Nghiên cứu tính đa hình thái của một số gen nhạy cảm trong bệnh Lupus ban đỏ hệ thống

bộ giáo dục v đo tạo bộ y tế

Trờng đại học y h nội
***




Phạm Đăng Khoa




Nghiên cứu Tính đa hình thái
của một số gen nhạy cảm
Trong bệnh Lupus ban đỏ hệ thống


Chuyên ngành: miễn dịch học
Mã số: 3.01.09


Tóm tắt Luận án tiến sĩ y học

Hà nội - 2006
Công trình đợc hoàn thành tại:
Trờng Đại học Y H Nội




Ngời hớng dẫn khoa học: GS. Vũ Triệu An


Phản biện 1: PGS.TS. Phạm Văn Hiển
Phản biện 2: GS.TS. Nguyễn Văn Nguyên
Phản biện 3: PGS.TS. Phan Quang Đoàn



Luận án đợc bảo vệ trớc Hội đồng chấm luận án cấp nhà nớc họp tại:
Trờng đại học Y H Nội

Vào hồi: 14 giờ 00, ngày 27 tháng 10 năm 2006




Có thể tìm luận án tại:
- Th viện Quốc gia.
- Th viện Trờng Đại học Y Hà Nội.
- Th viện Thông tin Y học Trung ơng.

24


Chữ viết tắt

bp (base pair): cặp bazơ
CD (cluster of differentiation): cụm biệt hoá
CD40L (CD40 ligand): phối tử của CD40
DNA (desoxyribonucleic acid): axit deoxyribonucleic
ds DNA (double-stranded DNA): DNA xoắn kép
HLA (human leukocyte antigen): kháng nguyên bạch cầu ngời
IL (interleukin): interleukin
MHC (major histocompatibility complex): phức hợp hoà hợp mô
chủ yếu
NA (neutrophil antigen): kháng nguyên bạch cầu hạt trung tính
PCR (polymerase chain reaction): phản ứng chuỗi do polymerase
SLE (systemic lupus erythematosus): bệnh lupus ban đỏ hệ thống
SNP (single nucleotide polymorphism): tính đa hình thái của
nucleotide đơn
TNF (tumor necrosis factor): yếu tố gây hoại tử u



1
đặt vấn đề

Tự miễn là một trong ba nhóm bệnh lí miễn dịch, đợc đặc trng
bởi sự xuất hiện các tự kháng thể chống lại các cấu thành của chính

bản thân. Bệnh tự miễn đợc phân ra bệnh tự miễn đặc hiệu cơ quan và
bệnh tự miễn toàn thân, trong đó lupus ban đỏ hệ thống (SLE) là một
bệnh tự miễn toàn thân điển hình.
Lịch sử nghiên cứu về các bệnh tự miễn nói chung và SLE nói
riêng có thể đợc chia thành 3 giai đoạn: (1) phát hiện ra các tự kháng
thể hoà tan; (2) phát hiện ra các tế bào T và B tự phản ứng; (3) phát
hiện mối liên quan với cơ địa và các gen nhạy cảm.
Việc phát hiện ra các tự kháng thể hoà tan rồi các tế bào T và B tự
phản ứng đã phần nào hé mở cơ chế bệnh sinh của bệnh tự miễn.
Nhng một vấn đề cơ bản vẫn cha đợc lí giải đầy đủ, đó là vì sao
các tế bào T và B đã bất hoạt nay lại đợc hoạt hoá trở lại. Vì vậy một
hớng nghiên cứu mới đợc đặt ra là tìm hiểu sâu hơn về cơ chế bệnh
sinh ở mức độ gen học.
Cho tới nay, ở Việt nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về vai
trò của tự kháng thể hoà tan và vai trò của các lympho bào tự phản ứng
trong cơ chế bệnh sinh của SLE. Nhng cha có tác giả nào nghiên
cứu về SLE ở mức độ gen học.
Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm 2 mục tiêu sau đây:
1. Mô tả tần suất typ gen và alen của một số gen nhạy cảm trong
bệnh lupus ban đỏ hệ thống ở ngời Kinh Việt nam.
2. Nhận xét sự phân bố tần suất typ gen và alen của một số gen
nhạy cảm ở bệnh nhân lupus ban đỏ hệ thống ngời Kinh Việt nam.



2
Đóng góp mới của luận án
1. Là nghiên cứu đầu tiên về cơ chế bệnh sinh của SLE ở mức độ
gen học.
2. Lần đầu tiên đa ra những số liệu về typ gen và alen của HLA-

DRB1, FcRIIA, FcRIIIA, FcRIIIB, C4A, TNFRII và IL-10
promoter ở bệnh nhân SLE ngời Việt nam.
3. Lần đầu tiên đa ra nhận xét về mối liên quan giữa tính đa hình
thái của các gen nêu trên với SLE ở ngời Việt nam.
Cấu trúc của luận án
Luận án dài 104 trang, ngoài phần Đặt vấn đề, Kết luận và Kiến
nghị, gồm 4 chơng. Chơng 1: Tổng quan (33 trang); Chơng 2: Đối
tợng và phơng pháp nghiên cứu (17 trang); Chơng 3: Kết quả (18
trang); Chơng 4: Bàn luận (32 trang). Luận án có 124 tài liệu tham
khảo, 4 phụ lục, 21 bảng, 11 biểu đồ và 9 hình.

Chơng 1: tổng quan ti liệu
1.1. Bệnh tự miễn
Bệnh tự miễn là một trạng thái bệnh lí do có sự kết hợp của tự
kháng thể với tự kháng nguyên mà gây ra viêm và dẫn đến tổn thơng
thực thể và chức năng tại tế bào, mô hay cơ quan.
Hiện nay để chẩn đoán xác định bệnh tự miễn, ngoài những kĩ
thuật kinh điển trong miễn dịch học, những kĩ thuật hiện đại trong
sinh học phân tử đã đợc áp dụng. Điều này không những đã giúp cho
việc chẩn đoán xác định đợc chính xác hơn mà còn cho phép đi sâu
tìm hiểu về cơ chế bệnh sinh của bệnh. Những kĩ thuật đó là:
- Kĩ thuật phát hiện tự kháng thể dịch thể trong máu.
- Kĩ thuật sinh thiết kết hợp với kĩ thuật sinh học, bao gồm:
+ Kĩ thuật hoá mô miễn dịch.

