Nghiên cứu mức độ methyl hóa của một số gen liên quan đến bệnh ung thư vú và ung thư cổ tử cung

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRƯƠNG KIM PHƯỢNG

NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ METHYL HÓA CỦA
MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN
BỆNH UNG THƯ VÚ VÀ UNG THƯ CỔ TỬ CUNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

TP. Hồ Chí Minh - Năm 2020


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRƯƠNG KIM PHƯỢNG

NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ METHYL HÓA CỦA
MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN
BỆNH UNG THƯ VÚ VÀ UNG THƯ CỔ TỬ CUNG
Ngành: Công Nghệ Sinh Học
Mã số ngành: 62420201
Phản biện 1: TS. TRẦN GIA BỬU
Phản biện 2: TS. PHẠM ĐÌNH CHƯƠNG
Phản biện 3: TS. LÊ MINH THƠNG
Phản biện độc lập 1: PGS.TS. HOÀNG ANH VŨ
Phản biện độc lập 2: TS. ĐỖ THỊ THU HẰNG
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. PGS.TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY

TP. Hồ Chí Minh - Năm 2020


LỜI CAM ĐOAN

Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi. Các dữ liệu
kết quả nêu trong luận án có nguồn gốc rõ ràng, đã công bố theo đúng quy định. Các
kết quả nghiên cứu trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng được cơng
bố trong bất cứ cơng trình nào khác.

Nghiên cứu sinh

Trương Kim Phượng


LỜI CẢM ƠN
Sau thời gian học tập và nghiên cứu, để hồn thành chương trình học tập,
nghiên cứu và thực hiện báo cáo đề tài luận án, tôi xin chân thành bày tỏ lòng
biết ơn đến:
Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại học, Bộ môn
Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học
Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện giúp đỡ tơi trong q trình
học tập, nghiên cứu khoa học và hồn thành đề tài luận án.
Ban Giám hiệu, Lãnh đạo Khoa Công nghệ Sinh học
Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho tơi hồn
thành cơng tác và có thời gian học tập và nghiên cứu.
Đặc biệt, tơi bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Lê Huyền Ái Thúy,
Cơ ln tận tình hướng dẫn tôi trên con đường học tập,nghiên cứu khoa học.
Cô tận tình động viên để tơi vượt qua trở ngại, hồn thành đề tài luận án.

TS. Đoàn Thị Phương Thảo nhiệt tình giúp đỡ tơi trong q trình thực
hiện nội dung nghiên cứu của luận án.
Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á tạo điều kiện, hỗ trợ tơi trong q
trình thực hiện nghiên cứu.
Tơi kính gửi lời tri ân sâu sắc đến Cha và Mẹ, người dành cả cuộc đời
để yêu thương tôi và cho tôi những điều tốt đẹp nhất. Tôi chân thành cảm ơn
những thành viên thương yêu trong gia đình, Thầy Cơ, đồng nghiệp,
bạn bè và các bạn sinh viên đã động viên, hỗ trợ và chia sẻ cùng tơi trong
q trình học tập và nghiên cứu.


MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Mục lục

i

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

iv

Danh mục các bảng

vi

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

x

ĐẶT VẤN ĐỀ

1

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

4

1.1.

4

TỔNG QUAN UNG THƯ

1.1.1. Khái niệm ung thư

4

1.1.2. Các yếu tố nguy cơ ung thư

6

1.1.3. Ung thư vú

10

1.1.4. Ung thư cổ tử cung

13

1.1.5. Tình hình ung thư trên thế giới và tại Việt Nam

18

1.2.

19

DẤU CHỨNG SINH HỌC UNG THƯ

1.2.1. Khái quá dấu chứng sinh học ung thư

19

1.2.2. Dấu chứng sinh học ung thư vú

21

1.2.3. Dấu chứng sinh học ung thư cổ tử cung

23

1.3.

24

SỰ METHYL HĨA DNA

1.3.1. Epigenetic

24

1.3.2. Sự methyl hóa DNA

25

1.3.3. Khuynh hướng điều trị ung thư dựa trên sự methyl hóa DNA

29

1.3.4. Khuynh hướng chẩn đốn ung thư dựa trên sự methyl hóa DNA

31

1.3.5. Phương pháp phân tích sự methyl hóa DNA

39

1.4.

46

TỔNG QUAN CÁC GEN MỤC TIÊU

1.4.1. Khái quát về các gen mục tiêu

46

1.4.2. Sự methyl hóa các gen mục tiêu

65
i


1.4.3. Tình hình nghiên cứu sự methyl hóa DNA đối với bệnh ung thư

71

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

76

2.1.

VẬT LIỆU

76

2.1.1. Vật liệu sinh học

76

2.1.2. Công cụ tin sinh học

78

2.1.3. Hóa chất

79

2.1.4. Thiết bị

79

2.1.5. Địa điểm nghiên cứu

79

2.2.

80

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Khai thác dữ liệu và phân tích tổng hợp về tính chất methyl hóa DNA
đối với ung thư vú và ung thư cổ tử cung
2.2.2. Khảo sát in silico

82
90

2.2.3. Khảo sát thực nghiệm trên bộ mẫu sinh thiết mô vú và bộ mẫu
dịch phết tế bào cổ tử cung

91

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

99

3.1.

KẾT QUẢ KHAI THÁC DỮ LIỆU VÀ PHÂN TÍCH TỔNG HỢP
XÁC ĐỊNH SỰ TƯƠNG QUAN GIỮA TÍNH CHẤT
METHYL HĨA BẤT THƯỜNG CỦA MỘT SỐ GEN MỤC TIÊU
VÀ UNG THƯ VÚ, UNG THƯ CỔ TỬ CUNG

3.1.1. Bộ dữ liệu trong phân tích tổng hợp

99
99

3.1.2. Phân tích sự tương quan giữa tính chất methyl hóa gen mục tiêu
và nguy cơ mắc ung thư vú

102

3.1.3. Phân tích tương quan giữa tính chất methyl hóa các gen mục tiêu
3.2.

và nguy cơ mắc ung thư cổ tử cung

110

KẾT QUẢ KHẢO SÁT IN SILICO

118

3.2.1. Thu nhận trình tự gen, xác định cấu trúc gen và đảo CpG

118

3.2.2. Thiết kế và đánh giá mồi

121

3.3.

KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỰC NGHIỆM XÁC ĐỊNH
SỰ TƯƠNG QUAN GIỮA TÍNH CHẤT METHYL HĨA

ii


BẤT THƯỜNG CỦA MỘT SỐ GEN MỤC TIÊU VÀ
UNG THƯ VÚ, UNG THƯ CỔ TỬ CUNG, Ở NGƯỜI VIỆT NAM 125
3.3.1. Đặc điểm methyl hóa các gen BRCA1, cyclin D2, p16INK4α, GSTP1,
RASSF1A trên bộ mẫu sinh thiết mô vú

128

3.3.2. Đặc điểm methyl hóa các gen APC, DcR1, p16INK4α, DAPK, RARβ
trên bộ mẫu dịch phết tế bào cổ tử cung

135

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

141

KẾT LUẬN

141

KIẾN NGHỊ

143

DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ

144

TÀI LIỆU THAM KHẢO

146

PHỤ LỤC

P1

iii


Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
AC, ADC

Adenomacarcinoma

AGC

Atypical Glandular Cells

APC

Adenomatous polyposis coli

ASC

Atypical squamous cell

ASR

Age Standardized Rate

bp

base pair

BRCA1

Breast cancer only one set, 1

CCND2

Cyclin D2

CDH1

Cadherin 1 (E-cadherin)

CDK

Cyclin-dependent kinase

CDKN2A

Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A

CEA

Carcinoembryonic antigen

CGIs

CpG island

CI

Confidence interval

CIN

Cervical intraepithelial neoplasia

CpG

Cytosine phosphate Guanine

DAPK

Death-associated protein kinase

DCIS

Ductal carcinoma in situ

Dcr1

Decoy receptor 1

DNA

Deoxyribonucleic acid

DNMT

DNA methyltransferase

EBV

Virus Epstein-Barr

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

GSTP1

Glutathione S-transferase pi 1

HPV

Human papilloma virus

HR

High risk

HSIL

High Grade Squamous Intraepithelial Lesion

IARC

International Agency for Research on Cancer
iv


IDC

Infiltrating ductal carcinoma

JNK

c-Jun N-terminal kinases

LR

Low risk

LSIL

Low Grade Squamous Intraepithelial Lesion

MBD

Methyl-CpG binding domain

MGMT

O6-methylguanine-DNA methyltransferase

miRNA

microRNA

MI

Methylation index

MSP

Methylation Specific PCR

NCBI

National Center for Biotechnology Information

Nested-MSP

Nested Methylation Specific PCR

OR

Odds Ratio

P16INK4a

Cyclin-Dependent Kinase inhibitor 2A

PCNA

Proliferating cell nucleus antigen

PCR

Polymerase Chain Reaction

QMSP

Quantitative Methylation specific Polymerase chain reation

RARβ

Retinoic acid receptor beta (RAR-beta)

RASSF1A

Ras association domain family protein 1A

qPCR

Real-time Polymerase Chain Reaction

SAM

S-adenyl methionine

SCC-Ag

Saquamous cell carcinoma antigen

SDS

Sodium dodecyl sulphate

TCF

T-cell factor/lymphoid enhancer factor

TIMP-3

Tissue inhibitor of metalloproteinase 3

TNBC

Triple negative breast cancer

TRDMT1

tRNA aspartic acid methyltransferase

Tris HCl

Tris(hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride

UHRF2

Ubiquitin-Like With PHD And Ring Finger domain 2

WHO

World Health Organization

v


Danh mục các bảng
Trang
Bảng 1.1. Một số nhóm gen ức chế khối

8

Bảng 1.2. Một số dạng thay đổi trên bộ gen liên quan
đến bệnh ung thư vú

11

Bảng 1.3. Tính chất methyl hóa các gen mục tiêu trong ung thư vú và

ung thư cổ tử cung

74

Bảng 2.1. Tiêu chí chọn mơ hình phân tích tổng

87

Bảng 2.2. Số liệu minh họa về mức độ methyl hóa trên gen mục tiêu

88

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR trong quy trình MSP/Nested-MSP

95

Bảng 3.1. Tỷ lệ methyl hóa các gen mục tiêu trong bộ mẫu ung thư vú và
bộ mẫu chứng, thuộc các nghiên cứu bệnh-chứng

100

Bảng 3.2. Tỷ lệ methyl hóa các gen mục tiêu trong bộ mẫu ung thư cổ tử cung
và bộ mẫu chứng, thuộc các nghiên cứu bệnh-chứng

101

Bảng 3.3. Đặc điểm 12 nghiên cứu bệnh-chứng về tính chất methyl hóa
gen p16INK4α trên bệnh ung thư vú

102

Bảng 3.4.Chỉ số OR phản ánh mức độ methyl hóa gen p16INK4α
trên bệnh ung thư vú, thuộc 12 nghiên cứu bệnh-chứng

103

Bảng 3.5. Chỉ số OR phản ánh mức độ methyl hóa gen p16INK4α
trên bệnh ung thư vú, thuộc 8 nghiên cứu bệnh-chứng

106

Bảng 3.6. Chỉ số OR phản ánh mức độ methyl hóa gen p16INK4α
trên bệnh ung thư vú, theo một số phân hạng

108

Bảng 3.7. Đặc điểm 17 nghiên cứu bệnh-chứng về tính chất methyl hóa
gen p16INK4α trên bệnh ung thư cổ tử cung

110

Bảng 3.8. Chỉ số OR phản ánh mức độ methyl hóa gen p16INK4α
trên bệnh ung thư cổ tử cung, thuộc 17 nghiên cứu bệnh-chứng

