodium (CMS) dẫn xuất colistin ít độc tính hơn đã được tìm ra, bằng
cách bổ sung thành phần –CH2SO3– vào tất cả vị trí nhóm amin tự do[82].

8