Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sirna hướng gen mục tiêu ksp và vegf trên một số dòng tế bào ung thư gan người

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


ĐỒN CHÍNH CHUNG

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT siRNA
HƯỚNG GEN MỤC TIÊU KSP VÀ VEGF TRÊN
MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ GAN NGƯỜI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2016


ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


ĐỒN CHÍNH CHUNG

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT siRNA
HƯỚNG GEN MỤC TIÊU KSP VÀ VEGF TRÊN
MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ GAN NGƯỜI
Chuyên ngành: Sinh lý học Người & Động vật
Mã số chuyên ngành: 62 42 30 01
Phản biện 1: GS.TS. NGUYỄN VĂN THUẬN
Phản biện 2: TS. HỒNG ANH VŨ
Phản biện 3: TS. NGƠ TẤT TRUNG
Phản biện độc lập 1: TS. BÙI CHÍ BẢO
Phản biện độc lập 2: TS. NGUYỄN TRỌNG TUỆ

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS.TS.BS. LÊ VĂN ĐÔNG
2. TS. ĐỖ MINH SĨ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2016


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả được đưa ra trong luận án là trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong bất
kỳ cơng trình nào khác.
Tp Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 08 năm 2015
Tác giả

Đồn Chính Chung


LỜI CẢM ƠN
Luận án tốt nghiệp này như một thành quả ghi nhận sự nỗ lực, cố gắng phấn
đấu vươn lên của tôi khi làm việc và nghiên cứu tại công ty Công nghệ sinh học
Dược Nanogen và là thành quả của quá trình học tập kiên trì tại trường Đại học
Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh. Cùng với đó là sự quan tâm, chia sẻ,
động viên nhiệt tình của cha mẹ, thầy cơ, anh chị và bạn bè.
Trước tiên, con xin gửi lời tri ân sâu sắc đến cha mẹ, những người đã sinh
thành, nuôi nấng, chỉ dạy con thành người. Cha mẹ luôn là nguồn động viên to lớn,
là chỗ dựa vững chắc cho con, luôn bên con khi con thành công cũng như thất bại.
Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và lời biết ơn sâu sắc đến PGS.TS.BS Lê Văn
Đông và TS. Đỗ Minh Sĩ, những người anh, người thầy đã truyền cho tôi nhiệt
huyết và niềm đam mê nghiên cứu khoa học. Các thầy đã giúp đỡ tận tình, hướng
dẫn và tạo mọi điều kiện tốt nhất về vật chất lẫn tinh thần để tơi làm việc, học tập và

nghiên cứu hồn thành luận án này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các bạn và các anh chị nhân viên phịng
nghiên cứu và phát triển, cơng ty Cơng nghệ sinh học Dược Nanogen đã góp ý, chỉ
dẫn giúp tơi hịa nhập vào môi trường làm việc và giúp đỡ nhiều mặt khác trong quá
trình thực hiện đề tài, chia sẻ với tôi những kinh nghiệm, kiến thức trong làm việc
và học tập. Các anh chị đã luôn động viên, quan tâm và giúp đỡ tôi trong suốt
những năm tháng làm việc cùng nhau và cả quãng thời gian thực hiện luận án này.


MỤC LỤC
Trang
Trang bìa chính
Trang bìa phụ
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục ................................................................................................................. i
Danh mục từ viết tắt ............................................................................................. vi
Danh mục bảng .................................................................................................... x
Danh mục hình ..................................................................................................... xi
MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1
Chƣơng 1. TỒNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái quát về ung thƣ gan ........................................................................... 6
1.1.1. Ung thư gan và nguyên nhân hình thành ung thư gan ........................... 6
1.1.2. Các phương pháp điều trị ung thư gan truyền thống ............................ 8
1.1.3. Các phương pháp điều trị ung thư gan dựa trên liệu pháp phân tử ...... 9
1.2. Kỹ thuật RNAi và ứng dụng RNAi trong điều trị ung thƣ gan .............. 10
1.2.1. Khái niệm về RNAi .............................................................................. 10
1.2.2. Cơ chế hoạt động của RNAi trong tế bào động vật hữu nhủ ............... 11
1.2.3. Thuận lợi và khó khăn trong việc ứng dụng kỹ thuật RNAi ................ 13
1.2.3.1. Thuận lợi trong việc ứng dụng kỹ thuật RNAi ........................... 13

1.2.3.2. Khó khăn trong việc ứng dụng kỹ thuật RNAi ........................... 14
1.2.4. Triển vọng ứng dụng kỹ thuật RNAi trong điều trị ung thư gan .......... 18
1.2.4.1. Kỹ thuật RNAi hướng mục tiêu virus HBV và HCV ................. 19
1.2.4.2. Kỹ thuật RNAi hướng mục tiêu các gen gây ung thư ................ 21
1.2.4.3. Kỹ thuật RNAi hướng mục tiêu các gen kiểm soát apoptosis .... 22
1.2.4.4. Kỹ thuật RNAi hướng mục tiêu các gen kiểm soát sự hình thành
mạch máu ............................................................................................................. 23
i