3
+ Kĩ thuật lai bằng DNA.
+ Kĩ thuật phân tích DNA bằng PCR.
Cơ chế bệnh sinh của các bệnh tự miễn cho đến nay vẫn cha hoàn
toàn đợc sáng tỏ. Dù sao trong cơ chế bệnh sinh của các tổn thơng

trong bệnh tự miễn, ngời ta nói nhiều tới vai trò của các tự kháng thể,
vai trò của các tế bào T tự phản ứng và vai trò của cơ địa.
1.2. Rối loạn miễn dịch trong bệnh SLE
SLE là một bệnh tự miễn toàn thân điển hình. Cùng với sự phát
triển của miễn dịch học, việc chẩn đoán và điều trị SLE cũng có nhiều
tiến bộ trong mấy thập niên gần đây. Các xét nghiệm, đặc biệt là các
xét nghiệm miễn dịch lâm sàng, đóng một vai trò cực kì quan trọng
trong việc chẩn đoán và theo dõi SLE. Các xét nghiệm này nhằm phát
hiện những kháng thể kinh điển và một số kháng thể khác mới đợc đề
cập tới trong ít năm gần đây.
Những nghiên cứu về phơng diện tự kháng thể hoà tan và tế bào
tự phản ứng trong SLE đã phần nào làm sáng tỏ cơ chế bệnh sinh của
bệnh. Để có thể tìm hiểu sâu hơn về cơ chế bệnh ở mức độ phân tử,
những khảo sát về gen học là hết sức cần thiết.
1.3. Gen học trong nghiên cứu SLE
SLE là bệnh đa yếu tố và có đặc tính gen học phức tạp với sự tham
gia của các gen thuộc phức hợp hoà hợp mô chủ yếu (MHC) và nhiều
gen khác không thuộc MHC. Các gen đã đợc biết trong bệnh này chỉ
xác định tính nhạy cảm, không một gen riêng biệt nào là cần thiết hoặc
đủ để làm xuất hiện bệnh.
1.3.1. Phơng pháp nghiên cứu về gen học. Bao gồm:
- Phơng pháp điều tra tỉ lệ theo phả hệ, dịch tễ.
- Phơng pháp nghiên cứu tính đa hình thái của gen nhạy cảm. Có

4
3 phơng pháp, đó là: nghiên cứu bệnh chứng dựa vào quần thể, phân
tích sự liên kết dựa vào gia đình và phân tích sự mất cân bằng liên kết
dựa vào gia đình.
Nhờ các phơng pháp phân tích gen học nêu trên, những hiểu biết
về vai trò của cơ địa và đột biến gen trong SLE ngày một đầy đủ hơn.

1.3.2. Vai trò của cơ địa và đột biến gen trong SLE
1.3.2.1. Vai trò của cơ địa trong SLE
Cơ địa là tổng hợp tất cả các đặc điểm hình thái và chức năng của
cơ thể, những đặc điểm đó khá bền vững, có tính di truyền và quyết
định mức độ phản ứng của cơ thể trớc những yếu tố xâm nhập.
Ngày nay, nhờ những thành tựu trong lĩnh vực miễn dịch gen học,
càng ngày ngời ta càng thấy rõ vai trò của cơ địa trong cơ chế bệnh
sinh của nhiều bệnh, trong đó có các bệnh tự miễn nói chung và SLE
nói riêng. Trong các locus gen tạo nên cơ địa của một cá thể, ngời ta
nói nhiều tới vai trò của hệ thống MHC.
Những mô tả đầu tiên về mối liên quan của các alen thuộc MHC
lớp II với SLE đã đợc công bố khoảng 20 năm trớc đây. Những nhận
xét này sau đó đã đợc xác nhận và thấy là HLA-DR2 và HLA-DR3
gây ra một cách riêng rẽ với nguy cơ tơng đối 2-3 lần cao hơn đối với
sự xuất hiện SLE ở ngời Âu Mĩ. ở những bệnh nhân ngời Mĩ gốc
Phi (là chủng ngời HLA-DR3 không phổ biến), HLA-DR2 và HLA-
DR7 đợc thấy có liên quan với SLE.
1.3.2.2. Vai trò của đột biến gen trong SLE
Tham gia trong cơ chế bệnh sinh của SLE, ngoài vai trò cơ địa (hệ
thống MHC) nh đã nói ở trên, trong những năm gần đây, ngời ta nói
nhiều và tập trung tìm hiểu về vai trò của các gen nhạy cảm với bệnh.
Đó là các gen mã cho các thành phần tham gia trong một số khâu then
chốt thuộc cơ chế bệnh sinh của bệnh, ví dụ receptor với phần Fc của

5
IgG (FcR), các cấu thành của hệ thống bổ thể, các cytokin liên quan
trong phản ứng viêm (TNF, IL-10 ). Khi các gen này có đột biến sẽ
ảnh hởng tới chức năng các sản phẩm do chúng mã hoá và do vậy có
ảnh hởng tới các bệnh có liên quan.
*Mối liên quan của gen m hoá cho Fc