111

Bảng 3.9. Chỉ số OR phản ánh mức độ methyl hóa gen p16INK4α
trên bệnh ung thư cổ tử cung, thuộc 9 nghiên cứu bệnh-chứng

vi

114


Bảng 3.10. Chỉ số OR phản ánh mức độ methyl hóa gen p16INK4α
trên bệnh ung thư cổ tử cung, theo một số phân hạng

116

Bảng 3.11. Thông tin các đảo CpG trên gen p16INK4α

118

Bảng 3.12. Thông tin bộ mồi khảo sát tính chất methyl hóa các gen mục tiêu 122
Bảng 3.13. Thông số nhiệt độ lai của phản ứng MSP

125

Bảng 3.14. Đặc điểm của bộ mẫu bệnh phẩm sinh thiết

128

Bảng 3.15. Tính chất methyl hóa các gen mục tiêu
trong bộ mẫu sinh thiết mơ vú

129

Bảng 3.16. Tính chất methyl hóa của các gen mục tiêu trong bộ mẫu
sinh thiết mô vú, theo đặc điểm bệnh học ung thư vú

130

Bảng 3.17. Chỉ số MI về mức độ methyl hóa DNA các gen mục tiêu
trong bộ mẫu sinh thiết mơ vú

134

Bảng 3.18. Tính chất methyl hóa các gen mục tiêu
trong bộ mẫu dịch phết tế bào cổ tử cung

135

Bảng 3.19. Mức độ tương quan giữa tính chất methyl hóa DNA
và chỉ số nhiễm HPV

137

Bảng 3.20. Tính chất methyl hóa các gen mục tiêu trong bộ mẫu dịch phết
tế bào cổ tử cung, theo đặc điểm nhiễm type HPV

137

Bảng 3.21. Chỉ số MI về mức độ methyl hóa DNA các gen mục tiêu
trong bộ mẫu dịch phết tế bào cổ tử cung

140

Phụ lục Bảng
Bảng PL1.1. Thông tin một số gen trên bộ gen

P1

Bảng PL1.2. Thông tin một số gen sinh ung

P4

Bảng PL1.3. Một số dấu chứng sinh học tiềm năng cho ung thư

P4

Bảng PL1.4. Các dạng bệnh ung thư vú

P5

Bảng PL1.5. Đặc điểm hóa mô miễn dịch của một số dạng bệnh ung thư vú

P5

Bảng PL1.6. Một số phương pháp phân tích tính chất methyl hóa DNA

P6

Bảng PL1.7. Đặc điểm của một số phương pháp phân tích methyl hóa DNA,
dựa vào phương pháp biến đổi bisulfite và kỹ thuật PCR

vii

P7

Bảng PL3.1. Số lượng công bố khoa học trong tiến trình
khai thác dữ liệu và phân tích tổng hợp

P8

Bảng PL3.2. Đặc điểm các nghiên cứu bệnh-chứng về tính chất methyl hóa
các gen mục tiêu trên bệnh ung thư vú

P8

Bảng PL3.3. Đặc điểm các nghiên cứu bệnh-chứng về tính chất methyl hóa
các gen mục tiêu trên bệnh ung thư cổ tử cung

P10

Bảng PL3.4. Chỉ số OR phản ánh mức độ methyl hóa gen BRCA1
trên bệnh ung thư vú, thuộc 16 nghiên cứu bệnh-chứng

P11

Bảng PL3.5. Chỉ số OR phản ánh mức độ methyl hóa gen cyclin D2
trên bệnh ung thư vú, thuộc 16 nghiên cứu bệnh-chứng

P12

Bảng PL3.6. Chỉ số OR phản ánh mức độ methyl hóa gen GSTP1
trên bệnh ung thư vú, thuộc 16 nghiên cứu bệnh-chứng

P13

Bảng PL3.7. Chỉ số OR phản ánh mức độ methyl hóa gen RASSF1A
trên bệnh ung thư vú, thuộc 12 nghiên cứu bệnh-chứng

P14

Bảng PL3.8. Tổng hợp chỉ số OR phản ánh mức độ methyl hóa
các gen mục tiêu trên bệnh ung thư vú, theo chủng tộc

P15

Bảng PL3.9. Tổng hợp chỉ số OR phản ánh mức độ methyl hóa
các gen mục tiêu trên bệnh ung thư vú, theo loại mẫu và phương pháp

P16

Bảng PL3.10. Chỉ số OR phản ánh mức độ methyl hóa gen DAPK
trên bệnh ung thư cổ tử cung, thuộc 21 nghiên cứu bệnh-chứng

P17

Bảng PL3.11. Chỉ số OR phản ánh mức độ methyl hóa gen RARβ
trên bệnh ung thư cổ tử cung, thuộc 10 nghiên cứu bệnh-chứng

P18

Bảng PL3.12. Tổng hợp chỉ số OR phản ánh mức độ methyl hóa
các gen mục tiêu trên bệnh ung thư cổ tử cung, theo chủng tộc

P18

Bảng PL3.13. Tổng hợp chỉ số OR phản ánh mức độ methyl các gen mục tiêu
trên bệnh ung thư cổ tử cung, theo loại mẫu và phương pháp

P19

Bảng PL3.14. Thông tin vùng promoter thuộc các gen mục tiêu
được khảo sát tính chất methyl hóa

P20

Bảng PL3.15. Thông số vật lý của bộ mồi khảo sát

viii


tính chất methyl hóa trên các gen mục tiêu

P22

Bảng PL3.16. Bộ mẫu bệnh phẩm ung thư vú và bộ mẫu chứng

P23

Bảng PL3.17. Tính chất methyl hóa các gen mục tiêu trong
bộ mẫu sinh thiết mô ung thư vú và bộ mẫu chứng

P27

Bảng PL3.18. Tính chất methyl hóa các gen mục tiêu trong
bộ mẫu dịch phết tế bào cổ tử cung

P30

Bảng PL3.19. Tính chất methyl hóa các gen mục tiêu trong
bộ mẫu bệnh phẩm ung thư vú