1.2.4.5. Kỹ thuật RNAi hướng mục tiêu các gen liên quan tới sự di căn hay
sự xấm lấn ............................................................................................................ 25
1.2.4.6. Kỹ thuật RNAi hướng mục tiêu các gen liên quan tới khả năng đáp
ứng thuốc .............................................................................................................. 26
1.2.5. Ứng dụng kỹ thuật RNAi trong thử nghiệm lâm sàng ......................... 27
1.3. Các gen mục tiêu của kỹ thuật RNAi ........................................................ 28
1.3.1. Gen mục tiêu KSP ................................................................................. 28
1.3.1.1. Đặc điểm của KSP ...................................................................... 28
1.3.1.2. Vai trị của KSP trong tiến trình phát triển của ung thư ............. 30
1.3.1.3. Các liệu pháp ức chế sự tăng sinh tế bào thông qua KSP ........... 31
1.3.2. Gen mục tiêu VEGF ............................................................................. 33
1.3.2.1 Đặc điểm của VEGF .................................................................... 33
1.3.2.2. Vai trị của VEGF trong tiến trình phát triển của ung thư .......... 34
1.3.2.3. Các liệu pháp ức chế sự tăng sinh, di căn và hình thành mạch của tế
bào thông qua VEGF ............................................................................................. 37
Chƣơng 2. VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP
2.1. Nguyên vật liệu sử dụng trong nghiên cứu ................................................. 40
2.1.1. Các dòng tế bào sử dụng trong nghiên cứu .......................................... 40
2.1.1.1. Đặc điểm dòng tế bào ung thư gan Hep3B ................................. 40
2.1.1.2. Đặc điểm dòng tế bào ung thư gan HepG2 ................................ 40

2.1.1.3. Đặc điểm dòng tế bào ung thư gan Huh-7 .................................. 41
2.1.1.4. Đặc điểm dòng tế bào gan thường THLE-3 ............................... 41
2.1.1.5. Đặc điểm dòng tế bào nội mô tĩnh mạch dây rốn HUVEC ........ 41
2.1.2. Trình tự các siRNA sử dụng trong nghiên cứu ..................................... 42
2.1.3. Các kháng thể sử dụng trong nghiên cứu ............................................. 43
2.1.4. Trình tự các mồi (primer) sử dụng trong nghiên cứu ........................... 44
2.1.5. Các bộ kit sử dụng trong nghiên cứu ...................................................... 44
2.1.6. Các mơi trường và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ........................ 45
2.1.7. Các hóa chất khác sử dụng trong nghiên cứu ....................................... 46
ii


2.2. Dụng cụ và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ........................................... 47
2.2.1. Dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu ...................................................... 47
2.2.2. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ........................................................ 47
2.3. Quy trình nghiên cứu .................................................................................. 49
2.3.1. Quy trình nghiên cứu giai đoạn 1 .......................................................... 50
2.3.2. Quy trình nghiên cứu giai đoạn 2 .......................................................... 52
2.3.3. Quy trình nghiên cứu giai đoạn 3 .......................................................... 54
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................ 55
2.4.1. Phương pháp giải đông và nuôi cấy tăng sinh tế bào ........................... 55
2.4.2. Phương pháp chuyển siRNA bằng lipofectamine ................................ 56
2.4.3. Phương pháp tách chiết và thu nhận RNA tổng số ................................ 58
2.4.4. Phương pháp realtime qRT-PCR .......................................................... 59
2.4.5. Phương pháp điện di protein SDS-PAGE .............................................. 60
2.4.6. Phương pháp lai Western Blot ................................................................ 62
2.4.7. Phương pháp định lượng protein ELISA .............................................. 63
2.4.8. Phương pháp đánh giá hoạt tính Caspase-3/7 ...................................... 64
2.4.9. Phương pháp đánh giá mức độ tăng sinh của tế bào ............................ 65
2.4.10. Phương pháp đánh giá mức độ sống sót của tế bào ............................ 66

2.4.11. Phương pháp đánh giá mức độ apoptosis của tế bào .......................... 67
2.4.12. Phương pháp đánh giá mức độ di cư in vitro của tế bào .................... 68
2.4.13. Phương pháp đánh giá mức độ di căn in vitro của tế bào .................. 69
2.4.14. Phương pháp đánh giá mức độ hình thành mạch của tế bào ............... 70
2.4.15. Phương pháp đánh giá mức độ đáp ứng thuốc của tế bào .................. 70
2.5. Phƣơng pháp xử lý kết quả và thống kê ................................................... 71
Chƣơng 3. KẾT QUẢ
3.1. Kết quả lựa chọn trình tự VEGF-siRNA và KSP-siRNA ....................... 72
3.1.1. Sự biểu hiện của gen VEGF và KSP trên các dòng tế bào ung thư gan và tế
bào gan người ....................................................................................................... 72
3.1.2. Hiệu quả chuyển siRNA trên dòng tế bào ung thư gan Hep3B ........... 74
iii


3.1.3. Hiệu quả ức chế sự biểu hiện của gen VEGF và KSP bởi các siRNA trên
tế bào ung thư gan Hep3B .................................................................................... 77
3.2. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của các siRNA lên một số tế bào ung thƣ gan
ngƣời .................................................................................................................... 81
3.2.1. Hiệu quả ức chế đồng thời hay riêng biệt sự biểu hiện của VEGF và KSP
bởi các siRNA trên các tế bào ung thư gan người và tế bào gan người ............... 81
3.2.2. Ảnh hưởng của các siRNA lên khả năng tăng sinh của các tế bào ung thư
gan người và tế bào gan người .............................................................................. 87
3.2.3. Ảnh hưởng của các siRNA lên sự cảm ứng apoptosis của các tế bào ung
thư gan người và tế bào gan người ....................................................................... 89
3.2.4. Sự thay đổi biểu hiện các nhân tố ảnh hưởng đến sự tăng sinh và cảm ứng
apoptosis của tế bào sau khi chuyển các siRNA .................................................. 93
3.2.5. Ảnh hưởng của các siRNA lên một số đặc tính khác của các tế bào ung
thư gan người ....................................................................................................... 96
3.2.5.1. Ảnh hưởng của các siRNA lên khả năng sống của các tế bào ung thư
gan người .............................................................................................................. 96