R và SLE
Receptor do các gen này mã hoá dùng để gắn phần Fc của IgG.
Đó là các gen nằm trên nhiễm sắc thể 1q21-24 ở ngời. FcR đợc
chia thành 3 nhóm: FcRI, FcRII và FcRIII.
Các receptor này có
chức năng quan trọng trong việc kết nối đáp ứng miễn dịch dịch thể và
đáp ứng miễn dịch tế bào bằng việc chuyển phức hợp miễn dịch tới các
tế bào hiệu ứng. Vì vậy, tính đa hình thái đợc xác định về mặt gen
học có ảnh hởng tới cấu trúc và chức năng của các FcR này có thể
góp phần tạo nguy cơ đối với SLE.
ở ngời, FcRII và FcRIII đợc chú ý nghiên cứu nhiều hơn vì
đó là những receptor có ái lực cao đối với IgG. Cho tới nay, ngời ta
đã xác định đợc 6 biến thể khác nhau của FcRII, chúng đợc mã hoá
bởi 3 gen (FcRIIA, IIB và IIC) và 2 biến thể gần giống nhau của
FcRIII (FcRIIIA và IIIB) đợc mã hoá bởi 2 gen khác nhau. Tính đa
hình thái về gen chỉ đợc thấy ở các gen mã hoá cho FcRIIA,
FcRIIIA và FcRIIIB.
FcRIIA đợc biểu lộ trên màng của tế bào mono, đại thực bào,
bạch cầu hạt trung tính và tiểu cầu.
FcRIIA có 2 alen biểu lộ đồng
trội, đó là do FcRIIA có một thay đổi ở exon 4 (A hoặc G ở vị trí
nucleotide 494) dẫn đến việc thay đổi 1 amino acid (Histidine [H]
hoặc Arginine [R] ở vị trí amino acid 131). Alen FcRIIA-R131 gắn
với IgG2 kém hiệu quả hơn so với alen H131, do vậy gây cản trở việc
thanh thải phức hợp miễn dịch.

6
FcRIIIA đợc biểu lộ trên bề mặt tế bào NK và đại thực bào, có
khả năng gắn với cả 2 dới lớp IgG1 và IgG3, giúp cho chức năng gây

độc tế bào và thực bào.
Tính đa hình thái thờng gặp nhất của
FcRIIIA là một đột biến điểm với sự thay thế T cho G ở vị trí
nucleotide 559 dẫn đến sự thay thế tơng ứng của Phenylalanine (F)
cho Valine (V) ở vị trí 158. Tính đa hình thái này gây ra sự thay đổi về
chức năng, cá thể đồng hợp V/V có khả năng gắn IgG1 và IgG3 tốt
hơn cá thể đồng hợp F/F.
FcRIIIB có hai dạng xác định bằng huyết thanh (NA1 và NA2)
do có 5 điểm khác nhau về nucleotide (G/C, C/T, A/G, G/A và G/A lần
lợt ở các vị trí nucleotide 141, 147, 227, 277 và 349) và dẫn đến 4
điểm khác nhau trong chuỗi amino acid (R/N, N/S, D/N và V/I lần lợt
ở các vị trí amino acid 36, 65, 82 và 106; có một đột biến câm C/T-
147). Tính đa hình thái này có ý nghĩa đối với chức năng sinh lí, khả
năng thực bào ở các cá thể có NA2 kém hơn ở các cá thể có NA1.
*Mối liên quan của gen m hoá cho bổ thể và SLE
Bổ thể bao gồm khoảng 20 protein huyết tơng có chức năng gây
ra đáp ứng viêm, xử lí phức hợp miễn dịch và thải loại các vi khuẩn
gây bệnh. Trong nhiều năm gần đây, ngời ta đã chú ý đến mối liên
quan chặt chẽ giữa sự thiếu hụt các cấu thành bổ thể đầu của con
đờng đặc hiệu (C1, C4, C2) với sự xuất hiện của SLE. SLE xuất hiện
ở gần 100% các cá thể thiếu hụt hoàn toàn C1 và C4, ở khoảng 30-
50% các cá thể thiếu hụt hoàn toàn C2. Cấu thành C4 đợc mã hoá bởi
2 gen, C4A và C4B. C4A null có liên quan với SLE ở một số tộc
ngời khác nhau. Sự thiếu hụt thờng gặp nhất là hiện tợng xoá trên
diện rộng (28kb) làm mất cả gen C4A và gen 21-OH. Sự thiếu hụt
thờng gặp thứ hai là hiện tợng ken thêm vào 2 bp ở codon 1213

7
thuộc exon 29 dẫn đến việc tạo thành bộ ba mã hoá stop, làm ngừng
quá trình tổng hợp chuỗi protein C4A.

Sự thiếu hụt các cấu thành bổ thể khác (từ C3 tới C9) ít liên quan
đến SLE.
*Mối liên quan của gen m hoá cho TNF và SLE
Yếu tố gây hoại tử u (TNF) là yếu tố bảo vệ chống lại SLE. Chức
năng của TNF thông qua 2 receptor: TNFRI và TNFRII, trong đó
TNFRII liên quan nhiều tới SLE.
Tính đa hình thái 2 alen dẫn đến sự thay đổi amino acid đã đợc
thấy trong vùng exon 4 (sự thay đổi Arginine thành Proline ở vị trí
143), exon 6 (sự thay đổi Methionine thành Arginine ở vị trí 196) và
exon 9 (sự thay đổi Alanine thành Threonine ở vị trí 363) của gen mã
hoá cho TNFRII. Trong đó chỉ có tính đa hình thái ở exon 6 là có liên
quan với SLE.
*Mối liên quan của gen m hoá cho IL-10 và SLE
Interleukin-10 (IL-10) là một cytokin điều hoà đợc tạo ra bởi tế
bào T, tế bào B, tế bào mono, đại thực bào, tế bào sừng, tế bào bạch
cầu ái toan, tế bào mast.
IL-10 có vai trò điều hoà đáp ứng miễn dịch
tế bào và dịch thể. Tăng mức IL-10 đợc thấy có liên quan với một số
bệnh tự miễn, trong đó có SLE. Tính đa hình thái của gen IL-10 thể
hiện ở 2 dạng microsatellit (AC)
n
và thay đổi nucleotid đơn (SNP).
Vùng promoter của gen IL-10 có 3 SNP đáng quan tâm ở các vị trí -
819 (C/T), -592 (C/A) và -1082 (G/A). Ngời ta đã nói đến mối liên
quan giữa typ gen và sự sản xuất IL-10; đặc biệt alen G của tính đa
hình thái G/A ở vị trí -1082 thấy có liên quan với kiểu hình sản xuất
IL-10 cao so với alen A. Các SNP ở vị trí -819 và -592 xuất hiện