P36

Bảng PL3.20. Tính chất methyl hóa các gen mục tiêu trong
bộ mẫu bệnh phẩm nhiễm HPV type nguy cơ cao

ix

P36


Danh mục các hình vẽ, đồ thị
Trang
Hình 1.1. Quá trình sinh ung

4

Hình 1.2. Sự xâm nhiễm của HPV và diễn tiến của ung thư cổ tử cung

16

Hình 1.3. Sự methyl hóa DNA – Dấu chứng sinh học tiềm năng

20

Hình 1.4. Phản ứng methyl hóa cytosine

26

Hình 1.5. Tiến trình chọn lọc phương pháp phân tích methyl hóa DNA

41

Hình 1.6. Ngun tắc biến đổi DNA bằng bisulfite

43

Hình 1.7. Chức năng của protein APC

48

Hình 1.8. Chức năng của protein BRCA1

50

Hình 1.9. Chức năng của protein Cyclin

52

Hình 1.10. Chức năng của protein p16INK4α

54

Hình 1.11. Chức năng của protein DAPK

56

Hình 1.12. Chức năng của protein DcR1

58

Hình 1.13. Chức năng của protein GSTP1

60

Hình 1.14. Chức năng của thụ thể retinoic acid

62

Hình 1.15. Chức năng của protein RASSF1A

64

Hình 2.1. Tiến trình thí nghiệm

81

Hình 2.2. Chương trình ln nhiệt phản ứng MSP và Nested-MSP

95

Hình 2.3. Phương pháp MSP

96

Hình 3.1. Vị trí đảo CpG trên trình tự promoter gen p16INK4α
được khảo sát tính chất methyl hóa

120

Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm Nested-MSP ở gen p16INK4α
trên một số mẫu bệnh phẩm ung thư vú

126

Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm Nested-MSP ở gen p16INK4α
trên một số mẫu bệnh phẩm nhiễm HPV type nguy cơ cao

126

Hình 3.4. Kết quả giải trình tự sản phẩm MSP gen p16INK4α

127

Đồ thị 3.1. Mức độ methyl hóa gen p16INK4α trên bệnh ung thư vú
(Đồ thị Forest plot trên 12 nghiên cứu bệnh-chứng)
x

104


Đồ thị 3.2. Sự thiên vị trong 12 nghiên cứu bệnh-chứng về tính chất
methyl hóa gen p16INK4α trên bệnh ung thư vú (Đồ thị Funnel plot)

104

Đồ thị 3.3. Mức độ methyl hóa gen p16INK4α trên bệnh ung thư vú
(Đồ thị Forest plot trên 8 nghiên cứu bệnh-chứng)

106

Đồ thị 3.4. Sự thiên vị trong 8 nghiên cứu bệnh-chứng về tính chất
methyl hóa gen p16INK4α trên bệnh ung thư vú (Đồ thị Funnel plot)

107

Đồ thị 3.5. Mức độ methyl hóa gen p16INK4α t trên bệnh ung thư cổ tử cung
(Đồ thị Forest plot trên 17 nghiên cứu bệnh-chứng)

112

Đồ thị 3.6. Sự thiên vị trong 17 nghiên cứu bệnh-chứng về tính chất
methyl hóa gen p16INK4α trên bệnh ung thư cổ tử cung (Đồ thị Funnel plot)

112

Đồ thị 3.7. Mức độ methyl hóa gen p16INK4α trên bệnh ung thư cổ tử cung
(Đồ thị Forest plot trên 9 nghiên cứu bệnh-chứng)

114

Đồ thị 3.8. Sự thiên vị trong 9 nghiên cứu bệnh-chứng về tính chất
methyl hóa gen p16INK4α trên bệnh ung thư cổ tử cung (Đồ thị Funnel plot)

115

Phụ lục Hình:
Hình PL1.1. Định vị của các gen mục tiêu

P37

Hình PL1.2. Định vị của các gen mục tiêu (tiếp theo)

P38

Hình PL3.1. Trình tự đảo CpG thuộc vùng promoter gen APC
được khảo sát tính chất methyl hóa

P40

Hình PL3.2. Trình tự đảo CpG thuộc vùng promoter gen BRCA1
được khảo sát tính chất methyl hóa

P41

Hình PL3.3. Trình tự đảo CpG thuộc vùng promoter gen cyclin D2
được khảo sát tính chất methyl hóa

P42

Hình PL3.4. Trình tự đảo CpG thuộc vùng promoter gen DAPK
được khảo sát tính chất methyl hóa

P43

Hình PL3.5. Trình tự đảo CpG thuộc vùng promoter gen DcR1
được khảo sát tính chất methyl hóa

P44

Hình PL3.6. Trình tự đảo CpG thuộc vùng promoter gen GSTP1
được khảo sát tính chất methyl hóa

P45

xi


Hình PL3.7. Trình tự đảo CpG thuộc vùng promoter gen RARβ
được khảo sát tính chất methyl hóa

P46

Hình PL3.8. Trình tự đảo CpG thuộc vùng promoter gen RASSF1A
được khảo sát tính chất methyl hóa

P47

Hình PL3.9. Kết quả giải trình tự sản phẩm MSP gen BRCA1

P48

Hình PL3.10. Kết quả giải trình tự sản phẩm MSP gen cyclin D2

P49

Hình PL3.11. Kết quả giải trình tự sản phẩm MSP gen GSTP1

P50

Hình PL3.12. Kết quả giải trình tự sản phẩm MSP gen RASSF1A

P51

Hình PL3.13. Kết quả giải trình tự sản phẩm MSP gen APC

P52

Hình PL3.14. Kết quả giải trình tự sản phẩm MSP gen DcR1

P53

Hình PL3.15. Kết quả giải trình tự sản phẩm MSP gen DAPK

P54

Hình PL3.16. Kết quả giải trình tự sản phẩm MSP gen RARβ

P55

Phụ lục Đồ thị:
Đồ thị PL1.1. Số liệu ung thư trên thế giới vào năm 2018

P56

Đồ thị PL1.2. Số liệu ung thư ở Việt Nam vào năm 2018

P57

Đồ thị PL3.1. Mức độ methyl hóa gen BRCA1 trên bệnh ung thư vú
(Đồ thị Forest plot trên 16 nghiên cứu bệnh-chứng)