3.2.5.2. Ảnh hưởng của các siRNA lên khả năng di cư và di căn in vitro của
các tế bào ung thư gan người ............................................................................... 98
3.2.5.3. Ảnh hưởng của các siRNA lên khả năng hình thành mạch in vitro
của tế bào nội mơ HUVEC .................................................................................. 104
3.3. Kết quả đánh giá hiệu ức chế tăng sinh tế bào ung thƣ gan ngƣời in vitro
khi phối hợp siRNA với Doxorubicin ............................................................... 108
3.3.1. Mức độ đáp ứng thuốc của tế bào ung thư gan với Doxorubicin ......... 108
3.3.2. Ảnh hưởng của VEGF-siRNA hay KSP-siRNA lên khả năng đáp ứng
thuốc của tế bào Hep3B với Doxorubicin ............................................................ 109
3.3.3. Ảnh hưởng của các siRNA lên khả năng đáp ứng thuốc của các tế bào ung
thư gan người với Doxorubicin ............................................................................ 111
3.3.4. Sự thay đổi biểu hiện một số nhân tố ảnh hưởng tới sự đáp ứng thuốc của
tế bào ung thư gan người ...................................................................................... 113
iv


3.3.4.1. Sự điều hòa biểu hiện các nhân tố kháng apoptosis .................... 113
3.3.4.2. Sự điều hòa biểu hiện nhân tố cảm ứng apoptosis ....................... 115
3.3.4.3. Sự cảm ứng apoptosis của tế bào ................................................. 117
Chƣơng 4. BÀN LUẬN
4.1. Lựa chọn dòng tế bào gan, trình tự siRNA và hiệu quả chuyển siRNA vào
tế bào ung thƣ gan ngƣời ................................................................................... 119
4.1.1. Lựa chọn các dòng tế bào gan sử dụng trong nghiên cứu ..................... 119
4.1.1 Hiệu quả chuyển siRNA vào tế bào ung thư gan người ........................ 120
4.1.2. Lựa chọn trình tự VEGF-siRNA và KSP-siRNA có hiệu quả ức chế cao
nhất ....................................................................................................................... 120
4.2. Ảnh hƣởng của các siRNA lên sự biểu hiện của gen VEGF, KSP và các đặc
tính sinh học của các tế bào ung thƣ gan ngƣời ............................................... 122
4.2.1. Ảnh hưởng của KSP-siRNA lên các tế bào ung thư gan người ........... 122
4.2.2. Ảnh hưởng của VEGF-siRNA lên các tế bào ung thư gan người ........ 124

4.2.3. Ảnh hưởng của sự phối hợp VEGF-siRNA và KSP-siRNA lên các tế bào
ung thư gan người ................................................................................................ 127
4.3. Ảnh hƣởng của các siRNA lên mức độ đáp ứng thuốc của các tế bào ung
thƣ gan ngƣời ...................................................................................................... 130
4.3.1. Mức độ đáp ứng thuốc của tế bào ung thư gan người ........................... 130
4.3.2. Ảnh hưởng của các siRNA lên mức độ đáp ứng thuốc của tế bào ung thư
gan người .............................................................................................................. 131
KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ
Kết luận ................................................................................................................ 138
Kiến nghị .............................................................................................................. 140
Danh mục công trình của tác giả .......................................................................... xiv
Tài liệu tham khảo ................................................................................................. xv
Phụ lục ..................................................................................................................