8
trong sự mất cân bằng liên kết mạnh mẽ với tính đa hình thái ở vị trí -

1082.
Những hiểu biết sâu sắc và đầy đủ hơn về lĩnh vực gen học trong
SLE là một cơ sở đáng tin cậy cho việc đề xuất các phác đồ điều trị
mới ngày một hiệu quả hơn đối với SLE.
1.4. Chiến lợc điều trị đối với SLE
Điều trị SLE là sự phối hợp nhiều mặt: tuyên truyền, giáo dục;
theo dõi chung về tình trạng nhiễm khuẩn và các yếu tố nguy cơ tim
mạch; điều trị các biến chứng kết hợp với các phác đồ điều trị thuốc
tuỳ thuộc vào từng ngời bệnh.
Phác đồ điều trị SLE luôn đợc thay đổi và ngày càng có hiệu quả
hơn, đó là nhờ vào sự hiểu biết ngày càng tốt hơn về cơ chế bệnh sinh
của bệnh. Có thể chia sự tiến bộ của các phác đồ điều trị SLE làm 3
giai đoạn lớn:
- Giai đoạn 1: các phác đồ kinh điển nhằm ức chế chung đáp ứng
miễn dịch.
- Giai đoạn 2: các phác đồ nhằm ức chế miễn dịch có chọn lọc.
- Giai đoạn 3: các phác đồ điều trị làm thay đổi cơ địa, các phác đồ
này đợc đề xuất nhờ những hiểu biết ngày càng sâu hơn về cơ chế
bệnh sinh mức độ phân tử. Ví dụ vấn đề truyền tế bào gốc tạo máu.
Nhìn chung các phác đồ điều trị theo hớng này còn đang ở giai đoạn
thử nghiệm và kết quả còn hạn chế.







9
Chơng 2: đối tợng v phơng pháp nghiên cứu

2.1. Đối tợng nghiên cứu: Ngời Kinh Việt nam, gồm 2 nhóm:
2.1.1. Nhóm bệnh
Gồm 99 bệnh nhân SLE đợc chẩn đoán xác định tại Viện Da liễu
Quốc gia, không có quan hệ về huyết thống và không mắc kèm các
bệnh tự miễn khác.
2.1.2. Nhóm chứng
Gồm 93 ngời cho máu tình nguyện tại Viện huyết học và Truyền
máu TW, không mắc các bệnh tự miễn và một số bệnh khác có liên
quan đến cơ địa, có sự phù hợp với nhóm bệnh về giới và tuổi.
2.2. Phơng pháp nghiên cứu
Phơng pháp nghiên cứu là phơng pháp nghiên cứu mô tả cắt
ngang.
Phơng pháp khảo sát tính đa hình thái của các gen nhạy cảm là
phơng pháp nghiên cứu bệnh - chứng dựa vào quần thể.
Kĩ thuật để khảo sát tính đa hình thái của các gen nhạy cảm là kĩ
thuật PCR, với các biến thể khác nhau tuỳ thuộc vào gen khảo sát. Các
gen đợc khảo sát: HLA-DRB1, FcRIIA, FcRIIIA, FcRIIIB, C4A,
TNFRII và IL-10 promoter.
2.3. Địa điểm nghiên cứu
Chiết tách và tinh khiết DNA đợc tiến hành tại Bộ môn Miễn
dịch-Sinh lí bệnh, Trờng Đại học Y Hà nội.
Kĩ thuật PCR để phân tích gen đợc tiến hành tại Khoa Vi sinh-
Miễn dịch, Trờng Đại học Y Aichi, Nhật bản.
2.4. Xử lí số liệu
So sánh tần suất typ gen và alen bằng kiểm định
2
.


10

Chơng 3: kết quả

3.1. Xác định typ gen của HLA-DRB1

Bảng 3.1. Tần suất các typ gen của HLA-DRB1
ở nhóm bệnh và nhóm chứng
HLA-DRB1 Nhóm bệnh
(n=87)
Nhóm chứng
(n=82)
DR1 0 (0%) 0 (0%)
DR2 22 (25,3%)
*
9 (11,0%)
DR3 10 (11,5%) 8 (9,7%)
DR4 8 (9,2%) 10 (12,2%)
DR5 22 (25,3%) 25 (30,5%)
DR6 7 (8,0%) 7 (8,5%)
DR7 1 (1,1%) 2 (2,4%)
DR8 5 (5,7%) 3 (3,6%)
DR9 8 (9,2%) 13 (15,8%)
DR10 4 (4,6%) 5 (6,1%)
*

2
= 5,77 và p < 0,05

Trong các typ gen, chỉ có tần suất của DR2 ở nhóm bệnh là cao
hơn ở nhóm chứng một cách có ý nghĩa (25,3% so với 11,0%;
2

=
5,77; p< 0,05), điều này cho thấy mối liên quan của HLA-DR2 với sự
xuất hiện SLE.

11
3.2. Xác định typ gen của FcRIIA
Sự phân bố tần suất 3 typ gen giữa 2 nhóm khác biệt có ý nghĩa.
Đặc biệt, cá thể đồng hợp H/H131 ở nhóm bệnh là 10 (10,1%) và
nhóm chứng là 32 (34,4%), sự khác biệt này có ý nghĩa với
2
=16,6 và
p<0,01.
Tần suất alen H131 là 94 (47,5%) ở nhóm bệnh và 114 (61,3%) ở
nhóm chứng. Nh vậy, ở nhóm bệnh, tần suất alen H131 thấp hơn ở
nhóm chứng một cách có ý nghĩa với
2
=7,4 và p<0,01.