P58

Đồ thị PL3.2. Sự thiên vị trong 16 nghiên cứu bệnh-chứng về tính chất
methyl hóa gen BRCA1 trên bệnh ung thư vú (Đồ thị Funnel plot)

P58

Đồ thị PL3.3. Mức độ methyl hóa gen cyclin D2 trên bệnh ung thư vú
(Đồ thị Forest plot trên 16 nghiên cứu bệnh-chứng)

P59

Đồ thị PL3.4. Sự thiên vị trong 16 nghiên cứu bệnh-chứng về tính chất
methyl hóa gen cyclin D2 trên bệnh ung thư vú (Đồ thị Funnel plot)

P59

Đồ thị PL3.5. Mức độ methyl hóa gen GSTP1 trên bệnh ung thư vú
(Đồ thị Forest plot trên 16 nghiên cứu bệnh-chứng)

P60

Đồ thị PL3.6. Sự thiên vị trong 16 nghiên cứu bệnh-chứng về tính chất

methyl hóa gen GSTP1 trên bệnh ung thư vú (Đồ thị Funnel plot)

P60

Đồ thị PL3.7. Mức độ methyl hóa gen RASSF1A trên bệnh ung thư vú
(Đồ thị Forest plot trên 12 nghiên cứu bệnh-chứng)

xii

P61


Đồ thị PL3.8. Sự thiên vị trong 12 nghiên cứu bệnh-chứng về tính chất
methyl hóa gen RASSF1A trên bệnh ung thư vú (Đồ thị Funnel plot)

P61

Đồ thị PL3.9. Mức độ methyl hóa gen DAPK trên bệnh ung thư cổ tử cung

P62

Đồ thị PL3.10. Sự thiên vị trong 21 nghiên cứu bệnh-chứng về tính chất
methyl hóa gen DAPK trên bệnh ung thư cổ tử cung (Đồ thị Funnel plot)

P62

Đồ thị PL3.11. Mức độ methyl hóa gen RARβ trên bệnh ung thư cổ tử cung
(Đồ thị Forest plot trên 10 nghiên cứu bệnh-chứng)

P63

Đồ thị PL3.12. Sự thiên vị trong 10 nghiên cứu bệnh-chứng về tính chất
methyl hóa RARβ trên bệnh ung thư cổ tử cung (Đồ thị Funnel plot)

P63

Phụ lục. Cập nhật cơng bố khoa học về kết quả phân tích tổng hợp trên
gen p16INK4α

P64

xiii


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư vú và ung thư cổ tử cung là hai loại ung thư thường gặp nhất và
gây tử vong cao ở phụ nữ nhiều nước trên thế giới và ở Việt Nam. Đây là các bệnh
lý rất phức tạp, do đó đã có nhiều nghiên cứu tập trung chủ yếu về nguyên nhân,
bệnh sinh và điều trị trong nhiều năm qua.
Những năm gần đây, hiện tượng epigenetic (sự thay đổi quá trình biểu hiện của
gen, mặc dù bản chất gen – trình tự nucleotide của gen khơng thay đổi) đang được
nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm theo khuynh hướng sử dụng chúng như
dấu chứng sinh học (biomarker), và thực tế cho thấy có một sự liên quan hết sức chặt
chẽ giữa hiện tượng epigenetic với nhiều loại ung thư. Một trong những kiểu
epigenetic được chứng minh có tiềm năng trở thành dấu chứng sinh học cao, đó là sự
bất hoạt của các gen ức chế khối u (tumour suppressor gene) bằng cơ chế methyl hóa
cao quá mức (hypermethylation) ở các nucleotide cytosine hiện diện chủ yếu trong
các đảo CpG (CpG island), và sự methyl hóa cao quá mức này thường được ghi nhận
tại vùng promoter hay kéo dài qua đến exon thứ nhất của các gen ức chế khối u này.
Xét nghiệm sàng lọc methyl hóa cao quá mức tại vùng promoter gen SEPT9 là sản

phẩm đầu tiên đã được Cục quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Mỹ (Food & Drug
Administration – FDA) phê chuẩn năm 2016 áp dụng cho ung thư đại trực tràng, đã
và đang mở ra nhiều triển vọng cho việc ứng dụng loại dấu chứng sinh học này không
những trong ung thư mà còn đối với các bệnh khác.
Việc tìm hiểu về tính mẫn cảm của con người đối với bệnh, mức độ biến đổi
vật chất di truyền của tế bào hoặc mức độ epigenetic trên cộng đồng dân cư Việt Nam,
sẽ là những dữ liệu ban đầu hết sức cần thiết nhằm tìm ra một loại dấu chứng
sinh học cho ung thư nói chung, ung thư vú hoặc ung thư cổ tử cung nói riêng.
Vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện nhằm tìm hiểu mức độ methyl hóa tại các đảo
CpG thuộc vùng promoter của một số gen liên quan đến bệnh ung thư vú và ung thư
cổ tử cung ở người Việt Nam. Những dữ liệu này sẽ là cơ sở khoa học quan trọng
nhằm tiến tới việc thiết lập các dấu chứng sinh học đặc trưng cho ung thư vú và
ung thư cổ tử cung trên người bệnh Việt Nam, ứng dụng trong các thử nghiệm
1


lâm sàng nhằm sàng lọc, chẩn đoán sớm và kể cả áp dụng thử nghiệm các phương
thức điều trị bệnh mới.

Mục tiêu tổng quát
Khảo sát mức độ methyl hóa của một số gen liên quan đến bệnh ung thư vú và
bệnh ung thư cổ tử cung.

Mục tiêu cụ thể
Nghiên cứu được bố trí ở dạng phân tích tổng hợp kết hợp thực nghiệm ở dạng
nghiên cứu bệnh-chứng, gồm các mục tiêu cụ thể:
1.