v


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
AGO

Argonaute

Protein Argonaute

ANG2

Angiopoietin-2

Protein Angiopoietin-2

APC

Anaphase-promoting complex

Phức hợp thúc đẩy kỳ sau

APO

Apoptosis

Tế bào chết theo chương trình

ATCC

American Type Culture Collection

Viện nuôi cấy tế bào Hoa Kỳ

BCL-2

B-cell lymphoma 2

Protein BCL-2

BCL-xL

B-cell lymphoma extra large

Protein BCL-xL

BEGM

Bronchial epithelial cell growth medium Môi trường tăng sinh tế bào
biểu mô

bFGF

Basic fibroblast growth factor

Nhân tố tăng trưởng ngun
bào sợi

BLAST

Basic local alignment search tool

Cơng cụ tìm kiếm sắp gióng
cột cục bộ

BSA

Bovine serum albumin

Albumin huyết thanh bị

CLS

Cell Line Service

Công ty cung cấp tế bào Đức

CPP

Cell penetrating peptides

Peptide xâm nhập tế bào

DAPI

4',6-diamidino-2-phenylindole

Thuốc nhuộm nhân DAPI

DC

Dendritic cell

Tế bào tua

DME

Dimethylenastron

Thuốc dimethylenastron

D-mitosis

Delayed in mitosis

Dừng ở nguyên phân

DNA

Deoxyribonucleic acid

Axit deoxyribonucleic

dsRNA

Double-stranded RNA

RNA mạch kép

ECGS

Endothelial Cell Growth Supplement

Thành phần cần cho sự tăng
trưởng của tế bào nội mô

EGF

Epidermal growth factor

Nhân tố tăng trưởng biểu mô

EGM-2

Endothelial cell growth medium-2

Môi trường tăng sinh tế bào
nội mô

vi


ELISA

enzyme-linked immunosorbent assay

Thử nghiệm hấp thu miễn
dịch liên kết với enzyme

EtdBr

Ethidium bromide

Chất nhuộm nhân DNA

FACS

Fluorescence-activated cell sorting

Phân tách tế bào được kích
hoạt bằng huỳnh quang

FITC

Fluorescein isothiocyanate

Chất phát huỳnh quang FITC

HB

Hepatoblastoma

Ung thư nguyên bào gan

HBV

Hepatitis B virus

Vi rút viêm gan B

HCC

Hepatocellular carcinoma

Ung thư gan

HCV

Hepatitis B virus

Vi rút viêm gan C

Her-2

Human epidermal growth factor receptor Thụ thể nhân tố tăng trưởng
biểu mô người

HGF

Nhân tố tăng trưởng tế bào

Hepatocyte Growth Factor

gan
HIF-1α

Hypoxia-inducible factor 1α

Nhân tố cảm ứng do tình
trạng thiếu oxy

HRP

Horseradish peroxidase

Enzyme horseradish
Peroxidase

Hsp70

heat-shock protein 70

Protein sốc nhiệt 70

HUVEC

Human umbilical vein endothelial cells Tế bào nội mơ tĩnh mạch
dây rốn người

IAP

Inhibitors of the apoptosis protein

Nhóm protein ức chế
q trình apoptosis

IFN

Interferon

Protein interferon

IRES

Internal ribosomal entry site

Vị trí liên kết với ribosome

KSP

Kinesin spindle protein

Protein cấu trúc thoi vô sắc
Kinesin

mRNA

Messenger RNA

RNA thơng tin

miRNA

MicroRNA

RNA có trình tự ngắn
vii


PACT

Protein activator of PKB

Nhân tố hoạt hóa PKB

PAGE

Polyacrylamide gel electrophoresis

Điện di protein

PEG

Polyethylene glycol

PEI

Polyethyleneimine

PI

Propidium iodide

PLK1

Polo-like kinase 1

PRC1

Polycomb-repressive complex

Phức hợp ức chế Polycomb

PTGS

Post-transcriptional gene silencing

Bất hoạt gen sau phiên mã

PVDF

Polyvinylidene fluoride

Màng PVDF

qRT-PCR

Quantitative reverse transcription PCR

Phản ứng PCR định lượng

Thuốc nhuộm nhân PI

phiên mã ngược
RISC

RNA-inducing silencing complex

Phức hợp cảm ứng làm bất
hoạt gen

RNA

Ribonucleic acid

Axit ribonucleic

RNAi

RNA interference

RNA can thiệp

RT-PCR

Reverse transcription PCR

Phản ứng PCR phiên mã
ngược

RRM2

Ribonucleoside-diphosphate

Tiểu phần M2 của enzyme

reductase subunit M2

ribonucleoside-diphosphate
reductase

SDS

Sodium dodecyl sulfate

siRNA

Small interfering RNA

RNA can thiệp có trình tự
ngắn

shRNA

short hairpin RNA

RNA kẹp tóc có trình tự
ngắn

SNALP

Stable nucleic acid lipid particles

Hạt acid nucleic-lipid

STAT-3

Signal transducer and

Nhân tố chuyển tín hiệu và

activator of transcription-3

hoạt hóa phiên mã 3

viii


TERT

Telomerase reverse transcriptase

Enzyme phiên mã ngược
telomerase

TGS

Transcriptional gene silencing

Bất hoạt gen khi phiên mã

TLR

Toll-like receptor

Thụ thể giống Toll

TRAIL

TNF-related apoptosis-inducing ligand

Phối tử cảm ứng apoptosis
liên quan tới TNF

TRBP

TAR-RNA binding protein

Protein liên kết RNA-TAR

VEGF

Vascular endothelial

Nhân tố tăng trưởng

growth factor

thành mạch nội mô

Vascular endothelial

Thụ thể nhân tố tăng trưởng

growth factor receptor

thành mạch nội mô

NK

Natural killer cell

Tế bào giết tự nhiên

NET-1

Neuroepithelial cell-transforming 1

Nhân tố chuyển dạng tế bào

VEGFR

biểu mô thần kinh
Ung thư gan

UTG

uPA

Urokinase-type plasminogen activator

Nhân tố hoạt hóa
plasminogen nhóm urokinase

ix


DANH MỤC BẢNG
Trang

Bảng 1.1. Các bệnh được nghiên cứu và điều trị bằng kỹ thuật RNAi ............... 27
Bảng 2.1. Trình tự các siRNA được sử dụng trong nghiên cứu ......................... 42
Bảng 2.2. Trình tự các mồi (primer) được sử dụng trong nghiên cứu ................ 44
Bảng 2.3. Danh sách các dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu ................... 47
Bảng 2.4. Danh sách các thiết bị chính được sử dụng trong nghiên cứu ............ 47
Bảng 2.5. Chu trình nhiệt của phản ứng realtime qRT-PCR ............................. 60

x


DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Cơ chế hoạt động của RNAi trong tế bào động vật hữu nhũ .............. 13
Hình 1.2. Quá trình hình thành, phát triển của ung thư gan và các mục tiêu của kỹ
thuật RNAi ........................................................................................................ 19
Hình 1.3. Vai trị của protein KSP trong q trình ngun phân ........................ 29
Hình 1.4. Tác động của VEGF lên các đặc tính sinh học của tế bào thơng qua con