Bảng 3.2. Tần suất typ gen và alen của gen mã hoá cho FcRIIA
Tần suất Nhóm bệnh
(n = 99)
Nhóm chứng
(n = 93)
Typ gen
R/R131
R/H131
H/H131

15 (15,1%)
74 (74,7%)

10 (10,1%)
*


11 (11,8%)
50 (53,8%)
32 (34,4%)
Alen
R131
H131

104 (52,5%)
94 (47,5%)
**

72 (38,7%)
114 (61,3%)

*

2
=16,6 và p<0,01 so với nhóm chứng

**

2
=7,4 và p<0,01 so với nhóm chứng

3.3. Xác định typ gen của FcRIIIA
Sự phân bố tần suất 3 typ gen giữa 2 nhóm khác biệt không có ý

nghĩa với
2
= 0,36 và p>0,1.
Tần suất alen ở nhóm bệnh và nhóm chứng khác biệt không có ý
nghĩa với
2
=0,13 và p>0,1.



12
Bảng 3.3. Tần suất typ gen và alen của gen mã hoá cho FcRIIIA
Tần suất Nhóm bệnh
(n = 67)
Nhóm chứng
(n = 62)
Typ gen
V/V158
V/F158
F/F158

11 (16,4%)
28 (41,8%)
28 (41,8%)
*


10 (16,1%)
29 (46,8%)
23 (37,1%)

Alen
V158
F158

50 (37,3%)
84 (62,7%)
**

49 (39,5%)
75 (60,5%)

*

2
= 0,36 và p>0,1 so với nhóm chứng

**

2
= 0,13và p>0,1 so với nhóm chứng

3.4. Xác định typ gen của FcRIIIB

Bảng 3.4. Tần suất typ gen và alen của gen mã hoá cho FcRIIIB
Tần suất Nhóm bệnh
(n = 67)
Nhóm chứng
(n = 66)
Typ gen
NA 1/1

NA 1/2
NA 2/2

16 (23,9%)
33 (49,2%)
18 (26,9%)
*


27 (40,9%)
32 (48,5%)
7 (10,6%)
Alen
NA 1
NA 2

65 (48,5%)
69 (51,5%)
**

86 (65,2%)
46 (34,8%)

*

2
= 5,77 và p<0,05 so với nhóm chứng

**

2
= 7,5và p<0,01 so với nhóm chứng


13
Sự phân bố tần suất 3 typ gen giữa 2 nhóm khác biệt có ý nghĩa.
Đặc biệt, cá thể đồng hợp NA2/2 ở nhóm bệnh là 18 (26,9%) và nhóm
chứng là 7 (10,6%), sự khác biệt này có ý nghĩa với
2
= 5,77 và
p<0,05.
ở nhóm bệnh, tần suất alen NA2 cao hơn ở nhóm chứng một cách
có ý nghĩa với
2
=7,5 và p<0,01.

3.5. Xác định typ của C4A
Sự thiếu hụt C4A do hiện tợng chèn 2 bp ở codon 1213 thuộc
exon 29 không đợc phát hiện thấy ở cả bệnh nhân SLE và ở cả ngời
chứng. Sự khuếch đại bằng PCR vùng exon 29 chứa vị trí chèn chỉ phát
hiện thấy duy nhất type không bị đột biến (chiều dài đoạn khuếch đại
là 59 bp).

3.6. Xác định typ gen của TNFRII
Kết quả cho thấy không có sự khác nhau có ý nghĩa trong tần suất
typ gen và tần suất alen giữa 2 nhóm bệnh nhân và chứng.
Bảng 3.5. Tần suất typ gen và alen của gen mã hoá cho TNFRII
Tần suất Nhóm bệnh
(n = 44)
Nhóm chứng

(n = 42)
Typ gen
196R/R
196M/R
196M/M

2 (4,5%)
*
15 (34,1%)
27 (61,4%)

1 (2,4%)
13 (30,9%)
28 (66,7%)
Alen
196R
196M

19 (21,6%)
**
69 (78,4%)

15 (17,9%)
69 (82,1%)

*

2
=0,30 và p>0,05 so với nhóm chứng

**

2
=0,38 và p>0,05 so với nhóm chứng

14
3.7. Xác định typ gen của IL-10 promoter
Bảng 3.6. Tần suất typ gen và alen của gen mã hoá cho IL-10
promoter
Tần suất Nhóm bệnh
(n = 64)
Nhóm chứng
(n = 57)
Typ gen
G/G
G/A
A/A

18 (28,1%)
*
31 (48,4%)
15 (23,4%)

6 (10,5%)
30 (52,6%)
21 (36,8%)
Alen
G
A

67 (52,3%)
**
61 (47,7%)

42 (36,8%)
72 (63,2%)

*

2
=5,87và p<0,05 so với nhóm chứng

**

2
=5,85 và p<0,05 so với nhóm chứng

Sự phân bố tần suất của 3 typ gen giữa 2 nhóm là khác biệt có ý
nghĩa. Đặc biệt, tình trạng đồng hợp G/G gặp 18 (28,1%) trong nhóm
bệnh nhân SLE so với 6 (10,5%) trong nhóm chứng (
2
=5,87, p<0,05).
Bệnh nhân SLE có tần suất alen G cao hơn một cách có ý nghĩa so với
nhóm chứng (52,3% so với 36,8%,
2
=5,85, p<0,05).


Chơng 4: bn luận
4.1. Các gen thuộc hệ thống HLA

ở ngời, các gen HLA nằm trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể số
6, bao gồm HLA lớp I, lớp II và lớp III.
Trong vùng DRB (thuộc HLA lớp II), năm locus gen đã đợc
nhận biết, kí hiệu là DRB1, DRB2, DRB3, DRB4 và DRB5. Trong đó