Xác định độ mạnh của sự tương quan giữa tính chất methyl hóa bất thường của

một số gen mục tiêu và nguy cơ mắc ung thư vú và ung thư cổ tử cung trên
thế giới và Việt Nam, bằng khai thác dữ liệu và phân tích tổng hợp
(Meta-analysis) trên từng gen mục tiêu: BRCA1, p16INK4α, cyclin D2, GSTP1 và
RASSF1A trong ung thư vú; DcR1, p16INK4α, DAPK, RARβ và APC trong ung thư
cổ tử cung.
2.

Xác định sự tương quan giữa tính chất methyl hóa bất thường tại các đảo CpG

thuộc vùng promoter của các gen mục tiêu: BRCA1, p16INK4a, cyclin D2, GSTP1
trong ung thư vú; DcR1, p16INK4α, DAPK, RARβ và APC trong ung thư cổ tử cung
(yếu tố nhiễm HPV - tiền ung thư cổ tử cung), ở người Việt Nam, bằng khảo sát
thực nghiệm trên bộ mẫu sinh thiết mô vú và bộ mẫu dịch phết tế bào cổ tử cung.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án
Bước vào thế kỷ 21, xu hướng y học có tính dự phịng, và đặc biệt là y học
cá thể (personal medicine) đang dần được hiện thực hóa, đặc biệt khi mà dữ liệu lớn
mang thuộc tính phân tử (big molecular data) đang được xây dựng và phát triển nhanh
chóng bởi việc giải mã tồn bộ bộ gen đang được thực hiện khá dễ dàng và phổ biến.
Như vậy, hiện tại và những năm tới, một trong những nhiệm vụ khơng kém phần quan
trọng đặt ra đó là tìm hiểu chức năng, ảnh hưởng của mỗi gen, hoạt động của mỗi gen
đến tính trạng trên con người, để rồi qua đó, việc chăm sóc sức khỏe cho mỗi cá nhân
sẽ dần được thực hiện dựa trên chính thơng tin của các gen của cá nhân đó. Cho nên,
những nghiên cứu về hoạt động của gen cần phải được tiến hành trên mỗi quần thể,
2


mỗi dân tộc đặc trưng, để tìm ra những điểm riêng, phản ánh tính tương tác giữa
kiểu gen đó, với các điều kiện sinh mơi mang tính đặc trưng của mỗi đất nước,
mỗi vùng miền, ảnh hưởng đến căn bệnh đang nghiên cứu.

Tính chấ t methyl hóa ta ̣i các đảo CpG thuô ̣c vùng promoter của các gen, nhấ t là
nhóm gen ức chế khối u là mô ̣t đă ̣c tính nổi bật của các tế bào ung thư, thể hiện khá
rõ trong ung thư vú, ung thư cổ tử cung; các công bố chủ yếu ở nước ngoài và một số
công bố trong nước đã dần đưa ra nhiề u số liê ̣u minh chứng. Các tỷ lệ methyl hóa cao
vượt mức của các gen ở các công bố có phầ n khác nhau, phầ n lớn tùy thuô ̣c vào loa ̣i
mẫu sử dụng, kỹ thuật phát hiê ̣n, và nhấ t là các chủng tô ̣c người bệnh
khác biệt nhau. Tính chất methyl hóa cao vượt mức phản ánh “sức số ng” của bô ̣ gen
trong những điề u kiê ̣n môi trường sống khác biê ̣t, liên quan tới bê ̣nh lý ung thư, vì
vâ ̣y vẫn đang cần được tiế p tu ̣c nghiên cứu, góp phần làm sáng tỏ cơ chế hình thành
của các khối u trong cơ thể người bệnh và phát triển thành ung thư. Dữ liệu khoa học
này cần được tiếp tục tích lũy, trên nhiều loại mẫu lâm sàng khác nhau, nhiều cộng
đồng dân cư với điều kiện sinh môi khác nhau, nhằm hướng tới viê ̣c sử du ̣ng chúng
như mô ̣t dấ u chứng sinh ho ̣c đặc trưng cho từng bê ̣nh ung thư, hỗ trợ trong các thử
nghiệm lâm sàng nhằm sàng lọc, chẩ n đoán sớm và kể cả áp dụng trong thử nghiệm
các phương thức điề u tri bệnh
mới.
̣
Tính mới của luận án
Luận án tiếp cận hai căn bệnh ung thư vú và ung thư cổ tử cung dựa trên phân
tích tính chất methyl hóa tại các vị trí CpG quan trọng nằm trong các đảo CpG thuộc
vùng promoter của một số gen ức chế khối u, trên người bệnh Việt Nam. Việc phân
tích kết hợp các gen (gồm 5 gen liên quan đến ung thư vú và 5 gen liên quan đến ung
thư cổ tử cung) là một điểm mới của luận án này, so với số cơng bố ít ỏi về tính chất
methyl hóa cao vượt mức này, trên người bệnh Việt Nam. Hơn nữa, việc so sánh tính
chất methyl hóa của các gen này với các dân tộc khác trên thế giới nhằm tìm ra các
đặc điểm riêng xuất hiện trong hệ gen người Việt Nam liên quan đến hai căn bệnh:
ung thư vú và ung thư cổ tử cung, xác định các yếu tố nguy cơ mang tính đặc trưng
ở người Việt Nam là điểm mới khác nữa của luận án.

3

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

TỔNG QUAN UNG THƯ

1.1.1.

Khái niệm ung thư

Ung thư là tên gọi của nhóm bệnh lý ở người, liên quan đến sự rối loạn trong
quá trình phân bào và các cơ chế điều hòa nội bào, dẫn đến sự loạn sản, các tế bào
bất thường phát triển quá mức và xâm lấn cục bộ hoặc di căn đến mô, bộ phận khác
ở xa trong cơ thể[118, 134, 135, 151, 457]. Một số thuật ngữ khác đề cập đến ung thư: khối u
ác tính và tân sinh ác tính[457].