đường VEGF/VEGFR ....................................................................................... 36
Hình 2.1. Một số thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu .................................. 48
Hình 2.2. Sơ đồ minh họa quy trình nghiên cứu tổng thể................................... 49
Hình 2.3. Sơ đồ minh họa quy trình nghiên cứu giai đoạn 1 ............................. 50
Hình 2.4. Sơ đồ minh họa quy trình nghiên cứu giai đoạn 2 ............................. 52
Hình 2.5. Sơ đồ minh họa quy trình nghiên cứu giai đoạn 3 ............................. 54
Hình 3.1. Sự biểu hiện mRNA VEGF và mRNA KSP của các dịng tế bào khác
nhau .................................................................................................................. 72
Hình 3.2. Sự biểu hiện protein VEGF và protein KSP của các dòng tế bào khác
nhau .................................................................................................................. 73
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ siRNA lên khả sống của tế bào Hep3B khi
chuyển CONT-siRNA và FITC – CONT-siRNA ............................................... 74
Hình 3.4. Hiệu quả chuyển siRNA vào tế bào Hep3B theo nồng độ và thời gian
chuyển ............................................................................................................... 75
Hình 3.5. Hiệu quả chuyển FITC – CONT-siRNA vào tế bào Hep3B theo thời gian
chuyển ............................................................................................................... 76
Hình 3.6. Ảnh hưởng của các siRNA khác nhau lên sự biểu hiện mRNA VEGF và
mRNA KSP của tế bào Hep3B .......................................................................... 77
Hình 3.7. Ảnh hưởng của các siRNA lên sự biểu hiện mRNA VEGF và mRNA
KSP của tế bào Hep3B theo thời gian ............................................................... 79

xi


Hình 3.8. Ảnh hưởng của các siRNA lên sự biểu hiện protein VEGF và protein
KSP của tế bào Hep3B theo thời gian ............................................................... 80
Hình 3.9. Ảnh hưởng của các siRNA lên sự biểu hiện mRNA VEGF và mRNA
KSP của các dịng tế bào gan khác nhau ........................................................... 82
Hình 3.10. Ảnh hưởng của các siRNA lên sự biểu hiện protein VEGF và protein
KSP của các dịng tế bào UTG .......................................................................... 85

Hình 3.11. Ảnh hưởng của các siRNA lên mức độ tiết protein VEGF của các dịng
tế bào UTG ....................................................................................................... 86
Hình 3.12. Ảnh hưởng của các siRNA lên khả năng tăng sinh của các dịng tế bào
khác nhau ......................................................................................................... 88
Hình 3.13. Ảnh hưởng của các siRNA lên sự cảm ứng apoptosis của tế bào Hep3B
theo thời gian .................................................................................................... 90
Hình 3.14. Ảnh hưởng của các siRNA lên sự cảm ứng apoptosis của các dịng tế
bào khác nhau ................................................................................................... 92
Hình 3.15. Ảnh hưởng của siRNA lên sự biểu hiện BCL-2 và Survivin trong tế bào
Hep3B .............................................................................................................. 94
Hình 3.16. Ảnh hưởng của các siRNA sự biểu hiện của Caspase-3 và Caspase-7
trong tế bào Hep3B ........................................................................................... 95
Hình 3.17. Ảnh hưởng của các siRNA lên khả năng hình thành bào lạc của các
dịng tế bào UTG .............................................................................................. 97
Hình 3.18. Ảnh hưởng của các siRNA lên khả năng di căn in vitro của các tế bào
UTG ................................................................................................................. 99
Hình 3.19. Ảnh hưởng của các siRNA lên sự di cư in vitro của các dịng tế bào
UTG ................................................................................................................. 104
Hình 3.20. Sự ức chế hình thành cấu trúc vi ống bởi các siRNA được phát hiện trên
mơ hình hình thành mạch của tế bào HUVEC ................................................... 105
Hình 3.21. Sự biểu hiện protein VEGFR2 trên các dòng tế bào và ảnh hưởng của
các siRNA lên sự biểu hiện của ANG2 trên tế bào HUVEC ............................... 107

xii


Hình 3.22. Ảnh hưởng của Doxorubicin lên khả năng tăng sinh của các dịng tế bào
UTG .................................................................................................................. 108
Hình 3.23. Ảnh hưởng của siRNA và Doxorubicin lên khả năng tăng sinh của tế
bào Hep3B ........................................................................................................ 110

Hình 3.24. Ảnh hưởng của các siRNA và Doxorubicin lên khả năng tăng sinh của
các dòng tế bào UTG ......................................................................................... 112
Hình 3.25. Ảnh hưởng của các siRNA và Doxorubicin lên sự biểu hiện BCL-2 và
Survivin trong tế bào Hep3B ............................................................................. 114
Hình 3.26. Ảnh hưởng của các siRNA và Doxorubicin lên sự biểu hiện của
Caspase-3 và Caspase-7 trong tế bào Hep3B ................................................... 116
Hình 3.27. Ảnh hưởng của Doxorubicin và siRNA lên sự cảm ứng apoptosis của tế
bào Hep3B ....................................................................................................... 118