15
locus DRB1 đợc xem là quan trọng nhất trong việc kiểm soát đáp ứng
miễn dịch cũng nh trong việc tạo ra các quyết định kháng nguyên
khác alen cùng loài chính.
Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy chỉ có tần suất của DR2 ở
nhóm bệnh là cao hơn ở nhóm chứng một cách có ý nghĩa (25,3% so
với 11,0%;
2
= 5,77; p < 0,05), điều này thể hiện mối liên quan của
DR2 với sự xuất hiện SLE ở ngời Việt nam.
Cũng giống nh kết quả nghiên cứu của chúng tôi, các tác giả
khác khi khảo sát ở các tộc ngời Đông Nam á nói riêng và châu á
nói chung (Nhật bản, Hàn quốc, Trung quốc, Thái lan, Malaysia) đều
nhận thấy mối liên quan của SLE với HLA-DR2. Kết quả nghiên cứu
của chúng tôi một lần nữa khẳng định DR2 là typ gen chủ yếu của
locus HLA-DRB1 qui định tính nhạy cảm với SLE ở những tộc ngời
Đông Nam á nói riêng và châu á nói chung.
4.2. Các gen mã hoá cho FcR
Gần đây nhiều nghiên cứu đã nhận thấy tính đa hình thái của
FcR có vai trò nh những yếu tố di truyền ảnh hởng đến tính nhạy
cảm đối với SLE và nhiều bệnh tự miễn khác.
4.2.1. Gen mã hoá cho FcRIIA
FcRII ở ngời là một glycoprotein có khối lợng phân tử 40 kD,
chỉ gắn IgG dới dạng phức hợp và có sự phân bố rộng rãi nhất trên bề
mặt tế bào. Cho đến nay, tính đa hình thái chỉ đợc thấy ở FcRIIA.

Gen mã hoá cho FcRIIA có 2 vị trí mang tính đa hình thái. Thứ nhất
là đột biến A CA thành TG dẫn đến sự thay đổi hoặc là glutamin hoặc
là tryptophan ở vị trí amino acid 27 trong domain giống Ig xa màng.
Sự thay đổi này không ảnh hởng tới ái lực của receptor đối với IgG.
Thứ hai là một thay đổi G thành A (ở vị trí nucleotide 494 thuộc exon
4) dẫn đến sự thay đổi hoặc là arginin (R) hoặc là histidin (H) ở vị trí

16
amino acid 131 trong domain giống Ig gần màng và ảnh hởng rõ rệt
tới ái lực và tính đặc hiệu của receptor. FcRIIA-H131 có khả năng
gắn IgG2 cao hơn FcRIIA-R131 khi đánh giá in vitro thông qua việc
loại các phức hợp miễn dịch hoà tan.
Trong nghiên cứu này chúng tôi chứng minh rằng ở nhóm bệnh
tần suất H131 thấp hơn một cách có ý nghĩa so với nhóm chứng. Kết
quả này phù hợp với các báo cáo trớc đây khi khảo sát ở bệnh nhân
SLE ngời Nhật bản và ngời Hàn quốc. Trái lại, một số báo cáo khác
lại cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa trong sự phân bố typ gen
của FcRIIA giữa nhóm bệnh và nhóm chứng ở ngời Âu Mĩ, ngời
Phi ở vùng Caribe, ngời Trung quốc và ngời Malaysia.
Nh vậy theo kết quả nghiên cứu của chúng tôi trên bệnh nhân
SLE ngời Việt nam, tần suất alen H131 (alen tạo cho FcRIIA có khả
năng gắn IgG tốt) thấp hơn có ý nghĩa so với nhóm chứng. Một khi
chức năng gắn IgG của FcRIIA không tốt sẽ làm cho phức hợp miễn
dịch khó bị bắt giữ và đào thải. Phức hợp miễn dịch lu hành lâu trong
máu dẫn đến sự tạo thuận cho khả năng chúng bị lắng đọng tại một số
mô, hoạt hoá bổ thể theo con đờng đặc hiệu và gây viêm tại nơi lắng
đọng. Đây là một khâu then chốt trong cơ chế bệnh sinh của SLE.
4.2.2. Gen mã hoá cho FcRIIIA
Tính đa hình thái có liên quan đến chức năng của FcRIIIA là do
một biến đổi (thay G bằng T ở vị trí nucleotid 559) dẫn đến sự biến đổi

valin (V) thành phenylalanin (F) ở vị trí amino acid 158 trong domain
giống Ig gần màng. FcRIIIA-158F có khả năng gắn IgG1 và IgG3
thấp hơn FcRIIIA-158V và xuất hiện với tần suất cao ở bệnh nhân
SLE.
Sự phân bố tần suất typ gen FcRIIIA trong nghiên cứu của
chúng tôi ở bệnh nhân SLE ngời Việt nam cho thấy không có sự khác

17
biệt có ý nghĩa giữa nhóm bệnh và nhóm chứng. Kết quả nghiên cứu
của chúng tôi phù hợp với kết quả của một số tác giả khi khảo sát trên
bệnh nhân ngời Nhật bản, Hàn quốc và ngời Mĩ gốc Phi. Trái lại,
kết quả của chúng tôi không phù hợp với kết quả khảo sát ở ngời Âu
Mĩ, ở tộc ngời này tần suất alen FcRIIIA-158F ở nhóm bệnh cao
hơn nhóm chứng một cách có ý nghĩa (74% so với 57%, p<0,01).
Nh vậy, theo kết quả nghiên cứu của chúng tôi, không có sự
khác biệt có ý nghĩa trong sự phân bố tần suất typ gen và alen của gen
mã hoá cho FcRIIIA giữa nhóm bệnh và nhóm chứng. Vậy, phải
chăng tính đa hình thái của gen mã hoá cho FcRIIIA không có vai trò
trong cơ chế bệnh sinh của SLE ở ngời Việt nam.
4.2.3. Gen mã hoá cho FcRIIIB
Tính đa hình thái của FcRIIIB có ý nghĩa đối với chức năng
sinh lý, cá thể mang NA2 có khả năng thực bào kém hơn cá thể mang
NA1. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tần suất NA2 ở nhóm
bệnh cao hơn một cách có ý nghĩa so với nhóm chứng. Kết quả này
phù hợp với kết quả khi nghiên cứu trên bệnh nhân SLE ở ngời Nhật
bản. Mặt khác, khi khảo sát trên ngời Âu Mĩ cũng nh ngời
Malaysia và Trung quốc, các tác giả lại thấy không có sự liên quan
giữa tính đa hình thái của FcRIIIB và SLE.
Nh vậy theo kết quả nghiên cứu của chúng tôi trên bệnh nhân
SLE ngời Việt nam, tần suất alen NA2 (alen tạo cho FcRIIIB khả

năng gắn IgG không tốt) cao hơn nhóm chứng một cách có ý nghĩa.
Cũng nh đối với FcRIIA, khi chức năng gắn IgG của FcRIIIB
không tốt sẽ làm cho phức hợp miễn dịch khó bị bắt giữ và đào thải.
Phức hợp miễn dịch lu hành lâu trong máu dẫn đến sự tạo thuận cho
khả năng chúng bị lắng đọng tại một số mô, hoạt hoá bổ thể theo con
đờng đặc hiệu và gây viêm tại nơi lắng đọng. Vì vậy, tính đa hình