Hình 1.1. Q trình sinh ung[258, 276]

4


Quá trình chuyển đổi tế bào lành (tế bào bình thường) thành tế bào tổn thương
tiền ung và tế bào khối u (bướu) ác tính diễn tiến qua nhiều giai đoạn: sự khơi mào
với các dạng bất thường về sự sinh trưởng và phân bào (tăng sản hoặc loạn sản), tiếp
theo là sự chuyển biến từ tế bào u lành thành u ác tính, tiến triển theo hướng xâm lấn
và di căn[118, 134, 135]. Ung thư khởi phát ở các tế bào đơn lẻ với hoạt động bất thường
ở cấp độ gen và protein, do sự tác động của các yếu tố môi trường cùng với các dạng
biến đổi trên bộ gen (đột biến, epigenetic, sự thay đổi cấu trúc nhiễm sắc thể, ...),
được mơ tả ở hình 1.1. Hệ quả của những biến đổi bất thường trên bộ gen gồm có:

(1) sự bất hoạt con đường tín hiệu nội bào kiểm sốt q trình phân bào và biệt hóa;
(2) tế bào khơng đáp ứng với tín hiệu kháng tăng trưởng; (3) sự tự tiêu bị bất hoạt,
tế bào thoát khỏi sự chết theo chương trình; (4) tế bào bất thường tăng sinh ồ ạt tại
vùng tổn thương đầu tiên (u nguyên phát) và biến đổi thành u ác tính; (5) tế bào
ác tính tăng trưởng và duy trì sự tạo mạch; (6) tế bào ác tính xâm lấn, di căn và
sinh u ác tính ở những vị trí gần hoặc xa vị trí khởi phát[134]. Đối với tế bào ác tính,
sự xâm lấn đến các vùng mơ lân cận hoặc di căn đến các vùng mô ở xa phụ thuộc vào
cơ chế điều hòa ngược (down-regulation) của các thụ thể bám dính chuyên biệt giữa
các tế bào và cơ chế điều hịa xi (up-regulation) của các thụ thể thúc đẩy sự
chuyển động của tế bào[135, 258].
Ung thư gồm có khoảng 200 dạng bệnh khác nhau. Trong đó, bệnh ung thư
thường gặp ở nam giới là ung thư phổi, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư gan và
ung thư thận. Bệnh ung thư thường gặp ở phụ nữ là ung thư vú, ung thư đại trực tràng,
ung thư phổi, ung thư cổ tử cung và ung thư tuyến giáp[451,

457]

. Theo WHO,

sự phân loại ung thư dựa theo nhiều tiêu chí: nguồn gốc và cấu trúc mô ung thư (ung
thư biểu mơ, u ngoại bì thần kinh, u tủy, u ngun bào tủy, ung thư mô mềm hoặc
bướu thịt, ...); vị trí u nguyên phát và đặc điểm giải phẫu bệnh (ung thư da, ung thư
vú, ung thư đầu cổ, ung thư xương và ung thư mô liên kết, …); dạng tế bào khối u
(ung thư biểu mô, ung thư biểu mô tế bào vảy, ...); đặc điểm bệnh học ung thư (loại
mô học của u, độ mô học, chỉ số gián phân, đặc điểm nhân của tế bào u, ...)[163, 324].

5


1.1.2.

Các yếu tố nguy cơ ung thư

1.1.2.1.

Yếu tố nguy cơ trong môi trường sống

Nghiên cứu của Higginson (1976) cho thấy hơn 90% các loại ung thư khởi phát
từ những yếu tố của mơi trường sống[151]. Vào thời điểm này, có khoảng 85% loại
bệnh ung thư chưa được xác định rõ về nguyên nhân nhưng đã có minh chứng khoa
học về sự tác động trực tiếp hoặc gián tiếp của yếu tố trong môi trường sống dẫn đến
ung thư. Mặc dù nghiên cứu của Doll và Peto (1981) ghi nhận các yếu tố môi trường
chiếm khoảng 1-3% nguyên nhân gây ung thư, nhưng nếu biết cách tránh hoặc giảm
các yếu tố nguy cơ có thể phịng tránh được khoảng 75% - 80% các bệnh ung thư[91].
Theo Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization - WHO), nguyên nhân
dẫn đến ung thư là sự tương tác giữa các yếu tố bộ máy di truyền của tế bào người và
các nhóm tác nhân nguy cơ ngoại sinh, thuộc môi trường sống[4, 107, 135, 258, 444, 458],
gồm có: (1) tia cực tím, bức xạ ion[1, 4, 107, 135, 458]; (2) tác nhân hóa học: amiăng,
arsenic, cadmium, nickel; thành phần khói thuốc lá
trường nước và khơng khí, …

[212]

[4, 51, 274]

; chất thải trong mơi

; (3) sử dụng thuốc lá, rượu bia; chế độ

dinh dưỡng không hợp lý (sử dụng quá nhiều chất béo, chất đạm hoặc thịt đỏ,...) và

sự thừa cân nặng [1, 4, 51, 107, 135, 274, 458]; (4) một số chất hiện diện trong thực phẩm gồm
có: hợp chất Nitrosamine, N-Nitroso, hợp chất Aflatoxin của nhóm nấm mốc
Aspergillus flavus, phẩm nhuộm thực phẩm (Paradimethyl amino benzen), ...[1, 4, 444];
(5) một số thành phần biệt dược thuộc nhóm alkyl: melphalan, chlorambucil và
cyclophosphamide hoặc các chất ức chế miễn dịch dùng cho các ca cấy ghép cơ quan;
thuốc ngừa thai[1, 4]; (6) nhóm tác nhân sinh học: virus, vi khuẩn có sự tương quan
chặt và là yếu tố nguy cơ chính đối với một số bệnh lý ung thư, điển hình là Human
papilloma virus (HPV) type nguy cơ cao (type nguy cơ cao) và ung thư cổ tử cung,
ung thư âm đạo[1, 4, 107, 135, 458]; virus viêm gan B (Hepatitis B virus, HBV), virus
viêm gan C (Hepatitis C virus) và ung thư gan[1, 4, 444, 451, 456]; virus Epstein-Barr và
ung thư vòm họng[301]; vi khuẩn Helicobacter pylori và ung thư dạ dày[1, 4, 107, 135, 458].