xiii


MỞ ĐẦU


Ung thư gan (UTG) là một trong những loại ung thư phổ biến nhất trên toàn
thế giới, chiếm 6,26% trong tổng số các ung thư ở người, với hơn 500.000 trường
hợp được phát hiện mỗi năm. Tại Việt Nam, UTG là loại ung thư phổ biến đứng thứ
4 ở cả nam và nữ. Tỷ lệ người mắc bệnh UTG ở Việt Nam đứng thứ hai thế giới,
cao gấp 10 lần so với Hoa Kỳ. Hiện nay, việc điều trị UTG chủ yếu dựa trên ba
phương pháp cơ bản, gồm phẫu thuật cắt bỏ khối u (có thể kết hợp với hóa trị hoặc
xạ trị), xạ trị (sử dụng tia xạ để tiêu diệt khối u) và hóa trị (sử dụng hóa chất gây
độc để tiêu diệt tế bào ung thư). Đa số các phương pháp điều trị truyền thống đều
chưa mang đến kết quả mong đợi. Hạn chế lớn nhất đối của các phương pháp này là
gây tổn thương cho các tế bào lành tính đang hoạt động bình thường. Gần đây, với
các tiến bộ trong lĩnh vực sinh học phân tử và tế bào, các chiến lược tác động trúng
đích trong điều trị UTG được đề xuất và phát triển, bao gồm cả kỹ thuật RNA can
thiệp (RNA interference – RNAi). RNAi là một cơ chế điều hòa biểu hiện gen
chuyên biệt được hoạt hóa bởi phân tử nhỏ siRNA (small-interfering RNA) với kích
thước khoảng 19-23 nucleotide. RNAi có vai trò ức chế sự biểu hiện các gen mục

tiêu thơng qua việc phân hủy các trình tự mRNA tương ứng hay ức chế q trình
dịch mã. Tác động có tính chọn lọc và đặc hiệu của RNAi lên bất kỳ một gen nào
giúp cho RNAi trở thành một công cụ hiệu quả trong nghiên cứu biểu hiện gen in
vitro và in vivo. Hơn nữa, RNAi có thể tác động ức chế đồng thời sự biểu hiện của
nhiều gen khác nhau liên quan đến ung thư. Ngoài ra, RNAi dễ dàng tổng hợp
(siRNA) hay dịng hóa vào các vector (shRNA). Hiệu quả tác động của RNAi lên
gen đích dễ dàng phát hiện trong một thời gian ngắn. Do vậy, việc sử dụng kỹ thuật
RNAi bất hoạt các gen giữ vai trị quan trọng trong con đường truyền tín hiệu tế bào
ung thư đang là một hướng đi đầy hứa hẹn trong điều trị UTG.
Sự hình thành và phát triển của ung thư phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác
nhau. Thứ nhất, sự tăng trưởng quá mức của tế bào do việc mất kiểm sốt sự cân
bằng giữa q trình sống và chết của tế bào. Thứ hai, sự kháng lại quá trình tế bào
chết theo chương trình (apoptosis) do rối loạn chức năng kiểm sốt trong chu trình
tế bào. Thứ ba, sự bất tử hóa của tế bào do hoạt tính telomerase được tăng cường
1


hay do sự tái tạo các đoạn telomere. Thứ tư, sự lẩn tránh khỏi hệ thống miễn dịch
bởi những biến đổi về mặt di truyền của tế bào ung thư. Cuối cùng, sự tạo mạch của
khối u được thúc đẩy bởi sự biểu hiện quá mức của các nhân tố kích thích tạo mạch.
Đây chính là những điểm khác biệt thường thấy giữa mơ bình thường và mơ ung
thư. Tương tự như các loại ung thư khác, tiến trình phát triển của UTG cũng phụ
thuộc vào sự tăng sinh quá mức của tế bào. Trong đó, nguyên phân là một bước
quan trọng trong quá trình tăng sinh tế bào. Protein cấu trúc thoi vô sắc Kinesin
(Kinesin spindle protein – KSP), một thành viên của họ protein vận động Kinesin,
đóng một vai trị chủ đạo trong q trình ngun phân. KSP tham gia vào quá trình
phân chia tế bào bằng cách gián tiếp phân tách các trung thể và sắp xếp thoi vô sắc
về hai cực trong nhân tế bào. Do vậy, sự kìm hãm hoạt động của KSP s dẫn đến
thất bại trong việc phân tách trung thể, ngăn chặn sự hình thành thoi vơ sắc lư ng
cực, ức chế quá trình nguyên phân, cảm ứng apoptosis và cuối cùng dẫn đến gây

chết tế bào đang phân chia. Gen KSP thường biểu hiện thấp hoặc không biểu hiện
trong các tế bào và mô không tăng sinh, nhưng biểu hiện mạnh ở các tế bào tăng
sinh hay tế bào chuyển dạng. Mức độ biểu hiện của KSP trong các mô của ung thư
vú, ung thư đại tràng, ung thư phổi,… thường cao hơn so với các mơ bình thường
nằm gần khối u. Sự biểu hiện quá mức của KSP có thể gây ra sự mất ổn định di
truyền và hình thành khối u trong chuột. Ngoài ra, sự biểu hiện của KSP cũng
thường phát hiện thấy trong các mô UTG và có mối tương quan chặt ch với tiến
trình phát triển của UTG. Do vậy, KSP trở thành một đích trị liệu đầy hứa hẹn trong
điều trị UTG. Bên cạnh các phương pháp điều trị sử dụng thuốc ức chế KSP, việc
sử dụng kỹ thuật RNAi tác động trực tiếp lên gen KSP cũng là một hướng đi mới
trong điều trị UTG. Cách tiếp cận này hy vọng mang lại phương pháp điều trị hiệu
quả hơn so với các phương pháp điều trị hiện nay.
Bên cạnh sự tăng sinh quá mức của các tế bào, sự hình thành và phát triển hệ
thống mạch máu trong khối u đặc cũng là một điểm đặc trưng của UTG. Trong đó,
q trình tạo mạch đóng vai trị chính trong tiến trình phát triển của bệnh. Sự hình
thành các mạch máu bên trong và xung quanh khối u làm tăng khả năng cung cấp
2