18
thái của gen mã hoá cho FcRIIIB có tham gia trong cơ chế bệnh sinh
của SLE ở ngời Việt nam.
4.3. Gen mã hoá cho C4A
Phần lớn các nghiên cứu đều cho thấy có một đột biến do hiện
tợng xoá gen trên diện rộng làm mất gen C4A là nguyên nhân thờng
gặp nhất gây C4A null ở bệnh nhân SLE ngời Âu Mĩ. Một trở ngại rất
lớn trong việc nghiên cứu vai trò của hiện tợng đột biến này là có sự
mất cân bằng liên kết có ý nghĩa của các gen trong haplotyp nên khó
có thể xác định đợc gen nào là gen đóng vai trò chính tạo nên tính
nhạy cảm với SLE.
Ngoài lí do trên, nguyên nhân thờng gặp thứ hai gây ra alen
C4A null là hiện tợng đột biến do chèn 2 bp ở codon 1213 thuộc exon
29 tạo ra một codon dừng sớm chuỗi sản phẩm. Đây là một nguyên
nhân khác gây thiếu hụt C4A không có liên quan với haplotyp đã nêu
trên.
Dạng đột biến do chèn 2 bp ở exon 29 gây thiếu hụt C4A xuất
hiện ở bệnh nhân SLE ngời Âu Mĩ nhiều hơn ngời Mĩ gốc Phi (3,4%
so với 1,8%). Vì vậy, bệnh nhân SLE ngời Việt nam trong đối tợng
nghiên cứu của chúng tôi xem ra có sự khác biệt về di truyền so với
ngời Âu Mĩ khi xét về khía cạnh này. Chúng tôi không phát hiện thấy
tình trạng thiếu hụt C4A do chèn 2 bp ở exon 29. Cũng giống nh kết
quả nghiên cứu của chúng tôi, sự thiếu hụt gen mã hoá cho cấu thành

bổ thể C4A không gặp ở bệnh nhân SLE ngời Nhật bản, ngời Hàn
quốc và ngời Trung quốc.
Nh vậy, kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy không có
tình trạng thiếu hụt C4A do hiện tợng chèn 2 bp ở codon 1213 thuộc
exon 29. Vậy, phải chăng trong cơ chế bệnh sinh của SLE ở ngời Việt
nam không có vai trò của tình trạng thiếu hụt C4A.

19
4.4. Gen mã hoá cho TNFRII
Cho tới nay đã có một số nghiên cứu về mối liên quan giữa tính
đa hình thái của gen mã hoá cho TNFRII với bệnh SLE. Khi khảo sát ở
bệnh nhân SLE ngời Nhật bản, ngời ta thấy tần suất alen 196R tăng
một cách có ý nghĩa so với nhóm chứng. Trái lại, ngời ta không thấy
sự khác biệt có ý nghĩa nào trong tính đa hình thái của gen mã hoá cho
TNFRII ở hai nhóm bệnh và chứng ở ngời Tây ban nha, ngời Anh và
ngời Hàn quốc. Trong nghiên cứu này, khi khảo sát ở bệnh nhân SLE
ngời Việt nam chúng tôi cũng nhận thấy không có mối liên quan giữa
tính đa hình thái của gen mã hoá cho TNFRII với sự xuất hiện SLE.
Nh vậy, theo kết quả nghiên cứu của chúng tôi trên bệnh nhân
SLE ngời Việt nam, không có sự khác biệt có ý nghĩa trong sự phân
bố tần suất typ gen và alen của gen mã hoá cho TNFRII giữa nhóm
bệnh và nhóm chứng. Vậy, phải chăng tính đa hình thái của gen mã
hoá cho TNFRII không có vai trò trong cơ chế bệnh sinh của SLE ở
ngời Việt nam.
4.5. Gen mã hoá cho IL-10 promoter
Tăng sản xuất IL-10 có thể tham gia trong cơ chế bệnh sinh của
SLE thông qua việc tạo ra tự kháng thể bởi tế bào B. Trong nghiên cứu
này trên ngời Việt nam, chúng tôi nhận thấy tần suất alen G (qui định
việc tăng sản xuất IL-10) của gen mã hoá cho IL-10 promoter -1082 ở
nhóm bệnh nhân SLE cao hơn nhóm chứng một cách có ý nghĩa. Nh

vậy, có một mối liên quan giữa tính đa hình thái của gen mã hoá cho
IL-10 promoter -1082 và bệnh SLE, điều này cho thấy vai trò của IL-
10 trong cơ chế bệnh sinh của SLE. Trớc đây, ngời ta đã chỉ ra sự
tăng một cách có ý nghĩa tần suất IL-10 G microsatellit nằm trong
vùng promoter của gen mã hoá cho IL-10 ở bệnh nhân SLE ngời
Italia. Tơng tự nh vậy, ngời ta cũng nhận thấy có mối liên quan