6


1.1.2.2.

Sự biến đổi trên gen

Tổng quan khoa học của Hanahan và Weinberg (2011) tổng kết các dạng
thay đổi trên bộ gen của tế bào sinh dưỡng hoặc tế bào mầm, bao gồm: sự đột biến
(đột biến điểm, đột biến mất đoạn/gắn chèn đoạn, lặp đoạn, đảo đoạn); sự tái sắp xếp
bộ gen một cách bất thường; những thay đổi biểu sinh – “epigenetic/epigenetics”
cụ thể là sự methyl hóa DNA, biến đổi histone và can thiệp của microRNA (hình
1.1)[134, 135]. Hệ quả là khởi phát và diễn tiến của quá trình sinh ung[134, 135]. Trên bộ
gen của tế bào nguyên phát, phần lớn sự thay đổi bất thường liên quan đến mức độ
hoạt động bất thường của các gen tiền sinh ung (Proto-oncogene) và gen sinh ung
(Oncogene) hoặc sự bất hoạt của các nhóm gen ức chế khối u (Tumor supressor
gene)[135, 258].
Trong trạng thái tế bào bất thường, một số gen có chức năng trong con đường

tín hiệu điều hịa hoạt động sống của tế bào, bị biến đổi cấu trúc hoặc trình tự (đột
biến, sự tái sắp xếp cấu trúc nhiễm sắc thể hoặc dung hợp gen, sự biến đổi epigenetic
– tính chất giải methyl hóa DNA, …). Hệ quả làm cho các gen này ở trạng thái tiền
sinh ung (Proto-oncogene) trở thành gen sinh ung (Oncogene)[45, 75, 327]. Một số gen
tiền sinh ung biến đổi thành gen sinh ung đã được xác định (bảng PL1.1 và PL1.2),
cụ thể là gen RAS, MYC, MAPK1[45]. Một số dạng protein sinh ung (Oncoprotein)
hiện diện trong tế bào ung thư, gồm có: nhân tố tăng trưởng, thụ thể nhân tố tăng
trưởng, nhân tố đường truyền tín hiệu, nhân tố điều hịa sự chết của chương trình[45].
Gen ức chế khối u (Tumor suppressor gene) có vai trị thiết yếu, liên quan đến
cơ chế sửa chữa DNA sai hỏng, điều hòa sự phân bào và sự chết theo chương trình,
ức chế quá trình di căn (bảng 1.1) [165, 224, 236, 327]. Sự thay đổi mức độ hoạt động của
các gen này xảy ra theo chiều hướng giảm hoặc mất chức năng, là yếu tố then chốt
kích hoạt cơ chế sinh ung diễn ra[165, 327]. Đồng thời, một số gen ức chế khối u có thể
bị biến đổi thành gen sinh ung trong điều kiện nhất định nào đó, điển hình là gen
TP53 và gen ARF[165, 224, 236, 327]. Bên cạnh các gen mục tiêu trong luận án, gen Rb và
gen TP53 được mơ tả tóm tắt về vai trò trong chu kỳ tế bào và sự sinh ung trong

7


nội dung sau đây. Bởi vì đây là các gen có vai trị trong nhiều con đường tín hiệu, các
cơ chế kiểm sốt, điều hịa (âm hoặc dương) chu kỳ tế bào, q trình phân bào,
biệt hóa tế bào và sự chết theo chương trình. Gen Rb và gen TP53 giữ vai trị
tương tác – đóng hoặc mở sự biểu hiện của các gen chức năng khác (cyclin D2,
p16INK4a, …).

Bảng 1.1. Một số nhóm gen ức chế khối u[165, 224, 236, 270, 327]
Nhóm chức năng

Gen

Con đường tín hiệu Wnt

APC; AXIN1; CDH1

Protein nội bào kiểm soát chu kỳ tế bào

Rb; p16INK4a; TP53

Thụ thể, tín hiệu kiểm sốt q trình phân bào

TGF-β; APC

Protein dừng chu kỳ tế bào tại điểm kiểm soát BRCA1; BRCA2; Rb;
p14ARF; p16INK4a
khi DNA bị sai hỏng
Protein cảm ứng sự chết theo chương trình

p53; p16INK4a

Protein sửa chữa DNA bị sai hỏng

ATM; ATR; BRCA1;
BRCA2; TP53; MSH2

Con đường tín hiệu Notch

NOTCH1

Protein điều hịa phiên mã

GATA3; RUNX1

Chú thích: Thơng tin về tên và vị trí của gen trên nhiễm sắc thể được trình bày ở
phụ lục (bảng PL1. 1).
Gen Retinoblastoma (Rb, RB, Rb1, pRb) là họ gen mã hóa các protein RB, còn
được gọi là pRB (Rb/p105, Rb/p107 và Rb2/p13) [119, 141]. Trong tế bào bình thường,
Rb có chức năng ức chế khối u, điều hòa âm chu kỳ tế bào và điều hịa cơ chế
biệt hóa của tế bào người, ở các bộ phận khác nhau: mắt, não, hệ thần kinh ngoại
biên, biểu mơ, tóc, cơ và gan[119]. Protein Rb khơng bị phosphoryl hóa sẽ liên kết với
nhân tố phiên mã E2F, làm cho E2F bị bất hoạt, ức chế sự phiên mã của một số gen
có chức năng trong các quá trình nội bào: sự tái bản DNA (cyclin E, …), dừng
chu kỳ tế bào tại điểm kiểm soát, sự chết theo chương trình và sự biệt hóa tế bào[50,
312]

. Hệ quả làm cho q trình tái bản DNA khơng diễn ra, chu kỳ tế bào dừng tại

điểm kiểm soát G1/S và các gen sửa chữa DNA sẽ hoạt động[50, 119, 141]. Đồng thời,
protein Rb ức chế sự biểu hiện của một số gen chức năng, bằng cách Rb tương tác
8