oxy và chất dinh dư ng, đồng thời loại bỏ bớt các chất thải cho khối u. Sự tạo mạch
cũng tạo thuận lợi cho sự di cư của các tế bào khối u tới những vùng xa hơn trong
cơ thể, hình thành sự di căn hay xâm lấn của các tế bào UTG. Vì vậy, chiến lược ức
chế sự tạo mạch của khối u là một hướng trị liệu tiềm năng đối với các dạng u ác
tính, kể cả khối u đặc. Nhân tố tăng sinh nội mô thành mạch (Vascular endothelial
growth factor – VEGF) là nhân tố điều hòa quan trọng trong quá trình hình thành
mạch của khối u. Gen VEGF thường biểu hiện trong mô UTG. Sự gia tăng mức độ
biểu hiện của VEGF tương ứng với sự gia tăng kích thước khối u gan. VEGF, chủ
yếu là VEGF-A, được tiết ra nhiều bởi các tế bào khối u gan. VEGF có thể tác động
lên nhiều loại tế bào khác nhau như tế bào nội mô, tế bào tiền thân nội mô, tế bào
gan vệ tinh, tế bào u máu (hemangiocytes) theo cơ chế cận tiết (paracrine) hay tự

hoạt hóa chính các tế bào khối u thơng qua cơ chế tự tiết (autocrine) nhằm kích hoạt
sự thay đổi mạch trong khối u gan. VEGF có khả năng gắn kết với thụ thể VEGFR1 và VEGFR-2. Đây là các thụ thể biểu hiện hầu hết trên bề mặt tế bào của các tế
bào nội mô, tế bào gan vệ tinh cũng như tế bào UTG. Sự tương tác giữa VEGF với
thụ thể VEGFR s kích hoạt con đường truyền tín hiệu thúc đẩy các q trình sinh
học như tăng sinh, biệt hóa, di căn, đáp ứng thuốc,…và kéo dài sự sống của tế bào
ung thư. Ngoài ra, mức độ biểu hiện của VEGF có tương quan với các giai đoạn
phát triển của bệnh UTG. Những ảnh hưởng này cho thấy VEGF thực sự là một
trong những yếu tố quan trọng trong chiến lược điều trị UTG. Sự hình thành mạch
của khối u có thể bị ức chế thơng qua việc ức chế hoạt động của VEGF gắn kết với
thụ thể VEGFR bằng kháng thể kháng VEGF (Bevacizumab, Avastin) hay các thụ
thể VEGFR hòa tan. Tuy nhiên, bất lợi lớn của các phương pháp tiếp cận này là
VEGF luân chuyển tuần hồn phải bị bắt giữ và vơ hiệu hóa hoàn toàn để ngăn chặn
các tác động diễn ra sau đó của VEGF. Ngồi ra, việc sử dụng kháng thể kháng
VEGF hay các chất ức chế khác gây ra những tác dụng phụ không mong muốn như
gây chảy máu hay đông tụ huyết. Do vậy, việc giảm lượng VEGF tiết ra từ khối u
gan thông qua việc ức chế sự biểu hiện của VEGF bằng kỹ thuật RNAi có thể là

3


một cách tiếp cận thích hợp. Hơn nữa, hiệu quả ức chế sự biểu hiện của gen VEGF
bằng siRNA đã được chứng minh trên nhiều mơ hình tế bào ung thư khác nhau.
Sự hình thành và phát triển của UTG liên quan tới các đột biến di truyền xảy
ra đồng thời trên nhiều gen khác nhau. Các chiến lược điều trị dựa trên sự ức chế
biểu hiện riêng biệt một gen có thể khơng đủ để kìm hãm tiến trình phát triển của
bệnh. Do vậy, việc ức chế đồng thời sự biểu hiện của nhiều gen khác nhau hi vọng
mang lại hiệu quả điều trị tốt hơn. Ngoài ra, việc kết hợp các liệu pháp tác động
trúng đích (siRNA) với các liệu pháp truyền thống (hóa trị liệu) cũng là một trong
các phương thức tiếp cận phù hợp hiện nay trong điều trị ung thư, đặc biệt là các
loại ung thư có mức độ đáp ứng thuốc thấp như UTG. Trong định hướng phát triển

liệu pháp điều trị UTG bằng siRNA, đề tài “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật
siRNA hướng gen mục tiêu KSP và VEGF trên một số dòng tế bào ung thư gan
người” được thực hiện với các mục tiêu:
1. Lựa chọn các trình tự siRNA hướng gen KSP và gen VEGF có hiệu quả ức
chế cao nhất.
2. Đánh giá ảnh hưởng của các siRNA lên một số dòng tế bào UTG người.
3. Đánh giá hiệu quả phối hợp giữa siRNA và thuốc kháng ung thư trong
việc tiêu diệt tế bào UTG in vitro.
Để đạt được mục tiêu nghiên cứu nêu trên, đề tài tiến hành 6 nội dung
nghiên cứu và có cách tiếp cận như sau:
1. Khảo sát hiệu quả ức chế của các trình tự siRNA hướng gen KSP và gen
VEGF trên tế bào UTG. Sàng lọc và lựa chọn trình tự siRNA ức chế sự biểu hiện
của gen KSP và gen VEGF hiệu quả nhất.
2. Khảo sát hiệu quả ức chế đồng thời hay riêng biệt sự biểu hiện của các
gen KSP và VEGF bởi các siRNA trên các dòng tế bào UTG khác nhau.
3. Đánh giá ảnh hưởng của các siRNA lên các đặc tính sinh học của tế bào
UTG như khả năng sống và tăng sinh, khả năng di cư và di căn, khả năng cảm ứng
apoptosis và khả năng cảm ứng hình thành mạch trên mơ hình tế bào nội mơ.