20
giữa tính đa hình thái do thay đổi một nucleotid của gen mã hoá cho
IL-10 promoter và bệnh nhân SLE ngời Mĩ gốc Phi. Trái với kết quả
nghiên cứu của chúng tôi, mối liên quan này không thấy ở bệnh nhân
SLE ngời Đài loan, ngời Âu Mĩ, ngời Trung quốc ở phía nam và
ngời Mêxicô.
Nh vậy, theo kết quả nghiên cứu của chúng tôi trên bệnh nhân
SLE ngời Việt nam, tần suất alen G (alen qui định việc tăng sản xuất
IL-10) cao hơn một cách có ý nghĩa so với nhóm chứng. IL-10 là một
yếu tố hoạt hoá có hiệu lực đối với tế bào B, kích thích cả quá trình
tăng sinh, biệt hoá và sản xuất kháng thể. Tăng hoạt tính tế bào B là
khâu then chốt trong cơ chế bệnh sinh của SLE thông qua việc tăng
sản xuất các tự kháng thể. Vì vậy, tính đa hình thái của gen mã hoá
cho IL-10 promoter có tham gia trong cơ chế bệnh sinh của SLE ở
ngời Việt nam.
4.6. Bàn luận về sự phân bố tần suất khác nhau giữa các dân tộc
Sự khác nhau trong các nghiên cứu trên có thể đợc lý giải theo
một số cách nh sau. Thứ nhất, SLE là một bệnh phức tạp về mặt gen
học và sự khác nhau về phenotyp của bệnh giữa các nhóm dân tộc có
thể có mối liên quan với sự khác nhau về sự phân bố các typ gen. Thứ
hai, ở những ngời bình thờng đã có sự phân bố khác nhau về tần suất
typ gen của các gen khảo sát giữa các nhóm dân tộc. Thứ ba, sự khác
nhau này có thể phản ánh tính phức tạp của sự nhạy cảm với SLE trong

các quần thể có nguồn gốc khác nhau. Cuối cùng, đó là ảnh hởng của
môi trờng sống khác nhau giữa các dân tộc tác động qua nhiều thế
hệ.
Nhờ những hiểu biết về cơ chế bệnh sinh của SLE ở mức độ gen
học và sinh học phân tử, ngày nay ngời ta đã đề xuất những phác đồ
điều trị mới đối với SLE. Sau đây là một số loại thuốc chính.

21
4.7. Một số thuốc điều trị mới
4.7.1. Các thuốc làm giảm sản xuất hoặc loại bỏ tự kháng thể
LJP 394
Một chế phẩm triethylene glycol đợc gắn với 4 epitop dsDNA,
mỗi epitop có 20 bp. Hợp chất này, có tên là LJP 394, trọng lợng
phân tử 54 kD sẽ gắn với globulin miễn dịch bề mặt kháng dsDNA của
các tế bào B sản xuất kháng thể kháng dsDNA mà không cần sự tham
gia của tế bào Th. Sự kết hợp này dẫn đến hiện tợng chết theo chơng
trình của các tế bào B.
Rituximab
Rituximab, một kháng thể đơn dòng thể khảm kháng CD20 của
ngời, làm giảm nhanh chóng các tế bào B mang dấu ấn CD20 trong
máu thông qua hiện tợng gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể và độc
tế bào qua trung gian bổ thể. Bằng cách này, rituximab gây cảm ứng
hiện tợng chết theo chơng trình (apoptosis) và ức chế sự phát triển
của tế bào.
Loại bỏ các tự kháng thể
Loại bỏ hoàn toàn các tự kháng thể bằng cách thay huyết tơng
hoặc kích thích sự xuất hiện kháng thể kháng idiotyp để phong bế
chúng. Tiêm globulin miễn dịch vào tĩnh mạch có lẽ là dựa vào sự hiện
diện của các kháng thể kháng idiotyp tự nhiên đối với các tự kháng thể
bệnh lí.

4.7.2. Các thuốc tác động tới tơng tác giữa tế bào T và B
Mycophenolat mofetyl
Mycophenolat mofetyl ức chế một cách chọn lọc sự tăng sinh
của lympho bào T và lympho bào B do ức chế inosin monophosphat
dehydrogenase, một enzym tham gia trong quá trình sinh tổng hợp
nucleotid purin. Hoạt tính sinh học tiếp sau là ức chế tổng hợp kháng

22
thể, ức chế quá trình glycosyl hoá các phân tử bám dính và các chất
đối kháng cytokin.
Kháng thể kháng CD40L (BG9588)
Phối tử của CD40 (CD40L) biểu lộ trên tế bào T hoạt hoá. Bằng
việc gắn vào receptor CD40 chủ yếu có trên tế bào B, CD40L sẽ tạo
thuận cho chức năng miễn dịch bình thờng. Vì vậy, điều trị bằng
kháng thể kháng CD40L làm giảm hoặc bình thờng hoá sự trình diện
của tự kháng nguyên bởi các tế bào apoptosis, giới hạn sự tăng sinh và
di trú tại lách của tế bào có tua.
4.7.3. Các thuốc tác động tới phản ứng viêm
Kháng thể đơn clon kháng IL-10
IL-10 là một cytokin có tác dụng kích thích tế bào B tăng sản
xuất kháng thể. Vì vậy, dùng kháng thể đơn clon kháng IL-10 sẽ làm
giảm khả năng tạo kháng thể, trong đó có các tự kháng thể bệnh lí của
tế bào B.
AS-101
AS-101, một hợp chất chứa telu hữu cơ, có vai trò điều biến miễn
dịch do làm giảm IL-10. Tuy nhiên, ngời ta cha hiểu rõ cơ chế làm
giảm IL-10 của AS-101.
Kháng thể kháng TNF
TNF tham gia trong cơ chế làm rối loạn điều hoà miễn dịch ở
SLE do làm tăng sản xuất các cytokin tiền viêm khác nh IL-1, IL-6

và IL-8, sau đó là làm thay đổi phức hợp miễn dịch lu hành. Vì vậy,
dùng kháng thể kháng TNF sẽ làm giảm các tác dụng trên.
4.7.4. Phác đồ làm thay đổi cơ địa
Làm thay đổi cơ địa bằng truyền tế bào gốc là một vấn đề thời sự
hiện nay, không những đợc áp dụng trong các bệnh tự miễn (trong đó
có SLE) mà còn đợc áp dụng trong nhiều bệnh khác.