4


4. Đánh giá sự thay đổi biểu hiện của một số phân tử liên quan tới ảnh
hưởng của các siRNA lên các đặc tính sinh học của tế bào UTG.
5. Khảo sát khả năng đáp ứng thuốc của các tế bào UTG và ảnh hưởng của
các siRNA lên sự đáp ứng thuốc của các dòng tế bào UTG.
6. Đánh giá sự thay đổi biểu hiện của một số phân tử liên quan tới ảnh hưởng
của siRNA lên sự đáp ứng thuốc của tế bào UTG.
Đề tài triển khai một hướng nghiên cứu hoàn toàn mới trong điều trị ung thư
ở Việt Nam. Kết quả đạt được s là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo khi đánh

giá hiệu quả điều trị của phương pháp này trên mơ hình động vật in vivo. Sự thành
công của nghiên cứu hi vọng mở ra hướng đi mới trong việc tiếp cận và phát triển
thuốc dựa trên kỹ thuật RNAi nhằm điều trị UTG và một số bệnh ung thư khác
trong tương lai tại chính đơn vị tác giả đang cơng tác.
Ngồi ra, trên phạm vi thế giới, nghiên cứu cũng đạt được một số kết quả
mới so với các nghiên cứu trước đây như:
1. siRNA ức chế đồng thời sự biểu hiện của gen VEGF và gen KSP cho hiệu
quả tốt hơn so với các siRNA ức chế riêng biệt từng gen.
2. VEGF có thể là nhân tố điều hịa trực tiếp sự biểu hiện của gen KSP bởi
VEGF-siRNA ức chế một phần sự biểu hiện của gen KSP.
3. Các siRNA làm tăng mức độ đáp ứng thuốc của tế bào UTG với
Doxorubicin. Trong đó, việc phối hợp đồng thời VEGF-siRNA và KSP-siRNA cho
hiệu quả tác động tốt nhất.

5


Chương 1

TỔNG QUAN
TÀI LIỆU


1.1. Khái quát về ung thư gan
1.1.1. Ung thư gan và nguyên nhân hình thành ung thư gan
Ung thư gan (UTG) là một trong những loại ung thư phổ biến nhất trên toàn
thế giới, với hơn 500.000 trường hợp được phát hiện mỗi năm và tỉ lệ tử vong gần
bằng với tỉ lệ mắc phải [15]. Theo thống kê năm 2010, UTG đứng vị trí thứ 5 trong
số các loại ung thư mô rắn thường gặp (sau ung thư phổi, ung thư vú, ung thư đại
trực tràng và ung thư dạ dày) và đứng thứ 3 về số ca tử vong. UTG chiếm khoảng

6,26% tổng số các loại ung thư, tỉ lệ mắc UTG ở khu vực châu Á cao nhất trên thế
giới. Đa số các trường hợp mắc UTG xuất phát từ các nước đang phát triển và nam
giới có tỉ lệ mắc bệnh cao hơn nữ giới [6, 50]. Tỷ lệ người mắc bệnh UTG ở Việt
Nam đứng thứ hai thế giới và cao gấp 10 lần so với Hoa Kỳ. Ở nước ta, trung bình
100 trường hợp bị ung thư có 4 trường hợp bị UTG [6].
UTG là sự phát triển và lan truyền các tế bào không khỏe mạnh trong gan.
UTG gồm hai loại: UTG nguyên phát và UTG thứ phát. Ung thư bắt nguồn từ các
tổn thương tế bào và mô gan được gọi là UTG nguyên phát. UTG nguyên phát gồm
4 nhóm: ung thư tế bào biểu mô gan (Hepatocellular carcinoma – HCC), ung thư
nguyên bào gan (Hepatoblastoma – HB), ung thư đường mật và u máu ác tính. Ung
thư biểu mơ gan hình thành từ tế bào gan bị tổn thương. Các tế bào này tạo ra tế bào
ác tính gây ung thư và lây lan sang các bộ phận khác của gan. Ung thư biểu mô gan
chiếm đến 85% UTG nguyên phát. Ung thư nguyên bào gan hình thành từ các tế
bào tiền thân gan hay các tế bào gốc gan bị đột biến trong quá trình hình thành phát
triển của gan. Đây là nhóm ung thư gan hiếm gặp ở người chưa trưởng thành. U
máu ác tính cũng là một dạng ung thư hiếm gặp nhưng cực kỳ nguy hiểm. U máu ác
tính bắt nguồn từ các tế bào mạch máu trong gan. Do phát triển từ mạch máu nên
nhóm u máu ác tính lây lan nhanh và phát triển mạnh. Một dạng khác của UTG là
ung thư đường mật. Ung thư đường mật bắt nguồn từ ống mật của gan. Các tế bào
lót của ống mật hay tế bào ống mật sản sinh ra ung thư rồi lây lan đến gan. Ung thư
đường mật thường phát triển và di căn chậm. Loại ung thư này chiếm khoảng 10%
UTG nguyên phát [1, 88]. Bên cạnh UTG nguyên phát, UTG thứ phát (UTG do di
6